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1 Fabricant
Consignes d'utilisation du
SURVEYOR® Scan KRAS Kit
Exons 3 & 4 CE IVD
pour les Systèmes DHPLC
Veuillez lire attentivement ces consignes d'utilisation avant d'utiliser
ce produit.
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Table des matières
1 Fabricant ......................................................................................................................................... 3
2 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD ....................................................................... 3
2.1 Utilisation prévue ..................................................................................................................................... 3
2.2 Mode d'emploi ......................................................................................................................................... 3
3 Principes régissant le test de détection de mutation SURVEYOR Scan KRAS ...................... 4
3.1 KRAS et NRAS............................................................................................................................................ 4
3.2 Analyse des échantillons patients en utilisant les kits SURVEYOR Scan ................................................... 4
3.3 SURVEYOR Nuclease ................................................................................................................................. 5
4 Traçabilité des contrôles des kits ................................................................................................ 6
5 Composants ................................................................................................................................... 7
5.1 Nombre d'échantillons qui peut être testé avec un kit ............................................................................ 7
5.2 Séquençage d'ADN ................................................................................................................................... 8
6 Équipement et réactifs supplémentaires nécessaires ............................................................... 8
7 Préparation des réactifs ................................................................................................................ 8
8 Conservation et durée de validité ................................................................................................ 8
9 Mises en garde et précautions ..................................................................................................... 9
10 Prélèvement, manipulation et conservation de l'échantillon primaire ................................... 9
11 Procédure de test ...................................................................................................................... 10
11.1 Détection de mutation somatique avec les kits SURVEYOR Scan - Présentation générale .................. 10
12 Consignes étape par étape ....................................................................................................... 11
12.1 Installation/Etalonnage INITIAL de la DHPLC ..................................................................................... 11
12.2 Considérations avant l'analyse d'échantillons KRAS ............................................................................ 11
12.3 Considérations relatives aux matrices .................................................................................................. 11
12.4 Considérations relatives aux flux de travail .......................................................................................... 12
12.5 Protocole d'amplification ..................................................................................................................... 14
12.6 Programme du thermocycleur pour le protocole d'amplification ....................................................... 16
12.7 Contrôle qualité des produits de PCR ................................................................................................... 16
12.8 Digestion SURVEYOR Nuclease ............................................................................................................. 17
13 Procédures de contrôle............................................................................................................. 18
13.1 Contrôle qualité du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD ...................................................... 18
13.2 Utilisation des ADN plasmidiques de contrôle ..................................................................................... 19
14 Interprétation des résultats ...................................................................................................... 19
14.1 Analyse de KRAS Exons 3 et 4 avec SURVEYOR Nuclease ..................................................................... 19
14.2 Lecture des données d’analyse SURVEYOR Scan .................................................................................. 20
14.3 Exemples de résultats........................................................................................................................... 21
15 Caractéristiques et performance ............................................................................................. 24
15.1 Seuil de détection des mutations avec les kits SURVEYOR Scan .......................................................... 24
15.2 Confirmation par séquençage .............................................................................................................. 24
15.3 Limites du kit ........................................................................................................................................ 24
Appendice A .................................................................................................................................... 26
A.1 Schéma de configuration des plaques pour les kits SURVEYOR Scan .................................................... 26
A.2 Empreintes de l'ADN de contrôle ........................................................................................................... 26
A.3 Exigences du système HPLC en phase dénaturante (DHPLC) ................................................................. 27
A.4 Configuration du laboratoire pour les tests PCR .................................................................................... 28
A.5 Références Documentaires .................................................................................................................... 29
Appendice B .................................................................................................................................... 30
Guide de Résolution des Problèmes............................................................................................................. 30
Informations relatives aux commandes ....................................................................................... 36
Coordonnées ................................................................................................................................... 36
Responsabilité de traduction ........................................................................................................ 36
Licences, marques & droit d'auteur .............................................................................................. 37
1 Fabricant
1 Fabricant
Fabricant
M
Représentant
CE
P
Transgenomic, Inc.
12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA
Tél. 1-402-452-5400
Transgenomic Limited
40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK
Tél. +44-141-892-8800
2 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD
2.1 Utilisation prévue
À usage professionnel uniquement. Le Transgenomic SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4
CE IVD est un test de diagnostic in vitro qui détecte les mutations somatiques des exons 2, 3 et 4
du gène KRAS. Ces mutations sont indiquées par des pics de clivage SURVEYOR Nuclease et
comprennent les mutations connues pour leur signifiance clinique potentielle. Le kit est conçu pour
être utilisé dans un laboratoire de diagnostic clinique par du personnel adéquatement formé aux
analyse d'ADN extrait de tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine.
Ce kit, référence catalogue 710106, est fourni dans une boîte unique contenant les composants cidessous. Les consignes d'utilisation peuvent être téléchargées à partir de la page
http://world.transgenomic.com/files/literature/482407-FR.pdf.
2.2 Mode d'emploi
Les cliniciens peuvent utiliser le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD avec le
Système DHPLC pour s'aider à décider si les patients atteints d'un cancer colorectal pourraient ou
non répondre à un traitement anti-EGFR (récepteur de facteur de croissance épidermique) tel que
le panitumumab.
Le SURVEYOR Scan KRAS kit Exons 3 & 4 CE IVD est conçu pour être utilisé pour analyser les
échantillons identifiés comme étant du type KRAS Exon 2 Wild-Type à l'issue de l'analyse
effectuée avec le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD. Ce kit doit être utilisé
conjointement au SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD.
Le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD ne doit pas être utilisé dans le diagnostic du
cancer colorectal ou d'un autre cancer.
Le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD est un test qui détecte la présence de
mutations somatiques potentielles dans les Exons 3 et 4 du gène KRAS mais sans pour autant
confirmer l'identité de la séquence de mutation. Pour confirmer précisément la mutation
détectée, des analyses supplémentaires, telles que le séquençage de l'ADN, seront
nécessaires.
Bien que les résultats de cette analyse avec ce kit indiquent le statut mutationnel du patient,
d'autres facteurs cliniques doivent être pris en compte, notamment les mutations de l'Exon 2 de
KRAS et des Exons 2, 3 & 4 de NRAS. Les résultats du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4
CE IVD ne doivent pas être utilisés comme méthode unique pour prendre des décisions
concernant le traitement des patients atteints d'un cancer colorectal.
Il est important de noter que l'utilisation de la DHPLC pour identifier les échantillons positifs de
mutation du gène KRAS avec ce kit doit uniquement servir d'indication et que toutes les
mutations doivent être confirmées par des analyses supplémentaires, telles que le
séquençage de l'ADN.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 3
3 Principes régissant le test de détection de mutation SURVEYOR Scan KRAS
3 Principes régissant le test de détection de mutation
SURVEYOR Scan KRAS
3.1 KRAS et NRAS
Des agents thérapeutiques ciblant le récepteur de facteur de croissance épidermique (EGFR) ont
prouvé leur efficacité contre le cancer colorectal. Les recherches ont indiqué qu'environ 40% des
tumeurs colorectales présentent des mutations somatiques du gène KRAS et les études cliniques
ont prouvé que les mutations de l'exon 2 (codons 12 et 13) de KRAS sont prédictifs d'une absence
de réponse aux traitements anti-EGFR. Des études exploratoires récentes ont démontré que la
population de patients peut-être encore plus précisément définie puisque les patients dont les
tumeurs mCRC présentent une mutation supplémentaire des exons 3 et 4 de KRAS ou des exons
2, 3 et 4 de NRAS ne semblent pas non plus avoir tendance à répondre au traitement contenant
1-7
des anti-EGFR . Ce kit est conçu pour l'analyse diagnostique de mutations somatiques des
exons 3 et 4 de KRAS.
Le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 3 & 4 CE IVD est un test visant à détecter toutes les
altérations de séquence et petites insertions/délétions des Exons 3 et 4 du gène KRAS. Les
mutations des codons 59, 61, 117 et 146 de KRAS ont été associées avec un manque d'efficacité
du panitumumab. Des Positive Controls sont fournis dans ce kit pour les mutations des codons 61,
117 et 146.
Ce kit s'appuie sur la technologie propriétaire de Transgenomic, SURVEYOR Nuclease, qui,
lorsqu'elle est associée à la DHPLC, permet une détection simple et sensible de mutations
potentielles. Il peut détecter un mélange mutant de 2-5% dans un bruit de fond d'ADN non mutant.
Des études de validation ont démontré l'existence d'une correspondance extrêmement élevée
avec le séquençage parmi des échantillons bien caractérisés de cancer colorectal. L'utilisation du
SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD diminuera à la fois la charge de séquençage de
l'utilisateur et aidera ce séquençage lorsqu'un logiciel de séquençage automatique ne parvient pas
à déterminer la présence de faibles niveaux de mutation.
En raison de la haute sensibilité de ce test par rapport au séquençage Sanger, il est conseillé
d'optimiser la configuration du laboratoire pour faire en sorte d'éviter toute contamination croisée
des contrôles ou des échantillons. Pour un exemple de configuration optimale du laboratoire,
consulter Appendice A.4 Configuration du laboratoire pour les tests PCR.
3.2 Analyse des échantillons patients en utilisant les kits SURVEYOR Scan
Le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD ne devra être utilisé que dans le contexte de
l'un des flux de travail indiqués ci-dessous.
Flux de travail B
Flux de travail A
Échantillon patient
Échantillon patient
Test KRAS Exons 2, 3 & 4
et NRAS Exons 2, 3 & 4
Rapport des
résultats
Test KRAS Exon 2
Résultat Mutation du
Codon 12 ou 13 de KRAS
Résultat Codon 12 ou
13 Wild-Type de KRAS
Rapport des résultats
Test KRAS Exons 2, 3 & 4
et NRAS Exons 2, 3 & 4
Rapport des résultats
Figure 1 Flux de travail du kit de détection de la mutation du gène KRAS et du gène NRAS
SURVEYOR Scan
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 4
3 Principes régissant le test de détection de mutation SURVEYOR Scan KRAS
Pour obtenir des suggestions sur la méthode de préparation des plaques de 96 puits de tous les
Exons 2-4 KRAS et NRAS, voir l'Appendice A.1 Schéma de configuration des plaques pour
les kits SURVEYOR Scan.
3.3 SURVEYOR Nuclease
SURVEYOR Nuclease de Transgenomic est une endonucléase de plante spécifique des
mésappariement de l’ADN extraite à partir de plantes et capable de détecter les polymorphismes
8
et mutations connus ou inconnus d’ADN hétéroduplexe . L'enzyme clive l'ADN très spécifiquement
au niveau des sites de mésappariement liés à la présence de substitution de bases ou d'autres
distorsions. Cette endonucléase d'ADN coupe les deux brins d'un hétéroduplexe d'ADN du côté 3’
du site de mésappariement. Les mésappariements liés à l'insertion/délétion et tous les
mésappariements de substitution de base sont reconnus, mais l'efficacité du clivage varie en
fonction de la séquence du mésappariement.
Figure 2. Mode d'action de
SURVEYOR Nuclease.
L'endonucléase reconnaît un
mésappariement et clive du côté 3’
de chaque base du mésappariement.
Cela clive l'ADN double brin et
produit une extrémité 3’ sortante
d'une seule base.
SURVEYOR Nuclease a été utilisée dans un large éventail de contextes pour détecter avec
précision une variété de mutations et de polymorphismes de gènes. En particulier, SURVEYOR
Nuclease a été utilisé pour vérifier la présence de mutations connues dans un certain nombre de
gènes associés avec le cancer du rein, le cancer des poumons, le cancer de la tête et du cou, la
leucémie, le cancer de l'endomètre et dans les évaluations prédictives de l'efficacité de la
9,10,11
radiothérapie
.
Le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD a été conçu pour cliver les mésappariements
des exons 3 et 4 du gène KRAS afin de les révéler par analyse consécutive avec DHPLC.
Remarque: Si un échantillon est 100% d'ADN mutant, aucun hétéroduplexe ne peut être
formé et l'échantillon apparaît comme étant “Wild-Type”. Toutefois, les échantillons de
biopsie tumorale contiendront des cellules Wild-Type en raison de l'hétérogénéité de la
tumeur et/ou de la contamination de tissus normaux; noter que ce kit détecte 5% Wild-Type
avec des traces identiques à 5% d'ADN mutant.
Remarque: Seul le DNA Polymerase fourni avec ce kit doit être utilisée pour réaliser ce test.
Remarque: Veuillez respecter les instructions spécifiques de votre manuel d'utilisation du
Système DHPLC.
Pour bien utiliser ce kit, nous vous conseillons vivement de lire entièrement et
attentivement ce manuel et de suivre à la lettre les instructions et conseils y figurant. Les
novices devront effectuer les expériences de contrôle indiquées au chapitre Utilisation des
ADN plasmidiques de contrôle.
Si vous avez des questions ou avez besoin d'assistance, veuillez appeler le (888) 233-9283
(Amérique du Nord uniquement), +1 (402) 452-5400 ou +44 (0) 141 892 8800 (Europe) en
demandant à parler à l'équipe “Assistance technique KRAS”. Vous pouvez également nous
envoyer un e-mail à l'adresse:
[email protected]
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 5
4 Traçabilité des contrôles des kits
4 Traçabilité des contrôles des kits
Les contrôles fournis avec de kit sont des clones plasmidiques de séquences des Exons 3 et 4 du
gène KRAS. Tous les clones ont été séquencés afin de vérifier la fidélité de la séquence en la
comparant à la NCBI Reference Sequence: NG_007524.1.
Les contrôles ont une “empreinte” génétique. Voir Appendice A.2 Empreintes de l'ADN de
contrôle; ces variations de la séquence KRAS Wild-Type dans une région où des mutations ne
sont pas prévues peuvent être utilisées pour résoudre les contaminations éventuelles de
l'échantillon par les Contrôles Positive Control. Voir Appendice B - Guide de Résolution des
Problèmes, Problème 8, pour y trouver un exemple d'une trace de contamination de ce genre de
SURVEYOR Scan.
Le “KRAS Control Wild-Type” a été élaboré par synthèse et clonage des exons 2, 3 et 4 de
KRAS en utilisant la séquence de référence NCBI ci-dessus.
Le “KRAS Positive Control Exon 3” a été élaboré par synthèse de l'exon 3 KRAS en utilisant la
séquence de référence ci-dessus contenant la mutation Q61H. Le séquençage de l'ADN a
confirmé que le seul changement de la séquence est situé au codon 61 avec une altération de
Q61H, CAA>CAC. Ce clone est ensuite mélangé avec l'ADN KRAS Control Wild-Type afin de
créer un mélange hétérozygote.
Le “KRAS Positive Control Exon 4A” a été élaboré par synthèse de l'exon 4 KRAS en utilisant la
séquence de référence ci-dessus contenant la mutation K117N. Le séquençage de l'ADN a
confirmé que le seul changement de la séquence est situé au codon 117 avec une altération de
K117N, AAA>AAT. Ce clone est ensuite mélangé avec l'ADN KRAS Control Wild-Type afin de
créer un mélange hétérozygote.
Le “KRAS Positive Control Exon 4B” a été élaboré par synthèse de l'exon 4 KRAS en utilisant la
séquence de référence ci-dessus contenant la mutation A146T. Le séquençage de l'ADN a
confirmé que le seul changement de la séquence est situé au codon 146 avec une altération de
A146T, GCA>ACA. Ce clone est ensuite mélangé avec l'ADN KRAS Control Wild-Type Exon afin
de créer un mélange hétérozygote.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 6
5 Composants
5 Composants
Le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 3 & 4 CE IVD se compose de (1) une Boîte de composants
de digestion SURVEYOR avec 10 tubes de réactif sans emplacements vides et (2) un Porte-tubes
de contrôles et composants de PCR contenant 13 tubes de réactif et 7 emplacements vides.
Référence
catalogue
Composant
Couleur des
bouchons
de tubes
Kit comprenant
assez de produit
pour 100 réactions
Violet
Noir
Rose
Marron
Rouge
Orange
Orange
2 x 105 µL
105 µL
105 µL
105 µL
250 µL
2 x 125 µL
2 x 125 µL
Rouge
Transparent
Transparent
Bleu
Bleu
Bleu
Bleu
Bleu
Bleu
Jaune
Vert
Vert
Vert
100 µL
1 mL
500 µL
90 µL
90 µL
90 µL
90 µL
90 µL
90 µL
120 µL
40 µL
40 µL
40 µL
Boîte de composants de digestion SURVEYOR
710160
710161
708049
708027
708030
710153F
710153R
SURVEYOR Nuclease W
SURVEYOR Enhancer W2
SURVEYOR Enhancer Cofactor
0.15 M MgCl2 Solution
SURVEYOR Stop Solution
Universal Sequencing Primer 1 (10 µM)
Universal Sequencing Primer 2 (10 µM)
Boîte de contrôles et composants de PCR
703310
703315
703065
710157F
710157R
710154F
710154R
710156F
710156R
710131
710136
710137
710138
482407
DNA Polymerase
DNA Polymerase 10X PCR Buffer
dNTPs (10 mM)
KRAS Primer Exon 3 Forward (10 µM)
KRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µM)
KRAS Primer Exon 4A Forward (10 µM)
KRAS Primer Exon 4A Reverse (10 µM)
KRAS Primer Exon 4B Forward (10 µM)
KRAS Primer Exon 4B Reverse (10 µM)
KRAS Control Wild-Type
KRAS Positive Control Exon 3
KRAS Positive Control Exon 4A
KRAS Positive Control Exon 4B
Mode d'emploi
À télécharger sur le site Internet*
http://world.transgenomic.com/files/literature/482407-FR.pdf
5.1 Nombre d'échantillons qui peut être testé avec un kit
Le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD est conçu pour permettre d’effectuer 100
réactions. Le nombre total d'échantillons pouvant être testé avec le kit dépend nombre moyen
d'échantillons testés simultanément par lot car un jeu de témoins de référence (Contrôle WildType, Positive Control et Contrôle sans matrice) doit être inclus dans chaque plaque d’analyse. Le
tableau ci-dessous indique le nombre d'échantillons pouvant être analysés avec le kit KRAS en
fonction du nombre moyen d’échantillons par série. Les calculs ont été réalisés en gardant à
l'esprit (a) les 9 contrôles (3x Wild-Type, 3x Positive Control, 3x Contrôle sans matrice)
nécessaires pour chaque série et (b) la limite de 100 réactions par kit.
Remarque: Si plusieurs plaques sont testées, un jeu des 9 contrôles cités ci-dessus doit être testé
sur chaque plaque. Par conséquent, deux plaques nécessitent un total de 18 réactions de
contrôle, 3 plaques nécessitent 27 réactions de contrôle, etc.
Lorsque le nombre d'échantillons par lot augmente, le nombre d'échantillons pouvant être
analysés dans un seul kit augmente également, ce qui fait baisser le coût moyen de réactif. Le
tableau ci-dessous sert de guide par rapport au nombre d'échantillons pouvant être testés avec un
seul kit.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 7
5 Composants
Nombre
d'échantillons
par lot
Nombre de réactions
de contrôles + Nombre
d'échantillons
d'amplicons
Nombre de
réactions
nécessaires
par série
Nombre total de
séries de lots
d'échantillon
par kit
Total
d'échantillons
testés par kit
1
9+3
12
8
8
2
9+6
15
6
12
3
9+9
18
5
15
4
9 + 12
21
4
16
5
9 + 15
24
4
20
5.2 Séquençage d'ADN
Les amorces Universal Sequencing Primers (PN 710153F et 710153R) sont fournies pour servir
au séquençage de l'ADN de tous les échantillons testés. Les amplicons PCR créés avant la
digestion SURVEYOR Nuclease doivent être utilisés pour le séquençage.
6 Équipement et réactifs supplémentaires nécessaires
Les équipements et réactifs supplémentaires nécessaires à l'utilisation du SURVEYOR Scan
KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD avec DHPLC comprennent:
Colonne pour Système DHPLC, tampons, standard de taille d'ADN- voir l'Appendice
A.3.1 Spécifications du DHPLC pour les applications SURVEYOR Scan pour obtenir
les caractéristiques correspondant au système DHPLC adéquat à utiliser avec ce kit
Eau de qualité biologie moléculaire
Tubes de 0,2 mL-PCR, bandelettes ou plaque de 96 puits
Micro-pipetteurs
Embouts de pipette
Bain de glace
Vortexer
Microcentrifuge
Thermocycleur
Gel d'agarose et équipement pour électrophorèse en gel d'agarose
Eau de javel 10% ou produit nettoyant similaire
7 Préparation des réactifs
Tous les réactifs fournis avec ce kit sont prêts à l'emploi. Certains composants devront être
décongelés, vortexés ou agités dans la centrifugeuse avant leur utilisation; reportez-vous aux
détails sur la Procédure de Test figurant ci-dessous. Les réactifs doivent être mélangés afin de
produire un Mélange Maître et des mélanges de réaction; tous les détails sont précisés dans la
Procédure de Test figurant ci-dessous.
8 Conservation et durée de validité
Le kit doit être conservé entre -18 ºC et -25 °C à température constante dans un congélateur
jusqu'à son utilisation. Notez la date d'expiration de chaque kit reçu. Ne pas utiliser le kit après la
date d'expiration.
Le mélange SURVEYOR Nuclease préparé à l'étape 7 de la Digestion avec SURVEYOR
Nuclease doit être utilisé immédiatement car SURVEYOR Nuclease W se désactive au fil du
temps en présence des autres composants du mélange de réaction SURVEYOR Nuclease.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 8
9 Mises en garde et précautions
9 Mises en garde et precautions
Aucun des kits de réactifs ne présente de danger pour la santé dans les quantités fournies. Le
document Transgenomic Réf. MSD-710106 peut être téléchargé à partir de
http://world.transgenomic.com/files/literature/710106-FR.pdf
Ce kit ne contient aucune substance d'origine humaine ou animale qui présente un risque
d'infection.
Ce kit doit être uniquement utilisé par les personnes ayant été formées aux techniques de
laboratoires appropriées. Lorsque vous travaillez avec les composants de ce kit, portez toujours
une blouse de laboratoire appropriée, des gants jetables ainsi que des lunettes de protection.
Après utilisation, les composants du kit doivent être éliminés comme déchets cliniques
conformément aux réglementations et règlements locaux.
Les aliquots de réactifs pipetés à partir des tubes de ce kit ne doivent être utilisés qu'une seule
fois. Les composants de ce kit ont été validés comme restant stables pendant 25 cycles de
congélation/décongélation. Ne pas utiliser ce kit au-delà de ce nombre de cycles de
congélation/décongélation.
10 Prélèvement, manipulation et conservation de
l'échantillon primaire
Le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD a été validé pour être utilisé avec de l'ADN
extrait d'échantillons de tumeurs colorectales cancéreuses enrobés de paraffine et fixés au formol
(FFPE). Pour assurer une extraction optimale de l'ADN, le tissu doit être fixé au formol pendant
14–24 heures avant d'être enrobé de paraffine.
Les biopsies de tumeurs sont des mélanges hétérogènes de cellules tumorales et non tumorales.
La tumeur elle-même consiste en un mélange hétérogène de cellules tumorales avec et sans
mutations. Parce que ces mutations somatiques peuvent ne pas être réparties de manière égale
dans toute la tumeur, l'analyse des mutations des différentes sections de la même tumeur en
résultant pourra s'avérer différente. Pour augmenter la probabilité de détection d'une mutation,
l'ADN issu de la région tumorale du tissu doit être isolé en grattant uniquement la région tumorale
de la surface vitrée à l'aide d'un scalpel stérile pour chaque nouvelle lame.
Pour assurer une utilisation réussie de ce kit, l'ADN extrait devra répondre aux critères figurant
dans les Considérations relatives aux matrices
REMARQUE: Les échantillons d'ADN extrait dont l'utilisation n'est pas prévue pour une analyse
immédiate au moyen de ce kit doivent être stockés congelés entre -20 ºC et -80 ºC.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 9
11 Procédure de test
11 Procédure de test
11.1 Détection de mutation somatique avec les kits SURVEYOR Scan Présentation générale
La détection et la confirmation de mutation avec SURVEYOR Nuclease impliquent les 3 étapes
suivantes:
Étape 1. Analyse de fragment basée sur la taille sur le WAVE MCE System Étape 1 Préparez les amplicons PCR amplicons à partir de l'ADN mutant (test) et normal
(référence), en poursuivant le dernier cycle d'amplification de PCR par une denaturation
pour fondre l’ensemble des les doubles brins puis les refroidir lentement afin d'assurer la
formation optimale d'hétéroduplexes et d'homoduplexes (les hétéroduplexes se forment
lorsqu'un brin d'une séquence de Wild-Type s'hybride avec un brin d'une séquence
mutante).
Étape 2 - Traiter une partie du mélange hybridé hétéroduplexe/homoduplexe avec
SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease sectionnera les deux brins d'ADN
hétéroduplexe pour produire des fragments d'ADN. L'ADN référence Control Wild-Type,
traité de manière similaire, sert de contrôle de fond.
Étape 3 - Analyse des fragments d'ADN avec un système DHPLC. La formation de
nouveaux produits de clivage dus à la présence d'un ou plusieurs mésappariements est
indiquée par la présence de pics chromatographiques additionnels. Les temps de
migration des produits de clivage indiquent la taille des fragments et donc l'emplacement
approximatif du ou des mésappariement(s).
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 10
12 Consignes étape par étape
12 Consignes étape par étape
12.1 Installation/Etalonnage INITIAL de la DHPLC
Lorsque vous réglez la plaque SURVEYOR Nuclease pour une analyse sur le système DHPLC,
veuillez vous reporter à l'Appendice A.3 Exigences du Système HPLC en phase dénaturante
(DHPLC).
12.2 Considérations avant l'analyse d'échantillons KRAS
Avant de lancer l'analyse d'échantillons sur le système DHPLC un étalon de taille d'ADN adéquat
doit être testé pour s'assurer que le système fonctionne correctement. Le personnel de laboratoire
utilisant l'instrument doit vérifier la qualité de la résolution de l'étalon de taille d'ADN avant de
procéder à l'analyse
12.3 Considérations relatives aux matrices
1. Pour une matrice d’ADN isolée à partir échantillons FFPE, adoptez les procédures de
laboratoire habituelles pour évaluer la qualité et la quantité d'ADN extrait et vérifier la
présence d'une matrice amplifiable par PCR.
2. Le ratio d'absorption 260/280 doit être supérieur à 1,80.
3. Pour accélérer la préparation de la PCR, la concentration de la matrice de travail de
chaque échantillon doit être de 12,5 ng/µL. Diluez la matrice d'ADN dans une eau de
qualité biologie moléculaire lorsque nécessaire.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 11
12 Consignes étape par étape
12.4 Considérations relatives aux flux de travail
Le kit est conçu pour permettre l'analyse de 100 réactions. Des lots d'échantillons plus restreints
peuvent être analysés mais les contrôles du kit et un «Contrôle sans matrice» devront être inclus
avec chaque lot d'échantillons. Le kit contient suffisamment de matériels de contrôle pour 100
réactions quelle que soit la taille du lot d'échantillons à analyser.
En général, le traitement des échantillons devra être réalisé du début à la fin en observant les
descriptions de ce manuel d'utilisation. Dans le cas où le traitement d'un échantillon serait
interrompu avant que toutes les étapes n'aient été achevées, l'ADN devra être conservé à -20 °C
jusqu'à la réalisation de l'étape suivante. Cependant, il faudra éviter d'exposer un échantillon
congelé à des cycles de congélation/décongélation répétés ainsi que de conserver entre -18 et -25
°C des produits d'ADN amplifié par PCR ou de digestion SURVEYOR Nuclease pendant des
périodes prolongées (>1 semaine).
L'analyse des échantillons doit correspondre au flux de travail illustré ci-dessous:
Grattage
tissulaire
1
Isolation
de l'ADN
& PCR
Électrophorèse en gel
d'agarose
2
3
Détermination PCR Intense/Faible
4
5
SURVEYOR
Scan Échoué
Analyse SURVEYOR
Nuclease & DHPLC
SURVEYOR Scan
Positif
SURVEYOR Scan
Négatif
6
7
Confirmation
de séquence
8
Échec de la
qualité de
séquence
NVD
(aucune variante
détectée)
Réussite de la
qualité de séquence
9
Mutations dans les
codons A59, Q61, K117
ou A146
NVD
Figure 3 Flux de Travail de l'analyse avec le kit SURVEYOR Scan KRAS
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 12
12 Consignes étape par étape
Remarques sur la Figure 3
1. Isolez l'ADN du FFPE en utilisant les procédures de laboratoires standard.
2. Effectuez la PCR et vérifiez la qualité de l'ADN par électrophorèse en gel.
3. Notez si la bande PCR est Intense (≥20 ng) ou Faible (<20 ng).
Si des bandes PCR multiples sont présentes, préparez un nouvel ADN génomique à
partir du prélèvement FFPE.
4. Avec les échantillons relevés comme étant PCR Intense ou PCR Faible après
amplification par PCR, procédez au traitement SURVEYOR Nuclease et à l'analyse avec
le système DHPLC.
Notez qu'avec les produits de PCR faibles il se peut que l'ADN soit insuffisant pour
générer des résultats significatifs sur la plate-forme DHPLC, mais il y aura
cependant suffisamment d'ADN pour le séquençage.
5. Voir Appendice B – Guide de résolution des problèmes pour y trouver des exemples de
résultats SURVEYOR Scan échoués. Tous les échantillons présentant un résultat
SURVEYOR Scan échoué doivent être retraités comme suit:
a. Répéter la procédure de PCR s'il reste suffisamment d'ADN génomique.
b. Ré-extraire l'ADN du tissu FFPE; ceci constitue le second choix car il est
généralement peu conseillé de recouper un autre bloc de tissu FFPE.
c.
Si un autre bloc ou section est utilisé, le test devra être recommencé dans son
intégralité étant donné que les différences des digestions peuvent être dues à
l'hétérogénéité de la tumeur.
6. En l'absence de pics de clivage visibles, enregistrer le résultat SURVEYOR Scan comme
étant négatif, soit NVD = Aucune variante détectée.
7. Si un échantillon présente des produits de clivage SURVEYOR Nuclease (non
correspondant au Wild-Type Control), ils devront faire l'objet d'un séquençage de
confirmation.
8. Si une analyse de séquençage de confirmation est inacceptable:
a. Répéter la procédure de PCR s'il reste suffisamment d'ADN génomique.
b. Ou ré-extraire l'ADN du tissu FFPE; ceci constitue le second choix car il est
généralement peu conseillé de recouper d'autres lames d'un bloc de tissu FFPE.
9. Si l'analyse de confirmation de la séquence est acceptable, les résultats devront indiquer
soit:
a. une séquence Wild-Type, c'est-à-dire aucune variante détectée (NVD); ou
b. un variant détecté. Lorsque la confirmation de séquence indique un changement
de base entraînant un changement au niveau de l'acide aminé aux positions:
i. codon 59
ii. codon 61
iii. codon 117; ou
iv. codon 146
relever comme mutation KRAS positive.
Remarque: il est possible d'obtenir un résultat SURVEYOR Scan positif qui indique également
'Aucune variante détectée' à partir d'un test de séquençage de confirmation. Le seuil de détection
(LOD) de SURVEYOR Nuclease sur le système DHPLC se situe à 2% mutant dans 98% d'ADN
Wild-Type pour certaines mutations, tandis que le LOD de séquençage est d'environ 10-25%
mutant dans 90-75% d'ADN Wild-Type.
Si un échantillon est 100% d'ADN mutant, aucun hétéroduplexe ne peut être formé et l'échantillon
apparaît comme étant “Wild-Type”. Toutefois, les échantillons de biopsie tumorale contiendront
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 13
12 Consignes étape par étape
des cellules Wild-Type en raison de l'hétérogénéité de la tumeur et/ou de la contamination de
tissus normaux; noter que ce kit détecte 5% Wild-Type avec des traces identiques à 5% d'ADN
mutant.
Remarque: Les résultats SURVEYOR Scan positifs peuvent découler de changements des bases
autres que ceux qui activent le KRAS. Bien que ces mutations soient rares, une confirmation par
une autre méthode, telle que le séquençage d'ADN, sera alors nécessaire avant d'enregistrer un
résultat SURVEYOR Scan Positif en tant activateur de mutation du KRAS.
Remarque: le processus de fixation dans du formol utilisé au cours de la préparation des
échantillons FFPE de biopsie tumorale peut entraîner une désamination des cytosines. Cette
désamination convertit la cytosine en uracile. La polymérase interprétera cet uracile comme étant
une thymine et incorporera une adénine dans les brins copiés. Ceci semblera être une mutation là
où le G normal sera remplacé par un A entraînant une mutation de GC à AT due au processus de
fixation et non pas une véritable mutation somatique. Il s'agit là d'événements rares mais s'ils sont
copiés de façon précoce au cours du cycle de PCR, ils ressembleront à des mutations. Ils ne se
répètent pas au cours d'une réanalyse.
Les exemples de mutations pouvant se produire suite à la désamination de cytosines qui seraient
prises en compte dans le choix du traitement du patient comprennent notamment: KRAS A146T.
-
Codon 146: GCA>ACA (A146T)
Il est par conséquent conseillé que toute mutation de ce type soit confirmée par double analyse du
même ADN génomique ou que tous les échantillons soient soumis à une double analyse à partir
du début de l'analyse.
12.5 Protocole d'amplification
1. La solution dNTP Transgenomic pré mélangée (PN 703065) est fournie à une
concentration de travail de 10 mM de désoxynucléotide (soit 2,5 mM de chacun des
quatre désoxynucléotides).
2. Les amorces de PCR KRAS Exon 3, Exon 4A et Exon 4B Forward et Reverse (PN
710157F/R, 710154F/R et 710156F/R) sont fournies à 10 µM.
3. Sortez les amorces de 10 µM, la solution de dNTP de pré mélangée et DNA Polymerase
10X PCR Buffer (PN 703315) du congélateur et faites-les décongeler sur de la glace.
4. Une fois dégelés, vortexez tous les composants du kit (~10 secondes) pour les mélanger
complètement, passez-les rapidement à la centrifugeuse (~10 secondes) pour vous
assurer qu'aucun liquide ne reste sur le couvercle des tubes et placez-les sur de la glace.
5. Préparez le Mélange Maître sur de la glace.
6. Utilisez le tableau ci-dessous comme guide pour préparer un Mélange Maître pour chaque
réaction (KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A et KRAS Exon 4B):
Nombre de réactions:
Calcul du Volume:
Volume d'eau (µL)
DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µL)
dNTPs (µL)
KRAS Primer Exon 3, 4A ou 4B Forward (µL)
KRAS Primer Exon 3, 4A ou 4B Reverse (µL)
DNA Polymerase (µL)
Volume total du Mélange Maître:
10
330**
50
40
25
25
10
48,0
**Remarque: L'utilisateur devrait s'efforcer de disposer d'au moins 25 ng d'ADN
pour 50 µL de réaction. Lorsque les concentrations d'ADN extraites sont inférieures à
12,5 ng/µL, augmentez le volume d'ADN extrait proportionnellement afin d'assurer 25 ng
par réaction. Faites également diminuer le volume d'eau du Mélange Maître de la même
quantité pour parvenir à 50 µL par réaction. L'ADN extrait de tous les échantillons
préparés avec ce Mélange Maître devra également être dilué à un niveau de
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12 Consignes étape par étape
concentration approximativement égal. L'utilisation de concentrations d'ADN extrait
inférieures à 5 ng/µL n'est pas conseillée.
7. Calculez les volumes requis pour tout Mélange Maître en vous reportant au graphique cidessus; notez que:
(a) Pour ce Mélange Maître 1, KRAS Exon 3, trois réactions supplémentaires seront
nécessaires pour le KRAS Wild-Type Control, KRAS Positive Control Exon 3 et le
Contrôle sans matrice KRAS Exon 3 (NTC1).
(b) Pour ce Mélange Maître 2, KRAS Exon 4A, trois réactions supplémentaires
seront nécessaires pour le KRAS Wild-Type Control, KRAS Positive Control Exon
4A et le Contrôle sans matrice KRAS Exon 4A (NTC2).
(c) Pour ce Mélange Maître 3, KRAS Exon 4B, trois réactions supplémentaires
seront nécessaires pour le KRAS Wild-Type Control, KRAS Positive Control Exon
4B et le Contrôle sans matrice KRAS Exon 4B (NTC3).
Remarque: prendre en compte qu'un volume de Mélange Maître légèrement supérieur à ce
calcul sera nécessaire pour remédier à toute perte survenant pendant le pipetage.
8. Étiquetez les tubes de 0,2 mL-PCR, ou puits d'une plaque de 96 puits avec les
informations appropriées relatives aux échantillons.
9. Étiquetez un tube de centrifuge de 2,0 mL pour la préparation du Mélange Maître.
10. Ajoutez le volume requis d'eau de qualité biologie moléculaire au tube de centrifugation de
2,0 mL portant l'étiquette «Mélange Maître».
11. Ajoutez la quantité requise de DNA Polymerase 10X PCR Buffer aux tubes contenant le
Mélange Maître.
12. Ajoutez le volume requis de 10 mM dNTP aux tubes de Mélange Maître.
13. Ajoutez le volume requis des amorces KRAS Forward Primer à leurs tubes de Mélange
Maître respectifs.
14. Ajoutez le volume requis des amorces KRAS Reverse Primer à leurs tubes de Mélange
Maître respectifs.
15. Retirez le DNA Polymerase (PN 703310) du congélateur.
16. Centrifugez le DNA Polymerase pendant ~10 secondes.
17. Vortexez le DNA Polymerase pendant ~10 secondes.
18. Ajoutez le volume requis de DNA Polymerase au tube contenant le Mélange Maître.
19. Rebouchez les tubes de Mélange Maître.
20. Avant utilisation, vortexez les tubes de Mélange Maître pendant ~30 secondes et passezles à la centrifugeuse pendant~10 secondes.
21. Conservez-les sur de la glace jusqu'à utilisation.
22. Pipetez 48,0 µL (voir remarque ci-dessus à l'étape 6) de Mélange Maître dans les puits
appropriés, en changeant les embouts de pipettes à chaque fois si vous utilisez un
pipeteur à canal unique. Si vous utilisez un pipeteur à répétition, assurez-vous qu'il n'y ait
pas d'éclaboussures ou de déversement de puits à puits. Maintenir la plaque sur de la
glace.
23. Ajoutez 2,0 µL (voir remarque ci-dessus à l'étape 6) de matrice d’ADN de chaque
échantillon, ou d'eau (contrôle sans matrice - NTC) dans les puits appropriés. Utilisez des
embouts de pipettes différents pour chaque échantillon et évitez toute contamination
croisée des échantillons par éclaboussures. Bouchez les puits contenant les échantillons
d'ADN et de NTC avec les bandes à 8-capuchons (si vous utilisez une plaque de 96-puits)
ou bouchez les tubes de 0,2 mL-PCR. Faites attention à ce que les bouchons soient
correctement placés.
24. N'ouvrez le kit de matrice de contrôle d'ADN qu'à ce stade (PN 710131, 710136, 710137,
710138), en ouvrant les tubes un par un. Pipetez 2,0 µL de chaque matrice de contrôle en
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 15
12 Consignes étape par étape
dernier pour éviter les possibilités de contamination des échantillons d'ADN. Rebouchez
de nouveaux chaque puits avec les bandes de 8-capuchons (si vous utilisiez une plaque
de 96-puits) ou rebouchez les tubes de 0,2 mL-PCR. Faites attention à ce que les
bouchons soient correctement placés.
REMARQUE: Observer les bonnes pratiques qui requièrent de placer les Contrôles sans
matrice (NTC) dans des puits non adjacents au Positive Control ou aux échantillons.
REMARQUE: Pour obtenir des suggestions sur la méthode de préparation des plaques
de 96 puits de tous les Exons 2-4 KRAS et NRAS, voir l'Appendice A.1 Plan de
configuration des plaques pour les kits SURVEYOR Scan.
25. Vortexez (à une vitesse d'environ 1/2) pendant 10 secondes.
26. Centrifugez pendant 1-2 minutes pour vous assurer que toutes les solutions soient
recueillies au fond des puits ou des tubes. Vérifiez que les solutions soient au fond de
chaque puits ou tube. Si ce n'est pas le cas, recommencez la centrifugation.
12.6 Programme du thermocycleur pour le protocole d'amplification
1. Utilisez le protocole de thermocycleur suivant pour l'amplification par PCR et la formation
d'hétéroduplexes:
15 cycles
30 cycles
1 cycle
Dénaturation Initiale
5 minutes
95 C
Amplification par essais (touchdown)
30 secondes
95 C
30 secondes
62 C, -0,5 ºC/cycle
25 secondes
72 C
Amplification
30 secondes
95 C
30 secondes
55 C
25 secondes
72 C
Extension finale
2 minutes
72 C
Formation d'hétéroduplexes
95 ºC
2 minutes
Maintien
≤12 C
12.7 Contrôle qualité des produits de PCR
1. Il est conseillé que la qualité et la quantité des amplicons soient évaluées par
électrophorèse sur gel (ou moyens équivalents) avant de procéder à la digestion
SURVEYOR Nuclease.
2. Analysez un aliquot du produit PCR avec un marquer de poids moléculaire d’ADN 100-bp.
3. Utilisez marquer de poids pour estimer la concentration d'ADN amplifié.
4. Seule une bande unique supérieure à 20 ng/µL, correspondant au produit PCR principal,
devrait être observée.
5. Si de multiples bandes sont présentes, assurez-vous que la qualité de la matrice d'ADN
utilisée était suffisante (voir Appendice B – Guide de Résolution des Problèmes).
6. Si aucun produit n'est observé, assurez-vous que la qualité de la matrice d'ADN utilisée
était suffisante (voir Appendice B – Guide de Résolution des Problèmes). Si la qualité
correspond aux spécifications, augmentez le volume de matrice à 4,0 µL par 50 µL de
réaction (réduisez le volume d'eau par réaction à 31,0 µL).
7. Aucun produit PCR ne doit être visible dans l'échantillon du contrôle sans matrice. Si des
produits d'ADN sont visibles avec ce contrôle, il est probable qu'une contamination ait eu
lieue; dans ce cas, voir Appendice B - Guide de Résolution des Problèmes.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 16
12 Consignes étape par étape
8. Déterminez la PCR comme Robuste ou Faible.
a. La PCR robuste devrait posséder une bande unique supérieure ou égale à 20
ng/µL.
b. La PCR faible devrait posséder une bande unique inférieure à 20 ng/µL.
c.
Procédez à la digestion par SURVEYOR Nuclease avec les scores de PCR
robustes et faibles.
Conseil: à ce stade, les produits PCR peuvent être conservés à des températures
inférieures ou égales à -20 ºC pendant une durée d'une semaine maximum.
12.8 Digestion SURVEYOR Nuclease
1. Une fois que l'échantillon PCR est considéré d'une qualité et d'une quantité suffisantes,
effectuez la digestion SURVEYOR Nuclease telle que décrite ci-dessous.
2. Décongelez les tubes contenant la 0,15 M MgCl2 Solution et le SURVEYOR Enhancer
Cofactor sur de la glace.
3. Ajoutez 10,0 µL de chaque matrice amplifiée par PCR dans un nouveau tube de 0,2 mLPCR ou dans le puits d'une plaque de 96-puits.
4. Préparez un mélange frais de 0.15 M MgCl2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor,
SURVEYOR Enhancer W2 et SURVEYOR Nuclease W (mélange SURVEYOR Nuclease).
Utilisez le tableau ci-dessous comme guide pour préparer un Mélange Maître de digestion
SURVEYOR Nuclease pour l'analyse d'échantillons multiples. L'exemple ci-dessous comporte les
volumes pour un Mélange Maître de 10 échantillons.
Prendre en compte qu'un volume de Mélange Maître légèrement supérieur à ce calcul sera
nécessaire pour remédier à toute perte survenant pendant le pipetage.
Nombre de Réactions de Digestion SURVEYOR
Nuclease:
Calcul du Volume:
0.15 M MgCl2 Solution (µL)
SURVEYOR Enhancer Cofactor (µL)
SURVEYOR Enhancer W2 (µL)
SURVEYOR Nuclease W (µL)
Volume total du Mélange Maître:
Ajoutez 5 µL de Mélange Maître SURVEYOR Nuclease
à chaque amplifié par PCR (µL)
échantillon
Volume de Réactions de Digestion SURVEYOR
Nuclease total:
10
10,0
10,0
10,0
20,0
50,0
10,0
15,0
a. Centrifugez chaque réactif avant de l'utiliser.
b. Vortexez légèrement chaque réactif avant de le pipeter; le centrifuger brièvement
pendant ~10 secondes après chaque étape de vortex.
c.
Pour chaque digestion, ajoutez les composants suivants à un tube de 0,2 mL-PCR (ou
plus grand) pour micro-centrifuge.
1,0 µL 0.15 M MgCl2 Solution (PN 708027)
1,0 µL SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049)
1,0 µL SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161)
2,0 µL SURVEYOR Nuclease W (PN 710160)
Ou ajoutez 5 µL de Mélange Maître préparé comme indiqué dans le tableau cidessus.
5. Vortexez légèrement le Mélange Maître de digestion SURVEYOR Nuclease pendant 10
secondes à petite vitesse.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 17
12 Consignes étape par étape
6. Centrifugez le Mélange Maître de digestion SURVEYOR Nuclease pendant 10 secondes
à petite vitesse.
7. Placez le Mélange Maître de digestion SURVEYOR Nuclease sur de la glace jusqu'à
utilisation.
Remarque: Le Mélange Maître de digestion SURVEYOR Nuclease préparé à l'Étape 7
doit être utilisé immédiatement car SURVEYOR Nuclease W se désactive au fil du temps
en présence des autres composants du Mélange Maître de digestion SURVEYOR
Nuclease Digest Master Mix.
8. Pipetez un aliquot de 5,0 µL du Mélange Maître SURVEYOR Nuclease dans chaque tube
ou puits contenant 10,0 µL d'aliquot de produit amplifié par PCR (voir Étape 3 ci-dessus).
9. Lorsque le pipetage est terminé, centrifugez les tubes de 0,2 mL-PCR ou la plaque de 96
puits pendant for 10 secondes.
10. Vortexez doucement les tubes de 0,2 mL-PCR ou la plaque de 96 puits pendant for 10
secondes.
11. Centrifugez pendant 10 secondes à petite vitesse (cette étape est particulièrement
importante si la digestion se produit dans un appareil sans couvercle chauffé).
12. Incubez à 42 °C pendant 30 minutes.
13. Ajoutez 1,0 µL SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) dans chaque tube ou puits et
vortexez délicatement (le volume total de réaction SURVEYOR Nuclease est de 16,0 µL).
Astuce: les produits de digestion SURVEYOR peuvent être conservés à ≤ -20 ºC
pendant une semaine maximum.
14. Chargez les échantillons digérés sur un système DHPLC.
Remarque: Pour obtenir des suggestions de paramètres de gradients utilisables sur le
système DHPLC pour analyser les échantillons digérés SURVEYOR Nuclease, veuillez
consulter http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kitseu/dhplcsystemsettings
13 Procédures de contrôle
13.1 Contrôle qualité du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD
Des ADN plasmidiques de contrôle sont compris dans le kit pour permettre des contrôles de
qualité à des étapes spécifiques de la procédure de test. Pour le Protocole d'amplification, ces
contrôles fournissent le moyen d'assurer que les mélanges maîtres soient correctement préparés
et que l'amplification fonctionne correctement. Des contrôles sans matrice (d'où de l'eau est
ajoutée à la place de la matrice d'ADN) sont également nécessaires pour vérifier la contamination
possible de composants du kit par toute matrice d'ADN étrangère.
Au stade de digestion SURVEYOR Nuclease, les amplicons issus de ces ADN plasmidiques de
contrôle fournissent un moyen efficace pour vérifier que les conditions de réaction de clivage
(conditions d'incubation et de préparation du Mélange Maître de digestion SURVEYOR Nuclease)
étaient satisfaisantes. Au stade de l'analyse, les chromatogrammes du système DHPLC des
amplicons de contrôle digérés SURVEYOR Nuclease permettent d'évaluer l'endroit où les pics des
produits de clivage correspondant aux mutations des exons 3 et 4 de KRAS, même à faible
niveau, vont éluer (voir les Figures 4-6). Il se peut que les pics des produits de clivage
correspondant à d'autres mutations des Exons 3 et 4 de KRAS éluent dans des positions
légèrement différentes.
Si les amplicons PCR ne correspondent pas aux résultats obtenus lors du Contrôle Qualité des
Produits de PCR, consultez l'Appendice B - Guide de Résolution des Problèmes ou contactez
le service d'assistance technique Transgenomic avant de passer aux étapes suivantes de
l'analyse des échantillons.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 18
13 Procédures de contrôle
13.2 Utilisation des ADN plasmidiques de contrôle
Ce kit est fourni avec quatre ADN de contrôle:
KRAS Control Wild-Type; PN 710131
KRAS Positive Control Exon 3; PN 710136
KRAS Positive Control Exon 4A; PN 710137
KRAS Positive Control Exon 4B; PN 710138
Ces ADN de contrôle sont des plasmides avec inserts. Les Positive Control contiennent chacun
deux plasmides: un mélange du KRAS Control Wild-Type et un clone de mutation différent du
Wild-Type au niveau d'une seule paire de bases. Les contrôles sont fournis dans des tubes
5
différents, chacun à une concentration de 10 copies/µL.
Les amorces KRAS Exons 3 & 4 Forward et Reverse PCR nécessaires à l'amplification par PCR
sont fournies séparément dans le kit. Veuillez suivre les instructions figurant dans le Protocole
d'amplification, Digestion avec SURVEYOR Nuclease et l'Analyse des KRAS Exons 3 et 4
avec SURVEYOR Nuclease pour l'utilisation de ces contrôles.
NOUS RECOMMANDONS VIVEMENT QUE LES UTILISATEURS PROCÈDENT À DES
EXPERIMENTATIONS AVEC LES CONTRÔLES SEULS AVANT D'ANALYSER LES
ÉCHANTILLONS GÉNOMIQUES
14 Interprétation des résultats
14.1 Analyse de KRAS Exons 3 et 4 avec SURVEYOR Nuclease
À des fins de comparaison et de contrôle, effectuez TOUJOURS une digestion SURVEYOR
Nuclease sur chacun des contrôles (Wild-Type et Positive Control), sur un contrôle sans matrice et
sur des matrices d'ADN, en réalisant cette vérification sur la même plaque d'échantillons du
Système DHPLC.
Au stade de digestion SURVEYOR Nuclease, les amplicons issus de ces ADN de contrôle
plasmidiques valident que les conditions de réaction de clivage (conditions d'incubation et de
préparation du mélange SURVEYOR Nuclease) sont satisfaisantes. Au stade de l'analyse, les
traces des amplicons de contrôle digérés par SURVEYOR Nuclease du Système DHPLC
permettent d'évaluer l'endroit où les fragments d'ADN résultant du clivage au niveau des sites de
mésappariement des mutations spécifiques, même à faible niveau, vont éluer (voir Figures 4-6).
Si soit les amplicons PCR soit les fragments de clivage SURVEYOR Nuclease dérivés des ADN
de contrôle ne correspondent pas aux résultats affichés, consultez l'Appendice B - Guide de
Résolution des Problèmes ou contactez l'assistance technique Transgenomic avant de passer
aux étapes suivantes de l'analyse des échantillons.
Les exemples fournis ci-dessous ne sont qu'indicatifs et ne doivent PAS être utilisés pour
déterminer l'identité d'aucune mutation. La confirmation de l'identité de toute mutation est
nécessaire afin de déterminer sans aucune équivoque la présence d'un changement spécifique de
bases au niveau des exons 3 ou 4 du gène KRAS.
SURVEYOR Nuclease clive au niveau de tous les mésappariements résultant de la formation
d'hétéroduplexes entre l'ADN Wild-Type et l'ADN mutant, et non pas uniquement au niveau des
mutations des Exons 3 ou 4. SURVEYOR Nuclease confirme la présence éventuelle d'un
mésappariement. L'identification du changement de base spécifique à la mutation est nécessaire
afin de connaître la situation d'activation du gène KRAS, et elle doit être confirmée par une autre
méthode telle que le séquençage.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 19
14 Interprétation des résultats
Procédures de contrôle
14.2 Lecture des données d’analyse SURVEYOR Scan
Inspectez les électrophérogrammes pour comparer ceux du Wild-Type et du Positive Control avec
ceux de l'échantillon. Vérifiez si l'électrophérogramme de l'échantillon est similaire ou différent du
modèle du Wild-Type. S'il est différent, l'échantillon devra être considéré “SURVEYOR Scan
Positif” et envoyé pour être analysé par séquençage de l'ADN. Voir les Figures 4-6 pour y trouver
des exemples et l'Appendice B – Guide de Résolution des Problèmes, Problèmes 7 et 8 pour
y trouver des exemples de ce genre d'échantillons.
Tout échantillon présentant un modèle SURVEYOR Nuclease diffèrent du Wild-Type devra faire
l'objet d'une confirmation de séquence, même s'il n'est pas identique au Positive Control. Voir
Appendice B – Guide de Résolution des Problèmes, Problème 7 y trouver un exemple de ce
genre d'échantillon.
Lorsque cela vous est demandé, zoomez sur la région d'intérêt et superposez les
électrophérogrammes de l'échantillon avec le Wild-Type Control de cet amplicon.
Notez toute différence entre le contrôle Wild Type Control et l'échantillon analysé.
Important! Après avoir minutieusement examiné chaque échantillon, l'examinateur de données
pourra voir si des échantillons adjacents sur la plaque d'analyse possèdent des résultats positifs
identiques SURVEYOR Scan. Si des résultats positifs identiques sont observés, ils peuvent être le
résultat d'une contamination entre échantillons ou entre contrôles et l'analyse doit être répétée.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 20
14 Interprétation des résultats
14.3 Exemples de résultats
Des exemples de résultats obtenus en utilisant le SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE
IVD avec le DHPLC sont indiqués aux Figures 4-6 ci-dessous. Dans ces exemples, en utilisant
®
des WAVE 4500 Systems avec des détecteurs UV et de fluorescence, le processus indiqué dans
la section Consignes étape par étape a été observé à la lettre. Pour obtenir des suggestions de
paramètres de gradients utilisables sur le système DHPLC pour analyser les échantillons digérés
SURVEYOR Nuclease, veuillez consulter http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/geneticanalysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings.
Figure 4A
Flux DHPLC
par
Q61H donne des
fragments de
65 et 135-bp
KRAS Control Wild-Type
KRAS Positive Control Exon 3
1, KRAS Exon 3
Amplicon Échantillon
non
Échantillon 2, KRAS Exon 3
clivé de
200-bpÉchantillon 3, KRAS Exon 3
Étalon de taille d'ADN
Amplicon
non clivé de
200-bp
Lavage
DHPLC
Figure 4B
Q61H donne des
fragments de
65 et 135-bp
KRAS Control Wild-Type
KRAS Positive Control Exon 3
1, KRAS Exon 3
Amplicon Échantillon
non
Échantillon 2, KRAS Exon 3
clivé de
200-bpÉchantillon 3, KRAS Exon 3
Étalon de taille d'ADN
Amplicon
non clivé de
200-bp
Figures 4A et 4B: Analyse WAVE DHPLC par détection UV (Figure 4A) et fluorescence
(Figure 4B) des produits de la digestion SURVEYOR Nuclease de KRAS Positive Control
Exon 3 et KRAS Control Wild-Type et ADN de CCR isolé de sections de FFPE. Au moment de
l'examen visuel des chromatogrammes, les échantillons digérés doivent être comparés au WildType Control (ligne marron). Le KRAS Positive Control Exon 3 (ligne verte) est un mélange de
plasmides G61H Wild-Type et mutant qui produisent des pics de digestion de 65 et 135 bp; ce
contrôle indique que l'étape de digestion SURVEYOR Nuclease fonctionne correctement et
indique la région du chromatogramme qui doit être soumise à une inspection visuelle pour
déterminer si l'échantillon concerné doit faire l'objet d'une analyse de séquençage. Si l'on compare
les modèles de digestion des Échantillons 1-3 avec l'électrophérogramme non digéré du WildType, il est évident que l'échantillon 2 (ligne noire) a une mutation probable et doit être soumis à
un séquençage pour vérifier la présence ou l'absence d'une mutation au codon concerné. Les
échantillons 1 et 3 (ligne bleue et rouge) ont des chromatogrammes similaires à ceux observés
pour le Wild-Type Control et n'ont pas besoin d'être soumis à une analyse de séquençage d'ADN.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 21
14 Interprétation des résultats
Notez que le résultat du séquençage constitue le résultat définitif étant donné qu'il peut y avoir
d'autres mutations non pertinentes produisant les mêmes tailles de fragment.
Figure 5A
Flux DHPLC
par
K117N donne
des fragments
de 80 et 88-bp
Figure 5B
K117N donne
des fragments
de 80 et 88-bp
Lavage
KRAS
Control Wild-Type
KRASDHPLC
Positive Control Exon 4A
Amplicon Échantillon
non
1, KRAS Exon 4A
clivé de
Échantillon 2, KRAS Exon 4A
200-bpÉtalon de taille d'ADN
Amplicon
non clivé de
168-bp
Lavage
KRAS
Control Wild-Type
KRASDHPLC
Positive Control Exon 4A
Amplicon Échantillon
non
1, KRAS Exon 4A
clivé de
Échantillon 2, KRAS Exon 4A
200-bpÉtalon de taille d'ADN
Amplicon
non clivé de
168-bp
Figures 5A et 5B: Analyse WAVE DHPLC par détection UV (Figure 5A) et fluorescence
(Figure 5B) des produits de la digestion SURVEYOR Nuclease de KRAS Positive Control
Exon 4A et KRAS Control Wild-Type et ADN de CCR isolé de sections de FFPE. Au moment
de l'examen visuel des chromatogrammes, les échantillons digérés doivent être comparés au
Wild-Type Control (ligne verte). Le KRAS Positive Control Exon 4A (ligne bleu) est un mélange de
plasmides K117N Wild-Type et mutant qui produisent des pics de digestion de 80 et 88 bp; ce
contrôle indique que l'étape de digestion SURVEYOR Nuclease fonctionne correctement et
indique la région du chromatogramme qui doit être soumise à une inspection visuelle pour
déterminer si l'échantillon concerné doit faire l'objet d'une analyse de séquençage. Si l'on compare
les modèles de digestion des Échantillons 1 et 2 avec l'électrophérogramme non digéré du WildType, il est évident que l'échantillon 1 (ligne rouge) a une mutation probable et doit être soumis à
un séquençage pour vérifier la présence ou l'absence d'une mutation au codon concerné.
L'échantillon 2 (ligne noire) a des chromatogrammes similaires à ceux observés pour le Wild-Type
Control et n'a pas besoin d'être soumis à une analyse de séquençage d'ADN. Notez que le
résultat du séquençage constitue le résultat définitif étant donné qu'il peut y avoir d'autres
mutations non pertinentes produisant les mêmes tailles de fragment.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 22
14 Interprétation des résultats
Figure 6A
Flux DHPLC
par
Amplicon
non clivé de
194-bp
Lavage
KRAS
Control Wild-Type
DHPLC
KRAS
Control Exon 4B
Amplicon non
Échantillon 1, KRAS Exon 4B
clivé deÉchantillon 2, KRAS Exon 4B
200-bp Échantillon 3, KRAS Exon 4B
Étalon de taille d'ADN
Lavage
DHPLC
A146T donne
des fragments
de 78 et 116-bp
Figure 6B
A146T donne
des fragments de
78 et 116-bp
Lavage
KRAS
Control Wild-Type
DHPLC
KRAS
Control Exon 4B
Amplicon non
Échantillon 1, KRAS Exon 4B
clivé deÉchantillon 2, KRAS Exon 4B
200-bp Échantillon 3, KRAS Exon 4B
Étalon de taille d'ADN
Amplicon
non clivé de
194-bp
Figures 6A et 6B: Analyse WAVE DHPLC par détection UV (Figure 6A) et fluorescence
(Figure 6B) des produits de la digestion SURVEYOR Nuclease de KRAS Positive Control
Exon 4B et KRAS Control Wild-Type et ADN de CCR isolé de sections de FFPE. Au moment
de l'examen visuel des chromatogrammes, les échantillons digérés doivent être comparés au
Wild-Type Control (ligne marron). Le KRAS Positive Control Exon 4B (ligne vert foncé) est un
mélange de plasmides A146T Wild-Type et mutant qui produisent des pics de digestion de 78 et
116 bp; ce contrôle indique que l'étape de digestion SURVEYOR Nuclease fonctionne
correctement et indique la région du chromatogramme qui doit être soumise à une inspection
visuelle pour déterminer si l'échantillon concerné doit faire l'objet d'une analyse de séquençage. Si
l'on compare les modèles de digestion des Échantillons 1 et 3 avec l'électrophérogramme non
digéré du Wild-Type, il est évident que l'échantillon 3 (ligne rouge) a une mutation probable et doit
être soumis à un séquençage pour vérifier la présence ou l'absence d'une mutation au codon
concerné. Les échantillons 3 et 3 (lignes noire et vert clair) ont des chromatogrammes similaires à
ceux observés pour le Wild-Type Control et n'ont pas besoin d'être soumis à une analyse de
séquençage d'ADN. Notez que le résultat du séquençage constitue le résultat définitif étant donné
qu'il peut y avoir d'autres mutations non pertinentes produisant les mêmes tailles de fragment.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 23
15 Caractéristiques et performance
15 Caractéristiques et performance
15.1 Seuil de détection des mutations avec les kits SURVEYOR Scan
La validation des kits SURVEYOR Scan pour les plateformes DHPLC en utilisant des clones
plasmidiques de toutes les mutations indiquées a montré que les pics SURVEYOR Nuclease
peuvent être détectés dans un mélange mutant de 2-5% dans un fond de type Wild-Type.
Le séquençage systématique des brins sens et anti-sens ne parvient souvent pas à détecter les
mutations dans les mélanges d'ADN Wild-Type dont le niveau est inférieur à 10%. Conjointement
aux résultats SURVEYOR Nuclease il est possible d'interpréter avec plus de confiance les
électrophérogrammes du séquençage des mutations de 5-10%.
Si l'analyse d'un échantillon montre un résultat SURVEYOR Scan positif mais sans
mutation KRAS ou NRAS détectable par le séquençage de l'ADN, nous vous conseillons
d'enregistrer un résultat «Aucune Variation Détectée». Voir «Considérations Relatives aux
Flux de Travail» pour en savoir plus.
15.2 Confirmation par séquençage
Procédez à un séquençage de confirmation pour tous les résultats SURVEYOR Scan positifs pour
déterminer l'identité de la séquence des mutations de l'exon 3 ou 4 de KRAS.
Ne procédez pas au séquençage de confirmation lorsque le SURVEYOR Scan a présenté un
résultat négatif. L'échantillon peut être relevé comme étant Wild-Type ou Aucune variation
détectée.
Les amorces Universal Sequencing Primer comprises dans ce kit sont prévues pour le
séquençage de confirmation. Il s'agit de l'amorce sens PN 710153F (Universal Sequencing Primer
1) et anti-sens PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2).
15.3 Limites du kit
Des contaminations provenant de l'extraction des échantillons enrobés de paraffine et fixés au
formol sont susceptibles d'interférer avec les procédures d'amplification par PCR et de digestion
SURVEYOR Nuclease. Les procédures de contrôle qualité présentées dans le Contrôle Qualité
des Produits de PCR servent à vérifier que l'ADN extrait convienne pour être utilisé avec ce kit.
Ce kit a été validé pour être utilisé avec des échantillons cancéreux de tumeurs colorectales
provenant de biopsie, enrobés de paraffine et fixés au formol. Il n'a pas été validé pour être utilisé
avec d'autres types de cancer ou avec des échantillons de biopsie frais ou congelés.
Pour résoudre les problèmes liés aux résultats non standard et pour obtenir des détails sur les
facteurs susceptibles d'avoir un effet sur cette analyse, reportez-vous à l'Appendice B - Guide de
Résolution des Problèmes, ci-dessous.
Prendre les précautions nécessaires pour éviter les rémanences et contaminations croisées avec
ce kit. Le niveau extrême de sensibilité de la méthode d'analyse nécessite de prendre les
précautions particulières suivantes:

Assurez-vous que tous les échantillons soient manipulés de manière à éviter toute
contamination croisée entre échantillons

Travaillez à un poste de travail PCR ou autre espace de travail adapté où la zone de
travail n'est pas exposée aux rayons UV avant de préparer les réactions d'amplification
par PCR.

Utilisez une zone ou pièce de travail PCR séparée pour ouvrir les échantillons après leur
amplification par PCR afin de procéder au contrôle qualité par électrophorèse en gel.

La préparation de la digestion SURVEYOR Nuclease doit toujours être effectuée dans une
pièce différente de travail PCR que celle dans laquelle la préparation PCR initiale a eu
lieu.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 24
15 Caractéristiques de performance


Assurez-vous que les contrôles plasmidiques du kit soient manipulés séparément des
échantillons de test à toutes les étapes de l'analyse.
o
Vérifiez que toutes les solutions et puits de contrôles sans matrice et
d'échantillons d'ADN soient bouchés avant d'ouvrir les tubes contenant le contrôle
plasmidique d'ADN.
o
OCCUPEZ-VOUS DES CONTRÔLES EN DERNIER. Ajoutez le contrôle
plasmidique d'ADN dans les tubes approprié uniquement après que TOUS les
tubes des contrôles sans matrice et puits d'échantillons aient été rebouchés.
o
Après avoir bouché les tubes de contrôle d'ADN, essuyez TOUS les tubes et
capuchons avec un agent destructeur d'ADN (tel que de la Javel à 10%) avant de
les transférer dans un autre endroit.
Assurez-vous que le pipetage des échantillons dans les plaques de 96 puits ne donne pas
lieu à une contamination des échantillons des puits adjacents suite à des éclaboussures
durant le mélange ou si vous oubliez de changer les embouts de pipette.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 25
Appendice A
Appendice A
A.1 Schéma de configuration des plaques pour les kits SURVEYOR Scan
Le schéma de configuration des plaques suggéré ci-dessous sert à effectuer l'analyse
SURVEYOR Scan des sept Exons KRAS et NRAS en simultané sur 10
échantillons.
Légende: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutation; NTC = Contrôle sans matrice.
A.2 Empreintes de l'ADN de contrôle
Les séquences avec une “Empreinte” sont indiquées ci-dessous.
Légende: Les régions où se trouvent les mutations les plus communes figurent en Violet. La
séquence en MAJUSCULES correspond aux bases codantes; les bases non-codantes
sont en minuscules.
Les contrôles ont une “empreinte” génétique indiquée en Jaune; cette variation de la
séquence KRAS Wild-Type dans une région où des mutations ne sont pas prévues peut
être utilisée pour résoudre les contaminations éventuelles de l'échantillon par Positive
Control. Voir Appendice B - Guide de Résolution des Problèmes, Problème 8, pour
y trouver un exemple d'une trace de contamination de ce genre de SURVEYOR Scan.
“Empreinte” du KRAS Exon 3
Taille de l'amplicon : 200 bp. Pour la création de l'empreinte génétique du contrôle
plasmidique de l'Exon 3 KRAS, ACC est changé en TGG. Les codons 59 et 61 sont également
mis en évidence ci-dessous.
GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG
“Empreinte” du KRAS Exon 4A
Taille de l'amplicon: 168 bp. Pour la création de l'empreinte génétique du contrôle plasmidique
de l'Exon 4A KRAS, AGA est changé en TCT. Le codon 117 est également mis en évidence cidessous.
AATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC
“Empreinte” du KRAS Exon 4B
Taille de l'amplicon: 194 bp. Pour la création de l'empreinte génétique du contrôle plasmidique
de l'Exon 4B KRAS, agt est changé en tca. Le codon 146 est également mis en évidence cidessous.
TCAGCAAAGACAAGACAGgtatcaaac
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 26
Appendice A
A.3 Exigences du système HPLC en phase dénaturante (DHPLC)
A.3.1 Spécifications de la DHPLC pour les applications SURVEYOR Scan
Les spécifications suivantes correspondent aux exigences minimum en termes de caractéristiques
du système DHPLC pour effectuer les tests des kits KRAS et NRAS SURVEYOR Scan.
Système de distribution de gradient de solvant à haute performance
 Capacité de gradient binaire; haute pression ou basse pression
 Contrôle du débit, plage minimum: 0,7 – 1,6 mL/min
 Précision du débit: ± 2% (H2O à 20 ºC)
 Dégazeur de solvant
Échantillonneur automatique
 Régulateur thermique pour refroidir les plaques, programmable: 4 à 14 ºC
 Volume d'injection: 5 X -50 µL
Cartouche de séparation
 Conçue pour la séparation des fragments d'ADN double brin, tailles de fragments de
50 bp à 250 bp
Four à régulation thermique de haute précision
 Plage des températures: 40 à 70 ºC
 Précision thermique: ± 0,2 ºC
 Reproductibilité des températures: ± 0,2 ºC
 Linéarité sur la plage complète des températures: ± 2,0 ºC
Alternative de détection 1
 Détecteur UV/VIS
 Gamme de longueurs d'ondes: 190 – 700 nm
 Source UV: Lampe au deutérium
Alternative de détection 2
 Détecteur de fluorescence
 Gamme de longueurs d'ondes: excitation: 200 – 850 nm; émission: 250 – 900 nm
 Source de fluorescence: Lampe au xénon de 150 W

Pompe à colorant fluorescent
 Débit fixe à 0,1 mL/min – 20%/+50%
 Débit pulsé bas
A.3.2 Fonctionnement du système
Pour la programmation et le fonctionnement du système DHPLC consultez et observez les
recommandations du fabricant pour l'analyse des fragments d'ADN à deux brins dont la taille se
situe entre 50 bp et 250 bp, en ciblant une discrimination de taille de 10 bp ou mieux. Il s'agit de
l'intervalle de tailles des fragments après la digestion SURVEYOR Nuclease en utilisant ce kit.
Pour obtenir des suggestions de paramètres de gradients utilisables sur le système DHPLC pour
analyser les échantillons digérés SURVEYOR Nuclease, veuillez consulter
http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kitseu/dhplcsystemsettings
A.3.3 Entretien des cartouches DHPLC
Observer les recommandations du fabricant pour l'entretien des cartouches DHPLC.
Remarque: l'analyse des réactions SURVEYOR Nuclease nécessitera des protocoles de
nettoyage plus fréquents et plus rigoureux que ceux qui sont préconisés pour l'analyse
d'échantillons PCR standard. Consultez les directives applicables à votre système DHPLC pour de
plus amples détails.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 27
Appendice A
A.4 Configuration du laboratoire pour les tests PCR
Pour produire des résultats de PCR fiables et sans contamination, observer les bonnes pratiques
de laboratoire au moment de configurer le laboratoire.
Lors de la planification de la disposition du laboratoire, tenir compte de la nécessité de séparation
spatiale des activités de préparation de l'amplification des activités post-amplification par PCR. Il
est important de séparer (i) isolation de l'ADN; (ii) amplification PCR; et (iii) activités post-PCR
telles que l'ouverture des tubes contenant les échantillons amplifiés en préparation pour les tests
sur gels et la préparation d'autres tests tels que test de digestion SURVEYOR Nuclease et
séquençage d'ADN.
Il est également important de disposer de fournitures et de matériels de laboratoire spécialement
destinés à chaque zone et ne pouvant être utilisés que dans cette zone. Le nettoyage des
surfaces avec de l'eau de Javel à 10% (v/v) fraîchement constituée chaque semaine, favorisera
l'élimination des fragments d'ADN ≤ 500 bp comme matrices pour la PCR. De plus, il pourra être
utile de traiter les éléments en plastique et les solutions avec une exposition de 7–10 minutes à
une lumière UV à ondes courtes en utilisant un dispositif de réticulation par rayonnement UV.
Remarque: les enzymes et ADN à amplifier ne devront pas être traités à la lumière UV.
Le port de vêtements de protection, le changement fréquent des gants et le lavage des mains
gantées avec la solution d'eau de Javel à 10% (v/v) avant de prendre place à un poste de travail
sont des gestes susceptibles de contribuer largement à réduire les risques de contamination.
Au minimum, il sera nécessaire d'avoir recours à une configuration similaire à la disposition à deux
pièces du diagramme ci-dessous spécifiquement conçue pour la PCR et l'analyse avec
SURVEYOR Nuclease.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 28
Appendice A
A.5 Références Documentaires
1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix
(panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer.
http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728
®
2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate
response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer.
Clin Cancer Res. 19 1902-12
3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients
with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA
304 1812-20
4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic
colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to
panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65
5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wildtype metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR
efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9
6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to
cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal
cancer. Br J Cancer 101 715-21
7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the
efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal
cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62
8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702707
9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib
resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6
10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in
haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9
11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant
resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706
Voir également http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf pour y trouver des
références à propos de SURVEYOR Nuclease et de ses applications.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 29
Appendice B
Appendice B
Guide de Résolution des Problèmes
L'utilisation efficace des kits SURVEYOR Scan à utiliser avec DHPLC dépend de la bonne
réalisation d'un certain nombre d'étapes. La plus essentielle d'entre elles étant l'amplification par
PCR permettant l’enrichissement spécifique d'ADN de taille uniforme en quantité suffisante pour
pouvoir être détecté après l'hybridation et le clivage. Cette étape dépend elle-même de la qualité
de l'échantillon initial. Il est déconseillé de réaliser l'analyse avec un ADN ne répondant pas aux
critères de qualité et de quantité indiqués.
Remarque: si c'est la première fois que vous utilisez SURVEYOR Nuclease, veuillez réaliser les
expériences indiquées au chapitre Utilisation des ADN plasmidiques de contrôle après avoir lu et
assimilé le chapitre Consignes étape par étape. Veuillez vous procurer les résultats des ADN
plasmidiques de contrôle avant de prendre contact avec le service d'assistance technique
Transgenomic.
Ce Guide de résolution des problèmes présente une liste de problèmes que vous êtes
susceptibles de rencontrer lors de l'utilisation des kits SURVEYOR Scan avec DHPLC, ainsi que
des suggestions sur la manière de les résoudre.
Reportez-vous au Manuel d'utilisation du système DHPLC pour obtenir des informations plus
détaillées sur le fonctionnement et l'entretien de l'appareil. Le manuel comprend des informations
de dépannage et explique les procédures spécifiques pour vérifier et entretenir la performance des
colonnes.
Problème 1 – Faible rendement PCR ou absence de produit PCR au cours
de l'analyse en gel d'agarose
FAIBLE
RENDEMENT PCR
Bon
Rende
-ment
PCR
Faible
PCR
Rende
-ment
Bande
d’ARN
CAUSE POSSIBLE
SOLUTION
Mauvaise qualité de
l'échantillon d'ADN
Répétez la purification d'ADN; revoyez la méthode
de purification utilisée. Si l'ADN extrait du FFPE
est trop fragmenté, des blocs alternatifs de FFPE
pourront s'avérer nécessaires.
Trop d'ARN dans
l'échantillon ce qui
provoque une
surestimation de la
concentration d'ADN.
Répétez le traitement RNase de l'échantillon
d'ADN et repurifiez l'ADN.
Thermocycleur non
calibré
Calibrez le thermocycleur
Échantillon insuffisant
Augmentez la quantité d'échantillon.
Remarque: Il faut utiliser de l'ADN de grande qualité issu du FFPE. L'ADN doit avoir une
concentration de 25 ng/µL comme déterminé par l'absorption à 260 nm, avoir un ratio
d'absorption de 260/280 nm supérieur à 1,8 et être supérieur à 90% d'ADN (à savoir pour
ainsi dire sans contamination d'ARNt et d'ARNr comme jugé par l'apparence du gel
d'agarose). Conservez les échantillons d'ADN entre -20 °C et -80 °C.
L'analyse de la matrice d'ADN extraite à partir de tissu enrobé de paraffine nécessite la prise de
certaines précautions. L'ADN extrait peut être traité avec de l'uracile-ADN-glycosylase pour éviter
l'amplification de fragments d'ADN contenant des résidus C désaminés. Souvent, un pourcentage
d'absorption élevé du de matière A260 extraite à partir de tissu enrobé de paraffine n'est pas bien
amplifié lors de la PCR. L'utilisation d'une quantité supérieure d’ADN de départ aide alors souvent à
obtenir un produit d'amplification convenable. Il serait également possible de choisir des sections
tumorales FFPE présentant un haut pourcentage de cellules tumorales. Il serait aussi possible
d'avoir recours à la microdissection, mais il s'agit d'une solution qui prend beaucoup de temps et
qui ne serait pas conseillée dans un cadre d'analyses en laboratoire générales.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 30
Appendice B
Problème 2 – Produits de PCR multiples au cours de l'analyse en gel
d'agarose
PRODUITS DE PCR
MULTIPLES
Bon
Rende
-ment
PCR
PCR à
Bandes
Multiples
CAUSE POSSIBLE
SOLUTION
Température d'annelage
trop basse
Contrôlez l’étalonnage du
thermocycleur
Remarque: La PCR doit conduire à une production suffisamment élevée (supérieure à 20 ng/µL)
d'une SEULE espèce amplifiée de taille correcte. L’enzyme DNA Polymerase et le tampon DNA
Polymerase 10X PCR Buffer fournis avec ce kit doivent être utilisés pour la PCR. Les amplicons
issus des contrôles devront être digérés avec SURVEYOR Nuclease et analysés pour exclure le
bruit de fond parasite par comparaison visuelle des profils d’électrophérogramme (voir Exemples
de Résultats, Figures 4-6). Vérifiez chaque produit d'ADN amplifié par électrophorèse sur gel
d'agarose (ou par l'analyse du Système DHPLC) avant la digestion pour vous assurer qu'il
s'agisse bien d'une seule espèce de la taille attendue.
Problème 3 – Pas de produits de clivage observés lors de l'analyse après
traitement SURVEYOR Nuclease des hétéroduplexes
PAS DE PRODUITS DE CLIVAGE
Position des
hétéroduplexes
manquants
CAUSE
POSSIBLE
SOLUTION
Proportion de
mésappariement
ciblée trop basse
Vérifiez le test en vous
servant des contrôles.
Formation
inefficace
d'hétéroduplexes
Suivez correctement la
procédure de PCR et
d'hybridation. Utilisez de
l'ADN fraîchement hybridé
par digestion SURVEYOR
Nuclease.
Effectuez une nouvelle
amplification PCR (1) en
utilisant la même quantité de
matrice d'ADN; (2) en
augmentant la quantité
d'ADN de départ; ou (3) en
isolant de l'ADN frais d'une
section de FFPE (la même
ou une section différente).
Pic d'homoduplexe
non coupé
SURVEYOR
Nuclease inactif
Procédez à la réaction
Positive Control pour vérifier
la performance de l'enzyme.
Utilisez uniquement des
Mélanges maître
SURVEYOR Nuclease
fraîchement préparés.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 31
Appendice B
Remarque: SURVEYOR Nuclease clive principalement au niveau des mésappariements des
hétéroduplexes. La proportion hétéroduplexes/homoduplexes de l'échantillon hybridé détermine la
taille du signal de digestion par l’enzyme SURVEYOR Nuclease. Si la mutation KRAS est
présente à une très faible concentration dans l'échantillon d'ADN génomique, il se peut que le
signal soit trop faible pour donner un résultat positif.
Il est important de veiller à inclure l'étape d'hybridation dans le programme du thermocycleur (voir
Protocole d'amplification) afin de maximiser l'efficacité de la formation d'hétéroduplexes. La
formation des hétéroduplexes est très irrégulière au cours des réactions par PCR standard.
Remarque: le Ratio signal/bruit est généralement suffisamment élevé pour détecter les mutations
présentes à un faible pourcentage dans la matrice d'ADN totale; il est possible de détecter même
2% d'ADN mutant. Les Figures 4-6 montrent les produits de la digestion générés avec les ADN
homoduplexes et hétéroduplexes du KRAS Positive Control (inclus dans ce kit) et les échantillons
FFPE sur un WAVE DHPLC 4500 System. Les produits du clivage sont clairement visibles sous la
forme de deux pics élués dont les tailles attendues peuvent être estimées par comparaison à un
marqueur de poids moléculaire pour ADN.
Attention: le contenu des tampons PCR disponibles dans le commerce varie sensiblement et
leurs formulations ne sont pas toujours définies par les fournisseurs. Plusieurs tampons ne SONT
PAS compatibles avec une digestion SURVEYOR Nuclease en raison de leur pH ou de la
présence d'additifs, d'agents tensio-actifs ou autres ingrédients exclusifs de ces fournisseurs. NE
PAS utiliser d'autres enzymes polymérase ou de tampons polymérase 10X que ceux qui
sont fournis dans ce kit.
Problème 4 – Bruit de fond élevé après traitement par SURVEYOR Nuclease
BRUIT DE FOND ÉLEVÉ
Flux
DHPLC
par
CAUSE POSSIBLE
SOLUTION
Étape d'hybridation
de qualité non
satisfaisante
Suivre les consignes
suivantes:
2. Répétez l'étape de
formation des
hétéroduplexes en
prenant soin de suivre la
procédure
recommandée, voir
12.7.1.
Lavage
DHPLC
Échantillon
dont la ligne
de référence
fait du bruit
1. Assurez-vous que la
concentration d'ADN se
trouve dans la fourchette
>25 ng/µL.
Quantité d'ADN trop
basse
Vérifiez le rendement et la
qualité de la matrice d'ADN
Produits de PCR non
spécifiques
Vérifiez le rendement et la
qualité de la matrice d'ADN
Le SURVEYOR
Enhancer W2 et/ou le
SURVEYOR
Enhancer Cofactor
ont perdu de leur
activité
Contrôlez la date de
péremption du kit.
Remarque: SURVEYOR Nuclease coupe également l'ADN à double brin à des endroits
d'appariement aléatoires. Ceci produit un bruit de fond après la digestion. Cette activité est
supprimée par l'activateur SURVEYOR Enhancer W2 et son Cofactor sans pour autant nuire à la
réaction de clivage de mésappariement. L'activateur SURVEYOR Enhancer W2 et le SURVEYOR
Enhancer Cofactor sont inclus dans ce kit et doivent systématiquement être utilisés.
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 32
Appendice B
Lorsque cette coupe se produit, elle génère des pics mineurs sur le Système DHPLC. La
comparaison du produit de digestion des contrôles homoduplexes avec les produits de digestion
des échantillons permettra de les identifier.
Problème 5 – Pics de digestion SURVEYOR Nuclease dans les contrôles
négatifs
PICS DE DIGESTION DANS LES CONTRÔLES
NÉGATIFS
Pics de digestion
de signal faible
dans le contrôle
Wild-Type
Flux DHPLC
Par
Pic
d'homoduplexe
non coupé
CAUSE POSSIBLE
SOLUTION
Contamination du
contenu du kit avec
par des contrôles
plasmidiques ou des
amplicons KRAS.
Jetez tous les
composants du kit
et utilisez un
nouveau kit.
Lavage
DHPLC
Contactez le service
d'assistance
technique
Transgenomic pour
discuter des causes
et sources de
contamination
potentielles.
Problème 6 – Résultats SURVEYOR Nuclease échoués
LA DIGESTION SURVEYOR NUCLEASE DES
POSITIVE CONTROLS A ÉCHOUÉ
Pas de pics
de digestion
clairs
Pic
d'homoduplexe
non coupé
CAUSE
POSSIBLE
SOLUTION
SURVEYOR
Nuclease n'a pas
été ajouté
Procédez à la
digestion d'un nouvel
échantillon
La digestion
SURVEYOR
Nuclease a été
effectuée à la
mauvaise
température
Procédez à la
digestion d'un nouvel
échantillon
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 33
Appendice B
Problème 7 – Pics inattendus dans le profit d’élution du produit de la
digestion SURVEYOR Nuclease
LA DIGESTION SURVEYOR NUCLEASE DES
POSITIVE CONTROLS A ÉCHOUÉ
Pic
d'homoduplexe
non coupé
CAUSE
POSSIBLE
Mutation
présente à un
site inhabituel
SOLUTION
Procéder au
séquençage de
l'échantillon pour
vérifier la
mutation
Pic de
digestion
inattendu
Flux DHPLC
par
Pics de
digestion
attendus
Lavage
DHPLC
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 34
Appendice B
Problème 8 – Contamination des échantillons avec les contrôles Positive
Control
Schémas de digestions pouvant indiquer la présence
d'une région marquée d'un mélange de contrôles
Positive Control et des hétéroduplexes Wild-Type
Mauvaise
technique
de pipetage
Échantillon 1
Échantillon 2
Échantillon 3
Région des Codons
12 & 13
Région d'empreinte du
contrôle
Échantillon 1
Aucune
variante
détectée dans
les Codons
12 & 13
Empreinte
détectée
CAUSE
POSSIBLE
SOLUTION
Il est important de
faire très attention à
éviter toute
contamination
croisée lors du
pipetage des
échantillons.
Vérifiez les régions
de la séquence de
l'empreinte de
contrôle pour
détecter toute
contamination
éventuelle au
Positive Control.
Échantillon 2
c.34G>T
p.G12C, 30%
Pas
d'empreinte
détectée
Échantillon 3
Aucune
variante
détectée dans
les Codons
12 & 13
Pas
d'empreinte
détectée
Consignes d'utilisation du SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD pour les Systèmes DHPLC Page 35
Informations relatives aux commandes
Informations relatives aux commandes
Numéro
du
produit
Nom du produit
Taille
710104
SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD
100 réactions
710106
SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD
100 réactions
710400
SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD
100 réactions
710077
CRC RAScan Combination Kit pour KRAS et NRAS Exons 2, 3
& 4 CE IVD
230 réactions
Coordonnées
Siège de la Société
Transgenomic, Inc.
12325 Emmet Street
Omaha
Nebraska 68164
Unites States of America
Bureau Européen
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40 Watt Road
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Glasgow G52 4RY
Unites Kingdom
N° de téléphone: (888) 233-9283*
Ou +1 (402) 452-5400
N° de fax:
+1 (402) 452-5401
E-mail: [email protected]
N° de téléphone: +44 141 892 8800
N° de fax:
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E-mail: [email protected]
*Pour l'Amérique du Nord uniquement
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Responsabilité de traduction
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au sujet de toute information contenue dans cette version traduite du manuel, se référer à la version anglaise Instructions
for Use for the SURVEYOR® Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD for DHPLC Systems – 482407(EN)
http://world.Transgenomic.com/files/literature/482407-EN.pdf et / ou contact Transgenomic à support @transgenomic.com.
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Licences, marques & droit d'auteur
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6,699,980, 6,391,557, 5,869,245, des brevets étrangers leur correspondant et d'autres brevets en instance. L'utilisation de
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et 5,487,972), aucun droit de reproduire aucune méthode brevetée et aucun droit de dériver aucun service commercial
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Document n°. 482407(FR) ver-04
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