Download 0〇 (12) 特許協力条約に基づいて公開された国際出願 (19

〇
0
(12) 特許協 力条約 に基づいて公開 された国際出願
(19)
世界知的所有権機関
国際事務局
(43) 国際公 開 曰
2011 年 6 月 9 日（
09.06.2011)
番 1 号丸の 内 M Y
P L A Z A (明治安 田
生 命 ビル ） 9 階 創 英 国 際 特 許 法 律 事 務 所
国際特 許分 類 ：
(51)
C12Q
1/68
(2006.01)
C12N
15/09
(2006.01)
Tokyo
(21)
国際 出願番号 ：
(22)
国際 出願 日：
(25)
国際 出願 の言語 ：
PCT/JP20
年
2010
12
(JP).
10/07 1727
(81)
月 3 曰（03. 12.2010)
日本語
指定 国 （
表示 の な い限 り、全 ての種 類の 国 内保
護 が 可 肯 ) : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,
BB,
BG,
BH,
CR, CU,
国際公 開の言語 ：
(26)
日本語
優 先権 デー タ：
特願 2009-27671 1 2 0 0 年
(30)
月 4 曰（04.12.2009)
12
GB,
JP
(84)
発 明者 ；お よび
発 明者/ 出願 人 （
米 国 につ い
(72)
GD,
BW,
BY,
DK,
DO,
CA,
DZ,
GM,
GT,
KG,
KM,
KN,
KP,
LS,
LU,
LY,
MA,
MD,
ME,
NI,
NO,
LT,
GE, GH,
BZ,
DM,
JP, KE,
MX,
出願 人 （
米 国 を除 く全 ての 指 定 国 につ い て)：学
校 沄 人 帝 ¾ 大 学 (TEIKYO
UNIVERSITY)
[JP/JP];
〒 1738605 東 京都 板橋 区加 賀 2 丁 目 1 1 番 1 号
Tokyo (JP). 久光製薬株 式会社 (HISAMITSU
PHAR
〒 8 4 10017 佐 賀
MACEUTICAL
CO., INC.)
[JP/JP];
県鳥栖巿 田代 大 官町 4 0 8 Saga (JP).
(71)
BR,
CZ, DE,
MY,
MZ,
RO,
NA,
NG,
HN,
PT,
RS, RU,
SC, SD,
SV,
SY, TH,
TJ, TM,
TN,
VC,
VN,
ZM,
ZA,
HR,
KR,
PL,
CH,
CL,
HU,
KZ,
ID,
LA,
MG,
NZ,
IL,
LC,
MK,
OM,
CO,
IN,
LK,
IS,
LR,
MN,
MW,
PE, PG, PH,
SE, SG, SK,
TR, TT,
CN,
EC, EE, EG, ES, FI,
SL,
TZ, UA,
UG,
SM,
ST,
US, UZ,
ZW.
指定 国 （
表示 の な い限 り、全 ての種 類の 広域保
護 が 可 肯^: ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW,
ユ ー ラ シア
MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW),
ョ一 ロッパ
(AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM),
(AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR,
の み): 稹 村 浩一
GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT,
〒 1920395 東 者 ノ乂
NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI
王子 巿 大 塚 3 5 9 学 校 法 人 帝 京 大 学 医真 菌
(BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR,
研 究セ ンタ一 内 Tokyo (JP). 宮嶋 良治 (MIYAJINE, SN, TD, TG).
〒 1920395 東 ¾ 都 八 王子巿
M A Yoshiharu)
[JP/JP];
大塚 3 5 9 学 校 法 人 帝 京 大 学 医真 菌研 究 セ 添付公 開書 類 ：
ン タ 一 内 Tokyo (JP). 度辺 晋 一 （
WATANABE
国際調 査報告 （
条約第 2 1 条 (3))
〒 1738606 東 京 都 板 橋 区加 賀 2 一
Shinich り[JP/JP];
丁 目 1 1 番 1 号 学校 法 人 帝 京 大学 医学 部 附 一
明細 書 の 別 個 の 部 分 と して 表 した配 列 リス ト
属病 院 内 Tokyo (JP).
(規則 5.2(a))
(75)
fMAKIMURA
KoichH
[JP/JP];
代 理 人 ：長 谷 川 芳 樹 ，外 （
HASEGAWA
Yoshiki
〒 1000005 東京者 千代 田区丸の 内二丁 目 1
(74)
et al);
(54)
Title:
(54)
発 明の名称 ：爪 白癬 の起 因菌の 同定用キ ッ トお よびその 同定方法
(57)
Abstract:
causative
species.
Disclosed
bacterium
Specifically
and can identify
the group
primer
i s at least one selected
probe
having
o f a primer
the nucleotide
for
o f nail
tinea
a causative
a primer
represented
sequence
consisting
represented
a causative
PCR method
b y SEQ
having
o f a probe
using
bacterium
b y a real-time
I D NO: 3 and a primer
the group
laentiiying
b y a real-time
set comprising
sequence
b y SEQ
from
a method
i s a kit for identiiying
bacterium
the nucleotide
represented
and
and accurately
disclosed
a causative
consisting
having
sequence
are a kit
rapidly
PCR
having
bacterium
a primer
o f nail tinea,
method,
wherein
the nucleotide
having
sequence
the nucleotide
which
tinea,
represented
can
specific
a primer
ldentiiy
b y SEQ
a primer
b y SEQ
represented
having
I D NO:4
b y SEQ
tne
t o a bacterium
set and a probe
set i s at least one selected
represented
set comprising
sequence
which
both
comprises
the primer
sequence
I D N O :2 and a primer
the nucleotide
o f nail
set and a probe
from
I D NO: l and a
the nucleotide
and the prove
I D NO:5
and a
b y SEQ I D NO: 6 .
要 約 ： 本発 明 は、菌種 特異 的な プライマ一 セ ッ トお よび プ ロー ブを用 い、 リアル タイム P C R 法 に
よ り起 因菌 を迅 速 か つ正確 に 同定 す る ことが で き る爪 白癬 の起 因菌の 同定用 キ ッ トお よび 同定 方法 を提
供 す る ことを 目的 とす る。 プライ マ一セ ッ トお よび プ ロー ブを含み 、 リアル タイム P C R 法 を用 いて爪
白癬 の起 因菌 を同定 す るた めの 同定 用キ ッ トで あ って 、 プライ マ一セ ッ トが 、配 列番号 1 の塩 基配 列 を
有す る プライマ一 と配 列番 号 2 の塩 基配 列 を有 す る プライ マ一 とか らな る プライマ一セ ッ ト、 お よび 、
配 列番 号 3 の塩 基配 列 を有 す る プライマー と配 列番号 4 の塩基 配 列 を有 す る プライ マ一 とか らな る ブラ
イマ一 セ ッ 卜か らな る群 よ り選択 され る少 な くと も一 つで あ り、 プ ロー ブが 、配 列番号 5 の塩 基配 列 を
有す る プ ロー ブ、 お よび、配 列番 号 6 の塩 基配 列 を有 す る プ ロー ブか らな る群 よ り選択 され る少 な くと
も一 つで ある、爪 白癬 の起 因菌 の 同定用キ ッ ト。
(57)
明
発 明の名称
細
書
：爪 白癬 の 起 因 菌 の 同 定 用 キ ッ トお よ び そ の 同 定 方 法
技術分野
[0001 ]
本 発 明 は 、 リア ル タ イ ム P C R 法 を 用 い た 爪 白癬 の 起 因 菌 の 同 定 用 キ ッ ト
お よびその 同定方法 に関す る。
背景技術
[0002]
爪 白癬 は 爪 の 真 菌 感 染 症 の 9 0 % 以 上 を 占 め て お り、 重 症 に な る と 爪 が 白
ま た は 黄 褐 色 に 変 色 し、 肥 厚 し、 爪 床 か ら離 れ て い く。 爪 白癬 の 起 因 菌 は 様
々 で あ る が 、 紅 色 白癬 菌 （トリ コ フ ィ トン っ レブ ル ム ） お よ び 毛 瘡 白癬 菌 （
トリ コ フ ィ トン
メ ン タ グ ロ フ ア イ テ ス ） の 2 菌 種 が 分 離 され た 起 因 菌 の 殆
ど を 占め て い る （
非 特 許 文 献 1 ) 。 爪 白癬 の 治 療 に は 、 テ ル ビナ フ イ ン 、 ィ
トラ コ ナ ゾ一 ル 、 グ リセ オ フ ル ビ ン 等 の 経 口 抗 真 菌 薬 や 、 イ ミ ダ ゾ一 ル 系 、
ァ リル ア ミ ン 系 、 ベ ン ジ ル ァ ミ ン 系 、 チ ォ カ ル バ ミ ン 酸 系 等 の 外 用 抗 真 菌 薬
が 用 い られ て い る 。 しか しな が ら、 爪 白癬 は 、 通 常 の 足 白癬 ま た は 体 部 白癬
に 比 べ て 完 治 しに く く、 特 に 既 存 の 外 用 抗 真 菌 薬 の 有 効 性 が 低 い と い う 問 題
点 が あ る 。 爪 白癬 の 治 療 効 果 を 向 上 させ る た め に は 、 起 因 菌 の 早 期 特 定 お よ
び 的確 な抗 真 菌剤 の選 定 が 不 可 欠 で あ る。
[0003]
爪 白癬 を 含 む 白癬 の 診 断 に は 、 患 部 か ら爪 や 角 質 等 の 試 料 を 採 取 し、 顕 微
鏡 で 観 察 して 菌 要 素 の 有 無 を 確 認 す る K O H 直 接 鏡 検 法 と 、 選 択 培 地 上 で 数
週 間 培 養 して コ ロ ニ ー ゃ 菌 の 微 細 構 造 を 観 察 す る こ と に よ り菌 種 を 同 定 す る
培 養 法 と が あ る 。 しか し、 K O H 直 接 鏡 検 法 に よ る 診 断 に は 熟 練 が 必 要 の う
え、基本 的 には菌種 を同定 で きな い。一方 、培養 法 は菌種 の 同定 はで きる も
の の 、 数 週 間 と い う長 い 期 間 を 要 し、 培 養 陽 性 率 も低 く、 さ ら に 形 態 学 的 な
同 定 に は 熟 練 を 必 要 とす る 。
[0004]
別 の 白癬 の 診 断 方 法 と して 、 例 え ば 、 爪 白癬 患 者 の 爪 甲 か ら抽 出 した 白癬
菌 ァ ク チ ン m R N A を リア ル タ イ ム P C R で 定 量 し 白癬 菌 の 検 出 と 菌 量 の 推
定 を試 み る方 法 が あ る （
非 特 許 文 献 2 ) 。 しか し、 この 方 法 は m R N A を 検
出 対 象 と して い るた め 取 扱 いの 利 便 性 に 欠 け る 。
[0005]
さ らに 、 爪 真 菌 症 の 起 因 菌 を正 確 に検 出 で き る診 断 法 と して 、 第 1 回 P C
R お よ び n e s t e d _ P C R を行 う方 法 が 開 示 され て い る （
特許 文献 1 )
。 しか し、 この 方 法 は 電 気 泳 動 を必 要 とす るた め 大 量 検 体 の 処 理 に は適 さな
い。
先行技 術 文献
特許 文献
[0006]
特 許 文 献 1 ：特 開 2 0 0 8 _ 0 6 7 6 0 5 号 公 報
非特 許 文献
[0007]
非 特 許 文 献 1 ：西 本 勝 太 郎 ：真 菌 誌
非 特 許 文 献 2 ：坪 井 良 治 ：臨 皮
5 7
4 7 : 1 0 3 —1 1 1,
(5 )
：9 4 - 9 7 ,
2 0 0 6
2 0 0 3
発 明 の概 要
発 明が 解 決 しょ う とす る課 題
[0008]
ウ ィ ル ス や 病 原 菌 の 検 出 に は リア ル タ イ ム P C R 法 を用 い る こ とが あ る 。
リア ル タ ィ ム P C R 法 は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラー と蛍 光 検 出器 を一 体 化 した 機
器 を用 い て P C R に よ る D N A の 増 幅 と蛍 光 に よ る増 幅 産 物 の 検 出 を 同 時 に
行 う手 法 で あ る 。 この 方 法 は 、 電 気 泳 動 に よ る増 幅 産 物 の 確 認 を必 要 と しな
いた め 、 簡 便 で か つ 迅 速 に結 果 が 得 られ 、 コ ン タ ミネ 一 シ ヨンの リス ク も低
い と い う利 点 が あ る 。 し力、し、 これ ま で 爪 白癬 の 起 因 菌 を リア ル タ イ ム P C
R 法 で 感 度 良 く定 量 的 に検 出
[0009]
同 定 す るた め の 方 法 は な か った 。
した が って 、 本 発 明 は 、 菌 種 特 異 的 な プ ラ イ マ 一 セ ッ トお よ び プ ロー ブ を
用 い 、 リア ル タ イ ム P C R 法 に よ り起 因 菌 を迅 速 か つ 正 確 に 同 定 す る こ とが
で き る 、 爪 白癬 の 起 因 菌 の 同 定 用 キ ッ トお よ び そ の 同 定 方 法 を提 供 す る こ と
を 目的 とす る 。
課 題 を解 決 す るた め の 手 段
[001 0 ]
本 発 明者 は 、 上 記 課 題 を解 決 す るた め 鋭 意 研 究 の 結 果 、 爪 白癬 の 起 因 菌 の
リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 に特 異 的 な プ ラ イ マ 一 セ ッ トお よ び プ ロ
— ブ を 用 い て 、 リア ル タ イ ム P C R を 行 う こ と で 迅 速 か つ 正 確 に 爪 白癬 の 起
因 菌 を 同 定 で き る こ と を 見 出 し、 本 発 明 の 完 成 に 至 った 。
[001
]
す な わ ち 、 本 発 明 は 、 プ ラ イ マ 一 セ ッ トお よ び プ ロー ブ を 含 み 、 リア ル タ
ィ ム P C R 法 を 用 い て 爪 白癬 の 起 因 菌 を 同 定 す る た め の 同 定 用 キ ッ トで あ つ
て 、 プ ラ イ マ ー セ ッ トが 、 配 列 番 号 1 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と配 列
番 号 2 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る プ ラ イ マ 一 セ ッ ト、 お よ び
、 配 列 番 号 3 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 4 の 塩 基 配 列 を 有 す
る プ ラ イ マ 一 とか らな る プ ラ イ マ 一 セ ッ 卜か らな る 群 よ り選 択 され る 少 な く
と も 一 つ で あ り、 プ ロー ブ が 、 配 列 番 号 5 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ロー ブ 、 お
よ び 、 配 列 番 号 6 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ロ一 ブ か らな る 群 よ り選 択 され る 少
な く と も 一 つ で あ る 、 爪 白癬 の 起 因 菌 の 同 定 用 キ ッ トを提 供 す る 。
[001 2 ]
配 列 番 号 1 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 2 の 塩 基 配 列 を 有 す
る プ ラ イ マ 一 とか らな る プ ラ イ マ 一 セ ッ 卜に よれ ば 、 真 菌 全 般 （u n i v e
I ) の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 の 全 長
r s a
（お よ そ 3 5 0 b p
) を 増 幅 す る こ とが で き 、 ま た 、 配 列 番 号 3 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー
と配 列 番 号 4 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る プ ラ イ マ ー セ ッ トに
よれ ば 、 主 な 起 因 菌 で あ る 紅 色 白癬 菌 （T r i c h o p h y t o n
ι c h o p h y t o n
お よ ひ 毛 瘡 曰獬 ¾ | ( 1
r u m )
m e n t a g r o
p h y t e s ) の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 の 一 部
b p )
[001 3 ]
r u b
（お よ そ 1 5 0
を 特 異 的 に 増 幅 す る こ とが で き る 。
配 列 番 号 5 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ロー ブ に よれ ば 、 毛 瘡 白癬 菌 の リポ ゾ 一
マ ル D N A の I T S 1 領 域 に特 異 的 に検 出 で き 、 配 列 番 号 6 の 塩 基 配 列 を有
す る プ ロー ブ に よれ ば 、 紅 色 白癬 菌 の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 に
特 異 的 に 検 出 す る こ とが で き る 。
[001 4 ]
した が っ て 、 本 発 明 の 同 定 用 キ ッ トに よれ ば 、 主 な 爪 白癬 の 起 因 菌 で あ る
紅 色 白癬 菌 （T r i c h o p h y t o n
(T r
I
c h o p h y t o n
正 確 に 同 定 す る こ とが で き る 。
r u b r u m )
お よ び 毛 瘡 白癬 菌
m e n t a g r o p h y t e s )
を 迅 速 力、つ
[001 5 ]
本 発 明 は 、 ま た 、 被 検 者 よ り採 取 した 爪 か ら 全 D N A を 抽 出 す る 工 程 と 、
爪 白 癬 の 起 因 菌 の リポ ゾ 一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 に 特 異 的 な 、 プ ラ イ マ
— セ ッ トお よ び プ ロ ー ブ を 用 意 す る 工 程 と 、 リ ア ル タ イ ム P C R 法 を 用 い て
、 プ ラ イ マ 一 セ ッ 卜に よ っ て 抽 出 した 全 D N A に お け る 爪 白 癬 の 起 因 菌 の リ
ポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 を 増 幅 す る と 同 時 に 、 プ ロー ブ に よ っ て 増
幅 した D N A を 検 出 し 、 菌 種 を 同 定 す る 工 程 と を 含 む 、 爪 白 癬 の 起 因 菌 の 同
定 方 法 を提 供 す る 。 本 発 明 の 同 定 方 法 に よれ ば 、 爪 白癬 の 起 因 菌 を 迅 速 か つ
正 確 に 同 定 す る こ とが で き る 。
[001 6 ]
本 発 明 の 同 定 方 法 に お い て 、 上 記 プ ラ イ マ ー セ ッ トが 、 配 列 番 号 1 の 塩 基
配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 2 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー とか ら
な る プ ラ イ マ 一 セ ッ ト、 お よ び 、 配 列 番 号 3 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ 一
と 配 列 番 号 4 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と か ら な る プ ラ イ マ ー セ ッ トか
ら な る 群 よ り選 択 さ れ る 少 な く と も 一 つ で あ る こ と が 好 ま し い 。 配 列 番 号 1
の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 2 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー
と か ら な る プ ラ イ マ 一 セ ッ 卜に よ れ ば 、 よ り広 範 囲 の 起 因 菌 を 同 定 す る こ と
が で き 、 配 列 番 号 3 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 4 の 塩 基 配 列
を 有 す る プ ラ イ マ 一 と か ら な る プ ラ イ マ 一 セ ッ 卜に よ れ ば 、 主 な 2 種 類 爪 白
癬 の 起 因 菌 、 す な わ ち 、 紅 色 白癬 菌
u m )
および
h y t e s )
瘡 白癬 菌
(T r
（T r
i c h o p h y t o n
i c h o p h y t o n
r u b r
m e n t a g r o p
を 正 確 に 効 率 よ く同 定 す る こ とが で き る 。 ま た 、 プ ラ イ マ 一 セ
ッ トは 目 的 に 応 じ て 2 種 類 の 混 合 物 を 使 用 し て も よ い 。
[001 7 ]
本 発 明 の 同 定 方 法 に お い て 、 上 記 プ ロー ブ が 、 配 列 番 号 5 の 塩 基 配 列 を 有
す る プ ロー ブ 、 お よ び 配 列 番 号 6 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ロ一 ブ か らな る ブ ラ
イ マ 一 セ ッ 卜か ら な る 群 よ り選 択 さ れ る 少 な く と も 一 つ で あ る こ と が 好 ま し
し、。 プ ロ ー ブ は 目 的 に 応 じ て 、 1 種 類 ま た は 2 種 類 の 混 合 物 を 使 用 し て も よ
し、。 2 種 類 の 混 合 物 を 使 用 す る 場 合 、 一 回 の リ ア ル タ イ ム P C R で 同 時 に 2
菌 種 の 同 定 を 可 能 とす る 。
発 明の効 果
本 発 明 の 同 定 用 キ ッ トお よ び 同 定 方 法 に よれ ば 、従 来 の K O H 直 接 鏡 検 法
[001 8 ]
ま た は培 養 法 に比 べ て 、 高 度 の 熟 練 や 数 週 間 の 培 養 期 間 が 不 要 とな るた め 、
よ り簡 便 で 迅 速 な 爪 白癬 の 起 因 菌 の 同 定 が 可 能 とな る 。 ま た 、従 来 の n e s
t e d _ P C R に よ る 同 定 に比 べ て も、 定 量 性 、検 出精 度 、 お よ び 菌 種 特 異
性 が 向上 され る うえ 、 電 気 泳 動 を必 要 と しな いた め 所 要 時 間 が 大 幅 に短 縮 で
き る と い う利 点 が あ る 。
発 明 を実施 す るための形態
本 発 明 の 同 定 方 法 は 、被 検 者 よ り採 取 した 爪 か ら全 D N A を抽 出 す る工 程
[001 9]
と、 爪 白癬 の 起 因 菌 の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 に特 異 的 な 、 ブ ラ
イ マ 一 セ ッ トお よ び プ ロー ブ を用 意 す る工 程 と、 リア ル タ イ ム P C R 法 を用
い て 、 プ ラ イ マ 一 セ ッ 卜に よ って抽 出 した 全 D N A に お け る爪 白癬 の 起 因 菌
の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 を増 幅 す る と同 時 に 、 プ ロー ブ に よ つ
て 増 幅 した D N A を検 出 し、 菌 種 を 同 定 す る工 程 と を含 む 。
本 発 明 の 同 定 方 法 に よ って 同 定 で き る爪 白癬 の 起 因 菌 は特 に 限 定 され な い
[0020]
力、 紅 色 白癬 菌 （トリコ フ ィ トン ' ル ブル ム ；T r i c h o p h y t o n
) 、 毛瘡 白癬 菌 （ト リ コ フ ィ ト ン
r u b r u
T r
I
メ ン
タグ ロ フ ア イ テ ス ；
m e n t a g r o p h y t e s ) 、崖 色 白き
c h o p h y t o n
( トリコ フ ィ トン - ヒ才 ラセ ゥム ；T r i c h o p h y t o n
) 、 岩 穴 状 白癬 菌 （トリコ フ ィ トン
c e u
p
h
y
t
o
n
t
o
n
s
u
A r t h r o d e r m a
ゾレマ
ヘ リ , ヽ之
J、
胞子菌
r
a
n
s
ノ、
<
( ミク ロス ポ ゾ
レム
v a n b r e u s e g h e m i
p
I
d e
m o p h y t o n
(
ι ) 、 ズ ゾレス □ 丁
b e n h a m i a e ) 、っヌ
c a n i s
ギ プセ ゥム ；M i c r o s p o r u
g y p s e u m ) 、 お よび鼠 径 表 皮 菌 （
ェ ピデ ル モ フ ィ ト ン
― 入 ム ；t
I a
/ ヽン フ ゾレセ ；；つ
力 ニ ス ；M i c r o s p o r u m
) 、 石 膏 状 小 胞 子 菌 （ミク ロス ポ ル ム
i o
トンズ ラ ンス ；T r i c h o
ゾレス 口 丁 ゾレマ
(A r t h r o d e r m a
v
f
フ ロ ッコ
I o c c o s u m ) が牵 げ
れ
る 。 特 に 、 紅 色 白癬 菌 お よ び 毛瘡 白癬 菌 が 分 離 され た 爪 白癬 の 起 因 菌 の 9 割
以 上 を 占め て い るた め 、 こ の 2 種 類 の 菌 種 を 同 定 で き る こ とは 爪 白癬 の 治 療
に お いて 重 要 な意 義 が あ る。
[0021 ]
本 発 明 の 同定 方 法 は 、 爪 白癬 患 者 また は患 者 の 疑 いの あ る ヒ トの 爪 を検 体
とす る。 爪検 体 は 、 ニ ッパ ー や 爪 切 り等 で切 り取 る こ とに よ って採 取 す れ ば
よ い。 爪検 体 の 量 は 、 リアル タィ ム P C R ( R e a l — t
m e r a s e
c h a i n
e a c t
i m e
p o l y
i o n ) の 寿型 と して 十 分 量 の D N
A を抽 出 で き る量 で あれ ば い い。 爪 の 厚 み や 湿 度 で 変 化 し得 るが お よそ 2 X
2 m m 、或 い は お よそ 5 〜 1 O m g 採 取 す れ ば よ い。
[0022]
爪検 体 か ら全 D N A を抽 出す る に は 、 常 法 で行 う こ とが で き、例 え ば爪 を
ビー ズ シ ョック に よ り粉 砕 し、 1 0 0 ° C で 1 0 分 間 煮 沸 等 に よ り殺 菌 した
後 、 フ エノー ル
ク ロ 口ホ ル ム で抽 出 し、 エ タ ノー ル で 沈澱 す る こ とに よ り
行 う こ とが で き る。抽 出 した 全 D N A を必 要 に応 じて市 販 の核 酸 定 量 キ ッ ト
で 定 量 して も よ い。
[0023]
本 発 明 の 同定 方 法 に使 用 され る プ ライ マ一 セ ッ トは 、 爪 白癬 の起 因 菌 の リ
ポ ゾ一 マル D N A の I T S 1
( i n t e
n a l
t
r a n s c r
i b e d
) 領 域 に特 異 的 な もの で あれ ば特 に限 定 され な い。 I T
s p a c e
S 1 領 域 は転 写 され な い領 域 で あ り、転 写 され る他 の領 域 （
例 えば、 2 8 S
領 域 な ど） に比 べ て種 の進 化 の 段 階 で D N A 配 列 の 多様 性 を獲 得 しや す いた
め 、 菌種 に限 定 した 特 異 性 の 高 い配 列 を保 持 して い る と考 え られ て い る。 当
業者 は周 知 の 方 法 、例 え ば 、 M o l e c u l a r
C l o n i n g :
L a b o r a t o r y
E d . )
p r
i n g
H a
b o
M a n u a l
(3
d
U n i v e r s i t y
P
C o l d
A
S
e s s に記 載 の 方
法 を用 いて 、 爪 白癬 の起 因 菌 の リポ ゾ一 マル D N A の I T S 1 領 域 の 塩 基 配
列 に基 づ き、本 発 明 の 同定 方 法 に使 用 され る プ ライ マー セ ッ トを適 宜 に設 計
す る こ とが で き る。 プ ライ マー の 長 さは好 ま し くは 1 5 〜 3 0 b p で あ り、
よ り好 ま し くは 1 8 〜 2 5 b p で あ り、 G C 含 量 は好 ま し くは 4 0 〜 6 0 %
、 よ り好 ま し くは 5 0 % 前 後 で あ る。 T m 値 は所 望 の P C R ア ニー リング温
度 に よ り 5 〜 1 0 °C 高 く設 定 す る こ とが 好 ま し く、本 発 明 の 同定 方 法 に お い
て ァ ニ一 リング温 度 が 好 ま し く 6 0 〜 6 5 °C で あ り、 T m 値 が 6 5 〜 7 0 °C
で ある ことが好 ま しい。 プライマ一セ ッ トによ って増幅 され る D N A 配列の
長 さは 5 0 〜 4 0 0 b p で あれ ばよ く、好 ま しくは約 1 5 0 b p 以下で ある
ことが好 ま しい。
広範囲の真菌の菌種 を同定す るため には、真菌 リボ ゾーム D N A の I T S
[0024]
領域 の特異 的配列 に相補 的で あ り、真菌全般 （u n i v e r s a l ) の リ
ポ ゾ一ム D N A の I T S 1 領域 を特異 的に増幅す るプライマ一セ ッ トを使用
す る ことが好 ま しい。例 えば、配列番号 1 の塩基配列 を有す るプライマー （
d e r m a F ) と配列番号 2 の塩基配列 を有す るプライマ一 （d e r m a R
) とか らな るプライ マ 一 セ ッ トは、殆 どの真菌の リポ ゾ一 マル D N A の I T
S 1 領域 の全長 （
およそ 3 5 0 b p ) を増幅す る ことがで きるため好 ま しく
用 い られ る。
一方 、爪 白癬 の起 因菌の 9 割 以上 を占め る主な起 因菌で ある紅色 白癬 菌 （
[0025]
T r i c h o p h y t o n
o p h y t o n
率 よ く検 出
r u b r u m ) および
瘡 白獬 ¾ | ( T r i c h
m e n t a g r o p h y t e s ) にタ一ケ ッ 卜を糸
父つて
同定す るため には、 これ らの菌種 に限定 した特異 的な プライマ
一セ ッ トを使用す る ことが好 ま しい。例 えば、配列番号 3 の塩基配列 を有す
るプライマ一 （d e r m a F 2 ) と配列番号 4 の塩基配列 を有す るプライマ
_
( d e r m a R 2 ) とか らな るプライ マ 一 セ ッ トは、紅色 白癬 菌 および毛
瘡 白癬 菌の リポ ゾ一 マル D N A の I T S 1 領域 の一部 （
およそ 1 5 0 b p )
を特異 的に増幅す る ことがで きるため、好 ま しく用 い られ る。また、毛瘡 白
癬 菌 と同 じく系統分類上の グルー プ I に属す る A r t h r o d e r
a n b r e u s e g h e m i i やA r t h r o d e r m a
a
v
s i m i i もし
の プライマ一セ ッ トによ って増幅 され る。 この プライマ一セ ッ トによる増幅
産物 は u n i V e r s a I プライマ一セ ッ トによる増幅産物 に比べ て配列が
短 いため、 リアル タイム P C R に要す る時間が短縮 で き、主な爪 白癬 の起 因
菌の 同定 を正確 かつ効率 よ く行 うことを可能 とす る。
[0026]
配列番号 1 ： 5 ' - T A A C A A G G T T T C C G T A G G T G A A C C
T —3 ，
配 列番 号 2 ：5 '
- T C G C T G C G T T C T T C A T C GA - 3 '
配 列番 号 3 ：5 '
- S S C C C C A T T C T T G T C T A CM T Y A C-
3 ，
配 列番 号 4 ：5 '
- A A C G C T C A GA C T GA C A G C T C T T C-
3 ，
本 発 明 の 同 定 方 法 に使 用 され る プ ロー ブ は 、 爪 白癬 の 起 因 菌 の リポ ゾ一 マ
[0027]
ル D N A の I T S 1 領 域 に特 異 的 な もの で あれ ば特 に 限 定 され な い 。 当業 者
は周 知 の 方 法 、例 え ば 、W o o t t o n ら （F e d e r h e n
l y s i s
o f
c o m p o s i t
g i o n s
i n
s e q u e n c e
s
E n z y m o に
i o n a l l y
S. A n a
b i a s e d
r e
d a t a b a s e s . M e t h o d
9 9 6 ; 2 6 6 : 5 5 4 - 7 1 ) の 方 法 を用 い て
、様 々 な 爪 白癬 の 起 因 菌 の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 の 配 列 に基 づ
い て 、 菌 種 特 異 的 な プ ロー ブ を検 索 し、 設 計 す る こ とが で き る 。 プ ロー ブの
長 さは特 に 限 定 され て お らず 、 ま た 、 特 異 的 な領 域 の 塩 基 配 列 の 長 さや G C
含 量 、 T m 値 に よ って 変 動 し得 るが 、 1 0 〜 5 0 m e r で あ る こ とが 好 ま し
し、。 プ ロー ブの T m は 好 ま し くプ ラ イ マ ー の T m 値 よ り高 く、 よ り好 ま し く
は それ よ り 1 0 °C ほ ど高 い 。 ま た 、 T m の 上 昇 お よ び 特 異 性 の 向上 の た め 、
例 えばM G B
(M i n o
G
o o
e
B i n d e
; ア プ ラ イ ドバ イ
ォ シス テ ム ズ ジ ャパ ン社 製 ） を結 合 させ て も よ い 。
[0028]
毛瘡 曰獬 ¾ | ( T r
I
c h o p h y t o n
m e n t a g r o p h y t e s
) の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 に特 異 的 にハ イ ブ リダ ィ ズ す る プ ロ
ー ブ と して は 、 配 列 番 号 5 の 配 列 を有 す る もの が 好 ま しい 。 この プ ロー ブ に
よれ ば 、 毛瘡 白癬 菌 で あ るか ど うか を正 確 に 同 定 す る こ とが で き る 。 ま た 、
毛瘡 白癬 菌 の 有 性 世 代 で あ る A r t h r o d e r m a
v a n b r e u s e
g h e m i i も この プ ロー ブ に よ って検 出 され るが 、 両 者 は 臨 床 症 状 も治 療
法 も 同 じで あ るた め 、 臨 床 上 両 者 を さ らに 区別
、 紅 色 白癬 菌 （T r i c h o p h y t o n
同 定 す る必 要 は な い 。 ま た
r u b r u m ) の リポ ゾ一 マ ル
D N A の I T S 1 領 域 に特 異 的 にハ イ ブ リダ ィ ズ す る プ ロー ブ と して は 、 配
列 番 号 6 の 配 列 を有 す る もの が 好 ま しい 。 この プ ロー ブ に よれ ば 、 紅 色 白癬
菌 で あ る か ど うか を 正 確 に 同 定 す る こ とが で き る 。 ま た 、 T r i c h o p h
y t o n
v i o I a c e u m も この プ ロー ブ とハ イ ブ リダ イ ズ す る 。 両 者
を 区 別 す る に は 、 I T S 1 領 域 の 塩 基 配 列 （G e n e B a n k
s i o n
N o . A B 5 2 0 8 4 0 お よび A B
A c c e s
9 4 2 4 6 ) を比 較 す る こ
と （
例 え ば 、 P C R 増 幅 産 物 の シー ク ェ ン シ ン グ を行 う こ と） に よ って 達 成
で き る 力、 爪 白癬 の 起 因 菌 と して T r i c h o p h y t o n
e u m は ご く稀 で あ る た め 、 臨 床 上 両 者 を 区 別
v i o l a c
同 定 す る意 味 が 殆 どな い 。
さ らに 、 全 真 菌 の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 に 特 異 的 に ハ イ ブ リダ
ィ ズ す る プ ロー ブ と して は 、 配 列 番 号 7 の 配 列 を有 す る もの が 好 ま しい 。 こ
の プ ロー ブ に よ って 表 在 性 真 菌 を広 範 囲 に検 出 す る こ とが で き 、 ま た 定 量 す
る こ と に よ り、 表 在 性 真 菌 の 全 体 量 や 爪 白癬 の 起 因 菌 が 全 真 菌 に お け る割 合
も確 認 す る こ とが で き る 。
[0029]
[0030]
配 列 番 号 5 ：5 '
- C T C T C T T T A G T GG C T A A A C- 3 '
配 列 番 号 6 ：5 '
- C G C G C T C C C C C T G C- 3 '
配 列 番 号 7 ：5 '
- T T Y A A C A A Y GGA T C T C T - 3 '
本 発 明 の 同 定 方 法 に使 用 され る プ ロー ブ は リア ル タ イ ム P C R に よ って 検
出 され る た め に標 識 す る必 要 が あ る 。 標 識 プ ロー ブ は 当 業 者 が リア ル タ イ ム
P C R シ ス テ ム に よ って 任 意 に選 択 で き る が 、 T a q M a n
ブが 好 ま し く用 い られ る 。 T a q M a n
( 商 標 ） プ ロ一
( 商 標 ） プ ロー ブ は 、 標 的 D N A に
特 異 的 に ハ イ ブ リダ ィ ズ す る塩 基 配 列 の 5 ' 末 端 に 蛍 光 色 素 、 3 ' 末 端 に ク
ェ ン チ ヤ一 （
消 光色 素 ） お よび M G B
(M i n o
G
o o
e
B i n
d e r ) に よ って 標 識 した プ ロー ブ で あ る 。 蛍 光 色 素 と して は 、 F A M
(商
標）、V I C
(商
(商 標 ） 、 N E D (商 標 ） 、 J O E
標）、 C y _ 3 、R O X
(商 標 ） 、 T e x a s
(商 標 ） 、 T A M R A
e d
(商 標 ） 、 お よび C
y _ 5 な どが 挙 げ られ る 。
[0031 ]
T a q M a n
( 商 標 ） プ ロー ブ は 、 そ の ま ま の 状 態 で は 、 プ ロー ブ上 に ク
ェ ン チ ヤ一 が 存 在 す る た め 、 励 起 光 を照 射 して も蛍 光 の 発 生 は 抑 制 され る 。
し力、し、 リアル タイム P C R の増幅反応 中において、 T a q M a n (商標 ）
プ ロ一 ブがァ 二 一 リングステ ップで錶型 D N A に特異 的にハ イ プ リダイズ し
、 さ らに、伸長反応ステ ップの際 に、 T a q
' → 3 '
D N A ポ リメラ一ゼの もつ 5
ェキ ソヌク レア一ゼ活性 によ り、錶型 にハ イ ブ リダィズ した T a q
M a n プ ロー ブが分解 され る と、蛍光色素が プ ロー ブか ら遊離 し、クェ ンチ
ヤー による抑制が解 除 され て蛍光が発せ られ 、 リアル タィム P C R システム
によ って検 出 され る。また、検 出 され る蛍光強度 はサ ンプル 中の標 的 D N A
の コ ピ一数 に依存す るため、検体 中の菌体 由来 D N A を定量す る こともで き
る。
[0032]
本発 明において、 目的に応 じて プライ マ 一 セ ッ トおよび プ ロー ブを選択す
る ことがで きる。主な起 因菌で あるか どうか を確認す る場合 、配列番号 3 の
塩基配列 を有す るプライマー と配列番号 4 の塩基配列 を有す るプライマー と
か らな るプライ マ ー セ ッ 卜と、配列番号 5 および
また は配列番号 6 の配列
を有す るプ ロー ブとの組み合わせが好 ま しい。稀 な起 因菌 を含めた広範囲の
真菌の 同定 には、配列番号 1 の塩基配列 を有す るプライマー と配列番号 2 の
塩基配列 を有す るプライマー とか らな るプライマーセ ッ トと、例 えば配列番
号 5 および
また は配列番号 6 の配列 を有す るプ ロ一 ブな ど各種起 因菌 に特
異 的な プ ロー ブとの組み合わせが好 ま しい。また、一つの プライ マ 一 セ ッ ト
および一つの プ ロー ブを添加 した系 （
シングル系）の ほか、複 数の プライマ
一セ ッ トおよび複 数の プ ロー ブを添加 した系 （
マル チ系） を用 いて複 数の菌
種 を同時に同定す る ことも可能 で ある。マル チ系の場合 、 プライ マ ー や プ ロ
ー ブ同士が干渉 し、検 出感度が低 下す る可能性が あるため、使用す るプライ
マ ー や プ ロー ブの配合比や濃度 を検 討す る必要が ある。
[0033]
本発 明において、起 因菌の菌種 の 同定 は以下の よ うに行われ る。 シングル
系 においては、 プ ロー ブか ら遊離 した蛍光色素が検 出 され た場合 、被験起 因
菌 は当該 プ ロー ブの特異 的な菌種 で ある と判定 し、蛍光色素が検 出 され なか
つた場合 、被験起 因菌 は当該 プ ロー ブの特異 的な菌種 でな い と判定す る。マ
ル チ系 においては、複 数の プ ロー ブが異 な る蛍光色素 によ って標識 され るた
め、検 出 され た蛍光色素の種類 に基 づ き、被験起 因菌 は当該蛍光色素が標識
した プ ロー ブの特異 的な菌種 で ある と判定す る。また、 D N A の抽 出
精製
の失敗 による偽 陰性 を排除す るため には、内部標準物 （
イ ンターナル コン ト
ロール） を使用 して もよい。イ ンターナル コン トロール と しては当業者 が適
切 に選択
モデ ィファイす る ことがで き、例 えば、 V o l I m e
らが開発
した R N A 用 イ ンタ一ナル コン トロール （E v a l u a t i o n
o v e I
a y
b r o a d — r a n g e
f o
a p i d
t h o g e n i c
f u n
s p e c i m e n s .
J u n ; 4 6
(6 )
J
r e a l — t
d e t e c t
i
i n
C I i n
: 1 9 1 9 - 2 6 .
i o n
i m e
o f
v a r i o u s
M i c
P しR
n
a s s
h u m a n
p a
c l i n i c a l
o b i o l .
E p u b
o f
2 0 0 8
2 0 0 8
A p r
2
. ) を D N A 用 にモデ ィファイす る ことがで きる。
[0034]
本発 明の 同定キ ッ トは、 プライ マ 一 セ ッ トおよび プ ロー ブを含み 、 リアル
タイム P C R 法 を用 いて爪 白癬 の起 因菌 を同定す るための 同定用キ ッ トで あ
る。 プライマーセ ッ トが、配列番号 1 の塩基配列 を有す るプライマー と配列
番号 2 の塩基配列 を有す るプライマー とか らな るプライマ一セ ッ ト、および
、配列番号 3 の塩基配列 を有す るプライマー と配列番号 4 の塩基配列 を有す
るプライマ一 とか らな るプライマ一セ ッ 卜か らな る群 よ り選択 され る少 な く
とも一つで あ り、 プ ロー ブが、配列番号 5 の塩基配列 を有す るプ ロー ブ、お
よび、配列番号 6 の塩基配列 を有す るプ ロ一 ブか らな る群 よ り選択 され る少
な くとも一つで ある。
[0035]
本発 明の 同定キ ッ トは、上記特定の プライ マ 一 セ ッ トおよび プ ロー ブの ほ
力、
、一般 的な リアル タイム P C R 用キ ッ トに含 まれ る試薬 、例 えば、 D N A
ポ リメラ一ゼ、 d N T P 、バ ッファ一 、ポ ジテ ィブコン トロール テ ンプ レー
トな どが含 まれ て もよい。使用利便性の観 点か ら、 P C R および蛍光検 出す
るための試薬が全 て適量 で ミックス され て いる状態 で提供 され る ことが好 ま
しい。
[0036]
本発 明の 同定キ ッ トは、同定 目的に応 じた プライ マ 一 セ ッ トおよび プ ロ一
ブの 組 合 せ を含 む こ とが 好 ま しい 。 主 な 爪 白癬 の 起 因 菌 を 同 定 す るた め の キ
ッ トは 、 配 列 番 号 3 の 塩 基 配 列 を有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 4 の 塩 基 配 列
を有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る プ ラ イ マ ー セ ッ 卜と、 配 列 番 号 5 ま た は配 列
番 号 6 の 塩 基 配 列 を有 す る プ ロー ブ との 組 合 せ が 好 ま し く使 用 され る 。稀 な
起 因 菌 を 同 定 す るた め の キ ッ トは 、 配 列 番 号 1 の 塩 基 配 列 を有 す る プ ラ イ マ
- と配 列 番 号 2 の 塩 基 配 列 を有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る プ ラ イ マ ー セ ッ ト
は 好 ま し く含 まれ る 。
[0037]
複 数 の プ ラ イ マ 一 セ ッ トお よ び プ ロー ブが 含 まれ る 同 定 キ ッ トは 、 一 回 の
リア ル タ イ ム P C R で複 数 の 起 因 菌 を 同 定 で き るた め 好 ま しい 。 この 場 合 、
プ ラ イ マ 一 セ ッ ト同 士 や プ ロ一 ブ 同 士 の 干 渉 に よ る検 出 感 度 の 低 下 を 防 ぐた
め 、 ポ ジ テ ィ ブ コ ン トロー ル に よ って 決 定 され た 最 適 な 配 合 比 お よ び 配 合 濃
度 の プ ラ イ マ ー セ ッ トお よ び プ ロー ブ を含 む キ ッ 卜が 好 ま しい 。
実施例
[0038]
以 下 、 実 施 例 を挙 げ て 、 本 発 明 を よ り具 体 的 に説 明 す るが 、 本 発 明 は これ
らの 実 施 例 に 限 定 され る もの で は な い 。
[0039]
(実 施 例 1 )
プ ラ イ マ ー セ ッ トお よ び プ ロー ブの 菌 種 特 異 性
爪 白癬 の 起 因 菌 の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 の 配 列 に特 異 的 な プ
ラ イ マ 一 セ ッ トお よ び プ ロー ブ を用 い て 、 リア ル タ イ ム P C R を行 い 、 菌 種
特 異 性 を検 討 した 。 プ ラ イ マ 一 セ ッ トは 、 （1 ) 配 列 番 号 1 の 塩 基 配 列 を有
す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 2 の 塩 基 配 列 を有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る ブ ラ
イ マ 一 セ ッ ト （d e r m a F
d e r m a R ) 、 お よ び 、 （2 ) 配 列 番 号 3
の 塩 基 配 列 を有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 4 の 塩 基 配 列 を有 す る プ ラ イ マ ー
とか らな る プ ラ イ マ 一 セ ッ ト （d e r m a F 2
d e r m a R 2 ) の 2 種類
を使 用 した 。 イ ン タ一 ナ ル コ ン トロー ル 用 プ ラ イ マ 一 セ ッ トと して 、 配 列 番
号 8 の 塩 基 配 列 を有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番 号 9 の 塩 基 配 列 を有 す る プ ラ イ
マ 一 とか らな る プ ラ イ マ 一 セ ッ ト
（M
S 2 —T M 3 —F
M S 2 _ T M 3 _
R ) を使 用 した 。 プ ラ イ マ 一 は全 て シ グ マ ア ル ドリッチ ジ ャパ ン株 式 会 社 よ
り購 入 した 。
dermaF : 5' -TAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCT-3 '
dermaR: 5' -TCGCTGCGTTCTTCATCGA-3'
dermaF2 : 5' -SSCCCCATTCTTGTCTACMTYAC-3 '
dermaR2 : 5' -AACGCTCAGACTGACAGCTCTTC-3 '
MS2-TM3-F : 5' - GGCTGCTCGCGGATACCC-3'
MS2-TM3-R: 5' -TGAGGGAATGTGGGAACCG -3'
[0040]
プ ロー ブ は 、 （1 ) 配 列 番 号 5 の 塩 基 配 列 の 5 ' 末 端 に F A M ( 商 標 ） 蛍
光 色 素 、 3 ' 末 端 に N F Q お よ び M G B に よ って標 識 した T a q M a n
(商
標 ） プ ロー ブ （T M E _ I T S 1 F ) 、 ( 2 ) 配 列 番 号 6 の 塩 基 配 列 の 5 '
末端 にV I C
( 商 標 ） 蛍 光 色 素 、 3 ' 末 端 に N F Q お よ び M G B に よ って標
識 した T a q M a n
( 商 標 ） プ ロー ブ （T R U _ I T S 1 V ) 、 ( 3 ) 配 列
番 号 7 の 塩 基 配 列 の 5 ' 末 端 に N E D (商 標 ） 蛍 光 色 素 、 3 ' 末 端 に N F Q
お よ び M G B に よ って標 識 した T a q M a n
S
( 商 標 ） プ ロー ブ （F U — I T
N ) の 3 種 類 を使 用 した 。 （4 ) イ ン タ一 ナ ル コ ン トロー ル 用 プ ロー ブ
と して 、 配 列 番 号 1 0 の 塩 基 配 列 の 5 ' 末 端 に C y 5 蛍 光 色 素 、 3 ' 末 端 に
B H Q 3 に よ って標 識 した T a q M a n
- C y 5 ) を使 用 した 。 な お 、 N F Q
u e n c h e r ；商 標 ) も B H Q 3
h e r
( 商 標 ） プ ロー ブ
（M
S 2 —T M 2
(N o n — f I u o r e s c e n t
(B l a c k
H o l e
u e n c
3 ；商 標 ） も非 蛍 光 性 消 光 剤 （ク ェ ン チ ヤ 一 ） で あ る 。 プ ロー ブ は
ア プ ラ イ ドバ イ オ シス テ ム ズ ジ ャパ ン株 式 会 社 お よ び シ グ マ ア ル ドリツチ ジ
ャパ ン株 式 会 社 よ り購 入 した 。
TME- I TS1 F: 5' - [FAM] -CTCTCTTTAGTGGCTAAAC- [NFQ-MGB] -3'
TRU- I TS1V : 5' -
FU- I TS1 N: 5' -
[ V I C] CGCGCTCCCCCTGC- [NFQ-MGB] -3'
[NED] TTYAACAAYGGATCTCT- [NFQ-MGB] -3'
MS2-TM2-Cy5 : 5' - [Cy5] -ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT- [BHQ3] -3'
[0041 ]
皮 膚 糸 状 菌 な どの 様 々 な 常 在 菌 を各 菌株 保 存 施 設 よ り入 手 した 。 これ らの
菌株 を通 常 の 培 養 方 法 に した が って 培 養 し、 フ ヱ ノ一 ル
ク 口 口ホ ル ム 法 で
全 D N A を抽 出 した 。 それ ぞれ の 全 D N A を イ ン ビ トロジ ェ ン社 Q u b i t
定量キ ッ トによ り定量 し、 0 . 3 p g
(概ね 1 0 0 コ ピーの リポ ソ一 マル D
N A 遺伝子 に相 当す る量） を錶型 と し、 リアル タイム P C R システム 7 5 0
0 F a s t
( ア プライ ドバ イオ システムズ ジャパ ン株 式会社 ） を用 いて リア
ル タイム P C R を行 った。反応液 （1 9
L X 5 0 反応分）の組成 は以下の
通 りで ある。 ゥ エル に 1 9 パ L ず つ分注 し、上記抽 出 した D N A を 1 パ L ず
つ入れ た。
水
3 5 7
し
プライマ一 （3 0 〃M ) X 4
6 .
しX 4
Ru
R e f e r e n c e
プ ロー ブ （
〜1 5 )
M)
D y e
X 4
P _r _e m _ι —
x
合計
[0042]
9 5 0
5
2 0
し
2 0
しX 4
5 0 0
し
L
リアル タイム P C R システムの操作 はメー カ取扱説 明書 に従 った。初期ホ
—ル ドは 9 5 °C 、 3 0 秒 、 P C R 反応 は、 9 5 °C で 1 0 秒 、 6 0 °C で 3 0 秒
を 6 0 サ イクル行 った。 リアル タイム P C R の結 果 は表 1 に示 した。増幅が
見 られ た場合 （
陽性） を 「十」で示 し、増幅が見 られ なか った場合 （
陰性）
を 「一」で示 した。
[0043]
ほ 1]
表 1 か ら、本検 出系 で は、 I T S 1 領 域 の全 長 を増 幅 す る d e r m a F
m a R プ ライ マ一 と F U _
d e
検 出 した 。 また 、 d e r m a F
I T S 1 N プ ロー ブに よ り広 範 囲 の 真 菌 を
d e r m a R また は d e r m a F 2
r m a R 2 と プ ロー ブ との セ ッ 卜で 、 共 に 毛瘡 白癬 菌 （T r
t o n
m e n t a g r o p h y t e s ) 、 お よび 、紅 色
h o p h y t o n
r u b r u
d e
i c h o p h y
獬 ¾l い - r i c
) を特 異 的 に検 出 で きた 。 さ らに 、 菌種 特
異 的 な プ ロー ブは 当該 菌種 のみ に反 応 し、 それ 以外 の 菌種 に は全 く反 応 しな
か った （
種 特異 性 1 0 0 % ) 。
(実 施 例 2 )
[0045]
リアル タイ ム P C R の検 出感 度
爪 白癬 の起 因 菌 の リポ ゾ一 マル D N A の I T S 1 領 域 の 配 列 に特 異 的 な プ
ライ マ一 セ ッ トお よび プ ロー ブ を用 いて 、本 発 明 の 同定 方 法 の検 出感 度 を検
討 した 。 ポ ジテ ィ ブ コ ン トロー ル と して 、 イ ン ビ トロジ ェ ン社 T O P O
A
C l o n i n
h o p h y t o n
K i t に付 属 す る p C R 2 .
r u b r u m、
ベ ク タ一 に 、 T r i e
ι c h o p h y t o n
g r o p h y t e s 、 お よび A s p e r g i
I I u s
T
m e n t a
f u m i g a t u s
の I T S 1 領 域 を ク ロー ニ ング した もの を使 用 した 。錶 型 濃 度 を希 釈 して検
出感 度 の 下 限 を調 べ た 。
[0046]
本 検 出 系 に お いて は 、各 濃 度 あた り4 回繰 り返 しの レプ リケ一 卜で再 現 性
を確 認 した 。結 果 は表 2 に示 した 。 1 回 の 増 幅 を 「十」 で 示 し、 4 回測 定 に
お いて全 て増 幅 が 見 られ た 場 合 、 「+ + + + 」 で 示 した 。
[0047]
ほ 2]
[0048]
錶型が非常 に希薄 な領域 においては有限な時間 と少数の分子が関与す る確
率 的な P C R 増幅現象 （
ポア ソン過程 ） とな るため、陰性
陽性 ではな く確
率 的な値 、す なわ ち検 出率 で表 した。検 出系やそれ ぞれ の立場 で値 は上下す
るが、一般 的に リアル タイム P C R 検 出系での検 出感度 は 9 0 〜 9 5 % が境
界 と して採用 され て いるため、本検 出系では 1 0 0 % 検 出 され た錶型濃度 を
その最低検 出感度 と した。本検 出系 において、 リポ ソ一 マル D N A 3 〜 5 0
コ ピーの錶型が あれ ば 1 0 0 % 増幅す る結 果 とな った。 これ は 白癬 な どの真
菌でおよそ 1 〜 2 細胞分 に相 当す るため、実用 的には十分 な感度 で ある と推
定 され る。また、 この検 出感度 は、 1 0 0 〜 5 0 0 コ ピー を必要 とす る n e
s t e d _ P C R 法 よ りも 2 〜 1 6 6 倍感度が高 い ことが分か った。
[0049]
(実施例 3
本発 明の 同定方法 を用 いた臨床試験 ）
爪真菌症未治療の皮膚科患者 に熟練 した医師 によ り直接鏡検 を行 い、感染
の有無 を確認 した。感染が確認 され た患者 の爪 に対 してエタノール消毒後 、
爪の遠位側 を爪切 りまた は二 ッパー で切 り取 り採取 した。採取 した爪 を ビー
ズ シ ョッカー （
多検体細胞破砕機 ） （
安井器械株 式会社 ）で粉砕 し、糸状菌
バ ッファ一 （2 0 0 m M
T r i s - H C I ,
p H
8 .
0 ,
2 5 mM
E
D T A ,
0 .
5 % S D S ,
沸 後 、 フ エ ノー ル
2 5 Om M
N a C I ) 中 で 1 0 0 °C 1 0 分 間 煮
ク ロ 口ホ ル ム 抽 出 し、 次 い で エ タ ノー ル 沈 澱 して D N A
を抽 出 した 。 D N A を 5 0 リ L の 超 純 水 に溶 解 して 保 存 した 。 得 られ た D N
A 含有液 2 5
L を錶 型 D N A サ ン プル と し、 既 知 の 濃 度 の ポ ジ テ ィ ブ コ ン
トロー ル と共 に 、 実 施 例 1 の 方 法 と同様 に リア ル タ イ ム P C R を行 った 。
結 果 を表 3 に 示 した 。 表 中 、 C
[0050]
T
は増 幅 カー ブ よ り得 られ る情 報 で あ り、 設
定 され た 閾 値 に相 当す る P C R サ イ クル 数 を示 す 。 C
比較 C
T
T
よ りは検 量 線 法 ま た は
法 の いず れ か を使 用 す る こ とに よ り錶 型 量 の 定 量 的 な 見 積 が で き る 。
今 回 は 、 大 量 検 体 に適 した 比 較 C
示 した 。 な お 、 比 較 C
T
T
法 を採 用 し、 そ こか ら算 出 され る錶 型 数 を
法 は P C R 効 率 が 1 0 0 % で あ る と仮 定 して 、 既 知 の
ポ ジ テ ィ ブ コ ン トロー ル との C
T
の 差 を利 用 して 錶 型 数 を概 算 す る方 法 で あ る
。 この 方 法 は増 幅 効 率 の 差 に よ る定 量 誤 差 が 生 じる と い うデ メ リツ 卜が あ る
力、 対 数 的 な挙 動 を示 す P C R に お い て は些 末 な 問 題 で あ る と考 え られ る 。
そ して 臨 床 検 体 に お い て は ソ フ トウ エア L i n R e g P C R
r
J M
、A m p l i f i c a t i o n
n k i n g
b a s e l
l y s i s
o f
l e i c
i n e
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q u a n t
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A c i d s
E p u b
2 0 0 9
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i c i e n c y :
b i a s
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(R u i j
P C
A p
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t h e
d a t a .
；3 7
I i
a n a
N u c
：e 4 5
e s .
2 0 0 9
F e b
2 2 . ) に よ り増 幅 効 率 を確 認 した と こ
ろ、 実 際 に は差 が ほ とん どな か った た め 、 比 較 C
T
(6 )
t e
法 を使 用 した 場 合 に お い て
増 幅 効 率 は殆 ど問 題 で な く、 錶 型 の コ ピー 数 の 概 算 量 を求 め る こ とが 可 能 で
あ る と判 断 した 。
[0051 ]
対 照 と して健 常 人 の 爪 7 人 分 を本 発 明 の 同 定 方 法 に付 した と こ ろ、最 大 で
も 1 0 0 コ ピ一 程 度 の 真 菌 の 錶 型 量 しか 検 出 され な か った た め 、 1 0 0 コ ピ
一 程 度 は通 常 で も常 在 して い る もの と考 え 、 それ 以 上 を爪 白癬 診 断 の 目安 と
した 。 ま た 、 実 際 に 臨 床 検 体 で検 出 され た 錶 型 量 は どれ も 1 0 0 コ ピー を大
幅 に上 回 った た め 、 この 基 準 が 適 当 で あ る と考 えた 。
[0052]
表 3 よ り、 熟 練 した 医 師 に よ り直 接 鏡 検 陽 性 と判 断 され た 3 3 例 の 爪 白癬
爪 検 体 を 本 発 明 の 同 定 方 法 で 診 断 した と こ ろ 、 全 例 が 陽 性 と な った （
検 出精
度 1 0 0 % ) 。 一 方 、 培 養 法 に て 菌 種 が 同 定 され た 検 体 は 1 5 例 で あ り、 そ
の う ち 1 3 例 が 本 発 明 の 同 定 方 法 の 判 定 結 果 と一 致 した 。 不 一 致 の 2 例 に つ
い て は 、 本 発 明 の 同 定 方 法 が 種 特 異 性 1 0 0 % で あ る こ とか ら、 培 養 法 が 誤
同 定 で あ る 可 能 性 が 考 え られ た 。 した が っ て 、 培 養 法 に よ る 菌 種 同 定 が 3 9
% で あ った の に 対 し、 本 発 明 の 同 定 精 度 が 1 0 0 % で あ った 。 ま た 、 培 養 法
で 菌 種 が 同 定 で き な か った 残 りの 1 6 例 に つ い て は 全 て 菌 種 同 定 され た 。 一
方 、 健 常 爪 を 本 発 明 の 同 定 方 法 に 付 して も 白癬 菌 由 来 の シ グ ナ ル は 全 く検 出
され ず （7 例 全 例 ） 、 擬 陽 性 判 定 が な い こ と も 示 され た 。 な お 、 表 3 中 、 T
R はT r
I
c h o p h y t o n
p h y t o n
r u b r u m
m e n t a g r o p h y t e s ¾
T M はT r
ι c h o
し、 N D は 検 出 され な 力、
つた こ と を 表 し、 ま た 、 I T S 1 は 、 一 応 増 幅 バ ン ドが 見 られ た も の の 、 同
定 に は 至 らな か った も の を 表 す 。
ほ 3]
同 様 な 方 法 で 、 皮 膚 白癬 の 起 因 菌 を 同 定 した 結 果 は 表 4 に 示 した 。
ほ 4]
産 業上の利用可能性
本 発 明 の 同 定 方 法 に よれ ば 、 爪 白癬 の 起 因 菌 を 迅 速 か つ 正 確 に 同 定 す る こ
とが で き 、 治 療 方 針 の 策 定 に 有 効 な 起 因 菌 情 報 を提 供 で き る た め 、 産 業 上 の
利 用 可 能 性 は大 で あ る。
請 求 の範 囲
[ 請 求 項 1]
プ ラ イ マ 一 セ ッ トお よ び プ ロー ブ を 含 み 、 リア ル タ イ ム P C R 法 を
用 い て 爪 白癬 の 起 因 菌 を 同 定 す る た め の 同 定 用 キ ッ 卜で あ っ て 、
前 記 プ ラ イ マ ー セ ッ 卜が 、 配 列 番 号 1 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ
-
と配 列 番 号 2 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る プ ラ イ マ ー
セ ッ ト、 お よ び 、 配 列 番 号 3 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番
号 4 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る プ ラ イ マ ー セ ッ 卜か ら
な る 群 よ り選 択 され る 少 な く と も 一 つ で あ り、
前 記 プ ロー ブ が 、 配 列 番 号 5 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ロー ブ 、 お よ び
、 配 列 番 号 6 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ロ 一 ブ か らな る 群 よ り選 択 され る
少 な く と も 一 つ で あ る 、 爪 白癬 の 起 因 菌 の 同 定 用 キ ッ ト。
[ 請 求 項 2]
被 検 者 よ り採 取 した 爪 か ら全 D N A を抽 出 す る 工 程 と 、
爪 白癬 の 起 因 菌 の リポ ゾ一 マ ル D N A の I T S 1 領 域 に 特 異 的 な 、
プ ラ イ マ 一 セ ッ トお よ び プ ロー ブ を 用 意 す る 工 程 と 、
リア ル タ イ ム P C R 法 を 用 い て 、 前 記 プ ラ イ マ 一 セ ッ トに よ っ て 前
記 抽 出 した 全 D N A に お け る 爪 白癬 の 起 因 菌 の リポ ゾ一 マ ル D N A の
I T S 1 領 域 を 増 幅 す る と 同 時 に 、 前 記 プ ロー ブ に よ っ て 前 記 増 幅 し
た D N A を検 出 し、 菌 種 を 同 定 す る 工 程 と
を 含 む 、 爪 白癬 の 起 因 菌 の 同 定 方 法 。
[ 請 求 項 3]
前 記 プ ラ イ マ ー セ ッ 卜が 、 配 列 番 号 1 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ
-
と配 列 番 号 2 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る プ ラ イ マ ー
セ ッ ト、 お よ び 、 配 列 番 号 3 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー と配 列 番
号 4 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ラ イ マ ー とか らな る プ ラ イ マ ー セ ッ 卜か ら
な る 群 よ り選 択 され る 少 な く と も 一 つ で あ る 、 請 求 項 2 記 載 の 爪 白癬
の起 因菌の 同定方法 。
[ 請 求 項 4]
前 記 プ ロー ブ が 、 配 列 番 号 5 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ロー ブ 、 お よ び
、 配 列 番 号 6 の 塩 基 配 列 を 有 す る プ ロ 一 ブ か らな る 群 よ り選 択 され る
少 な く と も 一 つ で あ る 、 請 求 項 2 ま た は 3 記 載 の 爪 白癬 の 起 因 菌 の 同
L ZL
/ l
Zd / l
d
8
890/ΪΪ0
OAV
INTERNATIONAL
A.
CLASSIFICATION
C 1 2Q1 /68
(2
International application No.
SEARCH REPORT
OF SUBJECT MATTER
6
1 ) i ,
C 1 2N1
5/09
(2 0 0
. 01 )
According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
B.
FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
C1 2 Q1 / 6 8 ,
C 1 2N1 5 / 0 9
Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched
Jitsuyo
Kokai
Shinan
Koho
Jitsuyo
1922-1
Shinan
Koho
996
Jitsuyo
1 971-2011
Shinan
Toroku
Jitsuyo
Toroku
Koho
1996-2011
Shinan
Koho
1994-2011
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)
CA/
B I 〇S I S /MEDLINE
(STN ) ,
JST
Plus
/ JME DPlus
/ JST
7
8 0 ( JDreaml
l )
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
C.
Category*
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Y
Arabat
z i s
M . et
dermatophyte
real
- time
i dent
Y
pol
f
Dermato
cat
2007 ,
K o i chi
Nuclear
,
YOS H I DA
DNA
o f
al . ,
s equence
cribed
Derma
t o logi
s
o f
space
cal
c t ion/
o f
i f i cat
DNA
T rans
cribed
cal
Myco
Medi
Rapid
tonsuran
t rans
dete
ex
p . 681- 68 9
the
I nternal
tipl
Journal
I dent
on
mul
ion
t i sh
1- 4
common
ion
System
S equence
Space
logy
1- 4
s
,
o f
r
2001 .
p . 61- 67
Er i . et
T r i chophyton
s
ed
o f
novel
react
Bri
Vo l . 157 ,
Journal
Vo l . 42 ,
a
chain
,
Bas
s omal
se
si s
b y
Specie
s
Ribo
Japane
04 . 30 ,
Y
,
e
s cheme
Dermatophyte
1 . ,
Diagno
ymeras
on
logy
MAKIMURA
for
al . ,
i n f e c t ions
Relevant to claim No.
s
nucl
r
identi
b y
ear
ribo
(I TS )
S cience
,
f i cati
speci
1
f
c
s omal
region
2006 ,
on
PCR
bas
o f
1- 4
ed
on
i nternal
,
Journal
Vo l . 42 ,
o f
p . 225- 23 0
See patent family annex.
Further documents are listed in the continuation of Box C .
*
"A"
Special categories of cited documents:
document defining the general state of the art which i s not considered
to be of particular relevance
"T"
later document published after the international filing date or priority
date and not in conflict with the application but cited to understand
the principle or theory underlying tiie invention
"E"
earlier application or patent but published on or after the international
filing date
document which may throw doubts on priority claim(s) or which i s
cited to establish the publication date of another citation or other
special reason (as specified)
"X"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered novel or cannot be considered to involve an inventive
step when the document i s taken alone
"Y"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered t o involve an inventive step when the document i s
combined with one or more other such documents, such combination
being obvious to a person skilled in the art
"&"
document member of the same patent family
"L"
"O"
"P"
document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other means
to the international filing date but later than
Date of the actual completion of the international search
01
February
,
2011
(01 . 02 . 11 )
Name and mailing address of the ISA/
Japane
se
Patent
Date of mailing of the international search report
15
February
Authorized officer
Of f i c e
Facsimile No.
Form PCT/ISA/210 (second sheet) (July 2009)
Telephone No.
,
2011
(15 . 02 . 11 )
INTERNATIONAL
C (Continuation).
Category*
SEARCH REPORT
International application No.
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
MOCHI ZUKI Takashi
. e t a l . , I denti
f i cati o n o f
Several
Cl i n i cal
I s o l ate s o f Dermatophyte
s
Bas e d o n the
Nucl eoti d e Sequence
o f I nte rnal
T rans cribed
Space r 1 ( I T S 1 ) i n Nucl ear
Ribo s omal
DNA . , The Journal
o f Dermato logy ,
1 9 9 9 , Vol . 2 6 , p . 2 7 6 - 2 8 1
一4
J P 2008- 2 78871
( Canon
I nc . ) ,
2 0 November
2 0 0 8 (2 0 . 1 1 . 2 0 0 8 ) ,
ent i r e text
& US 2 0 0 9 / 0 0 8 1 6 6 6 A l
一4
Form PCT/ISA/2 10 (continuation of second sheet) (July 2009)
国際 出願 番 号
国 際調 査 報告
A .
0 7 1 7 2 7
発 明 の属す る分 野 の分類 （
国際特許 分類 （I P C ) )
Int.Cl.
B .
J P 2 0 1 0 /
P C T
C12Ql/68 (2006. 01) i , C12N15/09 (2006. 01) i
調 査 を行 った分 野
調 査 を行 った最小 限資 料 （
国 際特許 分類 （I P C ) )
Int.Cl.
C12Q1/68,
C12N15/09
最 小 限資料 以外 の資料 で調 査 を行 った分 野 に含 まれ る もの
日本 国実用新 案公 報
日本 国公 開実用新 案公 報
日本 国実用新 案 登録公 報
日本 国登録 実用新 案公 報
1 9 2 2 — 1 9 9 6 年
1 9 7 1 —2 0 1 1年
1 9 9 6 —2 0 1 1年
1 9 9 4
2 0 1 1年
国 際調 査 で使 用 した電 子デ ー タベ ー ス （
デ ー タベ ー ス の 名称 、調 査 に使 用 した用 語 ）
CA/BIOSIS/MEDLINE (STN)
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580
C .
(JDreamII)
関連 す る と認 め られ る文献
引用文 献 の
カテ ゴ リ一 水
Y
引用文 献名
Arabatzis
M.
by a novel
Dermatophytes
o
real-time
common derraatopnyte
polymerase
scheme,
British
chain
infections
1-4
reaction
Journal
of
2007 ， Vol. 157 ， p . 681—689
MAKIMURA Koicm,
Internal
， Diagnosis
identification
Dermatology,
Y
et al.
multiplex
detection/
関連す る
請 求項 の 番 号
及 び一部 の箇所 が 関連 す る とき は、 そ の 関連す る箇所 の表 示
Species
Identification
Based on the
Transcribed
Spacer
System
DNA Sequences
1. ,
for
of Nuclear
1-4
Ribosomal
曰本 医真 菌 学 会雑 誌 ，
2001. 04. 30 ， Vol. 42 ， p . 61-67
c 欄 の続 き に も文 献 が列 挙 され てい る。
*
引用 文献 の カテ ゴ リー
ΓΑ 」特 に 関連 の あ る文献 で は な く、一般 的技術 水 準 を示す
もの
ΓΕ 」国 際 出願 日前 の 出願 また は特許 で あ るが 、国際 出願 日
以後 に公 表 され た もの
「L 」優 先 権 主 張 に疑 義 を提起 す る文 献 又 は他 の文献 の発 行
日若 し くは他 の特 別 な理 由 を確 立 す るた め に 引用 す
る文 献 （
理 由を付す ）
Γθ 」 口頭 に よ る開示 、使 用 、展示 等 に言及 す る文 献
「Ρ 」国 際 出願 日前 で、かつ優 先 権 の主 張の基礎 とな る出願
0 1 .
0 2 .
2 0 1 1
国 際調 査機 関の名 称及 び あて先
日本 国特許 庁 （I S A
J Ρ )
郵便番 号 1 0 0 — 8 9 1 5
東京 都 千代 田区霞 が 関三 丁 目 4 番 3 号
l S A
の 日の後 に公 表 され た文献
「
τ 」国際 出願 日又 は優 先 日後 に公 表 され た文 献 で あ って
出願 と矛 盾 す るもので はな く、発 明 の原 理 又 は理 論
の理解 のた め に引用す るもの
rx 」特 に 関連 の あ る文献 で あ って 、 当該 文献 のみ で発 明
の新 規性 又 は進 歩性 が ない と考 え られ る もの
ΓΥ 」特 に 関連 の あ る文献 で あ って 、 当該 文献 と他 の 1 以
上 の文 献 との 、当業者 に とって 自明 で あ る組 合せ に
よって進 歩性 が ない と考 え られ る も の
Γ& 」 同一 パ テ ン トフ ァ ミ リー文献
国際調 査 報告 の発 送 日
国 際調 査 を完 了 した 日
様式 P C T
パ テ ン トフ ァ ミ リー に関す る別紙 を参 照。
2 1 0
1 5 .
0 2.
特許 庁審 査官 （
権 限 の あ る職員 ）
松原
電話番 号
(第 2 ペ ー ジ） （2 0 0 9 年 7 月）
2 0
1
4 Ν
4 1 5 4
寛子
0 3 —3 5 8 1 —1 1 0 1
内線
3 4 8 8
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
C
(続 き） .
P 2 0
P C
関連 す る と認 め られ る文 献
引用 文 献 の
カ テ ゴ リー *
Y
引用 文 献 名
YOSHIDA E
，
tonsurans
b y specific
ribosomal
interna
Rapid
丄 transcribed
Science,
MOCHIZUKI Takashi.
et al.
Isolates
o f Dermatophytes
Internal
Transcribed
2 1 0
，
Spacer
o f Trichophyton
on DNA sequences
spacer
2006
o f Dermatology,
，
(ITS)
1-4
o f nuclear
1 region,
Journal
Vol. 4 2 ， p . 225—230
Identification
Based on the
o f Several
Nucleotide
1 (ITS 1) i n Nuclear
Clinical
Sequence
Ribosomal
1-4
of
DNA. ，
1999 ， Vol. 26 ， p . 276—281
A ( キ ヤ ノ ン 株 式 会 社 ） 2008. 11. 20,
J P 2008-278871
I SA
identification
PCR based
o f Derraatological
2009/0081666
関連 す る
請 求 項 の番 号
及 び一 部 の箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の表 示
. et al.
The Journal
様式 P C T
0 7 1 7 2 7
Al
(第 2 ペ ー ジ の 続 き） （2 0 0 9 年 7 月）
全文 &
US
1-4