Download T7 RNA ポリメラーゼを用いた新規な DNA シークエンス 解析法としての

T 7 R N A ポ リ メ ラ ー ゼ を 用 い た 新 規 な DN A シ ー ク エ ン ス
解析法としての「転写シークエンス法」の開発
Development of “ Transcriptional Sequencing Method” as a Novel
DNA Sequencing Method Using T7 RNA Polymerase
2 00 7 年 7 月
伊澤
真樹
第 1 章
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法
1.1. DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 開 発 の 歴 史 ·································1
1.2. DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 原 理 ·····································2
1.3. CS 法 の 問 題 点 ····················································8
1.4. 本 博 士 論 文 研 究 の 意 義 ············································9
参考文献
第 2 章
研究方法
2.1. 菌 株 ···························································13
2.1.1. 供 試 菌 株 ··················································13
2.2. DNA 調 製 法 お よ び 保 存 法 ··········································13
2.2.1. プ ラ ス ミ ド DNA 調 製 法 ······································13
2.2.2. 宿 主 大 腸 菌 の 凍 結 保 存 法 ····································14
2.2.3. DNA の 保 存 法 ··············································14
2.3. DNA 解 析 法 ······················································14
2.3.1. ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 法 ······································14
2.3.2. Ethanol(EtOH)沈 殿 法 ·······································15
2.3.3. PCR 法 ····················································15
2.3.4. 制 限 酵 素 に よ る DNA の 処 理 法 ································15
2.3.5. ア ガ ロ ー ス ゲ ル か ら の DNA 抽 出 法 ····························15
2.3.6. DNA の 脱 リ ン 酸 化 処 理 ······································16
2.3.7. DNA の ラ イ ゲ ー シ ョ ン ······································16
2.3.8. DNA の 大 腸 菌 へ の 形 質 転 換 法 ································16
2.3.9. 分 光 光 度 計 を 用 い た DNA 定 量 法 ······························16
2.3.10 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 ····································17
参考文献
第 3 章
T7 RNAP の 基 質 と し て 認 識 可 能 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 開 発
3.1. 緒 言 ···························································18
3.2. 実 験 方 法 ·······················································18
3.2.1. 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築 ··································18
3.2.2. T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み 実 験 ·············19
3.3. 実 験 結 果 ·······················································19
3.3.1. 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築 ··································19
3.3.2. T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み の 評 価 ···········21
3.4. 考 察 ···························································24
3.5. 結 語 ···························································25
参考文献
第 4 章
蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み の 改 善 し た T7 RNAP 変 異 体 の 構 築
4.1. 緒 言 ···························································27
4.2. 実 験 方 法 ·······················································27
4.2.1. T7 RNAP タ ン パ ク 質 発 現 ベ ク タ ー の 構 築 ·······················27
4.2.2. T7 RNAP 変 異 体 の 構 築 お よ び T7 RNAP タ ン パ ク 質 の 精 製 ·········28
4.2.3. T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の polymerase 活 性 の 比 較 ······30
4.2.4. T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の 伸 長 活 性 の 比 較 ·············30
4.2.5. T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の 各 3'-dATP に 対 す る 取 り 込 み 効
率 の 比 較 ·························································30
4.2.6. T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 野 生 型 T7 RNAP に よ る 3'-dATP 添 加 に よ る
RNA 合 成 実 験 ·····················································31
4.2.7. T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y と 野 生 型 T7 RNAP の 各 3'-dNTP の
取 り 込 み 効 率 の 比 較 ················································31
4.2.8. T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 野 生 型 T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を
用 い た RNA 合 成 実 験 ················································31
4.3. 実 験 結 果 ·······················································32
4.3.1. T7 RNAP 変 異 体 の 構 築 ·······································32
4.3.2. 変 異 導 入 に よ る T7 RNAP の 酵 素 活 性 へ の 影 響 ···················34
4.3.3. 3'-dATP 濃 度 変 化 に よ る T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y と 野 生 型
T7 RNAP 伸 長 反 応 の 相 違 点 ···········································37
4.3.4. T7 RNAP 変 異 体 F644Y、 F667Y お よ び 野 生 型 T7 RNAP の 各 3'-dNTP の
取 り 込 み 効 率 の 比 較 ················································39
4.3.5. T7 RNAP 変 異 体 F644Y を 用 い た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み 効 率 改
善 に よ る 効 果 ······················································40
4.4. 考 察 ···························································41
4.5. 結 語 ···························································42
参考文献
第 5 章
TS 法 の 構 築
5.1. 緒 言 ···························································44
5.2. 実 験 方 法 ·······················································44
5.2.1. 鋳 型 DNA の 調 製 ·············································44
5.2.2. T7 RNAP に よ る ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ の 取 り 込 み 実 験 ···········45
5.2.3. Pyrophosphatase タ ン パ ク 質 の 精 製 ···························45
5.2.4. ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を 添 加 し た TS 反 応 ······················46
5.2.5. CS 法 と TS 法 の 最 適 鋳 型 DNA 量 の 比 較 実 験 ·····················46
5.2.6. RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 を 有 す る ポ リ ア ミ ン の 探 索 ·············46
5.2.7. TS 法 に お け る ポ リ ア ミ ン 添 加 に よ る 効 果 の 検 討 ················47
5.3. 実 験 結 果 ·······················································47
5.3.1. T7 RNAP に よ る ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ 取 り 込 み 条 件 の 検 討 ·······47
5.3.2. ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ 添 加 に よ る TS 法 に お け る コ ン プ レ ッ シ ョ ン の
解 消 ······························································50
5.3.3. TS 法 の 構 築 と TS 法 の 特 長 に つ い て の 評 価 ·····················52
5.3.4. ポ リ ア ミ ン 添 加 に よ る TS 法 へ の 効 果 の 検 討 ····················56
5.4. 考 察 ···························································59
5.5. 結 語 ···························································60
参考文献
第 6 章
TS 法 に よ る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 優 位 性 の 評 価
6.1. 緒 言 ···························································62
6.2. 実 験 方 法 ·······················································62
6.2.1. 鋳 型 DNA の 調 製 ·············································62
6.2.2. EGFR PCR 産 物 の TS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 ·············62
6.2.3. pTS1 ベ ク タ ー の 構 築 ········································63
6.2.4. CS 法 と TS 法 の 反 応 時 間 の 比 較 実 験 ····························64
6.3. 実 験 結 果 ·······················································64
6.3.1. TS 法 に お け る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 評 価 ·····················64
6.3.2. pTS1 ベ ク タ ー の 構 築 ·········································67
6.3.3. TS 法 と CS 法 に お け る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 比 較 ··············68
6.4. 考 察 ···························································69
6.5. 結 語 ···························································70
参考文献
第 7 章
TS 法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 構 築
7.1. 緒 言 ···························································72
7.2. 実 験 方 法 ·······················································72
7.2.1. TS 法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 ···············72
7.2.2. 難 解 読 領 域 を 有 す る MDA 産 物 の TS 法 を 用 い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 ·
··································································73
7.3. 実 験 結 果 ·······················································74
7.3.1. 難 解 読 領 域 の TS 法 を 用 い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 ··············74
7.3.2. 難 解 読 領 域 を 有 す る MDA 産 物 の TS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 ··
··································································79
7.3.3. TS 法 に よ る 難 解 読 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 の 応 用 ·················82
7.4. 考 察 ···························································85
7.5. 結 語 ···························································87
参考文献
第８章
履歴書
研究業績
謝辞
総 括 ························································90
第 1章
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法
1.1. DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 開 発 の 歴 史
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 は 、DNA 分 子 を 構 成 す る ４ 種 の 塩 基（ A、T、G、C）の
配列順を解読する方法であり、遺伝子関連研究のみならず遺伝子検査などの臨
床分野においても広く使用されている遺伝子解析技術の基礎をなす技術である。
DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 法 は 、 1977年 に マ キ サ ム お よ び ギ ル バ ー ト に よ り 、 化 学
反 応 を 用 い た マ キ サ ム -ギ ル バ ー ト 法 (1)が 開 発 さ れ た 。 方 法 の 概 要 は 以 下 の 通 り
で あ る 。 ま ず 、 DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 い た い DNA断 片 の 5'ま た は 3'末 端 を T4
polyncleotide kinaseに よ っ て 放 射 性 同 位 体 （ RI） で 標 識 し た の ち 、 塩 基 種 特 異
的 に 反 応 す る 薬 剤 を 用 い て 部 分 分 解 す る 。 つ ぎ に 部 分 分 解 し た DNA断 片 を ポ リ ア
ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 に よ り 分 離 す る こ と で DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う も
の で あ る 。 マ キ サ ム -ギ ル バ ー ト 法 は 開 発 し て し ば ら く の 間 は 後 述 す る ジ デ オ キ
シ 法 と 比 べ て 広 く 用 い ら れ て い た が 、ジ デ オ キ シ 法 の 開 発 お よ び そ の 後 の 改 良 に
伴って現在はほとんど使われていない。
マ キ サ ム - ギ ル バ ー ト 法 が 開 発 さ れ た 年 と 同 じ 1 9 7 7 年 に 、サ ン ガ ー ら が F i g . 1 . 1
に 示 す よ う な 酵 素 反 応 を 利 用 し た DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 法 を 開 発 し た (2)。 ジ デ オ
キ シ 法 と 称 さ れ る こ の 方 法 は 、D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 い た い D N A に 相 補 的 な 配
列 を 有 す る D N A を D N A p o l y m e r a s e（ D N A P ） に よ り 合 成 す る 際 に D N A 合 成 反 応 の 開 始
に 必 要 な D N A オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （ プ ラ イ マ ー ）、 D N A P の 基 質 と な る R I 標 識
deoxynucleotide triphosphate(dNTP)と と も に DNA合 成 の 反 応 終 結 剤 と し て 機 能
す る dideoxynucleotide triphosphate(ddNTP) を 反 応 液 に 添 加 す る こ と で DNA 合
成 反 応 を 部 分 的 に 終 結 さ せ た DNA断 片 が で き る こ と を 利 用 し た 方 法 で あ る 。 こ の
DNA合 成 反 応 に よ り 塩 基 種 ご と に 調 製 し た DNA断 片 を 変 性 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ
ル 電 気 泳 動 に よ り 分 離 す る こ と で DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う こ と が で き る 。
ジデオキシ法は、サンガーらによって開発された従来法に基づいてさらなる改
良 が そ の の ち 加 え ら れ 、R I を 用 い た D N A 標 識 で は な く 蛍 光 を 用 い た D N A 断 片 の 標 識
を 耐 熱 性 DNAPの DNA合 成 反 応 に お い て 行 う サ イ ク ル シ ー ク エ ン ス 法 （ CS法 ） が 開
発 さ れ た ( 3 ) 。C S 法 は 従 来 の R I を 用 い た 方 法 と 比 較 し て 放 射 線 被 爆 の リ ス ク や 管 理
区 域 な ど で の 実 験 が 必 要 な い と い う 利 点 の 他 に DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 に 必 要 な 鋳
型 DNA量 が 少 な い な ど の 利 点 を 有 す る 。 CS法 は 蛍 光 自 動 シ ー ク エ ン サ ー と と も に
現 在 の DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 主 流 と な っ て お り 、 CS法 を 用 い て こ れ ま で に ヒ
ト な ど の 多 く の 生 物 の ゲ ノ ム DNAを 対 象 に し た 大 規 模 な 塩 基 配 列 解 析 プ ロ ジ ェ ク
ト が 進 行 し て い る (4,
5)
。 さ ら に CS法 を 用 い た DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 法 は 基 礎 研 究
分野のみならず疾患の遺伝子診断や医薬品に対する副作用の発現予測などのテ
ーラーメード医療分野への応用も進んできている。
1
Fig. 1.1
Procedure of dideoxy sequencing reaction.
1.2. DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 原 理
こ こ で は ま ず 、C S 法 の 基 本 原 理 で も あ る ジ デ オ キ シ 法 の 原 理 に つ い て 説 明 す る 。
Fig. 1.1に 示 す よ う に 、 シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 い た い 2本 鎖 DNAは 、 反 応 前 に 1本
鎖 DNA依 存 的 DNAPの 鋳 型 DNAと す る た め に ア ル カ リ 変 性 や 熱 変 性 に よ り 1本 鎖 DNA
と す る 必 要 が あ る 。 つ ぎ に 、 1本 鎖 DNAと し た 鋳 型 DNAと と も に 、 1本 鎖 DNA依 存 的
DNAP、 プ ラ イ マ ー 、 4種 類 の dNTPと 1種 類 の ddNTPを ひ と つ の 反 応 液 中 に 添 加 し て
D N A 合 成 反 応 を 行 う 。こ の 反 応 は d d N T P 種 ご と に 行 う 必 要 が あ る た め 同 時 に ４ つ の
独立した反応を行う。
ジ デ オ キ シ 反 応 に お け る D N A 合 成 反 応 は 1 本 鎖 D N A 依 存 的 D N A P（ E C 2 . 7 . 7 . 7 ）に よ
り 触 媒 さ れ 、 実 際 に は E. coli 由 来 の DNA polymerase 変 異 体 で あ る Klenow
Fragment(1) や E. coli フ ァ ー ジ で あ る T7 フ ァ ー ジ 由 来 の T7 DNA polymerase(6) が
DNAPと し て 用 い ら れ る 。 DNAPは Fig. 1.3 に 示 す よ う に 合 成 DNA鎖 の 3'末 端 と 基 質
と し て 取 り 込 ん だ d N T P の 5 ' 側 の ト リ リ ン 酸 の 間 で 縮 合 反 応 を 起 こ し 、ヌ ク レ オ チ
ド間にホスホジエステル結合を形成させるとともにピロリン酸を産生する反応
を 触 媒 す る 酵 素 で あ り 、D N A 合 成 反 応 は 鋳 型 D N A と な る 1 本 鎖 D N A の 相 補 鎖 に お い て
2
5'→ 3'の 方 向 に 進 行 す る 。
Fig. 1.2. Reaction Mechanism of DNAP Catalyzed Reaction.
Fig. 1.3
DNAP Reaction.
Fig. 1.4に は DNAPの 基 質 と し て ジ デ オ キ シ 法 で 用 い る dNTPと ddNTPの う ち dATP
と ddATPの 化 学 式 を 例 と し て 示 し て い る 。 ジ デ オ キ シ 反 応 に お い て は 同 一 反 応 液
中 に dNTPと ddNTPが 存 在 し 、 DNAPに よ り 両 方 が そ の 基 質 と し て 認 識 さ れ 合 成 DNA
鎖 に 取 り 込 ま れ る 。 dNTPと ddNTPで は リ ボ ー ス の 3'位 に お け る 置 換 基 が そ れ ぞ れ
OH基 と H基 と な っ て お り 、 ジ デ オ キ シ 法 に お い て は こ の 構 造 の 違 い に よ り DNAPに
よ る 取 り 込 み 後 の DNA反 応 過 程 が 異 な る こ と を 利 用 す る 点 が 重 要 な 部 分 で あ る 。
3
こ の DNA合 成 反 応 に お い て ddNTPが 基 質 と し て 取 り 込 ま れ た 場 合 に は ddNTPの リ ボ
ー ス の 3'末 端 に 次 の ヌ ク レ オ チ ド を 連 結 す る た め に 必 要 な OH基 を 持 た な い た め
dNTPの 代 わ り に ddNTPが 取 り 込 ま れ る と そ こ で DNA合 成 鎖 の 伸 長 が 停 止 す る 。
Fig. 1.4
Structure of dATP and ddATP.
こ の よ う な 2種 類 の 基 質 と と も に 、 ジ デ オ キ シ 法 に お い て は RI標 識 し た dNTPお
よ び DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 い た い DNA領 域 の 5'側 の 上 流 配 列 と 相 補 的 な 配 列
を 有 す る プ ラ イ マ ー を 用 い て DNA合 成 反 応 を 行 う 。dNTPの い ず れ か に P32等 の RIで
標 識 し た も の を 用 い る こ と で 、d d N T P の 取 り 込 み に よ り 反 応 停 止 し た D N A 断 片 を R I
に よ り 標 識 す る こ と が で き る 。 具 体 的 に は 、 あ る 反 応 液 中 に 例 え ば 4種 類 の dNTP
と ddATPが 添 加 さ れ て い る 条 件 下 で は 、 DNA配 列 の Aを 合 成 す る 場 合 に dATPを 取 り
込 ん だ 際 に は D N A 合 成 反 応 は さ ら に 進 行 し 、d d A T P の 場 合 に そ の 時 点 で 伸 長 反 応 は
停 止 す る 。前 者 の 場 合 に つ い て は 、つ ぎ の 配 列 が A 以 外 の も の で あ る 場 合 に は D N A
鎖 の 伸 長 反 応 が さ ら に 進 行 す る が 、 再 度 、 Aの 配 列 を 合 成 す る 場 合 に は 再 度 dATP
と ddATPの 競 合 的 な 反 応 が 起 こ る 。 こ の よ う な 反 応 過 程 を 繰 り 返 す こ と に よ り 、
合 成 さ れ た DNA鎖 の 3'末 端 に ddATPが 取 り 込 ま れ た 様 々 な 鎖 長 の DNA断 片 を 合 成 す
る こ と が で き る 。 同 様 の 反 応 を ddGTP， ddCTP， ddTTPを 添 加 し て 行 う こ と に よ り
合 成 DNA鎖 の 3'末 端 に そ れ ぞ れ の ddNTPが 取 り 込 ま れ た 様 々 な 鎖 長 の 1本 鎖 DNA断
4
片 を 調 製 す る こ と が で き る 。調 製 し た 様 々 な 鎖 長 の 1 本 鎖 D N A 断 片 は 尿 素 入 り の 変
性 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 に よ り 分 離 す る 。ジ デ オ キ シ 法 で 調 製 さ れ た
D N A は 1 本 鎖 D N A で あ る が 、1 本 鎖 の 核 酸 は 分 子 内 で 水 素 結 合 を 介 し た 二 次 構 造 を 形
成 す る こ と が 知 ら れ て い る 。二 次 構 造 の 形 成 は 電 気 泳 動 に お い て 分 子 量 に 依 存 し
た 正 確 な 分 離 の 妨 げ と な る が 、ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル に 尿 素 を 添 加 す る こ と で
二 次 構 造 の 形 成 が 抑 制 さ れ 、正 確 な 分 離 が 可 能 と な る 。ひ き つ づ き 電 気 泳 動 後 の
ゲ ル を X線 フ ィ ル ム に 接 触 さ せ る こ と で RIか ら の 放 射 線 を 検 出 す る オ ー ト ラ ジ オ
グ ラ フ ィ ー 法 に よ り 電 気 泳 動 パ タ ー ン を 視 覚 化 す る こ と が で き る 。得 ら れ た 電 気
泳 動 パ タ ー ン は ハ シ ゴ 状 の パ タ ー ン を 示 し 、低 分 子 側 か ら 順 々 に 判 読 す る こ と に
より最終的に塩基配列が決定できる。
ジ デ オ キ シ 法 を 用 い る こ と に よ り DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う こ と が 可 能 と な
っ た が 、 こ の 方 法 は RIを 用 い て DNAを 標 識 し て い る た め に 作 業 者 の 放 射 線 被 爆 に
よ る 健 康 上 の 問 題 や 厳 格 に 管 理 さ れ た R I 管 理 区 域 内 の 作 業 と な る こ と 、そ し て 作
業 に よ り 放 射 性 廃 棄 物 が 発 生 す る な ど の 様 々 な 問 題 が あ り 、一 般 的 に 広 く 用 い ら
れ る た め に は 多 く の 問 題 が あ っ た 。さ ら に 、D N A 合 成 反 応 の 前 に 鋳 型 D N A を ア ル カ
リ 溶 液 に よ る 変 性 や 熱 変 性 を 用 い る こ と に よ り 1本 鎖 DNAと す る 煩 雑 な 操 作 も 必
要 が あ っ た 。 ま た 、 DNA合 成 反 応 は プ ラ イ マ ー の 3'末 端 か ら 開 始 さ れ て 鋳 型 DNA
の 末 端 ま で 進 行 す る と DNA合 成 反 応 が 停 止 す る が 、 鋳 型 DNAは DNA合 成 反 応 に 一 度
用 い ら れ る だ け で あ る こ と も あ り DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 に 必 要 な 鋳 型 DNAは 約 10
μ gと 多 く 必 要 と な っ て い た 。 加 え て こ れ 以 外 に も 電 気 泳 動 結 果 か ら の 塩 基 配 列
の判読が作業者の目視によるためにその客観評価が難しく人為的な間違いの起
きる危険性が高いことも大きな問題である。
こ の よ う な 多 く の 問 題 が 従 来 の ジ デ オ キ シ 法 に あ る た め 、現 在 は こ の ジ デ オ キ
シ 法 を 基 に し て 改 良 さ れ た CS法 が 広 く 用 い ら れ て い る 。 CS法 の 開 発 に よ り 、 DNA
シ ー ク エ ン ス 解 析 が 広 く 用 い ら れ る よ う に な っ て き た 。 こ の CS法 の 反 応 過 程 を
Fig. 1.5に 示 す .
5
Fig. 1.5
Procedure of Cycle Sequencing.
そ の 特 徴 は 第 一 に 従 来 の ジ デ オ キ シ 法 で は 至 適 反 応 温 度 が 37 ℃ で あ る Klenow
Fragment や T7 DNA polymerase が 用 い ら れ て い た が 、 こ れ ら の DNAP の か わ り に
Thermus aquatics 由 来 の 耐 熱 性 DNAPで あ る Taq DNAPが 用 い ら れ た こ と で あ る 。
耐 熱 性 DNAPを 用 い る こ と で 反 応 前 の 鋳 型 DNAの 変 性 操 作 が 必 要 な く 、 1本 鎖 DNAの
調 製 が 反 応 液 中 で DNA合 成 反 応 と 同 時 に 行 え る よ う に な っ た こ と で 、 煩 雑 な 反 応
前 処 理 の 必 要 が 無 く な っ た 。さ ら に 、サ ー マ ル サ イ ク ラ ー と 呼 ば れ る 温 調 機 器 を
用 い て 反 応 温 度 を 変 化 さ せ る こ と で 鋳 型 DNAの 1本 鎖 DNAへ の 変 性 だ け で は な く プ
ラ イ マ ー の 鋳 型 D N A と の 結 合 （ ア ニ ー リ ン グ ）、 D N A 合 成 反 応 の 各 反 応 過 程 を 繰 り
返 し 行 う こ と で DNA合 成 反 応 を 連 続 的 に 行 う こ と が 可 能 に な っ た 。 こ れ に よ り 従
来 の ジ デ オ キ シ 反 応 で は 難 し か っ た 鋳 型 D N A の リ サ イ ク ル 、す な わ ち D N A 合 成 反 応
に 一 回 使 用 さ れ た 鋳 型 DNAが 反 応 液 中 で 繰 り 返 し 使 用 で き る よ う に な っ た 。 こ の
繰 り 返 し 使 用 の 効 果 で 一 回 の DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 に 必 要 な DNAが 従 来 法 の 場 合
6
と 比 較 し て 1 / 1 0 量 程 度 に ま で 減 ら す こ と が 可 能 と な り 、鋳 型 調 製 の コ ス ト ダ ウ ン
や 作 業 の 省 力 化 に 大 き く 貢 献 し た 。 第 二 の 特 徴 と し て は 、 DNAの 標 識 を 従 来 法 の
RI標 識 さ れ た dNTPを 用 い る 方 法 か ら 蛍 光 標 識 し た ddNTPを 用 い た DNA標 識 法 を 用
い る こ と に よ り 、R I 使 用 に お け る 様 々 な デ メ リ ッ ト を 解 消 す る こ と が で き た 。C S
法 で は そ れ ぞ れ の ddNTPを 、 蛍 光 波 長 が 異 な り 蛍 光 自 動 シ ー ク エ ン サ ー に お い て
分 光 可 能 な 蛍 光 物 質 に よ り 標 識 す る こ と で d d A T P ，d d G T P ，d d C T P ，d d T T P を そ れ ぞ
れ 区 別 し て 検 出 す る こ と が で き る (7,
8)
。こ れ に よ り R I 使 用 に よ る 様 々 な 問 題 の 解
消だけでなく後述する蛍光自動シークエンサーを用いることにより作業者の目
視による泳動結果の判読から機器およびソフトウェア使用による泳動結果の客
観 的 な 判 読 が で き る よ う に な っ た 。蛍 光 標 識 し た d d N T P を 取 り 込 ん だ D N A 断 片 の 電
気 泳 動 お よ び 検 出 は Fig. 1.6に 示 す 蛍 光 自 動 シ ー ク エ ン サ ー に よ っ て 行 う こ と
が で き 、変 性 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 に よ る 分 離 と 同 時 に A r レ ー ザ ー 等
に よ る ゲ ル 中 で の 蛍 光 の 励 起 お よ び CCD素 子 や 光 電 子 増 倍 管 に よ る 標 識 ddNTP由
来 の 蛍 光 の 検 出 を 行 い 、検 出 さ れ た 蛍 光 シ グ ナ ル が ど の 塩 基 に 対 応 す る も の か を
ソフトウェアによる客観的な判別による塩基配列の解読が行える。
Fig. 1.6
Mechanism of Automated DNA Sequencer.
7
1.3.
CS 法 の 問 題 点
CS 法 を 用 い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 は RI に よ る 被 爆 も な く 機 器 を 利 用 し た 簡
便 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 と な っ た こ と で 大 規 模 な ゲ ノ ム DNA の DNA シ ー ク
エンス解析プロジェクトなどや臨床分野への応用などが広く進むことになった。
し か し な が ら 、C S 法 に は D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う に あ た り 、さ ら に 解 決 が
必 要 な 以 下 に 示 す い く つ か の 問 題 点 が あ り 、 そ の 解 決 が DNA シ ー ク エ ン ス 解 析
の使用において極めて重要である。
問 題 の 第 一 に は 、 現 在 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て は 解 析 対 象 の DNA は
目 的 の DNA 領 域 が 簡 便 に 調 製 で き る こ と か ら PCR 産 物 と な る こ と が 極 め て 多 い 。
し か し な が ら PCR 産 物 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に つ い て CS 法 を 用 い る 場 合 に は
PCR 産 物 中 の dNTP や PCR プ ラ イ マ ー の PCR 産 物 中 か ら の 除 去 ま た は 不 活 性 化 処
理 を C S 法 に 用 い る 前 に 行 う 必 要 で あ る 。d N T P s と P C R プ ラ イ マ ー の 除 去 ま た は
酵 素 反 応 に よ る 不 活 性 化 処 理 が 必 要 な 理 由 は P C R 反 応 、C S 反 応 の 両 方 が 耐 熱 性
DNA polymerase に よ る DNA 合 成 反 応 に 基 づ い て い る こ と に よ る 。 PCR 産 物 中 に
は PCR 産 物 の 増 幅 反 応 に お い て 未 反 応 の ま ま の dNTP や PCR プ ラ イ マ ー が 残 存 し
て い る が 、 ま ず 残 存 dNTP が CS 反 応 に 混 入 し た 場 合 に は CS 反 応 液 中 の dNTP と
d d N T P の 相 対 比 の 変 化 を も た ら し 、d d N T P の 相 対 量 が 低 下 す る こ と に な る 。そ の
結果、最終的に得られる蛍光シグナルの低下や蛍光シグナルの不均一となる原
因となり、シークエンス解読鎖長が短くなるばかりでなくシークエンス精度も
低 下 し 、 大 き な 問 題 と な る 。 つ ぎ に 残 存 PCR プ ラ イ マ ー が 混 入 し た 場 合 に は 、
DNAP に よ る DNA 合 成 反 応 は Fig. 1.5 に 示 す よ う に プ ラ イ マ ー と 鋳 型 DNA の ア
ニ ー リ ン グ 部 位 か ら 開 始 さ れ る が 一 つ の CS 反 応 液 中 に 配 列 の 異 な る 複 数 種 の
プライマーが存在してしまうため、プライマーがアニーリングしている複数の
部 位 か ら CS 反 応 が 開 始 さ れ て し ま う こ と に な り DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 不 能 と な
っ て し ま う 。 こ の よ う な 問 題 が あ る た め 、 PCR 産 物 の 反 応 前 処 理 が 必 要 と な る
が、しかしながらこの操作は処理時間の増加に加え煩雑な操作を伴うだけでな
く コ ス ト 増 の 要 因 と な っ て い る 。通 常 、C S 法 の 場 合 は 反 応 前 に 鋳 型 D N A と な る
PCR 産 物 か ら ゲ ル ろ 過 法 や シ リ カ 膜 を 用 い た 精 製 法 に よ り dNTP と PCR プ ラ イ マ
ー を 取 り 除 く 方 法 や alkaline phosphatase と exonuclease I を 用 い た 酵 素 に よ
る dNTP と PCR プ ラ イ マ ー の 不 活 性 化 処 理 を 行 う 方 法 な ど が 用 い ら れ る (9)。 こ
の よ う な 反 応 前 操 作 は 極 め て 煩 雑 か つ 工 程 の 多 い 操 作 で あ り 、 こ の こ と は DNA
シークエンス解析の自動解析システムの開発や微細加工技術を用いたデバイス
開発などにおける障害ともなっている。
問 題 の 第 二 に は 、 CS 法 で 用 い て い る DNAP 自 身 に は 2 本 鎖 DNA の 1 本 鎖 DNA
へ の 解 離 を 触 媒 す る よ う な helicase 様 の 酵 素 活 性 は な く 反 応 温 度 上 昇 な ど の
処理が必要となる。また、それぞれの反応は反応温度の変化により連続的に引
き起こされているためサーマルサイクラー等の専用機器による反応温度の変化
8
が必要であるが機器による温度調節を行うことによる時間的ロスが大きく反応
時間の大幅な短縮は現状では難しいため現在よりも解析時間の短縮が必要な臨
床応用分野での利用においては、なんらかの改善が必要である。
問 題 の 第 三 に は 、 CS 法 を 利 用 し て DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た 場 合 に GC
含 量 が 多 い （ GC リ ッ チ ） DNA 領 域 や リ ピ ー ト 配 列 な ど は 原 理 上 解 読 不 能 と な る
こ と が 多 い 。 CS 法 に お い て は Fig. 1.5 に 示 す よ う に 熱 変 性 に よ っ て 鋳 型 DNA
を 1 本 鎖 DNA と す る 必 要 が あ る が 1 本 鎖 DNA は 分 子 内 で 水 素 結 合 を 介 し て 高 次
構 造 を 形 成 す る こ と が 知 ら れ て お り 、 GC リ ッ チ な 配 列 の 場 合 に は AT 配 列 の 場
合と比較して水素結合が多く形成されることに起因する強固な二次構造が形成
さ れ る た め 、 解 読 不 能 と な る 。 鋳 型 DNA で あ る 1 本 鎖 DNA に 強 固 な 二 次 構 造 が
形 成 さ れ る と 二 次 構 造 を 形 成 し て い る 領 域 で DNAP の DNA 合 成 反 応 が そ の 領 域 の
直 前 で 停 止 す る 。 そ の た め に GC リ ッ チ な DNA 配 列 は CS 法 で の 解 析 は 極 め て 困
難 と さ れ 、 こ の よ う な 問 題 を 解 決 す る 目 的 で こ れ ま で に DNA の 水 素 結 合 形 成 を
解 離 さ せ る た め に dimethyl sulphoxide(DMSO)や ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を DNA
合成反応液に添加することによる改善方法が報告されてきたがいずれも解決に
は不十分であり、これまでの技術ではこの問題を完全に解消することは難しい
(10, 11)
。
しかし、このような領域は意味のない領域というわけではなく、生物学的あ
る い は 産 業 面 で 重 要 な DNA 領 域 が 含 ま れ て い る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 生
物学的に重要なものとして遺伝子発現制御を担うプロモーターやエンハンサー
領 域 な ど が 多 く 存 在 し て い る CpG island が 知 ら れ て い る (12)。 CpG island は 極
め て GC リ ッ チ な DNA 領 域 で あ る 。 CpG island は ま た ゲ ノ ム イ ン プ リ ン テ ィ ン
グ な ど に よ る 遺 伝 子 発 現 を 制 御 す る 領 域 と し て 知 ら れ て お り (13,
14)
、メチル化
に よ る 5-methyl cytidine の 形 成 お よ び 脱 メ チ ル 化 が 遺 伝 子 配 列 自 身 の 変 化 を
伴わずに遺伝子発現を制御して細胞の発生および分化の過程において重要な働
きをする重要な遺伝子領域である。さらに産業面においては、一例として抗生
物 質 な ど を 産 生 す る 放 線 菌 に お い て は ゲ ノ ム 全 体 が GC リ ッ チ な 染 色 体 を 有 し
ているが、このような有用微生物の遺伝子解析は産業上有用な遺伝子産物の探
索 や 創 製 に お い て も 極 め て 重 要 で あ る (15)。
以 上 に 大 き な 問 題 点 を ３ つ に 分 け て 記 述 し た が 、C S 法 で 解 読 不 能 な D N A 領 域
をどのようにして解読するのかは極めて大きな問題である。
1.4.
本博士論文研究の意義
１ 章 (1.3.)で 述 べ た よ う に CS 法 に は 解 決 す べ き い く つ か の の 問 題 が あ る 。 1
章 ( 1 . 3 . ) に 記 述 し た よ う に 、C S 法 の 改 良 に よ っ て 対 応 す る こ と も 試 み ら れ て き
たが、現時点では実用的に満足できるような形式での解決には至っていない。
換 言 す れ ば 、 CS 法 の 有 す る こ れ ら の 問 題 は DNAP を ジ デ オ キ シ 法 に お け る DNA
9
合成反応に用いていることに起因する問題であると考えることができる。した
が っ て 、C S 法 と は 異 な る 原 理 を 有 す る 新 規 な D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 開 発 が
求められている。
そこで、本論文においてはジデオキシ法における伸長反応に用いる酵素に新
た に R N A p o l y m e r a s e ( R N A P ) を 用 い る こ と に よ り 、C S 法 の 問 題 点 を 解 決 で き る 新
た な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 開 発 が 可 能 で あ る と 予 想 し た 。 本 論 文 で は 、 ま
ず E. coli フ ァ ー ジ で あ る T7 フ ァ ー ジ 由 来 の T7 RNA polymerase（ T7 RNAP）
を 用 い た in vitro 転 写 反 応 を ジ デ オ キ シ 法 へ 応 用 す る こ と を 考 え た 。 T7 RNAP
は 、T 7 プ ロ モ ー タ ー 下 流 の D N A 配 列 に 相 補 的 な R N A を 合 成 す る こ と が 可 能 な た
め 、人 工 的 に 試 験 管 内 で R N A 合 成 を 行 う i n v i t r o 転 写 法 に お い て 用 い ら れ て い
る 酵 素 で あ る (16)。 T7 RNAP は 、 Fig. 1.7 に 示 す よ う な RNA 合 成 反 応 を 触 媒 す る
DNA
依 存 的
RNA
polymerase （ RNAP 、 EC2.7.7.6 ） に 属 し 、 nucleotide
triphosphate(NTP)を 基 質 と し て 取 り 込 み こ と で 鋳 型 DNA 配 列 に 相 補 的 な RNA
の合成を触媒する酵素である。
Fig. 1.7
RNAP Reaction.
本 論 文 で 用 い る T7 RNAP は 、 全 長 882 ア ミ ノ 酸 で RNA 結 合 ド メ イ ン と
polymerase ド メ イ ン の 二 つ の ド メ イ ン で 構 成 さ れ て い る 約 100 KDa の タ ン パ ク
質 で あ る が RNAP の 中 で も 特 殊 な 単 量 体 の 酵 素 で あ る こ と に 特 徴 の 一 つ が あ る 。
単量体であることは酵素精製や安定した実験結果の取得において多量体の酵素
と比較して大きな利点があり、このことは最終的な実用段階においても安定的
な 製 品 製 造 や コ ス ト 削 減 な ど の 効 果 も も た ら す 。 反 応 の 開 始 に お い て RNAP は
D N A P と 異 な り 、最 初 に プ ロ モ ー タ ー と よ ば れ る D N A 配 列 へ の 結 合 が 必 要 で あ る 。
T7 RNAP の 反 応 が 起 き る た め に は T7 RNAP が 認 識 し 結 合 す る 23 bp の DNA 配 列
10
で あ り 、 T7 プ ロ モ ー タ ー が 鋳 型 DNA 中 に 存 在 し て い る こ と が 必 要 で あ る 。
T7 RNAP の polymerase 反 応 過 程 と DNAP の polymerase 反 応 過 程 の 比 較 に つ い
て Fig. 1.8 に 示 す 。 T7 RNAP は 酵 素 自 身 に helicase 様 の 酵 素 活 性 を 有 し て い
る た め に 鋳 型 DNA の 1 本 鎖 DNA へ の 変 性 お よ び 反 応 後 の 巻 き 戻 し も 行 う こ と が
可 能 で 、 反 応 温 度 も 37℃ の 恒 温 で あ る た め Taq DNAP の よ う な サ ー マ ル サ イ ク
ラ ー に よ る 温 度 制 御 は 必 要 が な い 。 RNA 合 成 反 応 後 す み や か に 鋳 型 DNA の 巻 き
戻 し も 行 わ れ る こ と か ら 、 反 応 に 使 用 さ れ た 鋳 型 DNA が 同 一 反 応 液 中 で 繰 り 返
し 鋳 型 DNA と し て 機 能 す る こ と が で き る 。 さ ら に T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応
に お い て は 鋳 型 DNA が 1 本 鎖 と な る 領 域 は T7 RNAP が RNA 合 成 時 に 結 合 す る 短
い 領 域 の み と な る こ と で 鋳 型 DNA が 1 本 鎖 DNA の 状 態 で 分 子 内 で の 二 次 構 造 を
形 成 す る よ う な DNAP の 場 合 と 同 様 な リ ス ク が 極 め て 少 な い た め 、 CS 法 で は 困
難 で あ っ た G C リ ッ チ D N A 領 域 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 に な る 。ま た 、T 7
R N A P は 、d ( G C ) 1 6 D N A の よ う な Z 型 構 造 を 示 す D N A を 鋳 型 D N A と し て R N A 合 成 で
き る と い う 報 告 も あ り 、 こ れ も 長 所 で あ る (17)。
Fig. 1.8
Comparison of DNAP Reaction with DNAP Reaction.
本 論 文 で は 、 以 上 の よ う な 特 長 を 有 す る T7 RNAP を 用 い て ジ デ オ キ シ 反 応 を
行 う た め に 必 要 な 蛍 光 標 識 3'-deoxynucleoside triphosphate（ 蛍 光 タ ー ミ ネ
ー タ ー ） の 開 発 と 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み 活 性 が 上 昇 し た T7 RNAP 変 異
体 、 こ れ ら を 利 用 す る た め に 最 適 な 試 薬 類 の 開 発 を 行 う こ と で T7 RNAP を 用 い
11
た ジ デ オ キ シ 法 を 開 発 し CS 法 の 問 題 点 の 解 消 し た 新 規 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析
法の開発を行った。
参考文献
(1) A.M. Maxam, W. Gilbert, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 74, 560-564(1977).
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(17) P. Droge, F. M. Pohl, Nucleic Acids Res., 19, 5301-5306(1991).
12
第 2 章 研究方法
本章では、研究を進めるに当たって基本になる一般的な実験方法について記
述する。なお、特殊な実験方法については各章ごとに記述する。
2.1. 菌 株
2.1.1. 供 試 菌 株
遺 伝 子 組 換 え 宿 主 大 腸 菌 と し て は 、 Escherichia coli JM109(Nippon gene,
Tokyo, Japan)を 使 用 し た 。
2.2. DNA 調 製 法 お よ び 保 存 法
2.2.1. プ ラ ス ミ ド DNA 調 製 法
プ ラ ス ミ ド 精 製 キ ッ ト を 用 い た 遺 伝 子 組 換 え プ ラ ス ミ ド DNA の 調 製 は 、 抗 生
物 質 ampicillin を 添 加 し た LB 培 地 (1)を 用 い て 37℃ で 18 時 間 培 養 し た 大 腸 菌
か ら QiAprep Plasmid Mini kit(QIAGEN, Tokyo, Japan)に お い て RNase A を P1
Buffer に 添 加 せ ず 使 用 す る こ と に よ り 、 プ ラ ス ミ ド DNA を 調 製 し た 。 RNase A
の無添加以外の操作法については、製品添付の取扱い説明書に従って、プラス
ミ ド DNA の 調 製 を 行 っ た 。
CsCl 密 度 勾 配 超 遠 心 法 を 用 い た 遺 伝 子 組 換 え プ ラ ス ミ ド DNA の 調 製 は 、
ampicillin を 添 加 し た LB 培 地 (1)250 ml を 三 角 フ ラ ス コ に 入 れ 、 組 換 え プ ラ ス
ミ ド D N A を 保 持 し た 大 腸 菌 を 植 菌 し た の ち 、3 7 ℃ で 1 8 時 間 培 養 し た 。培 養 後 の
溶 液 を 培 養 液 用 の 遠 心 管 に 移 し 、 冷 却 遠 心 器 himac CR20(Hitachi koki, Tokyo,
Japan)を 用 い て 4,000 X g で 15 分 遠 心 処 理 す る こ と で 大 腸 菌 の 菌 体 を 沈 殿 さ せ
た 。 遠 心 管 か ら 上 清 を 除 去 し 、 2.5 ml の Sol I 溶 液 (1)を 添 加 し て 、 大 腸 菌 の 菌
体 を 懸 濁 し た の ち 、 室 温 で 10 分 間 静 置 し た 。 静 置 し た の ち に 、 10 ml の Sol II
溶 液 (1)を 添 加 し て 、 ゆ る や か に 攪 拌 し 、 氷 中 で 10 分 間 静 置 し た 。 10 分 間 静 置
し た 溶 液 に 7.5 ml の Sol III 溶 液 (1)を 添 加 し て 十 分 に 混 合 し た の ち 、 上 清 を
採 取 し た 。採 取 し た 上 清 に 0 . 6 倍 量 の 2 - p r o p a n o l を 添 加 し 、遠 心 処 理 す る こ と
で DNA 沈 殿 物 を 得 た 。 得 ら れ た DNA 沈 殿 物 に 8.4 ml の TE(10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA, pH 7.5)を 添 加 し て DNA 沈 殿 物 を 溶 解 し た 。 さ ら に CsCl 9.7 g お よ び
ethidium bromide(5 ng/ml)0.84 ml を 添 加 し 、 CsCl を 溶 解 さ せ た の ち 、 超 遠 心
用の遠心管に移し、専用のシーラーを用いて遠心管の口をシールした。シール
し た 遠 心 管 を 超 遠 心 器 himac CP 70 MX(Hitachi koki, Tokyo, Japan)を 用 い て 、
400,000 X g で 6 時 間 遠 心 す る こ と で プ ラ ス ミ ド DNA を 分 離 し た 。 遠 心 後 の 遠
13
心 管 に ニ ー ド ル を さ し て 、 プ ラ ス ミ ド DNA 画 分 を 分 画 し 、 butanol 抽 出 に よ っ
て 、 ethidium bromide(EtBr)を 除 去 し た (2)。 EtBr 除 去 後 の 溶 液 に 等 量 の TE を
添 加 し 、 TE 添 加 後 の 溶 液 の 2 倍 量 の 99.5%(v/v)ethanol を 添 加 す る こ と で 、
ethanol 沈 殿 を 行 い 、 プ ラ ス ミ ド DNA を 得 た 。
2.2.2. 宿 主 大 腸 菌 の 凍 結 保 存 法
遺 伝 子 組 換 え プ ラ ス ミ ド を 導 入 し た 大 腸 菌 の 保 存 に つ い て は 、L B 培 地 に 植 菌
し た 後 に 37℃ で 18 時 間 培 養 し た 培 養 液 300 μ l を 1.5 ml 容 の ス ク リ ュ ー キ ャ
ッ プ 付 き の マ イ ク ロ チ ュ ー ブ に 移 し た 後 、5 0 0 μ l の 8 0 % ( v / v ) の g l y c e r o l 溶 液
を 添 加 し て 、 -80℃ で 凍 結 保 存 し た (1)。
2.2.3. DNA の 保 存 法
プ ラ ス ミ ド DNA は QiAprep Plasmid Mini kit に よ る 溶 出 液 に 溶 解 し た 状 態 も
し く は TE(10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)に 溶 解 し た 状 態 で 、 -20℃ で
凍 結 保 存 し た (1)。
2.3. DNA 解 析 法
2.3.1. ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 法
DNA 断 片 の ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 用 い た 電 気 泳 動 は 、 ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 に よ り
確 認 し た い DNA 断 片 が 1 kb 以 上 の 場 合 は 、 1%(w/v)ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 用 い て 電
気 泳 動 を 行 い 、1 k b 未 満 の 場 合 は 、3 % ( w / v ) ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 用 い て 行 っ た ( 1 ) 。
1%(w/v) ア ガ ロ ー ス ゲ ル の 調 製 に は 、 Agarose S(Nippon Gene, Tokyo, Japan)
を 用 い 、 3% ア ガ ロ ー ス ゲ ル の 調 製 に は Agarose 21(Nippon Gene, Tokyo, Japan)
を 用 い て 、 1X TBE(50 ｍ M Tris, 1 ｍ M EDTA, 49 ｍ M borate)に 懸 濁 し 、 電 子
レ ン ジ で 加 熱 し て ア ガ ロ ー ス を 溶 解 さ せ た 。 溶 解 し た ア ガ ロ ー ス に 0.5 μ g/ml
と な る よ う に E t B r を 添 加 し 、ゲ ル ト レ イ ( A d v a n c e , T o k y o , J a p a n ) に 流 し 入 れ 、
コ ー ム (Advance, Tokyo, Japan)を セ ッ ト し た の ち に 室 温 に 静 置 し て 固 化 さ せ る
こ と で 、 ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 作 製 し た 。 作 製 し た ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 1 X TBE を 満
た し た 電 気 泳 動 装 置 Mupid(Advance, Tokyo, Japan)に セ ッ ト し 、 DNA 溶 液 を サ
ン プ ル ウ ェ ル に 入 れ た の ち 、1 0 0 V 定 電 圧 で 電 気 泳 動 を 行 っ た ( 1 ) 。電 気 泳 動 後 の
ア ガ ロ ー ル ゲ ル は 、 ゲ ル 撮 影 装 置 Printgraph(Atto, Tokyo, Japan)を 用 い て 紫
外線照射状態で撮影し、撮影された結果は感熱紙に印刷した。
14
2.3.2. Ethanol(EtOH)沈 殿 法
E t O H 沈 殿 法 は 、E t O H 沈 殿 に よ り 回 収 し た い D N A 溶 液 に 、1 / 2 0 量 の 3 M s o d i u m
acetate(pH 5.2)を 添 加 お よ び 混 合 し た の ち に 、 2 倍 量 の 99.5%(v/v) EtOH を 添
加 お よ び 混 合 し て 、- 8 0 ℃ で 5 分 静 置 し た 。静 置 後 の D N A 溶 液 を 冷 却 遠 心 器 h i m a c
CF9RX(Hitachi Koki, Tokyo, Japan)を 用 い て 18,700 X g で 15 分 間 遠 心 し 、 DNA
の 沈 殿 を 得 た 。遠 心 後 に D N A 沈 殿 物 を 残 し て E t O H を 除 去 し た の ち 、つ ぎ に 7 0 %
EtOH を 添 加 し て 、 18,700 X g で 5 分 間 遠 心 し 、 そ の の ち EtOH を 除 去 す る こ と
で DNA 沈 殿 物 を 得 た
(1)
。 得 ら れ た DNA 沈 殿 物 は Centrifuge Concentrator
VC-96(TAITEC, Saitama, Japan)で 乾 燥 さ せ た の ち 、 TE に 溶 解 し て -20℃ で 凍 結
保存した。
2.3.3. PCR 法
P C R 法 を 用 い た P C R 産 物 の 調 製 に つ い て は 、E x T a q D N A p o l y m e r a s e ( T a k a r a b i o ,
Shiga, Japan)を 用 い て 、 製 品 添 付 の 反 応 バ ッ フ ァ ー を 添 加 し た 反 応 液 20 μ l
に 鋳 型 DNA 、 PCR primer 、 deoxynucleotide triphosphate(dNTP) 、 ExTaq DNA
polymerase を 添 加 し 、 サ ー マ ル サ イ ク ラ ー を 用 い て PCR 反 応 を 行 っ た (3,
4, 5)
。
ま た 、 サ ー マ ル サ イ ク ラ ー と し て は PTC200 DNA Engine(MJ Research, CA, USA)
を 用 い た 。 PCR 産 物 を 制 限 酵 素 で 処 理 す る 場 合 に は 、 SUPREC 02(Takara Bio,
Shiga, Japan)を 用 い て 、 製 品 添 付 の 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 、 PCR 産 物 を 精 製 し た
の ち に TE に 溶 解 し た 。
2.3.4. 制 限 酵 素 に よ る DNA の 処 理 法
制 限 酵 素 に よ る DNA の 処 理 に つ い て は 、 製 品 の 取 扱 説 明 書 お よ び 製 品 カ タ ロ
グに基づいて、制限酵素添付の反応バッファーを添加した反応液中に処理した
い DNA お よ び 制 限 酵 素 を 添 加 し て 、 制 限 酵 素 に よ る 反 応 を 行 っ た (1)。
2.3.5. ア ガ ロ ー ス ゲ ル か ら の DNA 抽 出 法
抽 出 し た い DNA を ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 に よ り 分 離 し 、 泳 動 後 の ア ガ ロ ー ス ゲ
ル を E t B r に よ り 染 色 し た の ち 、ト ラ ン ス イ ル ミ ネ ー タ ー 上 で 紫 外 線 照 射 す る こ
と で 、 DNA バ ン ド を 確 認 し た 。 確 認 さ れ た DNA バ ン ド の 中 か ら 抽 出 し た い DNA
と 考 え ら れ る D N A バ ン ド を カ ッ タ ー ナ イ フ 等 で 切 断 し 、ア ガ ロ ー ス ゲ ル 片 を 1 . 5
m l 容 の マ イ ク ロ チ ュ ー ブ に 採 取 し た ( 2 ) 。採 取 し た D N A を 含 む ア ガ ロ ー ス ゲ ル 片
か ら 、 Gene Pure kit(Nippon Gene, Tokyo, Japan)を 用 い て 採 取 し た DNA の 抽
出 を 行 っ た 。 抽 出 し た DNA を 含 む 溶 液 は -20℃ で 凍 結 保 存 し た 。
15
2.3.6. DNA の 脱 リ ン 酸 化 処 理
DNA の 脱 リ ン 酸 化 処 理 に つ い て は 、 制 限 酵 素 処 理 に よ っ て 処 理 さ れ た DNA ま
た は 合 成 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を T4 polynucleotide kinase(Nippon Gene, Tokyo,
Japan)を 用 い 、 製 品 説 明 書 に 従 っ て 反 応 液 を 調 製 し て 37℃ で 30 分 間 の 反 応 を
行 っ た 。 反 応 し た の ち に 反 応 液 と 同 量 の Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol
(Nippon Gene, Tokyo, Japan) を 添 加 お よ び 混 合 し 、 冷 却 遠 心 器 himac CF9RX
を 用 い て 18,700 X g で 5 分 間 遠 心 し た 。 遠 心 し た の ち に 上 清 を 採 取 し て 、 別 の
1.5 ml 容 の マ イ ク ロ チ ュ ー ブ に 移 し た 。 採 取 し た 上 清 に 同 量 の chloroform を
添 加 し て 混 合 し た の ち 、 18,700 X g で 5 分 間 遠 心 し て 上 清 を 採 取 し た (1)。 採 取
し た 上 清 を 別 の 1.5 ml 容 の マ イ ク ロ チ ュ ー ブ に 移 し EtOH 沈 殿 し た 。 EtOH 沈 殿
に よ っ て 得 ら れ た DNA 沈 殿 物 を す る こ と で 脱 リ ン 酸 化 し た DNA を 得 た (1)。 得 ら
れ た DNA 沈 殿 物 は Centrifuge Concentrator VC-96(TAITEC, Saitama, Japan)
で 乾 燥 さ せ た の ち 、 TE に 溶 解 し て -20℃ で 凍 結 保 存 し た 。
2.3.7. DNA の ラ イ ゲ ー シ ョ ン
DNA の ラ イ ゲ ー シ ョ ン は 、 脱 リ ン 酸 化 処 理 し た DNA を DNA Ligation kit Ver.
2（ T a k a r a B i o , S h i g a , J a p a n ）を 用 い 、製 品 説 明 書 に 従 っ て 反 応 液 を 調 製 し た 。
つ ぎ に ラ イ ゲ ー シ ョ ン し た い D N A を 反 応 液 に 添 加 し て 、1 6 ℃ で 1 8 時 間 の 反 応 を
行 っ た (1)。 反 応 後 の 反 応 液 は -20℃ で 凍 結 保 存 し た 。
2.3.8. DNA の 大 腸 菌 へ の 形 質 転 換 法
DNA の 大 腸 菌 へ の 形 質 転 換 は 、 コ ン ピ テ ン ト セ ル 200 μ l を 1.5 ml 容 の マ イ
ク ロ チ ュ ー ブ に 移 し た の ち 、 形 質 転 換 し た い DNA を 添 加 し て 、 ヒ ー ト ブ ロ ッ ク
を 用 い て 42℃ で 90 秒 加 熱 処 理 し た 。 熱 処 理 後 の 溶 液 に 800 μ l の SOC 溶 液 (1)
を 添 加 し て 、 37℃ で 1 時 間 振 と う 培 養 し た の ち 、 ス ピ ン ダ ウ ン し 、 菌 体 を 回 収
し た 。回 収 し た 菌 体 は 培 養 プ レ ー ト で 固 化 さ せ た L B 寒 天 培 地 上 に コ ン ラ ー ジ 棒
を 用 い て 、 塗 布 し 、 37℃ で 一 晩 培 養 し た (1)。
2.3.9. 分 光 光 度 計 を 用 い た DNA 定 量 法
分 光 光 度 計 を 用 い た
DNA の 定 量 は 、 分 光 光 度 計
Gene Quant(Amersham
Bioscience, Tokyo, Japan)を 用 い 、 機 器 添 付 の 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 定 量 し た い
DNA 溶 液 を 測 定 用 の キ ュ ベ ッ ト に 入 れ 、 吸 光 度 を 測 定 し た 。 測 定 し た 吸 光 度 の
値 に 基 づ い て DNA 量 を 算 出 し た (1,
6)
。
16
2.3.10. DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法
T7 RNAP 変 異 遺 伝 子 構 築 に お い て 、 T7 RNAP 遺 伝 子 を 含 む PCR 産 物 の CS 法 を 用
い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 は 、 Big Dye Terminator Cycle sequencing kit ま
た は
ABI
Prism
Taq
dye
terminator
cycle
sequencing
FS
kit(Applied
Biosystems, Tokyo, Japan)を 用 い て 、 そ れ ぞ れ の 製 品 に 添 付 の 取 扱 説 明 書 に 従
っ て 、D N A シ ー ク エ ン ス 反 応 お よ び 精 製 を 行 っ た 。精 製 産 物 を A B I P r i s m 3 7 7 D N A
s e q u e n c e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , T o k y o , J a p a n ) に お い て 解 析 す る 場 合 に は 、A B I
Prism 377 DNA Sequencer 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 調 製 し た loading buffer に 溶 解
し 、 ABI Prism 310 Genetic Analyzer（ Applied Biosystems, Tokyo, Japan）
に お い て 解 析 す る 場 合 に は 、 Template
Suppression
Reagent(Applied
Biosystems, Tokyo, Japan) に 溶 解 し た 。 溶 解 し た 反 応 産 物 の 泳 動 お よ び DNA
シ ー ク エ ン ス 結 果 の 解 析 は そ れ ぞ れ の DNA シ ー ク エ ン サ ー の 取 扱 説 明 書 に 従 っ
て 泳 動 お よ び 泳 動 結 果 の 解 析 を 行 っ た 。 DNA シ ー ク エ ン サ ー で 用 い た シ ー ク エ
ン ス ゲ ル に お い て は 、 ABI Prism 377 DNA sequencer に つ い て は 、 機 器 添 付 の
取 扱 説 明 書 に 従 っ て ゲ ル 溶 液 を 調 製 し 、 ABI Prism 377 DNA sequencer 専 用 の
シークエンスゲル調製用のガラス板の間に充填およびシークエンスゲルの重合
反応を行うことでシークエンスゲルを調製した
(2)
。 ABI Prism 310 Genetic
A n a l y z e r に つ い て は 、流 動 ゲ ル で あ る P O P 6 ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , T o k y o , J a p a n )
を機器添付の取扱説明書に従って装填した。キャピラリーガラスへの充填は機
器によって、自動で行った。
参考文献
(1)
T.
Maniatis,
E.
F.
Fritsch,
J.
Sambrook,
Molecular
Cloning:
A
Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989).
(2) 豊 島 久 眞 男 、 山 本 雅 監 修 、 新 細 胞 工 学 実 験 プ ロ ト コ ー ル 、 秀 潤 社 (1993)
(3) M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, PCR Strategies, Academic
Press (1995).
(4) 藤 永 薫 編 、 遺 伝 子 増 幅 PCR 法 、 共 立 出 版 (1994).
(5) W. M. Barnes,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 15, 2216-2220(1994).
(6) 泉 美 治 、 中 川 八 郎 、 三 輪 谷 俊 夫 編 、 生 物 化 学 実 験 の て び き 3 核 酸 の 分 離 ・
分 析 法 、 化 学 同 人 、 14(1990).
17
第 3 章
開発
3.1.
T7 RNAP の 基 質 と し て 認 識 可 能 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の
緒言
T S 法 の 構 築 に あ た っ て は 、ジ デ オ キ シ 法 に お け る d d N T P と 同 様 の 性 能 を 示 し 、
T7 RNAP が 基 質 と し て 取 り 込 む こ と が 可 能 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築 が 必 要
と さ れ た 。蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー は 、T7 RNAP の 基 質 と し て 認 識 さ れ 、RNA 鎖 に 取
り 込 ま れ た 場 合 に 反 応 停 止 を 引 き 起 こ す 。 反 応 停 止 に よ り 得 ら れ た RNA 産 物 は
3'末 端 に 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー が 取 り 込 ま れ た 形 と な っ て お り 、 こ の た め RNA 産
物は蛍光で標識されることになる。
本 章 で は 、T S 法 の 構 築 に 必 要 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 開 発 を 行 っ た 。す な わ
ち 、T S 法 に お い て R N A 合 成 反 応 の 停 止 お よ び R N A 産 物 の 蛍 光 標 識 を 行 う た め に
必 要 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築 を 試 み 、 T7 RNAP を 用 い た in vitro 転 写 法 に
より、蛍光ターミネーターの基質としての取り込みの効率について検討した。
さ ら に 、 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を 添 加 し て 合 成 し た RNA 産 物 の DNA シ ー ク エ ン サ
ー を 用 い た 解 析 に お い て 、 RNA 産 物 由 来 の シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 さ れ 、
分子量ごとに分離されたシークエンスパターンが得られるかについて検討した。
こ れ ら の 検 討 結 果 を 基 盤 と し て 、T S 法 の 構 築 に 必 要 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー と し
て R110-(CH2)4-3'-dGTP(Dye-G)、 R6G-(CH2)4-3'-dATP(Dye-A)、 TMR-(CH2)4-3'dUTP(Dye-U)、 ROX-(CH2)4-3'-dCTP(Dye-C)を 最 適 な も の と し て 選 択 す る こ と と
した。
3.2. 実 験 方 法
3.2.1. 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築
蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築 に あ た っ て は 、 Prober(1) ら の 方 法 に 従 っ て 蛍 光 体
6-carboxy tetramethyl rhodamine(TMR)、 6-carboxy X-rhodamine(ROX)、 5carboxy rhodamine6(R6G)、 5-carboxy rhodamine110(R110)の N-Hydroxysucci
-n i m id y l es t e r( M o l ec u l ar P r ob e , O R , U .S . A .) を 3 ' - d UT P 、3' - d CT P 、3 ' -d A T P 、
3'-dGTP に 付 加 し て す る こ と に よ っ て 、 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー TMR-3'-dUTP(DyeU) 、R O X -3 ' - dC T P (D ye - C ) 、R6 G - 3' - d AT P( D y e- A ) , R 1 1 0- 3 ' - dG T P (D y e -G ) を 合 成 し
た 。 各 試 薬 の 合 成 に 当 た っ て は 、 7-deaza-3'-dATP 、 7-deaza-3'-dGTP 有 す る
purin 塩 基 の 7 位 お よ び 3'-dCTP、 3'-dUTP の 有 す る pyrimidine 塩 基 の 5 位 に
リ ン カ ー [-C≡ C-(CH2)n-NH-]を 導 入 し た の ち 、 N, N-dimethyl formamide 水 溶 液
に 混 合 し 、 triethylamine お よ び rhodamine 色 素 の N-Hydroxysuccinimidyl
e s t e r を 添 加 し て 、室 温 で 一 晩 攪 拌 す る こ と で r h o d a m i n e 色 素 の c a r b o x y l 基 と
18
リ ン カ ー 中 の a m i n o 基 を 結 合 さ せ た 。つ ぎ に 、攪 拌 後 の 溶 液 か ら D E A E イ オ ン 交
換 カ ラ ム (Tosoh, Tokyo, Japan)を 用 い て 精 製 し 、 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー Dye-U、
Dye-C、 Dye-A, Dye-G を 得 た 。
3.2.2. T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み 実 験
T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み の 評 価 実 験 は 以 下 の 反 応 条 件
を 用 い て 行 っ た 。 反 応 液 と し て 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2, 5 mM DTT,
2 mM spermidine(HCl)3, 250 μ M ATP, 500 μ M GTP, 200 μ M CTP, 500 μ M UTP
を 含 む 反 応 液 に 鋳 型 DNA と し て 制 限 酵 素 Pvu II で 切 断 し た pBluescript
SK(Stratagene, CA, U.S.A.) 200 ng を 添 加 し た 。 こ の 反 応 液 に 25 units 野 生
型 T7 RNAP(Invitrogen, Tokyo, Japan)と Dye-A を 添 加 し て 、 37℃ で 1 時 間 反
応 し た 。 Dye-A は 終 濃 度 100μ M、 50 μ M、 25 μ M、 10 μ M、 5 μ M と な る よ う
に 反 応 液 に 添 加 し た 。 反 応 後 の 反 応 液 か ら Sephadex G50 column(Amersham
Biosciences, Tokyo, Japan)を 用 い て ゲ ル ろ 過 を 行 う こ と で RNA 産 物 を 精 製 し 、
精 製 し た RNA 合 成 産 物 は Centrifuge Concentrator VC-96（ TAITEC, Saitama,
Japan） に よ っ て 蒸 発 乾 固 し た 。 乾 燥 し た RNA 合 成 産 物 を ABI Prism 377 DNA
Sequencer(Applied Biosystems, Tokyo, Japan)の 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 調 製 し た
loading buffer 6 μ l に 溶 解 し 、 そ の う ち 2 μ l を 90℃ で 3 分 間 熱 処 理 し た 。
熱 処 理 後 の 溶 液 は ABI Prism 377 DNA Sequencer で 泳 動 し 、 取 扱 説 明 書 に 従 っ
て 泳 動 結 果 を 解 析 し た 。 泳 動 し た の ち に 残 っ た RNA 溶 液 4 μ l は 、 -20℃ で 保
存した。
3.3. 実 験 結 果
3.3.1. 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築
本 論 文 は 、 T7 RNAP を 用 い た 新 し い
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 で あ る
Transcriptional Sequencing (TS)法 を 開 発 す る こ と を 目 的 と し て い る 。 TS 法
の 原 理 は Fig. 3.1 に 示 し て い る が 、 TS 法 で は 1 章 Fig. 1.1 に 示 す ジ デ オ キ シ
法 に お け る DNA 伸 長 と ddNTP 取 り 込 み に よ る DNA 伸 長 反 応 の 停 止 に 相 当 す る 反
応 を T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 を 用 い て 行 う こ と が 必 要 と な る 。 こ の た め に
は 、T 7 R N A P の 基 質 と す る た め に d d N T P の リ ボ ー ス の 2 ' 位 が - O H 基 と な る 3 ' - d N T P
を 用 い る こ と が 必 要 で あ り 、さ ら に C S 法 と 同 様 に D N A シ ー ク エ ン サ ー を 用 い て
検 出 す る た め に は 3'-dNTP を 蛍 光 体 に よ っ て 標 識 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構
築が必要である。
以 上 の よ う な 背 景 か ら 、本 章 で は T 7 R N A P に よ り 基 質 と し て 取 り 込 ま れ 、D N A
シークエンサーを用いた解析によって、シークエンスシグナルの検出を可能と
19
する蛍光ターミネーターの構築を試み、その評価を行った。
Fig. 3.1
Procedure of Transcriptional Sequencing
F i g . 3 . 2 に 、本 章 に お い て 構 築 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー で あ る D y e - U 、D y e - C 、
D y e - A 、D y e - G の 構 造 を 示 す 。蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築 に 用 い る 蛍 光 体 は 、D N A
シ ー ク エ ン サ ー に 搭 載 さ れ て い る 536 nm、 559 nm、 586 nm、 615 nm の 分 光 フ ィ
ル タ ー で 分 光 可 能 で あ り 、 DNA シ ー ク エ ン サ ー に 搭 載 さ れ て い る 488 nm お よ び
514 nm の 波 長 を 放 出 す る Ar レ ー ザ ー に よ り 励 起 可 能 と 考 え ら れ る (2)蛍 光 体
R11O、 R6G、 TMR、 ROX を 3'-dNTP の 標 識 に 用 い て 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を 構 築 し
た。
20
Fig. 3.2
Structure of four rhodamine-labeled 3'-dNTPs.
Cn indicates the number of CH2 chain in the linker between rhodamine dye
and base of 3'-dNTP.
3.3.2. T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み の 評 価
つ ぎ に 、 構 築 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を T7 RNAP を 用 い た RNA 合 成 反 応 に 添
加 し た 場 合 の T7 RNAP に よ る 取 り 込 み 、 お よ び シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル の 検 出 に
つ い て 検 討 を 行 っ た 。 T7 RNAP を 用 い た RNA 合 成 反 応 に 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を
添 加 し 、T 7 RN A P に よ り 基 質 と し て 取 り 込 ま れ た 場 合 に は 、R N A 合 成 反 応 は 停 止
し 、そ の 結 果 得 ら れ た R N A 産 物 の 3 ' 末 端 は 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー に よ り 蛍 光 標 識
さ れ る こ と に な る 。 蛍 光 標 識 さ れ た RNA 産 物 を DNA シ ー ク エ ン サ ー で 解 析 す る
ことによりシークエンスシグナルが得られることになる。実際に 4 種の蛍光タ
ー ミ ネ ー タ ー Dye-U、 Dye-C、 Dye-A、 Dye-G を T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 に 添
加 し 、 合 成 さ れ た RNA 産 物 を DNA シ ー ク エ ン サ ー で 解 析 し た と こ ろ 、 Dye-U お
よ び Dye-G で は 分 子 量 毎 に 分 離 し た シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た 。 し か
21
し 、 Dye-A お よ び Dye-C で は シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル は 検 出 さ れ な か っ た （ デ ー
タ 省 略 ）。 以 上 の 結 果 に お い て 、 D y e - A お よ び D y e - C を 添 加 し た 場 合 に シ ー ク エ
ン ス シ グ ナ ル が 検 出 出 来 な か っ た 原 因 と し て 、 以 下 に 示 す 知 見 か ら 、 T7 RNAP
による蛍光ターミネーターの基質としての取り込みの際に蛍光物質に起因する
立 体 障 害 が 関 与 し て い る と 推 測 し た 。 ま ず 、 蛍 光 標 識 し て い な い 3'-dNTP お よ
び [α -32P]UTP の 共 存 下 で T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 を 行 っ た と こ ろ 、 RI 標
識 さ れ た シ ー ク エ ン ス ラ ダ ー が 確 認 さ れ た 。 こ の 結 果 か ら 3'-dNTP は T7 RNAP
の 基 質 と な る こ と を 示 し て い る 。 つ ぎ に Dye-C に つ い て は 、 蛍 光 体 で あ る ROX
と 3'-dCTP と の 組 み 合 わ せ 以 外 に TMR 、 R6G お よ び R110 に よ り 標 識 し た
TMR-3'-dCTP、 R6G-3'-dCTP お よ び R110-3'-dCTP を 構 築 し 、 T7 RNAP に よ る RNA
合成反応に添加した場合でも、シークエンスシグナルは検出されなかった。こ
の結果はシークエンスシグナルが得られなかった原因が蛍光体の種類によるも
の で は な い こ と を 示 唆 し た 。 以 上 の よ う な 実 験 結 果 に 基 づ き 、 Dye-A お よ び
D y e - C で シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 さ れ な か っ た 原 因 は 、蛍 光 物 質 と 3 ' - d N T P
種 の 組 み 合 わ せ に 起 因 す る 問 題 で は な く 、 T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー
の 取 り 込 み の 際 に 蛍 光 物 質 に 起 因 す る 何 ら か の 立 体 障 害 が 生 じ 、 T7 RNAP が 蛍
光ターミネーターを取り込めないのではないかと推測した。
そ こ で 、こ の 立 体 障 害 の 解 消 を 目 的 に 、蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー に お い て T 7 R N A P
に 取 り 込 ま れ る リ ボ ー ス お よ び 塩 基 部 分 と T7 RNAP と の 相 互 作 用 の 必 要 が な い
蛍光体をつなぐリンカーの鎖長を長くすることで、立体障害の解消を試みた。
具 体 的 に は 、 Fig. 3.2 に 示 す 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 造 に お い て 蛍 光 体 と 塩 基
間 に 存 在 す る メ チ レ ン 鎖 ( C H 2 ) n の リ ン カ ー 鎖 長 を 、最 初 に 構 築 し た n = 1 か ら n = 4
に変更した蛍光ターミネーターを構築した。つぎにこのリンカー鎖長を延長し
た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 に 添 加 し 、 DNA シ ー ク エ
ン サ ー で RNA 合 成 産 物 を 解 析 す る こ と で シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 得 ら れ る か に
ついて検討を行った。
Fig. 3.3 に 示 す 実 験 は 制 限 酵 素 Pvu II で 切 断 し た pBluescript SK プ ラ ス ミ
ド DNA を 鋳 型 DNA と し て 用 い 、 リ ン カ ー 鎖 長 の 異 な る Dye-A を 野 生 型 T7 RNAP
を 用 い た RNA 合 成 反 応 に 添 加 し て 得 ら れ た RNA 産 物 の DNA シ ー ク エ ン サ ー で の
解 析 結 果 を 示 し て い る 。F i g . 3 . 3 に 示 す 実 験 結 果 に お い て 、リ ン カ ー 鎖 長 が n = 1
で あ る Dye-A を RNA 合 成 反 応 に 添 加 し た 場 合 、 終 濃 度 100 μ M か ら 5 μ M と な
るように添加したすべての反応条件において、シークエンスシグナルを得るこ
と が 出 来 な か っ た 。一 方 、リ ン カ ー 鎖 長 が n = 4 で あ る D y e - A を 用 い た 場 合 に は 、
終 濃 度 100 μ M か ら 5 μ M と な る よ う に 添 加 し た す べ て の 反 応 条 件 に お い て 、
シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル を 得 る こ と が 出 来 た 。 ま た 、 終 濃 度 10 μ M お よ び 5 μ M
で リ ン カ ー 鎖 長 n=4 の Dye-A を 添 加 し た 場 合 に は 低 分 子 領 域 か ら 高 分 子 領 域 に
渡 っ て シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 得 ら れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。し か し な が ら 、
終 濃 度 100 μ M か ら 25 μ M の 反 応 条 件 で は 高 分 子 領 域 に 至 る 前 に シ ー ク エ ン ス
22
シ グ ナ ル が 減 衰 し て お り 、 こ の 結 果 は 、 こ の 検 討 実 験 に 用 い た RNA 合 成 反 応 条
件 に お い て 、 Dye-A 量 が 多 く な る こ と に よ り 、 伸 長 反 応 よ り も 蛍 光 タ ー ミ ネ ー
ターを取り込みによる停止反応が優先的に起こったため、低分子領域で停止し
た RNA 産 物 が 多 い こ と を 示 し て い る 。
以 上 の よ う に n=1 の リ ン カ ー を 有 す る Dye-A を 用 い た 場 合 に は 認 め ら れ な か
ったシークエンスシグナルがリンカー鎖の延長により検出出来ることが明らか
と な っ た が 、 リ ン カ ー 鎖 の 延 長 に よ る 同 様 の 効 果 は Dye-C に お い て も リ ン カ ー
鎖 長 を n=4 と す る こ と で 同 様 に 認 め ら れ 、 シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た
（ デ ー タ 省 略 ）。以 上 の 結 果 に よ り n = 1 の リ ン カ ー を 有 す る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー
を 用 い た 場 合 に シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 出 来 な か っ た Dye-C お よ び Dye-A
に つ い て 、 リ ン カ ー 鎖 長 を n=4 と す る こ と で シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル の 検 出 が 可
能 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ れ と は 別 に n=4 の リ ン カ ー を 有 す る Dye-G
お よ び Dye-U を 用 い た 場 合 は 、 n=1 の 場 合 と 同 様 に シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル を 得
ることが可能であった。
本 章 に お け る 検 討 結 果 に 基 づ い て 、T S 法 の 構 築 に あ た っ て は 蛍 光 タ ー ミ ネ ー
タ ー の リ ン カ ー 鎖 長 が n=4 で あ る Dye-U(n=4) 、 Dye-C(n=4) 、 Dye-A(n=4) 、
Dye-G(n=4)を 用 い る こ と と し た 。
23
Fig. 3.3
Effects of linker length on the termination patterns with
R6G-3'-dATP.
(CH2)1
and
(CH2)4 linker
for
R6G-3'-dATP
were
tested.
Each
lane
had
R6G-(CH2)1-3'-dATP and R6G-(CH2)4-3'-dATP (lane 1-5 and 6-10, respectively).
R6G-3'-dATP concentrations in lanes 1 and 6, 100 μ M; lanes 2 and 7, 50
μ M; lanes 3 and 8, 25 μ M; lanes 4 and 9, 10 μ M; lanes 5 and 10, 5 μ
M.
3.4. 考 察
本 章 で は 、 TS 法 を 行 う た め に 必 要 で あ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 構 築 を っ た 。
3'-dNTP と 蛍 光 体 の 間 の リ ン カ ー 鎖 長 を n=1 か ら n=4 へ 変 更 す る こ と に よ っ て
T7 RNAP に よ り 基 質 と し て 取 り 込 ま れ 、 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー に よ り 蛍 光 標 識 さ
れ る こ と で 、シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 得 ら れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。し か し 、
リ ン カ ー 鎖 長 に つ い て は n=1 お よ び n=4 以 外 の 場 合 に お い て 、 n=6 の リ ン カ ー
を 用 い た 際 に も n = 4 を 用 い た 場 合 と 同 様 の 効 果 が 認 め ら れ た 。し か し な が ら n = 3
の リ ン カ ー を 用 い た 場 合 で は n=1 の 場 合 と 同 様 に シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出
さ れ な か っ た（ デ ー タ 省 略 ）。こ の 結 果 か ら 、リ ン カ ー 鎖 長 が 短 い 場 合 に は 蛍 光
体 に 起 因 す る 立 体 障 害 の 影 響 が 大 き く 、 n=4 以 上 に な っ た 場 合 に 、 こ の 問 題 が
解消されることが明らかとなった。このようなリンカー鎖の延長による同様の
効 果 は 、 ジ デ オ キ シ 法 に 関 す る 報 告 で は な い が 、 PCR 法 を 用 い た 蛍 光 標 識 DNA
プ ロ ー ブ の 調 製 法 に お い て 、標 識 ヌ ク レ オ チ ド と し て C y 3 - d U T P を 用 い た 場 合 に
24
蛍 光 体 Cy3 と 塩 基 間 の リ ン カ ー 鎖 の 延 長 に よ り PCR 産 物 由 来 の 蛍 光 シ グ ナ ル 強
度 が 上 昇 す る こ と が 報 告 さ れ て い る (3)。
以 上 の 知 見 は 、 DNAP や RNAP を 用 い た 効 率 の 良 い 核 酸 蛍 光 標 識 法 の 構 築 に お
いて有用なものと考えられる。
3.5. 結 語
本 章 で は 、 T7 RNAP の 基 質 と し て 認 識 可 能 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 開 発 を 行
っ た 。蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー は 、T7 RNAP の 基 質 と し て 認 識 さ れ 、RNA 鎖 に 取 り 込
ま れ た 場 合 、D N A P の 場 合 の d d N T P と 同 様 に 、反 応 終 結 を 引 き 起 こ す も の で あ る 。
蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー と し て 4 種 の 蛍 光 体 T M R 、R O X 、R 6 G 、R 1 1 0 を 3 ' - d U T P 、3 ' - d C T P 、
3'-dATP、 3'-dGTP に そ れ ぞ れ 付 加 す る こ と に よ り 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー Dye-U、
Dye-C、 Dye-A、 Dye-G の 構 築 を 行 っ た 。
つ ぎ に 構 築 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー が 、 T7 RNAP の 基 質 と な り 得 る の か に つ
い て 、T 7 R N AP を 用 い た i n v it r o 転 写 反 応 へ 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を 添 加 し 、R NA
産物由来のシークエンスシグナルの検出を指標に検討を行った。その結果、
Dye-U お よ び Dye-G で は 、 分 子 量 毎 に 分 離 し た シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 さ
れ た が 、 Dye-A お よ び Dye-C で は 検 出 さ れ な か っ た 。 シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が
検出できない原因として、本章における検討結果から、蛍光ターミネーターの
有 す る 蛍 光 物 質 に 起 因 す る 何 ら か の 立 体 障 害 に よ っ て T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー
ミネーターの取り込みの阻害が起こったことを示唆した。そこで、この問題の
解 消 を 目 的 に 3'-dNTP と 蛍 光 物 質 間 の リ ン カ ー 鎖 長 を n=1 か ら n=4 に 変 更 し た
と こ ろ 、 リ ン カ ー 鎖 長 n=4 の Dye-A お よ び Dye-C の 両 者 に 、 分 離 し た シ ー ク エ
ンスシグナルが検出された。
以 上 よ り 、T S 法 に 適 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー こ れ ら の 検 討 結 果 を 基 盤 と し て
以 上 よ り 、T S 法 の 構 築 に 必 要 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー と し て R 1 1 0 - ( C H 2 ) 4 - 3 ' - d G T P
( D y e - G ) 、R 6 G - ( C H 2 ) 4 - 3 ' - d A T P ( D y e - A ) 、T M R - ( C H 2 ) 4 - 3 ' - d U T P ( D y e - U ) 、R O X - ( C H 2 ) 4
-3'-dCTP(Dye-C)を 最 適 な も の と し て 選 択 し 、 TS 法 に 必 用 と さ れ る 蛍 光 タ ー ミ
ネーターの開発に成功した。
参考文献
(1) J. M. Prober, G. L. Trainor, R. J. Dam, F. W. Hobbs, C. W. Robertson,
R. J. Zagursky, A. J. Cocuzza, M. A. Jensen, K. Baumeister, Science, 238,
336-341(1987).
(2) L. G. Lee, S. L. Spurgeon, C. R. Heiner, S. C. Benson, B. B. Rosenblum,
S. M. Menchen, R. J. Graham, A. Constantinescu, K. G. Upadhya, J. M. Cassel,
Nucleic Acids Res., 25, 2816-2822(1997).
25
(3) Z. Zhu, J. Chao, H. Yu, A. S. Waggoner, Nucleic Acids Res., 22,
3418-3422(1994).
26
第 4 章 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み の 改 善 し た T 7 RN AP 変 異
体の構築
4.1.
緒言
第 3 章 に お け る 検 討 に お い て 、 野 生 型 T7 RNAP お よ び 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を
用 い て 調 製 し た RNA 産 物 由 来 の シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 弱 い こ と に 起 因 す る と
考えられるシークエンスエラーの問題が明らかとなった。この問題の原因とし
て T7 RNAP の 3'-dNTP と NTP に 対 す る 基 質 特 異 性 の 違 い に よ り 、 NTP と 比 較 し
て 効 率 よ く 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー が T7 RNAP に 取 り 込 ま れ て い な い こ と が 推 測 さ
れた。
本 章 に お い て は 、 T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み の 改 善 を 行
うことにより、シークエンスシグナルの上昇によりシークエンスエラーを解消
す る こ と が 可 能 と 考 え 、 NTP と 3'-dNTP の 基 質 特 異 性 に 関 与 し て い る T7 RNAP
の ア ミ ノ 酸 部 位 を 探 索 し て 改 良 を 加 え る こ と と し た 。 と く に 、 NTP と 3'-dNTP
の 構 造 の 相 違 点 で あ る リ ボ ー ス の 3' 位 の -OH 基 と の 相 互 作 用 に 関 与 す る T7
RNAP の ア ミ ノ 酸 残 基 を 探 索 し て 、検 討 を 加 え た 。す な わ ち 、こ の 部 位 へ の 変 異
導 入 を 行 う こ と に よ り 3'-OH 基 に 対 す る 基 質 特 異 性 を 変 化 さ せ 、 3'-dNTP の 取
り 込 み が 改 善 さ れ た T7 RNAP 変 異 体 を 構 築 で き れ ば シ ー ク エ ン ス エ ラ ー の 問 題
の 解 消 が 可 能 で あ る と 考 え た た め で あ る 。 以 上 よ り 、 T7 RNAP に お け る 3'-OH
基 と の 相 互 作 用 部 位 の 探 索 お よ び T7 RNAP 変 異 体 の 構 築 を 行 う と と も に 、 そ の
評価を行った。
4.2. 実 験 方 法
4.2.1. T7 RNAP タ ン パ ク 質 発 現 ベ ク タ ー の 構 築
T7 RNAP 遺 伝 子 を 単 離 す る 目 的 で 、 ま ず Studier(1)の 方 法 に 基 づ い て T7 フ ァ
ー ジ ゲ ノ ム DNA を 以 下 の 方 法 で 調 製 し た 。 具 体 的 に は T7 フ ァ ー ジ (National
Institute of Genetics, Mishima, Japan)を 感 染 さ せ た 大 腸 菌 C600 の 菌 体 を 遠
心 処 理 す る こ と で 残 査 を 取 り 除 き 、 終 濃 度 0.5 M NaCl お よ び 10% glycerol と
な る よ う に NaCl お よ び glycerol を 添 加 し て 沈 殿 を 形 成 さ せ る 。 形 成 し た 沈 殿
を 遠 心 処 理 す る こ と に よ り 得 た 沈 殿 物 を SM バ ッ フ ァ ー (10
mM Tris-HCl pH7.5,
10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 0.01%(w/v) NaCl, 0.01%(w/v) gelatin)に て 懸 濁 さ
せ た 。 懸 濁 溶 液 を CsCl 密 度 勾 配 遠 心 法 に よ り 遠 心 処 理 す る こ と で 、 T7 フ ァ ー
ジ 粒 子 の 濃 縮 層 が 形 成 で き る 。形 成 し た T 7 フ ァ ー ジ 粒 子 の 濃 縮 層 は 分 取 し た の
ち に TE バ ッ フ ァ ー (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA)で 透 析 し た 。 透 析 後 の
T7 フ ァ ー ジ 粒 子 は フ ェ ノ ー ル 抽 出 を す る こ と で T7 フ ァ ー ジ 由 来 の タ ン パ ク 質
27
を 除 去 し 、T 7 フ ァ ー ジ ゲ ノ ム D N A を 含 む 抽 出 液 を イ ソ プ ロ パ ノ ー ル 沈 殿 す る こ
と で T 7 フ ァ ー ジ ゲ ノ ム D N A を 精 製 し た 。精 製 し た T 7 フ ァ ー ジ ゲ ノ ム D N A は T E
バ ッ フ ァ ー に 溶 解 し て -20℃ で 保 存 し た 。
つ ぎ に 、 T7 RNAP 遺 伝 子 の 全 長 領 域 を 単 離 す る 目 的 で 、 0.6 M PCR プ ラ イ マ ー
T7Rpol-N(5'-ATA,TTT,TAG,CCA,TGG,AGG,ATT,GAT,ATA,TGA,ACA,CGA,TTA,ACA,TC
G,CTA,AG-3')と T7Rpol-C(5'-ATA,TTT,TAG,CCA,TGG,TAT,AGT,GAG,TCG,TAT,TGA
,TTT,GGC,G-3')を 用 い 、 を 添 加 し 、 T7 フ ァ ー ジ ゲ ノ ム DNA を 鋳 型 DNA 100 ng
お よ び Ex Taq DNA polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan)を 添 加 し て PCR 反
応 を 行 う こ と に よ り 、 T7 RNAP 遺 伝 子 の 全 長 領 域 を コ ー ド す る PCR 産 物 を 調 製
し た 。 PCR 法 に 用 い る サ ー マ ル サ イ ク ラ ー と し て は PTC-200 DNA Engine(MJ
Research, CA , U.S.A)を 使 用 し た 。 PCR 反 応 プ ロ グ ラ ム は 94℃ で 1 分 間 の 予 備
変 性 処 理 後 、9 4 ℃ で 3 0 秒 、5 5 ℃ で 4 5 秒 、7 2 ℃ で 2 分 の 増 幅 反 応 を 3 0 回 繰 り 返
し た の ち に 7 2 ℃ で 5 分 の 後 処 理 を 行 っ た 。得 ら れ た P C R 産 物 は 、D y e T e r m i n a t o r
FS Cycle Sequencing kit お よ び
ABI Prism 377 DNA sequencer(Applied
Biosystems, Tokyo, Japan)に よ り DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う こ と で PCR に よ
る 変 異 塩 基 の 導 入 が な い こ と を 確 認 し た 。さ ら に 、制 限 酵 素 N c o I に よ り 切 断 し
て、アガロースゲルによる電気泳動を行った。電気泳動後のアガロースゲルか
ら DNA 断 片 を 切 り 出 し た の ち に Gene Pure Kit(Nippon Gene, Tokyo, Japan)を
用 い て 抽 出 し 、 制 限 酵 素
NcoI で 切 断 し た タ ン パ ク 質 発 現 用 ベ ク タ ー
pTrc99A(Amersham Bioscience, Tokyo, Japan)と ラ イ ゲ ー シ ョ ン す る こ と で T7
RNAP 発 現 ベ ク タ ー pT7R を 構 築 し た 。
4.2.2. T7 RNAP 変 異 体 の 構 築 お よ び T7 RNAP タ ン パ ク 質 の 精 製
T7 RNAP 変 異 体 の 構 築 お よ び T7 RNAP タ ン パ ク 質 の 精 製 は 、 以 下 の 方 法 で 行
っ た 。 最 初 に T7 RNAP 変 異 体 遺 伝 子 を 構 築 す る 際 の ク ロ ー ニ ン グ 部 位 と し て 利
用 す る た め に T7 RNAP 遺 伝 子 上 に な い 制 限 酵 素 切 断 部 位 で あ る XhoI 切 断 部 位 を
以 下 の 工 程 で p T 7 R に 導 入 し た 。具 体 的 に は 、ま ず 0 . 6 μ M P C R プ ラ イ マ ー A p a F I
(5'-CAT,CTG,GTC,GCA,TTG,GGT,CAC-3')と PCR プ ラ イ マ ー Xho-R(5'-CCA,AGT,GT
T,CTC,GAG,TGG,AGA-3')の 組 み 合 わ せ お よ び PCR プ ラ イ マ ー Xho-F(5'-CTA,AGT,
CTC,CAC,TCG,AGA,ACA,CTT,GG-3')と PCR プ ラ イ マ ー Afl III-R(5'-CAG,CCA,GCA,
GCT,TAG,CAG,CAG-3')の 組 み 合 わ せ で 、 鋳 型 DNA と し て pT7R 100 pg お よ び 2.5
units ExTaq DNA polymerase(Takara Bio, Shiga, Japan)を 添 加 し て PCR 反 応
を 行 う こ と に よ り PCR 産 物 を 調 製 し た 。 PCR 法 に 用 い る サ ー マ ル サ イ ク ラ ー と
し て は PTC-200 DNA Engine(MJ Research, CA , U.S.A)を 使 用 し た 。 PCR 反 応 プ
ロ グ ラ ム は 94℃ で 1 分 間 の 予 備 変 性 処 理 後 、94℃ で 30 秒 、55℃ で 45 秒 、72℃
で 3.5 分 の 増 幅 反 応 を 30 回 繰 り 返 し た の ち に 72℃ で 5 分 の 後 処 理 を 行 っ た 。
前 者 の PCR プ ラ イ マ ー の 組 み 合 わ せ か ら 得 ら れ た PCR 産 物 は 制 限 酵 素 ApaI と
28
XhoI で 切 断 し 、 後 者 は 制 限 酵 素 AflIII と XhoI で 切 断 し た 。 さ ら に T7 RNAP 発
現 ベ ク タ ー DNA を 制 限 酵 素 ApaI と AflIII で 切 断 し て 、 こ れ ら の 3 つ の DNA 断
片 を 連 結 す る こ と で pT7R の T7 RNAP 遺 伝 子 上 に XhoI 切 断 部 位 を 導 入 し た 。
T7 RNAP 遺 伝 子 へ の 点 変 異 の 導 入 は 、 Horton(2)ら の PCR 法 を 用 い た 点 変 異 導
入 法 に 従 い 、 点 変 異 を 導 入 し た T7 RNAP 遺 伝 子 を 有 す る PCR プ ラ イ マ ー を 用 い
て 点 変 異 の 導 入 を 行 っ た 。 点 変 異 の 導 入 で 用 い た PCR 反 応 は 0.6 μ M の 各 PCR
プ ラ イ マ ー お よ び 2.5 units ExTaq DNA polymerase を 用 い て 行 っ た 。 PCR 法 に
用 い る サ ー マ ル サ イ ク ラ ー と し て は PTC-200 DNA Engine(MJ Research, CA ,
U . S . A ) を 使 用 し た 。P C R 反 応 プ ロ グ ラ ム は 9 4 ℃ で 1 分 間 の 予 備 変 性 処 理 後 、9 4 ℃
で 3 0 秒 、5 5 ℃ で 1 分 、7 2 ℃ で 2 分 の 増 幅 反 応 を 3 0 回 繰 り 返 し た の ち に 7 2 ℃ で
5 分 の 後 処 理 を 行 っ た T7 RNAP 変 異 遺 伝 子 を 有 す る PCR 産 物 は Dye Terminator FS
Cycle Sequencing kit お よ び ABI Prism 377 DNA sequencer に よ り DNA シ ー ク
エ ン ス 解 析 を 行 う こ と で PCR に よ る 変 異 塩 基 の 導 入 が な い こ と を 確 認 し た 。 得
ら れ た D N A 断 片 の う ち F 6 4 4 Y 、F 6 4 6 Y を コ ー ド す る 変 異 遺 伝 子 を 含 む D N A 断 片 は
制 限 酵 素 HpaI お よ び PstI で 切 断 し 、 F667Y、 F733Y、 F782Y を コ ー ド す る 変 異
遺 伝 子 を 含 む D N A 断 片 は 制 限 酵 素 X h o I お よ び A f l I I で 切 断 し た 。F 8 8 2 Y を コ ー
ド す る 変 異 体 遺 伝 子 を 含 む D N A 断 片 に つ い て は 制 限 酵 素 K p n I で 切 断 し た 。制 限
酵 素 で 切 断 し た 各 DNA 断 片 は ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 お よ び ア ガ ロ ー ス ゲ ル か ら 抽
出 し 、 pT7R DNA を 上 記 の 制 限 酵 素 の 組 み 合 わ せ で 切 断 後 、 同 様 に ア ガ ロ ー ス ゲ
ル か ら の 抽 出 を 行 っ た 。 抽 出 し た 変 異 遺 伝 子 DNA 断 片 と pT7R DNA を ラ イ ゲ ー
シ ョ ン す る こ と で T7 RNAP 変 異 体 タ ン パ ク 質 発 現 ベ ク タ ー を 構 築 し た 。
T7 RNAP タ ン パ ク 質 の 発 現 お よ び 精 製 は 、 構 築 し た T7 RNAP 発 現 ベ ク タ ー を
大 腸 菌 DH5α に 導 入 し 、 Chamberlin(3)ら お よ び Zawadzki(4)ら の 方 法 に 基 づ い て
以 下 の 方 法 に よ っ て 行 っ た 。 ま ず T7 RNAP タ ン パ ク 質 発 現 ベ ク タ ー を 導 入 し た
大 腸 菌 DH5α を 抗 生 物 質 ampicillin を 含 む LB 培 地 に 植 菌 し て 、 OD600 が 0.4 か
ら 0.6 に な っ た と こ ろ で isopropyl-β -D-thiogalactoside(IPTG)を 終 濃 度 0.4
m M に な る よ う に 添 加 し て 8 時 間 培 養 し た 。培 養 後 の 菌 体 を 遠 心 処 理 に よ り 集 菌
し て 、 菌 体 の 10 倍 量 の 20 mM Tris-HCl pH 8.1, 130 mM NaCl, 2 mM EDTA を 含
む Wash Buffer を 添 加 し て 懸 濁 し た 。 さ ら に 、 再 び 遠 心 処 理 し た 後 に 上 清 を 除
去 し 、 菌 体 の 10 倍 量 の 50
mM Tris-HCl pH 8.1, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA,
5 mM DTT, 0.1 mM benzamine, 30 μ g/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF),
10 μ g/ml bacitracin を 含 む sonication buffer を 用 い て 、 菌 体 を 懸 濁 し た 。
懸 濁 溶 液 は Sonifier 450(Branson, CT, U.S.A)を 用 い て 、 超 音 波 処 理 し た の ち
に 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム 沈 殿 に よ り T7 RNAP タ ン パ ク 質 の 含 ま れ る 画 分 を 分 画 し た 。
T7 RNAP 画 分 を Haparin-Sepharose お よ び Q-Sepharose(Amersham Bioscience,
Tokyo, Japan)に 充 層 し て 0.1 M か ら 0.64 M の NaCl 濃 度 勾 配 を 与 え た 条 件 下 で 、
T7 RNAP タ ン パ ク 質 を 溶 出 し た 。 溶 出 画 分 を SDS-ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気
泳 動 に 供 す る こ と に よ り T7 RNAP に 相 当 す る 約 100 kDa の バ ン ド を 確 認 し た の
29
ち に 、 50%(w/v) glycerol, 20 mM KH2PO4 pH 7.7, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 30
μ g/ml PMSF を 含 む storage buffer に 対 し て 16 時 間 透 析 し -20℃ に て 保 存 し た 。
4.2.3. T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の polymerase 活 性 の 比 較
T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の polymerase 活 性 の 比 較 実 験 は 以 下 の 反 応
条 件 を 用 い て 行 っ た 。 反 応 液 と し て は 、 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2, 5
mM DTT, 200 μ M GMP, 250 μ M ATP, 250 μ M GTP, 250 μ M CTP, 250 μ M UTP,
0 . 2 μ C i [ α - 3 2 P ] U T P を 調 製 し 、 鋳 型 D N A と し て p B l u e s c r i p t S K（ S t r a t a g e n e ,
CA, U.S.A.） を 制 限 酵 素 PvuII に よ り 処 理 し た DNA 20 ng お よ び T7 RNAP 変 異
体 ま た は 野 生 型 T7 RNAP 酵 素 標 品 を 1 μ g 添 加 し 、 37℃ で 15 分 反 応 を 行 っ た 。
反 応 に よ っ て 得 ら れ た RNA 合 成 産 物 は Sousa(7)ら お よ び Bonner(12)ら の 方 法 に 従
っ て RNA 合 成 産 物 を ト リ ク ロ ロ 酢 酸 沈 殿 に よ り 不 溶 性 の 沈 殿 物 と し て 沈 殿 さ せ 、
DE81 ペ ー パ ー （ Whatman, Tokyo, Japan） に 吸 着 さ せ た 。 つ ぎ に 沈 殿 物 の 吸 着
し た DE81 ペ ー パ ー を シ ン チ レ ー シ ョ ン バ イ ア ル に 封 入 し て 液 体 シ ン チ レ ー シ
ョ ン カ ウ ン タ ー (BECKMAN, Tokyo, Japan)に よ り DE81 ペ ー パ ー の 吸 着 物 由 来 の
放 射 線 量 を 測 定 し た 。 T7 RNAP 変 異 体 お よ び 野 生 型 T7 RNAP に よ る 測 定 値 の 比
較 に よ り 野 生 型 T7 RNAP と の 相 対 値 を 計 算 し た 。 な お 、 T7 RNAP タ ン パ ク 質 の
蛋 白 量 は 、 プ ロ テ イ ン ア ッ セ イ キ ッ ト （ BIO-RAD, Tokyo, Japan） を 用 い て 測 定
した。
4.2.4. T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の 伸 長 活 性 の 比 較
T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の 伸 長 活 性 の 比 較 実 験 は Bonner(5)ら の 方 法
に 従 っ て 以 下 の 方 法 で 実 験 を 行 っ た 。本 章 実 験 方 法 ( 4 . 2 . 4 ) と 同 じ 組 成 の 反 応 液
に 、 マ ウ ス reeler cDNA を 含 む 環 状 pBluescript DNA（ 6） を 鋳 型 DNA と し て 添
加 し た 。 こ の 反 応 液 に 5 units T7 RNAP 変 異 体 お よ び 野 生 型 RNAP 酵 素 標 品 を 添
加 し て 37℃ で 15 分 反 応 し た 後 、 RNA 合 成 産 物 を 6 M 尿 素 を 含 む 8%(w/v)ポ リ ア
ク リ ル ア ミ ド ゲ ル で 電 気 泳 動 後 、 BAS2000 Image Analyzer（ Fuji Film, Tokyo,
Japan） に よ り オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー を 行 う こ と で 電 気 泳 動 パ タ ー ン を 得 た 。
4.2.5. T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の 各 3'-dATP に 対 す る 取 り 込 み 効 率 の 比
較
T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の 各 3'-dATP に 対 す る 取 り 込 み 効 率 の 比 較 事
件 は 、以 下 の 反 応 条 件 を 用 い て 行 っ た 。本 章 実 験 方 法 ( 4 . 2 . 4 ) と 同 じ 組 成 の 反 応 液
お よ び 放 射 線 量 の 検 出 方 法 に お い て 、 終 濃 度 100 μ M 3'-dATP と な る よ う に
3 ' - d A T P 溶 液 を 添 加 し て 、T 7 R N A P 各 酵 素 標 品 を 用 い て 得 ら れ た 放 射 線 量 の 測 定 値
30
か ら T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP と の 相 対 値 を 算 出 し た 。
4.2.6. T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 野 生 型 T7 RNAP に よ る 3'-dATP 添 加 に よ る RNA
合成実験
T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 野 生 型 T7 RNAP に よ る 3'-dATP 添 加 に よ る RNA 合 成
実 験 は 、以 下 の 反 応 条 件 を 用 い て 行 っ た 。本 章 実 験 方 法 ( 4 . 2 . 5 ) と 同 じ 反 応 液 お
よ び 電 気 泳 動 条 件 に お い て 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 野 生 型 T7 RNAP の 酵 素 標
品 を 用 い て RNA 合 成 反 応 を 行 う 際 に 終 濃 度 500 μ M、 100 μ M、 50 μ M、 2.5
μ M、 1 μ M と な る よ う に 3'-dATP 溶 液 を そ れ ぞ れ 添 加 し て 、 RNA 合 成 反 応 を 行
っ た 。 つ ぎ に RNA 合 成 産 物 の 電 気 泳 動 お よ び オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー を 行 い 、
電気泳動パターンを得た。
4.2.7. T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y と 野 生 型 T7 RNAP の 各 3'-dNTP の 取
り込み効率の比較
T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y と 野 生 型 T7 RNAP の 各 3'-dNTP の 取 り 込
み 効 率 の 比 較 実 験 は 、 以 下 の 反 応 条 件 を 用 い て 行 っ た 。 本 章 実 験 方 法 (4.2.5)
と 同 じ 反 応 液 組 成 お よ び 電 気 泳 動 条 件 に お い て 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び
F667Y と 野 生 型 T7 RNAP 酵 素 標 品 を 用 い て RNA 合 成 反 応 を 行 う 際 に 3'-dGTP、
3'-dATP、 3'-dCTP、 3'-dUTP を そ れ ぞ れ 終 濃 度 500 μ M お よ び 250 μ M と な る
よ う に 添 加 し て R N A 合 成 反 応 を 行 っ た 。R N A 合 成 産 物 は 電 気 泳 動 を 行 い 、T a b o r ( 7 )
ら の 方 法 に 従 っ て T7 RNAP に よ る 各 3'-dNTP の 取 り 込 み 効 率 を 算 出 し た 。
4.2.8. T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 野 生 型 T7 RNAP に よ る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を 用
い た RNA 合 成 実 験
蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を 添 加 し た 場 合 の T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 野 生 型 T7 RNAP
に よ る RNA 合 成 実 験 は 、 以 下 の 反 応 条 件 を 用 い て 行 っ た 。 反 応 液 と し て 40 mM
Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2, 5 mM DTT, 2 mM spermidine(HCl)3, 250 μ M ATP,
500 μ M GTP, 200 μ M CTP, 500 μ M UTP, 0.1 μ M R6G-(CH2)4-3'-dATP、 0.1 μ
M R110-(CH2)4-3'-dGTP、 1 μ M TMR-(CH2)4-3'-dUTP、 5 μ M ROX-(CH2)4-3'-dCTP
を 調 製 し 、 鋳 型 DNA と し て ヒ ト Thyrotoropin cDNA 配 列 を 持 つ PCR 産 物 (8)10 ng
を 反 応 液 に 添 加 し た 。 こ の 反 応 液 に 25 units T7 RNAP 変 異 体 F644Y ま た は 野
生 型 T7 RNAP 酵 素 標 品 を 添 加 し 、 37℃ で 1 時 間 反 応 し た の ち 、 Sephadex G50
column(Amersham Biosciences, Tokyo, Japan)を 用 い て ゲ ル ろ 過 を 行 い RNA 産
物 を 精 製 し た 。精 製 し た R N A 合 成 産 物 は C e n t r i f u g e C o n c e n t r a t o r V C - 9 6（ T A I T E C ,
Saitama, Japan） に よ っ て 蒸 発 乾 固 し た 。
31
乾 燥 し た RNA 合 成 産 物 を ABI Prism 377 DNA Sequencer(Applied Biosystems,
Tokyo, Japan)の 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 調 製 し た loading buffer 6 μ l に 溶 解 し 、
そ の う ち 2 μ l を 9 0 ℃ で 3 分 間 熱 処 理 し た 。熱 処 理 後 の 溶 液 は A B I P r i s m 3 7 7 D N A
Sequencer で 泳 動 し 、 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 泳 動 結 果 を 解 析 し た 。 泳 動 し た の ち
に 残 っ た RNA 溶 液 4 μ l は 、 -20℃ で 保 存 し た 。
4.3. 実 験 結 果
4.3.1. T7 RNAP 変 異 体 の 構 築
Fig. 4.1 に 、 本 章 に お け る 検 討 に お い て 構 築 し た T7 RNAP 変 異 体 の 変 異 部 位
と そ の 周 辺 の 立 体 構 造 上 の 特 徴 を 示 す 。 本 章 で は 、 T7 RNAP の 基 質 で あ る NTP
の リ ボ ー ス の 3'-OH 基 と の 相 互 作 用 に 関 与 す る T7 RNAP タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸
部位を探索し、相互作用に関与するアミノ酸部位の変異体の構築することによ
り 3'-dNTP の 取 り 込 み が 改 善 し た T7 RNAP 変 異 体 の 作 製 を 試 み た 。 さ ら に 、 こ
の よ う な T7 RNAP 変 異 体 を 用 い る こ と で TS 法 に お け る 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取
り込みを改善し、シークエンスシグナルの上昇とともにノイズシグナルを解消
す る こ と を 目 的 と し て 検 討 を 行 っ た 。ま ず 、T 7 R N A P と NT P の リ ボ ー ス の 3 '- O H
基 と の 相 互 作 用 部 位 の 候 補 と し て は 、 こ れ ま で の T7 RNAP の 機 能 解 析 お よ び T7
RNAP の 構 造 解 析 (9)の 報 告 を 基 に し て 、 T7 RNAP に お い て polymerase 活 性 を 有
する
polymerase ド メ イ ン に 存 在 す る
Helix Y(625-634 aa)-loop(635-648
aa)-Helix Z(649-658 aa)-loop(658-684 aa)の 領 域 に 注 目 し た 。 こ れ ら の 領 域
に 位 置 す る K631, Y639, G640, D812, D537 は Osumi-Davis(10)ら の 報 告 で T7 RNAP
タ ン パ ク 質 表 面 に あ る と 予 測 さ れ て い る 。 ま た 、 D812, D537 は polymerase 活
性発現に重要な二価カチオンとの相互作用に関与していることが示されている
(11)
。 さ ら に 、 K631, Y639, G640 は polymerase ド メ イ ン 中 の motif B お よ び そ
の 近 傍 に 位 置 し て お り 、Y 6 3 9 に つ い て は N T P を 取 り 込 む 際 に N T P の リ ボ ー ス の
2'-OH 基 と の 相 互 作 用 に お い て 重 要 な 機 能 を 有 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る
(12)
。 Motif B は Motif C と と も に 様 々 な polymerase に お い て 活 性 発 現 に 関 わ
る 重 要 な 領 域 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る (13)。 T7 RNAP に 関 す る こ れ ら の 報 告
と は 別 に D N A P の 機 能 解 析 に お い て 、D N A P の 基 質 で あ る d N T P の リ ボ ー ス の 3 ' - O H
基 ま た は 2 ' - H 基 と の 相 互 作 用 に つ い て 、分 子 内 に 芳 香 族 環 を 有 す る ア ミ ノ 酸 が
関与していることを示す報告が複数されている。たとえば
polymerase I の F762, F766
(14, 15)
、T a q D N A p o l y m e r a s e の F 6 6 7
(7)
E. coli DNA
、M M L V R e v e r s e
transcriptase に お い て は F155 が (16)、 Mycobacterium DNA polymerase I に お
い て は Y737(17)が リ ボ ー ス の 2'や 3'-OH 基 と の 相 互 作 用 に 重 要 で あ る こ と が 報
告 さ れ 、 こ れ ら の 報 告 は リ ボ ー ス の 2'ま た は 3'が OH 基 を 認 識 す る こ と が 示 唆
されるアミノ酸として、アミノ酸分子内に芳香族環を有するフェニルアラニン
32
や チ ロ シ ン 残 基 が 機 能 し て い る こ と を 報 告 し て い る 。 こ れ ら の 知 見 か ら 3'-OH
基 と の 相 互 作 用 部 位 の 候 補 と し て T7 RNAP の 625 aa か ら 684 aa の 領 域 に 位 置
す る 芳 香 族 ア ミ ノ 酸 で あ る F644、 F646 お よ び F667 を 選 択 し た 。 さ ら に 、 こ れ
ら の 部 位 以 外 に polymerase ド メ イ ン に あ り T7 RNAP タ ン パ ク 質 表 面 に 位 置 す る
こ と が 示 唆 さ れ る F 7 3 3 、F 7 8 2 お よ び F 8 8 2 も 候 補 と し て 選 択 し た 。本 論 文 で は 、
さ ら に T7 RNAP の Y639F と 2'-OH 基 と の 相 互 作 用 に 関 す る 報 告 (12)や E. coli DNA
polymerase と 3'-OH 基 と の 相 互 作 用 に 関 す る 報 告 (7)を 踏 ま え て 、 polymerase
タ ン パ ク 質 と N T P の リ ボ ー ス の 3 ' - O H 基 と の 相 互 作 用 に お い て 、p o l y m e r a s e タ
ン パ ク 質 の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 残 基 中 に 存 在 す る 芳 香 族 環 の パ ラ 位 の -H 基 と NTP
の リ ボ ー ス の -OH 基 と の 水 素 結 合 を 介 し た 相 互 作 用 の 形 成 を す る と 仮 定 し た 。
こ の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 残 基 の チ ロ シ ン 残 基 へ の 置 換 に よ り 、 リ ボ ー ス の 3'-H
基 と チ ロ シ ン 残 基 の 芳 香 族 環 の パ ラ 位 に 存 在 す る -OH 基 が 新 た に 相 互 作 用 を 形
成できる可能性を考えたのである。3 章で構築した蛍光ターミネーターのリボ
ー ス の 3'位 は -H 基 で あ り 、 上 記 の 仮 説 に 従 え ば 、 T7 RNAP に お い て 3'-OH 基 と
の相互作用に関与するアミノ酸部位をチロシン残基に置換した変異体を構築す
る こ と で 、 野 生 型 T7 RNAP に お い て は 取 り 込 み の 悪 い 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー と の
相互作用を形成することにより蛍光ターミネーターの取り込みが改善できると
考えた。蛍光ターミネーターの取り込みの改善によるシークエンスシグナルの
上昇に伴い、3 章において明らかになったノイズシグナルの減少とこれに伴う
シークエンスエラーの解消が期待された。
以 上 の よ う な 理 由 に よ り 本 章 で は T 7 R N A P の F 6 4 4 、F 6 4 6 、F 6 6 7 、F 7 3 3 、F 7 8 2 、
F882 に つ い て 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y、 F646Y、 F667Y、 F733Y、 F782Y、 F882Y
を構築した。
33
Fig. 4.1
Mutation sites of T7 RNAP mutant.
The mutated residues and highly conserved motifs among various DNA and RNAP
are indicated in this figure. The motifs and mutated sites are located above
and below the amino acid sequence, respectively. Motif B, Motif C, HelixY,
HelixZ and HelixAA are located at 625-652, 805-818, 625-634, 649-658 and
684-699, respectively. The series of T7 RNAP mutants designed in this study
consisted of F644Y, F646Y, F667Y, F733Y, F782Y, F882Y and Y639F.
4.3.2.
変 異 導 入 に よ る T7 RNAP の 酵 素 活 性 へ の 影 響
Fig. 4.2、 Table 4.1 お よ び Table 4.2 に 、 T7 RNAP 変 異 体 の 野 生 型 T7 RNAP
と 比 較 し た 伸 長 活 性 、 polymerase 活 性 、 3'-dATP の 取 り 込 み 効 率 の 検 討 結 果 を
示 す 。 ま ず Table 4.1 は T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の polymerase 活 性 の
比 較 検 討 結 果 を 示 す 。 構 築 し た T7 RNAP 変 異 体 の う ち 、 T7 RNAP 変 異 体 F882Y
は 野 生 型 T 7 R N A P と 比 較 し て 著 し い p o l y m e r a s e 活 性 の 低 下 が 認 め ら れ た 。F 8 8 2
は RNA 合 成 反 応 に お い て rNTP の 塩 基 部 分 と T7 RNAP と の 相 互 作 用 に 関 与 し て い
る ア ミ ノ 酸 残 基 で あ る と の 報 告 ( 1 9 ) が あ り 、変 異 導 入 に よ り N T P と の 親 和 性 の 低
下 を 引 き 起 こ し p o l y m e r a s e 活 性 の 低 下 が 引 き 起 こ さ れ た と 考 え ら れ る 。そ の 他
の T7 RNAP 変 異 体 に お い て も 数 倍 程 度 の 活 性 低 下 が 認 め ら れ た が 著 し い も の で
はなく、この結果はフェニルアラニンからチロシンへの変異が構造変化の少な
い 変 異 で あ る こ と に 起 因 す る と 考 え ら れ る 。 こ の 実 験 結 果 か ら T7 RNAP 変 異 体
F882Y 以 外 の 変 異 体 に つ い て は 実 用 に 十 分 耐 え う る polymerase 活 性 を 有 し て い
ると考えられる。
34
Table 4.1
Relative activity of T7 RNAP mutant
Relative activities of RNAP
Mutation Site activity
comparing
with
Wild-type
F882Y
N.D.
F782Y
0.31
F733Y
0.65
F667Y
0.56
F646Y
0.39
F644Y
0.63
F644Y/F667Y
0.45
Y639F
0.12
Wild-type
1.00
The relative activity of each RNAP mutant was measured as the incorporated
rate of [α -32P]UTP. The reaction was performed in the presence of 250 μ
M each RNTP using the plasmid DNA digested by PvuII as the template. ND
indicates that no activity was detected. Total reaction aliquots were
spotted onto DE81 paper, and after washing, the retained radioactivity of
DE81 paper was counted.
つ ぎ に 、 Fig. 4.2 に T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の 伸 長 活 性 に つ い て の
比 較 実 験 結 果 を 示 す 。 こ の 実 験 で は マ ウ ス reeler cDNA を 含 む 環 状 plasmid
DNA(6)を 鋳 型 DNA と し 、 各 酵 素 を 用 い て 合 成 さ れ た RNA 合 成 産 物 の 鎖 長 を 電 気
泳 動 パ タ ー ン に よ り 比 較 す る こ と で 伸 長 活 性 の 違 い を 検 討 し た 。 Fig. 4.2 に お
い て は 野 生 型 T7 RNAP と 比 較 し て T7 RNAP 変 異 体 F667Y、 F646Y お よ び Y639F
ではわずかな違いが認められたが、優位な変化は認められなかった。さらにこ
れ ら の 変 異 体 と T7 RNAP 変 異 体 F882Y 以 外 の 変 異 体 に よ る 伸 長 活 性 に は 違 い が
ほ と ん ど 見 ら れ な か っ た 。 こ の 結 果 か ら 、 T7 RNAP 変 異 体 F882Y 以 外 の T7 RNAP
変 異 体 で は 野 生 型 T7 RNAP と の 優 位 な 差 は 認 め ら れ ず 、 polymerase 活 性 だ け で
はなく伸長活性についても十分に実用に耐えうると考えられた。
35
Fig. 4.2
Processivity of T7 RNAP mutants
The assay method used in this study was described previously(5). The
processivity of each RNAP was measured by the incorporation of [α -32P]UTP
using a circular DNA as the template. In this reaction mixture, 10 μ mol
of closed circular reeler cDNA clone was used as the template. The final
product
was
subjected
to
electrphoresis
on
8%
polyacrylamide
gel
containing 6 M urea and autoradiographed. lane 1, Wild-Type; lane 2, F644Y;
lane 3, F667Y; lane 4, Y639F; lane 5, F646Y; lane 6, F733Y; lane 7, F782Y;
lane 8, F644Y/F667Y; lane 9, F882Y.
さ ら に Table 4.2 で は pBluescript を 制 限 酵 素 PvuII に よ り 線 状 化 し た 2 本 鎖
DNA を 鋳 型 DNA と し て 、 T7 RNAP 変 異 体 と 野 生 型 T7 RNAP の 3'-dATP の 取 り 込 み
効 率 の 比 較 を 行 っ た 。 3'-dATP は 、 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー 中 に も 含 ま れ て お り 、
RNA polymerase 反 応 に 基 質 と し て 取 り 込 ま れ る こ と に よ り RNA 伸 長 が 阻 害 さ れ
る R N A 合 成 阻 害 剤 で あ る 。こ の 実 験 で は 3 ' - d A T P に よ る p o l y m e r a s e 反 応 阻 害 を
指 標 に し て T7 RNAP 変 異 体 の 3'-dATP と 基 質 と し て の 取 り 込 み 効 率 の 評 価 を 行
っ た 。 そ の 結 果 、 T7 RNAP 変 異 体 の 中 で T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y が
36
野 生 型 T7 RNAP と 比 較 し て 3'-dATP 添 加 に よ り 顕 著 に RNA 産 物 量 が 減 少 し て お
り 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y を 用 い た 場 合 、 野 生 型 T7 RNAP を 用 い
た 場 合 と 比 較 し て RNA 産 物 由 来 の 放 射 活 性 の 値 が 約 20%に 減 少 し た 。 こ の こ と
は T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y が NTP と 3'-dATP の 違 い 、 す な わ ち NTP
の リ ボ ー ス の 3'位 に お け る -OH 基 と -H 基 の 構 造 の 相 違 を 識 別 す る 酵 素 活 性 が 変
化 す る こ と で T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y が 3'-dATP を 基 質 と し て 効 率
良 く 取 り 込 む よ う に な っ た こ と が 推 測 さ れ た 。 一 方 、 T7 RNAP 変 異 体 F646Y で
は 3'-dATP の 基 質 と し て の 取 り 込 み 効 率 が 野 性 型 T7 RNAP と 比 較 し て 減 少 し て
お り 、 F646Y の 変 異 導 入 に よ り 3'-dATP に 対 す る 基 質 特 異 性 に 影 響 を 与 え た 可
能 性 が あ る 。 ま た T7 RNAP 変 異 体 F644Y と F667Y に 関 し て は 3'-dATP の 取 り 込
み 効 率 が 異 な り 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y の 3'-dATP の 取 り 込 み が F667Y よ り も
優 れ て い る こ と か ら 、 こ の 2 つ の ア ミ ノ 酸 部 位 の NTP と の 相 互 作 用 に お け る 作
用機構が異なることも考えられる。
Table 4.2
Relative efficiencies of recognizing the 3'-OH groups of
ribonucleotides as substrate in each mutated T7 RNAP and wild-Type.
Mutation
site
Fold reduction by 3'-dATP
F644Y
98.24-99.12
F667Y
90.46-90.76
F644Y/F667Y
106.24-108.43
F782Y
21.89-23.22
F733Y
20.22-21.14
F646Y
8.23-9.44
Y639F
17.17-18.62
Wild-Type
19.12-19.35
For the template DNA, see Table 4.1. 3'-dATP concentrations were 100 μ
M. The experiment was triplicated. The value in this table represents the
average of the relative reduction of the [α -32P]UTP incorporation rate
by each RNAP in the presence of the 100 μ M 3'-dATP.
4.3.3.
3'-dATP 濃 度 変 化 に よ る T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y と 野 生 型
T7 RNAP 伸 長 反 応 の 相 違 点
Fig. 4.3 に 、 鋳 型 DNA と し て マ ウ ス reeler cDNA を 含 む 環 状 plasmid DNA(6)
を 用 い 、濃 度 の 異 な る 3 ’- d A TP の 添 加 し た 場 合 に T 7 R N AP 変 異 体 F 6 4 4Y と 野 生
型 T7 RNAP に よ る 伸 長 反 応 阻 害 の 違 い に つ い て の 検 討 結 果 を 示 す 。 こ の 実 験 に
37
お い て は Table 4.2 の 実 験 に お い て 3'-dATP の 取 り 込 み 効 率 が 顕 著 に 上 昇 し た
こ と が 明 ら か と な っ た T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 野 生 型 T7 RNAP に つ い て 、 500
μ M か ら 1 μ M の 終 濃 度 に な る よ う に 3'-dATP を 添 加 し た 場 合 、 明 ら か に 野 生
型 T7 RNAP に よ る 3'-dATP の 取 り 込 み 効 率 は T7 RNAP 変 異 体 F644Y と 比 較 し て
低 く 、 本 実 験 で 検 討 し た す べ て 3'-dATP 濃 度 で RNA 合 成 産 物 の ほ と ん ど が 完 全
長 RNA 合 成 産 物 と な っ て い た 。 し か し 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y を 用 い た RNA 合
成 反 応 に よ る RNA 合 成 産 物 は 500 μ M、 250 μ M、 100 μ M で は ほ と ん ど が 低 分
子 領 域 で 終 結 し て お り 、 完 全 長 ま で 伸 長 し て い る RNA 産 物 は 全 体 の 数 ％ で あ っ
た 。 こ の 結 果 と 同 様 の 結 果 は T7 RNAP 変 異 体 F667Y を 用 い た 同 様 の 実 験 を 行 っ
た 場 合 で も 認 め ら れ た （ デ ー タ 省 略 ）。 こ の 結 果 か ら T 7 R N A P 変 異 体 F 6 4 4 お
よ び F667 の ２ つ の ア ミ ノ 酸 残 基 は NTP の リ ボ ー ス の 3'-OH 基 と 相 互 作 用 に 重
要な部位であることが明らかとなった。このような効果は、同様の実験方法に
よ り 、 E.coli DNA polymerase I 、 Taq DNA polymerase や T7 DNA polymerase
な ど に よ っ て も 確 認 さ れ て い る (7)。
38
Fig. 4.3
Chain termination study for the presence of the incorporated of
3'-dNTPs and rNTPs in F644Y and wild-type T7 RNAP
Template DNA and electrophoresis conditions are given in Fig. 4.2. Each
lane also had Wild-type (WT) and F644Y mutant RNAP (lane 1-5 and lane 6-10,
respectively). 3'-dATP concentrations in lanes 1 and 6, 500 μ M; lanes 2
and 7, 100 μ M; lanes 3 and 8, 50 μ M; lanes 4 and 9, 2.5 μ M; lanes 5 and
10, 1 μ M.
4.3.4. T7 RNAP 変 異 体 F644Y、 F667Y お よ び 野 生 型 T7 RNAP の 各 3'-dNTP の 取
り込み効率の比較
Table 4.2 お よ び Fig. 4.3 の 実 験 結 果 か ら 3'-dATP の 取 り 込 み 効 率 の 上 昇 が
明 ら か と な っ た T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y に つ い て 、 Table 4.3 に お
い て は 、 野 生 型 T7 RNAP と 比 較 し た 各 3'-dNTP の 取 り 込 み 効 率 の 違 い に つ い て
示 し て い る 。 こ の 実 験 に お い て は 環 状 プ ラ ス ミ ド DNA を 鋳 型 DNA と し て 用 い 、
各 3'-dNTP を 添 加 す る こ と に よ る RNA 合 成 量 の 減 少 の 程 度 を 調 べ る こ と で そ れ
ぞ れ の T7 RNAP に よ る 3'-dNTP の 取 り 込 み 効 率 の 違 い を 検 討 し て い る 。 そ の 結
果 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y は 3'-dNTP 種 の 違 い に お い て 差 が 認 め
ら れ る が 、 い ず れ の 場 合 も 野 生 型 T7 RNAP と 比 較 し て 3'-dNTP を 取 り 込 む 効 率
39
が 共 通 に N T P と 比 較 し て 1 0 0 倍 以 上 上 昇 し て い た 。ま た 、T 7 R N A P 変 異 体 F 6 4 4 Y
お よ び F667Y 共 通 に 3'-dUTP の 取 り 込 み 効 率 の 上 昇 が 最 も 高 く 、 さ ら に ４ 種 の
3'-dNTP を 比 較 す る と 上 昇 の 程 度 は 3'-dUTP>3'-dCTP>3'-dATP>3'-dGTP で あ り 、
purin 塩 基 よ り も pyrimidine 塩 基 を 有 す る 3'-dNTP で 上 昇 の 度 合 い が 優 位 と な
っ た 。 T7 RNAP 変 異 体 F644Y と F667Y 間 で は 、 各 3'-dNTP の 取 り 込 み 効 率 は 若
干 の 違 い が 認 め ら れ た 。 こ れ ら の 結 果 に よ り F644 お よ び F667 が 3'-OH 基 の 相
互作用に関与するアミノ酸部位であることが明らかとなった。
Table 4.3 Relative selectivity of F644Y, F667Y and wild-Type T7 RNAP for
3'-dNTPs and rNTPs.
Mutation
site
F644Y
3'-dATP/ATP
3'-dUTP/UTP
3'-dCTP/CTP
3'-dGTP/GTP
46.08-50.53
83.89-86.11
127.71-130.01 41.61-44.10
F667Y
38.76-41.81
68.23-70.32
115.79-118.43 34.92-37.10
Wild-Type
0.23-0.24
0.31-0.34
0.59-0.61
0.30-0.34
The rates of each 3'-dNTPs incorporation to rNTPs are compared for F644Y
and F667Y mutants and wild-type T7 RNAP. The template is given in Fig. 4.2
and Table 4.1, respectively. The 3'-dNTPs concentrations were 500 μ M and
250 μ M.
4.3.5. T7 RNAP 変 異 体 F644Y を 用 い た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み 効 率 改 善
による効果
Fig. 4.5 に 、 ヒ ト Thyrotoropin cDNA(8)PCR 産 物 を 鋳 型 に し て 蛍 光 タ ー ミ ネ
ー タ ー を 基 質 と し て 添 加 し 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び 野 生 型 T7 RNAP を 用
い て RNA 合 成 反 応 を 行 う こ と に よ り 合 成 し た RNA 合 成 産 物 を 蛍 光 自 動 DNA シ ー
クエンサーで解析することで、蛍光ターミネーター由来のシークエンスシグナ
ル の 変 化 お よ び ノ イ ズ シ グ ナ ル 減 少 の 効 果 に つ い て 検 討 結 果 を 示 す 。野 生 型 T 7
RNAP と 比 較 し て 、 T7 RNAP 変 異 体 F644Y に よ っ て 合 成 さ れ た RNA 合 成 産 物 か ら
得 ら れ た シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル は 、 野 生 型 T7 RNAP の 解 析 結 果 に お い て 矢 印 で
示すような高いノイズシグナルのためシークエンスエラーとなるシークエンス
シグナルは顕著に低下し、正確なシグナルのみ顕著に上昇することが明らかと
なった。この結果より、3 章において問題となった弱いシークエンスシグナル
に 起 因 し た ノ イ ズ シ グ ナ ル の 問 題 が T7 RNAP 変 異 体 F644Y を 用 い る こ と で 解 消
で き る こ と が 明 ら か と な り 、T S 法 に お い て 正 確 な D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 え
ることが示唆される結果となった。
40
Fig. 4.4
Electrophoresis of Transcriptional Sequencing
using F644Y
mutant.
The reaction was carried out with PCR product of human thyrotropin- β
CDNA(8) and F644Y or Wild-type(WT) T7 RNAP. This figure shows the G-signals.
Arrowheads show the high background signals of wild-type T7 RNAP.
4.4. 考 察
本 章 に お け る 検 討 に よ り 、 T7 RNAP に お い て F644 お よ び F667 の ２ つ の ア ミ
ノ 酸 部 位 が NTP の 3'-OH 基 を 認 識 す る 特 異 性 に お い て 重 要 な 機 能 を 果 し て い る
こ と が 明 ら か に な っ た 。 T7 RNAP タ ン パ ク 質 の 構 造 上 、 ま ず F644 は T7 RNAP の
polymerase ド メ イ ン の 内 部 に あ る Helix Y(624 aa-634 aa) と Helix Z(648
aa-658 aa)に 挟 ま れ た loop に 存 在 す る 。 こ の loop 内 に は 、 リ ボ ー ス の 2'-OH
基 と 相 互 作 用 し 、基 質 特 異 性 に 関 与 す る Y 6 3 9 も 存 在 し 、N TP と の 相 互 作 用 に 重
要 と 考 え ら れ て い る (12)。 ま た 、 F667 は Helix Z と Helix AA（ 659 aa-684 aa）
に 挟 ま れ た loop に 存 在 す る 。 こ の ２ つ の loop に 存 在 す る ２ つ の ア ミ ノ 酸 部 位
が 3'-dNTP と の 相 互 作 用 お よ び polymerase 反 応 の 際 の NTP 分 子 の 安 定 化 を 行 っ
ていることが示唆される。
敷 延 す る と こ の ２ つ の ア ミ ノ 酸 部 位 の 変 異 体 は 3'-dNTP の 取 り 込 み 効 率 に つ
い て 野 生 型 T7 RNAP と 比 較 し て 同 様 に 改 善 し て い る 。 し か し 、 T7 RNAP 変 異 体
F 6 4 4 Y は F 6 6 7 Y と 比 較 し て 、T 7 R N A P 変 異 体 F 6 4 4 Y の 3 ' - d A T P の 取 り 込 み 効 率 が
上 回 っ て い る 。ま た 、2 ' - OH 基 の 基 質 特 異 性 発 現 に 関 与 し て い る Y 6 3 9 の 近 傍 に
位 置 し て い る 。し た が っ て 、そ の 物 理 的 距 離 な ど か ら 考 え 、F644 が 3'-OH 基 と
の 直 接 の 相 互 作 用 部 位 と し て 機 能 し 、F 6 6 7 は 金 属 イ オ ン な ど を 介 し て 間 接 的 に
3'-OH 基 を 認 識 す る 活 性 を 有 し て い る と 考 え る こ と も で き る 。 ま た 、 こ れ ら ２
41
つのアミノ酸部位を同時にチロシン残基に置換した二重変異体
T7 RNAP
F644Y/F667Y で は T7 RNAP 変 異 体 F644Y や F667Y を 単 独 で 使 用 し た 場 合 と 比 較
し て 、3 ' - d A T P の 取 り 込 み 効 率 が さ ら に 上 昇 し て い る 。し た が っ て 、F 6 4 4 と F 6 6 7
が そ れ ぞ れ 別 々 の 作 用 機 構 に よ っ て 3'-OH と の 相 互 作 用 に 関 与 し て い る こ と が
示唆される。
こ れ ま で の E coli DNA polymerase I に 関 す る 報 告 で は 、 dNTP の リ ボ ー ス の
3'-OH 基 と の 相 互 作 用 に 関 与 し て い る F762 を チ ロ シ ン 残 基 に 置 換 す る と ddNTP
の DNA 合 成 鎖 へ の 取 り 込 み 効 率 が 100 倍 以 上 上 昇 す る と さ れ て い る (7)。 こ の よ
う な 結 果 が 、 本 章 の T7 RNAP 変 異 体 に お け る 解 析 結 果 で も 100-270 倍 の 取 り 込
み 効 率 の 改 善 と し て 同 様 の 効 果 が 認 め ら れ た 。 ま た 本 章 の 検 討 結 果 に よ り T7
RNAP に お け る リ ボ ー ス の 3'-OH 基 と の 相 互 作 用 に お い て F644 と F667 の ２ 箇 所
が 重 要 や 役 割 を は た し て い る と 考 え ら れ る 。 こ の 結 果 か ら 、 こ れ ま で に DNAP
に よ る 3'-0H 基 の 認 識 機 構 に お い て 報 告 さ れ て い る １ つ の ア ミ ノ 酸 だ け で は な
く 、 複 数 の ア ミ ノ 酸 残 基 が 直 接 お よ び 間 接 的 に 3'-OH 基 に 相 互 作 用 す る こ と も
考 え ら れ 、 今 後 、 他 の DNAP、 RNAP、 Reverse transcriptase に お い て も あ ら た
な知見が得られることも期待される。
本 章 に お い て 得 ら れ た T7 RNAP 変 異 体 を 用 い て TS 反 応 を 行 う こ と で 、 3 章 ま
でに問題になっていたノイズシグナルを顕著に低下させることが可能である。
また、正確な配列のシークエンスシグナルのシグナル強度のみが顕著に上昇さ
せ る こ と で 、T S 法 に よ り 均 一 か つ 正 確 な D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 得 る こ と
が可能であることが明らかとなった。
4.5. 結 語
構 築 し た T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び F667Y を 用 い て 3'-dATP を 添 加 し て in
v i t r o 転 写 反 応 を 行 っ た と こ ろ 、野 生 型 T 7 R N A P と 比 較 し て 優 位 に 転 写 終 結 し 、
3'-dNTPs の 取 り 込 み 効 率 の 顕 著 な 上 昇 を 示 し た 。 さ ら に 、 TS 法 に お い て も T7
R N A P 変 異 体 F 6 4 4 Y お よ び F 6 6 7 Y を 使 用 す る こ と に よ り 、蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー 由
来のシークエンスシグナルが上昇し、シークエンスエラーが減少することが明
ら か と な り 、T S 法 に お い て シ ー ク エ ン ス 精 度 の 改 善 に 寄 与 す る こ と が で き る こ
と か ら 、 TS 法 が DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 と し て 性 能 的 に 改 善 さ れ た 。
参考文献
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43
第 5章
TS 法 の 構 築
5.1. 緒 言
T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 、シ ー ク エ ン ス ピ ー ク の 重 な り に
起 因 し て シ ー ク エ ン ス エ ラ ー が 生 ず る 配 列 の 存 在 が 確 認 さ れ 、 正 確 な DNA シ ー
クエンス解析にはこの解消が必要であった。この現象はコンプレッションと呼
ば れ 、D N A P を 用 い た ジ デ オ キ シ 法 に お い て も 認 め ら れ る 問 題 で あ る 。T S 反 応 に
よ り 合 成 さ れ た R N A 合 成 産 物 を 電 気 泳 動 に よ り 分 離 す る 際 に 、電 気 泳 動 中 の R N A
分子内に水素結合を介した二次構造が形成されることにより、電気泳動上の
RNA 分 子 の 移 動 度 が 変 化 し 、 分 子 量 に よ る 正 確 な 分 離 が 困 難 に な る こ と が 主 因
と考えられる。
本章では、上記のコンプレッションに関する問題を解決することを目的とし
て 、 以 下 の 方 法 を 検 討 し た 。 す な わ ち 、 核 酸 分 子 内 に お い て は guanosine
t r i p h o s p h a t e（ r G T P ）と 比 較 し て 、水 素 結 合 を 介 し た 2 本 鎖 形 成 能 が 弱 い i n o s i n e
triphosphate（ rITP） や 7-deaza-guanosine triphosphate（ c7-rGTP） な ど の
r G T P の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ に 着 目 し 、こ れ ら を r G T P と 置 換 し て 用 い て T S 反
応を行うことにより二次構造の解消および二次構造形成に起因するコンプレッ
ションの解消が可能かどうかを検証した。さらに、本章までの開発成果である
蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー 、 変 異 型 T7 RNAP お よ び ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を 含 む TS
反 応 条 件 を 用 い て T S 法 を 構 築 し 、そ の 特 長 に つ い て 評 価 し た 。ま た 、本 章 で は
T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 を 有 す る 物 質 と し て こ れ ま で に 促 進 効
果 の 報 告 が あ っ た spermidine 以 上 の 促 進 効 果 を 有 す る ポ リ ア ミ ン の 探 索 を 行
っ た 。促 進 効 果 が 認 め ら れ た ポ リ ア ミ ン に つ い て は 、T S 法 に お け る 添 加 効 果 に
ついて検討し、機能を評価した。
5.2. 実 験 方 法
5.2.1. 鋳 型 DNA の 調 製
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に 用 い る ヒ ト Tyrotropin cDNA を 含 む PCR 産 物 は 0.1 M
PCR プ ラ イ マ ー TSH-F(5'-ACG,TTG,TAA,AAC,GAC,GGC,CAG,T-3')お よ び PCR プ ラ
イ マ ー T S H - R ( 5 ' - T A A , C A A , T T T , C A C , A G G , A A A , C A - 3 ' ) を 用 い 、鋳 型 D N A と し て ヒ ト
Tyrotropin cDNA を 含 む pBluescript II DNA(1) 1 pg お よ び 0.5 units Ex Taq
DNA polymerase(Takara Bio, Shiga, Japan)を 添 加 し て PCR 反 応 を 行 う こ と に
よ り PCR 産 物 を 調 製 し た 。 p53 エ キ ソ ン 8 遺 伝 子 を 含 む PCR 産 物 は 、 ヒ ト 大 腸
が ん 細 胞 株 HT29(American Type Cell Collection, VA ,U.S.A)お よ び ヒ ト 胎 盤
ゲ ノ ム DNA 100 ng を 鋳 型 DNA と し て T7 プ ロ モ ー タ ー 配 列 を 含 む PCR プ ラ イ マ
44
ー P53-T7(5'-GTA,ATA,CGA,CTC,ACT,ATA,GGG,CAC,CTA,CCT,GGA,GCT,GGA,GC-3')
お よ び PCR プ ラ イ マ ー G2(5'-CCA,AGA,CTT,AGT,ACC,TGA,AG-3')を 0.2 M と な る
よ う に 用 い 、 0.5 units Ex Taq DNA polymerase(Takara Bio, Shiga, Japan)
を 添 加 し た PCR 反 応 に よ り p53 エ キ ソ ン 8 領 域 を 含 む PCR 産 物 を 調 製 し た (2)。
PCR 法 に 用 い る サ ー マ ル サ イ ク ラ ー は PTC-200 DNA Engine(MJ Research, CA ,
U.S.A)を 使 用 し た 。 PCR 反 応 プ ロ グ ラ ム は 、 ま ず 96℃ で 1 分 間 、 55℃ で 30 秒 、
72℃ で 1 分 の 反 応 を 行 い 、つ ぎ に 96℃ で 30 秒 、55℃ で 30 秒 、72℃ で 1 分 の 増
幅 反 応 を 24 回 繰 り 返 し た の ち に 72℃ で 5 分 の 後 処 理 を 行 っ た 。
5.2.2. T7 RNAP に よ る ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ の 取 り 込 み 実 験
r G T P の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ で あ る r I T P（ Y a m a s a , T o k y o , J a p a n ）や c 7 - r G T P
を 用 い た RNA 合 成 反 応 に お け る 取 り 込 み 効 率 お よ び 至 適 濃 度 の 検 討 実 験 を 以 下
の 方 法 で 行 っ た 。 実 験 に 用 い た c7-rGTP お よ び c7-rATP は Tolman(3)ら 報 告 に 従
っ て 合 成 し た 。 RNA 合 成 反 応 は 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2, 5 mM DTT,
200 μ M GMP, 200 μ M ATP, 200 μ M CTP, 200 μ M UTP, 1 μ Ci [α -32P] UTP
を 含 む 転 写 反 応 液 に 鋳 型 DNA と し て ヒ ト Thyrotoropin cDNA 配 列 を 有 す る PCR
産 物 10ng お よ び rGTP ま た は ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を 野 生 型 T7 RNAP 25 units
と と も に 添 加 し 、 37℃ で 1 時 間 反 応 を 行 っ た 。 得 ら れ た RNA 合 成 産 物 は 7 M 尿
素 を 含 む 5%(w/v) Long Ranger ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル で 電 気 泳 動 後 に BAS2000
Image Analyzer（ Fuji Film, Tokyo, Japan） に よ り オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー を
行って電気泳動パターンを得た。
5.2.3. Pyrophosphatase タ ン パ ク 質 の 精 製
P y r o p h o s p a t a s e ( P P a s e ) タ ン パ ク 質 の 精 製 は 、パ ン 酵 母 由 来 の P P a s e（ S i g m a ,
Tokyo, Japan） を 購 入 し 、 以 下 の 精 製 法 に よ り 混 入 し て い る RNase を 除 去 し て
精 製 し た PPase を 調 製 し た 。 ま ず 、 購 入 し た PPase を 20 mM Tris-HCl pH 7.9,
1 mM EDTA を 含 む dialysis Buffer に 懸 濁 し た の ち に dialysis Buffer に 対 し
て 透 析 を 行 っ た 。 透 析 後 の タ ン パ ク 質 溶 液 を
SP Sepharose(Amersham
Bioscience, Tokyo, Japan)に 充 層 し 、 0 M か ら 0.1 M の NaCl 濃 度 勾 配 を 与 え
た 条 件 下 で PPase タ ン パ ク 質 を 溶 出 し た 。 溶 出 し た PPase タ ン パ ク 質 を 含 む 画
分 を 、 さ ら に Q-Sepharose(Amersham Bioscience, Tokyo, Japan)に 充 層 し て 0 M
か ら 1 M の N a C l 濃 度 勾 配 を 与 え た 条 件 下 で P P a s e タ ン パ ク 質 を 溶 出 し た 。溶 出
画 分 を SDS-ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 に 供 す る こ と に よ り PPase タ ン パ
ク 質 に 相 当 す る 約 32 kDa の バ ン ド を 確 認 し た の ち に 20 mM Tris-HCl pH 7.9, 1
mM EDTA, 50%(v/v) glycerol を 含 む storage buffer に 対 し て 透 析 し 、 -20℃ に
て保存した。
45
5.2.4.
ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を 添 加 し た TS 反 応
TS 反 応 に お け る コ ン プ レ ッ シ ョ ン の 解 消 を 目 的 と し て 、 ITP ま た は c7-rGTP
を T S 反 応 に 添 加 し た 場 合 の 検 討 実 験 を 以 下 の 反 応 条 件 を 用 い て 行 っ た 。反 応 液
と し て は 、4 0
mM Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2, 5 mM DTT, 2 mM spermidine(HCl)3,
2 mM GMP, 250 μ M ATP, 500 μ M GTP, 250 μ M CTP, 500 μ M UTP, 0.1 μ M
R6G-(CH)4-3'-dATP 、 0.1 μ M R110-(CH)4-3'-dGTP 、 1 μ M TMR-(CH)4-3'-dUTP 、
5 μ M ROX-(CH)4-3'-dCTP を 調 製 し 鋳 型 DNA と し て PCR 産 物 10 ng を 反 応 液 に
添 加 し た 。 ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を 用 い る 場 合 に は rGTP と 同 量 の rITP ま た は
c7-rGTP を rGTP と 置 換 し て 反 応 液 に 添 加 し た 。 こ の 反 応 液 に 25 units T7 RNAP
変 異 体 F644Y お よ び 10 units PPase を 添 加 し て 37℃ で 1 時 間 反 応 し た の ち 、
Sephadex G25 column(Amersham Biosciences, Tokyo, Japan)を 用 い て ゲ ル ろ 過
を 行 い R N A 産 物 を 精 製 し た 。精 製 し た R N A 合 成 産 物 は C e n t r i f u g e C o n c e n t r a t o r
VC-96（ TAITEC, Saitama, Japan） に よ っ て 蒸 発 乾 固 し た 。 乾 燥 し た RNA 合 成 産
物 を ABI Prism 377 DNA Sequencer(Applied Biosystems, Tokyo, Japan)の 取
扱 説 明 書 に 従 っ て 調 製 し た loading buffer 6 μ l に 溶 解 し 、 そ の う ち 2 μ l
を 90℃ で 3 分 間 熱 処 理 し た 。 熱 処 理 後 の 溶 液 は ABI Prism 377 DNA Sequencer
で 泳 動 し 、取 扱 説 明 書 に 従 っ て 泳 動 結 果 を 解 析 し た 。泳 動 し た の ち に 残 っ た R N A
溶 液 4 μ l は 、 -20℃ で 保 存 し た 。
5.2.5.
CS 法 と TS 法 の 最 適 鋳 型 DNA 量 の 比 較 実 験
TS 反 応 に つ い て は 本 章 実 験 方 法 (5.2.2)お け る c7-rGTP を 使 用 し た 同 条 件 で
反 応 を 行 っ た 。 CS 法 に つ い て は
Dye terminator FS Cycle Sequencing
k i t ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , T o k y o , J a p a n ) の 製 品 説 明 書 に 従 い 、A B I P r i s m 3 7 7 D N A
Sequencer で 泳 動 し 、 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 泳 動 結 果 を 解 析 し た 。 本 実 験 に お い
て は 鋳 型 D N A と し て 環 状 p B l u e s c r i p t S K（ S t r a t a g e n e , C A , U . S . A . ）を 用 い た 。
5.2.6.
RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 を 有 す る ポ リ ア ミ ン の 探 索
T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 の あ る ポ リ ア ミ ン の 検 討 実 験 は 以 下
の 反 応 条 件 を 用 い て 行 っ た 。 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2, 5 mM DTT, 200
μ M GMP, 250 μ M ATP, 250 μ M GTP, 250 μ M CTP, 250 μ M UTP, 0.2 μ Ci [α
-32P] UTP を 含 む 転 写 反 応 液 に pBluescript SK を 制 限 酵 素 PvuII に よ り 処 理 し
た D N A お よ び ポ リ ア ミ ン を 終 濃 度 2 m M に な る よ う に 添 加 し た 。こ の 転 写 反 応 液
に 野 生 型 T7 RNAP 酵 素 標 品 を 5 units 添 加 し 、 37℃ 、 1 時 間 の 条 件 で 反 応 を 行
っ た 。 反 応 に よ り 得 ら れ た RNA 合 成 産 物 は 6 M 尿 素 を 含 む 8%(w/v)ポ リ ア ク リ
ル ア ミ ド ゲ ル 上 で 電 気 泳 動 後 に BAS2000 Image Analyzer（ Fuji Film, Tokyo,
J a p a n ）に よ り オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー を 行 っ て 電 気 泳 動 パ タ ー ン を 得 た 。放 射
46
線 量 を そ れ ぞ れ の 電 気 泳 動 上 の RNA バ ン ド の 強 度 か ら 測 定 し 、 ポ リ ア ミ ン に よ
る促進効果を数値化した。
5.2.7.
TS 法 に お け る ポ リ ア ミ ン 添 加 に よ る 効 果 の 検 討
TS 法 に お い て 、 ポ リ ア ミ ン 添 加 に よ る TS 反 応 の 促 進 効 果 の 検 討 実 験 は 以 下
の 反 応 条 件 を 用 い て 行 っ た 。 反 応 液 と し て 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2,
5 mM DTT, 2 mM spermidine(HCl)3, 2 mM GMP, 2.5 mM ITP, 250 μ M ATP, 250
μ M CTP, 500 μ M UTP, 0.1 μ M R6G-(CH2)4-3'-dATP、 0.1 μ M R110-(CH2)4-3'
-dGTP、 1 μ M TMR-(CH2)4-3'-dUTP、 5 μ M ROX-(CH2)4-3'-dCTP を 調 製 し 、 鋳 型
DNA と し て ラ ム ダ フ ァ ー ジ ゲ ノ ム DNA を 含 む PCR 産 物 10 ng を 反 応 液 に 添 加 し
た 。 こ の 反 応 液 に 25 units T7 RNAP 変 異 体 F644Y お よ び 10 units PPase を 添
加 し て 3 7 ℃ で 1 時 間 反 応 し た の ち 、S e p h a d e x G 5 0 c o l u m n ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s ,
T o k y o , J a p a n ) を 用 い て ゲ ル ろ 過 を 行 い R N A 産 物 を 精 製 し た 。精 製 し た R N A 合 成
産 物 は Centrifuge Concentrator VC-96（ TAITEC, Saitama, Japan） に よ っ て
蒸 発 乾 固 し た 。 乾 燥 し た RNA 合 成 産 物 を ABI Prism 377 DNA Sequencer(Applied
Biosystems, Tokyo, Japan)の 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 調 製 し た loading buffer 6 μ
l に 溶 解 し 、そ の う ち 2 μ l を 9 0 ℃ で 3 分 間 熱 処 理 し た 。熱 処 理 後 の 溶 液 は A B I
Prism 377 DNA Sequencer で 泳 動 し 、 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 泳 動 結 果 を 解 析 し た 。
泳 動 し た の ち に 残 っ た RNA 溶 液 4 μ l は 、 -20℃ で 保 存 し た 。
5.3. 実 験 結 果
5.3.1.
T7 RNAP に よ る ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ 取 り 込 み 条 件 の 検 討
DNAP を 用 い た ジ デ オ キ シ 反 応 に お い て dGTP の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ と し て
の dITP や c7-dGTP、 c7-dATP を 使 用 す る こ と が コ ン プ レ ッ シ ョ ン の 解 消 に 効 果
の あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 dITP は 、 guanine 塩 基 と 比 較 し て 、 塩 基 の 3 位
の -NH2 基 が な い 。 し た が っ て 、 Watson Crick 型 の 核 酸 間 の 二 次 構 造 形 成 に お け
る 水 素 結 合 数 は ２ 個 と な り 、 dGTP が dCTP と 水 素 結 合 を 介 し て 相 補 的 に 結 合 す
る 場 合 の ３ 個 と 比 較 し て 、そ の 数 は 少 な く な る 。こ の た め 、d G T P に 置 換 し て d I T P
を用いることにより水素結合を介した核酸分子内の二次構造形成が抑制される
ことにより、ジデオキシ法におけるコンプレッションの解消に効果があること
が 報 告 さ れ て い る (4) 。 ま た c7-dGTP(5) お よ び c7-dATP(6) に つ い て は 非 Watson
Crick 型 の 核 酸 間 の 二 次 構 造 形 成 の 形 態 で あ る Hoogsteen 型 の 水 素 結 合 に 関 与
する 7 位の N がないことにより、二次構造の形成が抑制されることが示唆され
ている。このようなヌクレオチドアナログによるコンプレッション解消の効果
が TS 法 に お い て も 認 め ら れ れ ば TS 法 に お け る コ ン プ レ ッ シ ョ ン を 解 消 で き る
47
可 能 性 が あ る 。そ こ で こ れ ら の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ と 同 様 の 機 能 が 期 待 さ れ 、
T7 RNAP が 基 質 と し て の 取 り 込 み が 可 能 と 考 え ら れ る ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ 、
す な わ ち dITP、 c7-dGTP お よ び c7-dATP の リ ボ ー ス の 3'位 が -OH 基 で あ る ヌ ク
レ オ チ ド ア ナ ロ グ で あ る r I T P や c 7 - r G T P 、c 7 - r A T P を T S 法 で 用 い る こ と に よ っ
てコンプレッションの解消が可能と推測した。
し か し 、 RNA 分 子 は DNA 分 子 よ り も Tm 値 が 高 く 、 DNA 分 子 と 比 較 し て 強 固 な
二 次 構 造 を 形 成 す る こ と が 知 ら れ て お り (7)、 TS 法 に お い て は DNAP を 用 い た ジ
デ オ キ シ 法 の 場 合 と 比 較 し て RNA 分 子 内 に よ り 強 固 な 二 次 構 造 の 形 成 が 推 測 さ
れ る 。 ま た 、 こ れ ら の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ に よ る RNA 分 子 内 の 二 次 構 造 の 形
成抑制やコンプレッションへの影響に関する報告はない。さらに、これらのヌ
ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ に つ い て は 、 T7 RNAP に よ り 基 質 と し て 取 り 込 ま れ る こ と
が 報 告 ( 8 ) さ れ て い る 。し か し 、T S 法 に お け る 合 成 鎖 長 で あ る 数 百 塩 基 程 度 の 比
較 的 長 い 鎖 長 の RNA 合 成 に お い て 反 応 停 止 等 を 伴 わ ず T7 RNAP に 取 り 込 ま れ る
か ど う か の 検 証 や RNA 合 成 反 応 に 用 い る 場 合 の 至 適 濃 度 に 関 す る 報 告 も な さ れ
て い な い 。 そ こ で 本 章 に お い て は こ れ ら の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を T7 RNAP に
よ る RNA 合 成 反 応 に 使 用 す る 場 合 の 最 適 濃 度 を 検 討 し た 。 さ ら に 、 得 ら れ た 知
見 を 基 に し て 、実 際 に T S 法 に お い て こ れ ら の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を 用 い た 場
合のコンプレッション部位の変化を測定することによって、コンプレッション
解消の効果を検討した。
RNA 分 子 に お い て は Fig. 5.1 に 示 す よ う な Watson Crick 型 の 水 素 結 合 を 介
し た 核 酸 間 の 二 次 構 造 の 形 成 の み な ら ず 非 Watson Crick 型 (9)で あ る Hoogsteen
型 ( 1 0 ) の 水 素 結 合 を 介 し た 二 次 構 造 の 形 成 も 考 え ら れ る 。核 酸 に お け る 水 素 結 合
を介した二次構造の形成にはこのような二つの形式が主に考えられるが、
Watson-Crick 型 の 場 合 は GC 間 の 水 素 結 合 数 が 多 い こ と な ど か ら Hoogsteen 型
と比較して安定な構造を形成すると考えられている。
以 上 の 背 景 よ り 、T S 法 に お け る コ ン プ レ ッ シ ョ ン の 解 消 を 目 的 と し て 、本 章
で は 核 酸 間 の 水 素 結 合 形 成 の 抑 制 効 果 が 期 待 で き る rITP や c7-rGTP、 c7-rATP
の よ う な ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ を TS 反 応 に 用 い る こ と に よ り コ ン プ レ ッ シ ョ
ンの解消について検討した。
48
Fig. 5.1
Hydrogen bond formation among the ribonucleotides.
F i g . 5 . 2 に r G T P の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ で あ る r I T P 、c 7 - r G T P お よ び c 7 - r A T P
を T7 RNAP を 用 い た RNA 合 成 反 応 に 用 い た 場 合 の 最 適 濃 度 に つ い て の 検 討 結 果
を 示 す 。 Fig. 5.2 の lane 1 か ら 4 に お い て は RNA 合 成 反 応 に お い て rGTP と 置
換 し て rITP を 200 μ M か ら 1600 μ M の 濃 度 の 範 囲 で 添 加 し た 場 合 、 濃 度 の 増
加 に 依 存 し て RNA 合 成 産 物 量 が 増 加 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 同 様 の 傾 向 は
c7-rGTP を 単 独 で 添 加 し た 場 合 に お い て も 認 め ら れ た (lane 5-8) 。 し か し 、
c7-rGTP と c7-rATP を 800 μ M の 濃 度 で 添 加 し た 場 合 に は RNA 合 成 産 物 が ほ と ん
ど 検 出 さ れ ず（ デ ー タ 省 略 ）、1 6 0 0 μ M の 濃 度 で 添 加 し た 場 合 ( l a n e 9 ) に も r I T P
お よ び c7-rGTP を 単 独 で 添 加 し た 場 合 と 比 較 し て 顕 著 に RNA 合 成 量 が 少 な い こ
と を 明 ら か に し た 。 さ ら に 、 TS 反 応 に 準 じ た T7 RNAP を 用 い た RNA 合 成 反 応 に
お い て 、 rITP お よ び c7-rGTP は 基 質 と し て T7 RNAP に 十 分 に 取 り 込 ま れ る こ と
が 明 ら か と な っ た 。こ の 結 果 を 踏 ま え て 、T S 法 に お け る D NA シ ー ク エ ン ス 解 析
に お い て は GC 塩 基 の 関 与 す る コ ン プ レ ッ シ ョ ン に 起 因 す る シ ー ク エ ン ス エ ラ
ー が 主 な も の と な っ て い る こ と と c7-rATP を 添 加 し た 場 合 に は 低 い RNA 合 成 効
率 と な る こ と か ら 、 rITP お よ び c7-rGTP 添 加 に よ る GC 間 の 水 素 結 合 を 介 し た
二次構造形成の抑制によるコンプレッションの解消について検討することとし
た。
49
Fig. 5.2
Incorporation of the nucleotide analog in RNA synthesis.
To examine whether several types of structure-destabilizing nucleotide
analogs
are
incorporated
into
T7
7
transcripts,
rITP,
c7-rGTP,
was
7
substituted for rGTP, or both c -rATP and c -rGTP were substituted for rGTP
and rATP. The template gene is 10 ng of human TSH PCR product. The
concentrations of substrates were: (C) standard transcription with 200 μ
M each of the four rNTPs, 200 μ M of rATP, rCTP, rUTP with (1) 200 μ M rITP,
(2) 400 μ M rITP, (3) 800 μ M rITP, (4) 1600 μ M rITP, (5) 200 μ M c7-rGTP,
(6) 400 μ M c7-rGTP, (7) 800 μ M c7-rGTP, (8) 1600 μ M c7-rGTP, (9) 200
μ M c7-rGTP of rCTP and rUTP with 1600 μ M c7-rGTP and c7-rATP.
5.3.2.
ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ 添 加 に よ る TS 法 に お け る コ ン プ レ ッ シ ョ ン の
解消
Fig. 5.3 お よ び Fig. 5.4 に お い て は 、 rGTP を 用 い た TS 法 に よ る DNA シ ー ク
エ ン ス 解 析 結 果 と rITP お よ び c7-rGTP を 用 い た 場 合 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結
果 の 比 較 を 行 い 、r G T P を 用 い た 場 合 に 認 め ら れ る コ ン プ レ ッ シ ョ ン 部 位 の 変 化
を比較することでそれぞれのヌクレオチドアナログによるコンプレッションの
解 消 に 対 す る 効 果 を 検 証 し た 。 ま ず 、 Fig. 5.3 に お い て は 、 ヒ ト Tyrotoropin
cDNA 由 来 の PCR 産 物 中 に 存 在 す る コ ン プ レ ッ シ ョ ン 部 位 に つ い て rGTP を 用 い
て 行 っ た TS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 と c7-rGTP を 用 い た 場 合 の DNA
シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 比 較 し た 。 Fig. 5.3 に 示 す よ う に 、 rGTP を 用 い た TS
法の場合に認められる G のシークエンスピークと C のシークエンスピークのコ
50
ン プ レ ッ シ ョ ン に 起 因 す る シ ー ク エ ン ス エ ラ ー が c7-rGTP の 添 加 に よ っ て 分 離
し 、 正 確 に DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 行 え る こ と が 明 ら か と な っ た 。
つ ぎ に 、 Fig. 5.4 に お い て は 、 ヒ ト p53 エ キ ソ ン 8 遺 伝 子 領 域 を 含 む PCR 産
物 (Panel A)お よ び ラ ム ダ フ ァ ー ジ ゲ ノ ム DNA を 含 む PCR 産 物 (Panel B)を 鋳 型
D N A に 用 い 、r G T P を 用 い て 行 っ た T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 と r I T P
を 用 い た T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 比 較 し た 。F i g . 5 . 4 ( P a n e l A )
に は 図 中 に お い て 矢 印 で 示 す 5 つ の コ ン プ レ ッ シ ョ ン 部 位 が あ り 、 矢 印 1、 2
および 3 で示すコンプレッション部位は G または C のシークエンスピークの関
与 す る コ ン プ レ ッ シ ョ ン 部 位 で あ る 。ま た 、矢 印 4 は G C 塩 基 に は さ ま れ た A C U A A
配 列 を ル ー プ 構 造 と し て 有 す る コ ン プ レ ッ シ ョ ン 部 位 (GC/ACUAA/GC)、 矢 印 5
は GC 塩 基 に は さ ま れ た GAGGUAA 配 列 を ル ー プ 構 造 と し て 有 す る コ ン プ レ ッ シ ョ
ン 部 位 (GC/GAGGUAA/GC)で あ る 。 Fig. 5.4(Panel B)に お い て は 、 CAC お よ び そ
の 相 補 的 配 列 で あ る GUG に は さ ま れ た GGUGGUG 配 列 を ル ー プ 構 造 と し て 有 す る
配 列 に お け る コ ン プ レ ッ シ ョ ン 部 位 (CAC/GGUGGUG/GUG)で あ る 。 rITP を 使 用 す
ることにより、図中において下線で示す領域が正確な配列へと変化している。
し た が っ て 、 Fig. 5.4 の コ ン プ レ ッ シ ョ ン 部 位 に つ い て rGTP に 置 換 し て rITP
を用いることによってコンプレッション現象を解消し正確な配列を決定できた
こ と か ら 、 c7-rGTP お よ び rITP と も に TS 反 応 に 添 加 す る こ と に よ り コ ン プ レ
ッションの解消が可能なことを明らかにした。
Fig. 5.3
Elimination of peak compression by use of c7-rGTP in place of
rGTP.
The arrows indicate two compression sites in human TSH cDNA using rGTP as
the
substrate
a.
Compressions
in
the
corresponding
sequence
eliminated by the use of 7-deaza-rGTP for the substrate b.
51
were
Fig. 5.4
Elimination of peak compression by use of rITP in the place of
rGTP.
The arrows or underlines indicate compression sites in p53 exon8 (A) and
lambda phage genomic DNA (B) using rGTP as the substrate (upper panel).
Compressions in the corresponding sequence were eliminated by use of rITP
for the substrate (lower panel).
5.3.3.
TS 法 の 構 築 と TS 法 の 特 長 に つ い て の 評 価
前 章 ま で の 成 果 お よ び 本 章 に お け る TS 反 応 条 件 の 検 討 に よ り 得 ら れ た 成 果
を 基 に し て 、 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー 、 T7 RNAP 変 異 体 お よ び TS 反 応 に 最 適 化 し た
反 応 条 件 を 使 用 す る こ と で TS 法 を 構 築 し 、 そ の 特 長 に つ い て 評 価 し た 。 TS 反
応 系 に は 、 こ れ ま で の 開 発 成 果 に 加 え て さ ら に パ ン 酵 母 由 来 の PPase を 添 加 し
て い る 。P P a s e は R N A P に よ る R N A 合 成 反 応 の 際 に 副 産 物 と し て 産 生 す る ピ ロ リ
ン 酸 を 分 解 し て 2 分 子 の 無 機 リ ン 酸 と す る 反 応 を 触 媒 す る 酵 素 で あ る 。 RNA 合
成反応が進行すると反応液中に副産物としてピロリン酸の蓄積が起こるが、ピ
ロ リ ン 酸 の 蓄 積 に よ り RNA 合 成 反 応 の 平 衡 は 逆 反 応 す な わ ち 分 解 反 応 に 傾 く こ
と に な る 。 こ の た め 見 か け 上 、 RNA 合 成 反 応 の 進 行 が 徐 々 に 停 止 す る こ と に な
る (11)。 こ の よ う な 反 応 停 止 が TS 反 応 に 部 分 的 に 起 こ る と シ ー ク エ ン ス シ グ ナ
ルの停止に起因した均一性の低下を引き起こすことが示唆される。一方、反応
系 に PPase を 添 加 す る こ と に よ り 、 上 述 の RNA 合 成 反 応 の 停 止 が 回 避 さ れ 、 シ
ー ク エ ン ス 反 応 の 効 率 改 善 さ れ る こ と が 期 待 さ れ る 。ま た 、T 7 R N AP に よ る R N A
合 成 反 応 に PPase を 使 用 す る こ と で RNA 合 成 量 が 増 加 す る と の 報 告 (12)も あ る こ
と か ら 、T S 反 応 に お い て P P a s e の 添 加 効 果 に つ い て は 、F ig . 5 .5 に 示 す 実 験 に
52
よ り 検 討 し た 。 PPase を 添 加 し た 場 合 に は 、 無 添 加 の 場 合 に 認 め ら れ た シ ー ク
エンスシグナルの高低差が減少し均一性が増すことが明らかとなり、シグナル
強度の上昇も認められた。
Fig. 5.5
Improvement of peak uniformity by use of PPase.
Sequencing reactions were performed in the absence or presence of PPase.
Minus or plus indicates the absence or presence of PPase. All peaks
indicating termination patterns with TMR-3'-dUTP are shown on the same
scale. The arrows indicate sites relatively sensitive to pyrophospholysis
a. Peak degradations in sensitive sites were prevented by PPase b.
つ ぎ に 、 Fig. 5.6 に ヒ ト Tyrotropin cDNA を 有 す る プ ラ ス ミ ド DNA を 鋳 型 に
し て T S 法 と C S 法 に よ っ て 行 っ た D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 示 す 。C S 法 に よ
る 解 析 結 果 （ panel B） と 比 較 し て 、 TS 法 に よ る 解 析 結 果 (panel A)は シ グ ナ ル
の高低差が結果全体にわたって少なく、均一性に優れていることが明らかとな
っ た 。 シ ー ク エ ン ス ピ ー ク の 均 一 性 が 優 れ て い る こ と は DNA シ ー ク エ ン ス 精 度
の 上 昇 に 貢 献 し 、 DNA の 変 異 部 位 の 探 索 や 検 査 な ど の 高 い シ ー ク エ ン ス 精 度 が
要求される領域において信頼性の高い効果を発揮することが期待される。
53
Fig. 5.6
Comparison of TS (A) with dye-terminator cycle sequencing (B)
on the ABI 377 DNA sequencer.
100ng of human TSH cDNA was sequenced with both methods.
Fig. 5.6 に 示 す 結 果 よ り TS 法 は CS 法 と 比 較 し て シ ー ク エ ン ス ピ ー ク の 均 一
性 が 優 れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た が 、 さ ら に TS 法 と CS 法 に お い て DNA シ
ー ク エ ン ス 解 析 に 使 用 す る 鋳 型 DNA 量 と シ ー ク エ ン ス 精 度 の 関 係 を 検 討 し た
Table 5.1)。 500 ng と 200 ng の 鋳 型 量 に お い て は 、 600 塩 基 ま で の DNA シ ー ク
エ ン ス 解 析 で は 同 等 の シ ー ク エ ン ス 精 度 を 示 し た 。し か し 、C S 法 に お い て 5 0 n g
の 鋳 型 DNA 量 の 場 合 に は 、 顕 著 に シ ー ク エ ン ス 精 度 が 低 下 し た 。 25 ng の 鋳 型
DNA 量 で は 90%以 上 の シ ー ク エ ン ス 精 度 を 示 す の は 1-100 塩 基 ま で の 領 域 だ け で
あ り 、そ れ 以 降 は 解 析 に 耐 え う る 結 果 は 得 ら れ な か っ た 。一 方 、TS 法 に お い て
は 鋳 型 DNA 25 ng か ら 500 ng を 使 用 し た 場 合 に は 1-500 塩 基 の 領 域 に お い て 良
好 な シ ー ク エ ン ス 精 度 を 示 し 、 鋳 型 DNA 量 10 ng で も 1-400 塩 基 ま で の 領 域 で
93 % 以 上 の シ ー ク エ ン ス 精 度 を 示 し た 。以 上 よ り 、T S 法 は C S 法 と 比 較 し て 少 な
い 量 の 鋳 型 DNA か ら も 良 好 な シ ー ク エ ン ス 精 度 で DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能
なことを明らかにした。
54
Table 5.1
Effects of template amounts on sequence accuracy.
Fig. 5.7 に は 、 CS 法 で は 解 析 不 能 な 未 精 製 PCR 産 物 を 鋳 型 DNA と し た DNA
シ ー ク エ ン ス 解 析 を T S 法 に よ っ て 行 っ た 結 果 を 示 す 。P C R 産 物 を 鋳 型 D N A と し
て 用 い る に あ た り 、 検 討 実 験 に お い て 、 等 量 の PCR 反 応 液 と in vitro 転 写 反
応 液 を 混 合 し た 溶 液 を 用 い て in vitro 転 写 反 応 を 行 っ た 場 合 で も 、 PCR 反 応 液
の 混 合 に よ る と 考 え ら れ る 顕 著 な i n v i t r o 反 応 の 阻 害 が 認 め ら れ な い こ と 、お
よ び PCR 産 物 を 鋳 型 と し て in vitro 転 写 反 応 を 行 っ た 場 合 に 転 写 反 応 が 起 こ る
こ と を 明 ら か と し た （ デ ー タ 省 略 ）。 し た が っ て 、 P C R 産 物 を 鋳 型 D N A と し て 利
用 し た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を TS 法 に よ っ て 行 え る こ と の 可 能 性 を 見 出 し た 。
F i g . 5 . 6 で は 、鋳 型 D N A と し て ヒ ト 大 腸 が ん 細 胞 株 H T 2 9 由 来 の p 5 3 エ キ ソ ン 8
遺 伝 子 領 域 を 含 む PCR 産 物 を 鋳 型 DNA と し て 未 精 製 の ま ま 用 い た 場 合 に TS 法 に
よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 が 正 確 に 行 え る か 否 か の 点 に つ い て 、p 5 3 エ キ ソ ン 8
遺伝子上に存在する点変異の検出を行うことにより調べることとした。この
p53 エ キ ソ ン 8 遺 伝 子 領 域 で は p53 の R274H 変 異 を 引 き 起 こ す DNA 変 異 で あ る G
か ら A へ の 点 変 異 の 存 在 が H T 2 9 細 胞 株 に お い て 確 認 さ れ て い る 。こ の 鋳 型 D N A
の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に つ い て T S 法 を 用 い た 場 合 、ヒ ト 胎 盤 ゲ ノ ム D N A 由 来
の PCR 産 物 で は CGT と な っ て い る 配 列 が HT29 由 来 の PCR 産 物 で は CAT と な っ て
お り 、T S 法 に よ る こ の 変 異 部 位 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 で は シ ー ク エ ン ス ピ ー
クの G と A が重なったヘテロ型の点変異として正確に検出できることが明らか
と な っ た 。 以 上 よ り 、 TS 法 で は CS 法 と 異 な り 未 精 製 の PCR 産 物 も 反 応 前 の 精
製 処 理 を 必 要 と せ ず に 、 直 接 シ ー ク エ ン ス 解 析 の 鋳 型 DNA と し て 用 い る こ と が
可能であった。
55
Fig. 5.7
The
top
Detection of heterozygotes by TS.
chromatogram
shows
sequence
of
p53
exon
8
PCR
product
by
amplification of wt DNA. The lower chromatogram shows the heterozygous
point mutation from 274R(CGT) to 274H(CAT) in human colon carcinoma cell
line HT29.
5.3.4.
ポ リ ア ミ ン 添 加 に よ る TS 法 へ の 効 果 の 検 討
本 章 に お い て は 、T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 検 出 感 度 の 向 上
を 目 的 と し た 研 究 を 実 施 し た 。と く に 、他 の 研 究 者 に よ っ て 、polymerase 活 性
の 上 昇 へ の 効 果 が 報 告 さ れ て い る ポ リ ア ミ ン に 注 目 し て 、 T7 RNAP に よ る RNA
合成反応を促進する化合物を探索することとした。ポリアミンは分子内に複数
の -NH2 基 を 有 す る 分 子 で あ り 、 細 胞 分 裂 や 遺 伝 子 発 現 の 際 に 不 可 欠 で あ る こ と
が 明 ら か に さ れ て い る (13)。 ま た 、 SP6 RNAP お よ び T7 RNAP の よ う な バ ク テ リ
オファージ
RNAP(14) や ヒ ト お よ び マ ウ ス
由来
RNAP(15,
16)
などに関して、
p o l y m e r a s e 活 性 を 上 昇 さ せ る 効 果 が 報 告 さ れ て お り 、ポ リ ア ミ ン が 鋳 型 D N A と
polymerase タ ン パ ク 質 と の 複 合 体 を 一 時 的 に 安 定 化 す る こ と を 示 唆 す る 結 果
と 解 釈 さ れ て い る 。 T7 RNAP に つ い て は 直 鎖 状 の ポ リ ア ミ ン で あ る spermidine
が T7 RNAP の polymerase 活 性 を 上 昇 さ せ る と の 報 告 が あ る (13)。
Fig. 5.8 で は 、 T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 を 示 す ポ リ ア ミ ン の 探
索 を 行 い 、 数 種 の ポ リ ア ミ ン に つ い て 明 ら か と な っ た RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果
と spermidine に よ る 促 進 効 果 を 比 較 し た 。 Fig. 5.8 で は 、 制 限 酵 素 PvuII で
切 断 し た 線 状 pBluescript DNA を 鋳 型 DNA と し て 用 い 、 T7 RNAP に よ る RNA 合
成 反 応 に お い て ポ リ ア ミ ン を 使 用 し た 場 合 の RNA 合 成 産 物 量 の 変 化 を 比 較 す る
こ と で ポ リ ア ミ ン に よ る
RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 に つ い て 検 討 し た 。
cadaverine、 1,8-diaminooctane を 添 加 し た 場 合 に 、 spermidine を 使 用 し た 場
合 よ り も 、 RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 が 認 め ら れ 、 ポ リ ア ミ ン を 添 加 し な い 場 合
56
と 比 較 し て 1,8-diaminooctane で は 4.62 倍 、 cadaverine の 場 合 は 3.40 倍 の
RNA 合 成 量 の 増 加 を 確 認 し た 。 Fig. 5.9 に は 、 Fig. 5.8 に お い て RNA 合 成 反 応
の 促 進 効 果 が 明 ら か と な っ た 1,8-diaminooctane お よ び cadaverine と こ れ ま で
の 報 告 で R N A 合 成 反 応 の 促 進 効 果 が 示 さ れ た s p e r m i d i n e の 構 造 を 示 す 。こ れ ら
の ポ リ ア ミ ン は 直 鎖 状 の 構 造 を 有 し 、 末 端 に -NH2 基 を 有 す る 。 し か し 、 同 じ く
末 端 に -NH2 基 を 有 す る 1,3-diaminopentane や 1,9-diaminononane で は RNA 合
成 反 応 の 促 進 効 果 が 認 め ら れ な か っ た （ デ ー タ 省 略 ）。 本 章 に お い て 、 R N A 合 成
反 応 の 促 進 効 果 が 認 め ら れ た こ れ ら ポ リ ア ミ ン は 終 濃 度 0.2-2 mM が 最 適 濃 度 で
あることが明らかとなった。
Fig. 5.8
Effects of polyamine addition on the transcription by T7 RNAP.
Each lane indicates RNA products obtained in the absence of additive (lane
1),
in
the
presence
of
spermidine
(lane
2),
cadaverine
Agmatine(lane 4), and 1,8-diaminoocctane (lane 5).
57
(lane
3),
Fig. 5.9
Structures of linear polyamines as enhancers for T7 RNAP
activity.
以 上 の 結 果 を も と に し て 、 T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 が 明 ら か
に な っ た ポ リ ア ミ ン を TS 反 応 に 用 い た 場 合 の 効 果 を 検 証 し た (Fig. 5.10)検 討
実 験 に お い て は 、 通 常 よ り も 少 な い 量 （ 10 ng） の 鋳 型 DNA で TS 法 に よ る DNA
シークエンス解析に行った場合に、ポリアミン添加の有無によるシークエンス
エ ラ ー の 相 違 度 を 検 討 し た 。 ポ リ ア ミ ン を 添 加 し な い 場 合 に は 150 塩 基 付 近 で
シ ー ク エ ン ス エ ラ ー が 出 現 し て 300 塩 基 付 近 で は シ グ ナ ル の 低 下 が 著 し く な り 、
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 困 難 と な っ た 。
一 方 、 1,8-diaminooctane を 添 加 し た 場 合 に は 400 塩 基 を 超 え て も シ ー ク エ
ン ス エ ラ ー は 認 め ら れ ず 、 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 で あ っ た 。 以 上 よ り 、
TS 法 に お い て 1,8-diaminooctane を 添 加 す る こ と に よ り 従 来 の TS 反 応 条 件 を
用 い た 場 合 (50 ng)と 比 較 し て さ ら に 少 量 (10 ng)の 鋳 型 DNA で DNA シ ー ク エ ン
ス解析が可能なことを明らかにした。
58
Fig. 5.10
Effects of 1,8-diaminooctane on the sequencing signals.
Sequencing signals of the TS from a small amount of the template DNA in
the absence of any additive (upper panel, A) and in the presence of
1,8-diaminooctane (lower panel, B).
5.4. 考 察
本 章 で は 、T S 反 応 に お い て r G T P に 置 換 し て r I T P お よ び c 7 - r G T P を 使 用 す る
こ と で rGTP を 添 加 し て 反 応 し た 場 合 に 見 ら れ た コ ン プ レ ッ シ ョ ン の 問 題 が 解
消 さ れ る こ と を 明 ら か に し た 。 コ ン プ レ ッ シ ョ ン の 解 消 に は 、 Watson Crick 型
の 核 酸 間 の 二 次 構 造 形 成 の 抑 制 お よ び Hoogsteen 型 の 核 酸 間 の 二 次 構 造 形 成 の
抑 制 の い ず れ に つ い て も そ の 効 果 が あ っ た 。 し か し 、 高 い 精 度 で DNA シ ー ク エ
ン ス 解 析 を 行 う た め に は 、長 鎖（ 一 例 と し て 400 bp 以 上 ）に わ た り シ ー ク エ ン
ス ピ ー ク の 均 一 性 が 確 保 さ れ る こ と が 必 要 で あ り 、 Fig. 5.3 お よ び Fig. 5.4
の 結 果 か ら c7-rGTP を 用 い た 場 合 と 比 較 し て rITP を 用 い た 場 合 が 均 一 性 に 優 れ
て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 さ ら に 、 Watson Crick 型 の 水 素 結 合 に よ る 核 酸
間 の 二 次 構 造 形 成 に お い て 、 rGTP と rCTP 間 で は 3 つ の 水 素 結 合 が 形 成 さ れ る
こ と か ら 、H o o g s t e e n 型 よ り も 強 固 な 二 次 構 造 を 形 成 す る と 考 え ら れ が 、W a t s o n
Crick 型 の 水 素 結 合 に よ る 二 次 構 造 形 成 の 抑 制 に は rITP が 必 要 で あ る 。 DNA シ
ー ク エ ン ス 解 析 法 で は 多 様 な DNA 配 列 の 解 析 を 行 う こ と が 必 要 で あ り 、 こ の た
め 、 TS 法 に お い て の コ ン プ レ ッ シ ョ ン の 対 策 に は 、 c7-rGTP と 比 較 し て コ ン プ
レ ッ シ ョ ン の 抑 制 に つ い て 、 対 応 可 能 な DNA 配 列 種 を 多 い こ と が 示 唆 さ れ る
r I T P の 使 用 が 適 し て い る と 考 え ら れ る 。r I T P を 使 用 し た 場 合 の R N A 合 成 反 応 に
関 し て は Fig. 5.2 の lane 3 お よ び 4 で は RNA 合 成 産 物 の 低 分 子 側 に ス メ ア な
電 気 泳 動 像 が 認 め ら れ て い る が 、 こ れ ら は RNA 合 成 反 応 の 部 分 的 な 停 止 反 応 に
59
起 因 す る 可 能 性 が あ る 。し か し 、T S 法 に お い て は R N A 合 成 反 応 の 部 分 的 な 停 止
に よ る RNA 合 成 産 物 は 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー が 取 り 込 ま れ て 停 止 し た RNA 合 成 産
物とは異なり、蛍光ターミネーターが取り込まれていないため、実際のシーク
エンス解析過程では視覚化されることはなく問題とならない。
ポ リ ア ミ ン 添 加 に よ る RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 に つ い て は 、 反 応 溶 液 中 に お
い て 、 3 価 の カ チ オ ン と し て 存 在 す る spermidine と 比 較 し て 、 2 価 の カ チ オ ン
と し て 存 在 す る 1,8-diaminooctane お よ び cadaverin が 優 れ た 促 進 効 果 を 示 し
た 。 ポ リ ア ミ ン は 、 負 に 帯 電 し た DNA の 凝 集 剤 と し て 用 い ら れ る が (17)、 2 価 の
ポ リ ア ミ ン は 3 価 の s p e r m i d i n e と 比 較 し て 、D N A の 凝 集 効 果 が 弱 い こ と が 示 唆
さ れ る 。 以 上 の よ う な 効 果 に よ り 、 2 価 の ポ リ ア ミ ン に よ る 鋳 型 DNA の 凝 集 が
T 7 R N A P に よ る R N A 合 成 に 適 し た 条 件 と な っ た こ と が 、R N A 合 成 反 応 の 促 進 効 果
を生み出していることが示唆される。
T S 法 の 特 長 に 関 す る 検 討 か ら 、C S 法 と 比 較 し て 一 回 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析
に 必 要 な 鋳 型 DNA 量 が 少 な い こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ れ は 、 T7 RNAP に よ る
RNA 合 成 の 場 合 は 鋳 型 DNA の リ サ イ ク ル が CS 法 と 比 較 し て 効 率 良 く 行 わ れ る こ
と に よ る 。 T7 RNAP に よ る RNA 合 成 は こ れ ま で の 報 告 に お い て は 鋳 型 DNA 1 μ g
か ら 3 0 μ g を 超 え る R N A 合 成 が 可 能 で あ り 、反 応 条 件 に お い て は さ ら に 大 量 の
合 成 も 可 能 で あ る 。 一 方 、 CS 法 で は 最 終 的 に 得 ら れ る 1 本 鎖 DNA の 量 は CS 反
応の繰り返し回数に依存しており、通常は酵素活性の低下や蛍光物質の安定性
を 踏 ま え て 25 サ イ ク ル 程 度 の 繰 り 返 し 回 数 が 一 般 的 で あ る 。 よ っ て 、 仮 に CS
反 応 に お け る 各 反 応 過 程 が 100%の 効 率 で 進 ん だ 場 合 で も 、 1 μ g の 鋳 型 DNA か
ら 1 2 .5 μ g の 1 本 鎖 D NA が 合 成 さ れ る の み で あ る 。以 上 よ り 、T S 法 に よ る D N A
シ ー ク エ ン ス 解 析 で は 、C S 法 と 比 較 し て 少 な い 鋳 型 D N A 量 で 解 析 が 行 え る こ と
を 支 持 し て い る 。 さ ら に 、 本 章 に お い て 見 出 し た RNA 合 成 反 応 の 促 進 効 果 を 有
す る 直 鎖 状 の ポ リ ア ミ ン を TS 法 に お い て 用 い る こ と に よ り 、 CS 法 と 比 較 し て
も よ り 少 な い 鋳 型 DNA 量 で DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 な こ と を 明 ら か に し た 。
ま た 、本 章 の 結 果 に よ り C S 法 に お い て は D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に 用 い る こ と
が 困 難 な 未 精 製 の P C R 産 物 が 、T S 法 に お い て は 反 応 前 精 製 を 行 わ ず に 使 用 で き
る こ と を 確 認 し た 。こ の 結 果 か ら 、TS 法 を 用 い る こ と で 、現 在 の DNA シ ー ク エ
ン ス 解 析 に お い て 鋳 型 DNA と し て の 使 用 頻 度 が 極 め て 高 い PCR 産 物 を 迅 速 か つ
低 コ ス ト で DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 で き る こ と が 明 ら か と な っ た 。
5.5. 結 語
TS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て コ ン プ レ ッ シ ョ ン に よ る シ ー ク エ
ンスエラーが確認され、その解消を目的とした検討を行った。さらに、本章ま
で の 開 発 成 果 を 基 に T S 法 を 構 築 し 、そ の 特 長 に つ い て 評 価 し た 。コ ン プ レ ッ シ
ョ ン に 関 し て guanosine triphosphate（ rGTP） と 比 較 し て 、 水 素 結 合 を 介 し た
60
2 本鎖形成能が弱い
inosine triphosphate （ rITP ） や
7-deaza-guanosine
triphosphate（ c7-rGTP） を rGTP と 置 換 す る こ と に よ り 解 消 出 来 る こ と を 明 ら
か に し た 。 さ ら に 、 c7-rGTP を 使 用 し て 、 ヒ ト 大 腸 が ん 細 胞 株 HT29 の p53 遺 伝
子 配 列 を 有 す る PCR 産 物 中 に 存 在 す る 点 変 異 (R274H)の 正 確 な 解 析 が 可 能 で あ
り 、こ の 解 析 に お い て T S 法 を 用 い る こ と で 未 精 製 の P C R 産 物 の D N A シ ー ク エ ン
ス 解 析 が 可 能 で あ る こ と も 明 ら か と な っ た 。 加 え て TS 法 お よ び CS 法 に お い て
鋳 型 DNA 量 と シ ー ク エ ン ス 精 度 と の 関 係 を 調 べ 、 微 量 な DNA 量 に お い て も TS
法 に よ る 解 析 結 果 は CS 法 よ り も 少 な い 鋳 型 DNA 量 で 優 れ た シ ー ク エ ン ス 精 度 を
示 し 、1 , 8 - d ia m i no oc t a ne の 使 用 に よ り 、1 0 ng の 微 量 な DN A か ら も 高 い シ ー ク
エンス精度による解析を可能とした。
参考文献
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(15) D. G. Blair, Int. J. Biochem., 16, 747-756(1984).
(16) D. G. Blair, Int. J. Biochem., 17, 23-30(1985).
(17)
J.
Pelta,
F.
Livolant,
J.
L.
5656-5662(1996).
61
Sikorav,
J.
Biol.
Chem.,
271,
第 6章
TS 法 に よ る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 優 位 性 の 評 価
6.1. 緒 言
前 章 ま で の 検 討 に よ り 、 TS 法 は CS 法 と 比 較 し て 、 未 精 製 の PCR 産 物 を 直 接
的 に 鋳 型 DNA と し て 用 い る こ と が 可 能 な こ と 、 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 の た め に
必 要 と さ れ る 鋳 型 DNA が 少 量 で す む こ と 、 お よ び DNA 解 析 過 程 に お け る シ ー ク
エ ン ス ピ ー ク の 均 一 性 が 優 れ て い る こ と な ど を 示 し 、T S 法 の 優 位 性 を 明 ら か に
した。
本 章 で は 、実 際 の 使 用 を 想 定 し て 、T S 法 に よ る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 に つ い
て 検 討 し た 。 す な わ ち 、 TS 法 の 原 理 か ら は CS 法 と 比 較 し て 、 シ ー ク エ ン ス 反
応 時 間 が 短 い こ と が 予 想 さ れ て い た た め で 、こ の 点 に 関 す る T S 法 の 優 位 性 に つ
い て 評 価 を 行 っ た 。さ ら に 本 章 で は 、TS 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に 適 し
た 鋳 型 DNA を 調 製 で き る ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー の 構 築 を 行 い 、 そ の 特 長 に つ い
ても検討した。
6.2. 実 験 方 法
6.2.1. 鋳 型 DNA の 調 製
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に 用 い る ヒ ト EGFR エ キ ソ ン 19 遺 伝 子 を 含 む PCR 産 物 (1)
は 、 T7 promoter ま た は T3 promoter 配 列 を EGFR 遺 伝 子 配 列 に ア ニ ー リ ン グ す
る 配 列 に 付 加 し た 0.3μ M PCR プ ラ イ マ ー E19-F-T7(5'-GGC,TAA,TAC,GAC,TCA,C
TA,TAG,GGA,GAC,ATG,TGG,CAC,CAT,CTC,ACA,A — 3') お よ び
PCR プ ラ イ マ ー
E19-R-T3(5'-GGC,AAT,TAA,CCC,TCA,CTA,AAG,GGA,GAC,AGC,TGC,CAG,ACA,TGA,GA
A,A-3')を 用 い 、 鋳 型 DNA と し て ヒ ト ゲ ノ ム DNA(Promega, Tokyo, Japan)200 ng
お よ び 0.5 units GeneTaq NT(Nippon gene, Tokyo, Japan)を 添 加 し て PCR 反
応 を 行 う こ と に よ り PCR 産 物 を 調 製 し た 。 PCR 法 に 用 い る サ ー マ ル サ イ ク ラ ー
と し て は PTC-200 DNA Engine(MJ Research, CA , U.S.A)を 使 用 し た 。 PCR 反 応
プ ロ グ ラ ム は 94℃ で 3 分 間 の 熱 変 性 処 理 の の ち に 94℃ で 45 秒 、 55℃ で 45 秒 、
72℃ で 3 分 の 増 幅 反 応 を 30 回 繰 り 返 し た の ち に 72℃ で 5 分 の 後 処 理 を 行 っ た 。
6.2.2. EGFR PCR 産 物 の TS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析
T S 法 で 用 い た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー は 、蛍 光 体 と し て B O D I P Y F L 、B O D I P Y R 6 G 、
BODIPY 564/570、 BODIPY 581/591 の N-hydroxysuccinimidyl ester(Molecular
Probe, OR, U.S.A.)を 用 い 、 3 章 実 験 方 法 （ 3.1.1.） と 同 様 の 方 法 に よ っ て 構
築 し た BODIPY FL-3'-dGTP、 BODIPY R6G-3'-dATP、 BODIPY 564/570-3'-dUTP、
62
BODIPY 581/591-3'-dCTP を 用 い た 。 各 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の リ ン カ ー に お け る
メ チ レ ン 鎖 長 は 、BODIPY FL-3'-dGTP、BODIPY R6G-3'-dATP、BODIPY 564/570-3'
- d U T P 、B O D I P Y 5 8 1 / 5 9 1 - 3 ' - d C T P に つ い て 、そ れ ぞ れ 8 、9 、6 、5 と し た 。ま た 、
T7 RNAP は F644Y の 点 変 異 と 172 お よ び 173 ア ミ ノ 酸 残 基 が 欠 損 し た T7 RNAP
変 異 体 delta-F644Y 酵 素 標 品 を 用 い た 。 発 現 ベ ク タ ー 構 築 に 当 た り 、 4 章 実 験
方 法 （ 4.2.2.） で 構 築 し た T7 RNAP F644Y 発 現 ベ ク タ ー DNA を 鋳 型 DNA と し て
用 い 、 172 お よ び 173 番 目 の ア ミ ノ 酸 残 基 (2,
3)
をコードする塩基配列が欠損し
た T7 RNAP 遺 伝 子 に 対 す る PCR プ ラ イ マ ー T7-delta-F(5'-TAC,AAG,AAA,GCA,TT
T,ATG,CAA,GTT,GTC,GAG.G-3')と PCR プ ラ イ マ ー T7-delta-R(5'-GAC,GTG,CCC,T
AC,GTT,GAG,TTG,TTC, CTC,AAC-3')を 添 加 し て PCR 反 応 を 行 う こ と で T7 RNAP
を コ ー ド す る 全 長 遺 伝 子 お よ び 発 現 ベ ク タ ー 全 長 領 域 を 含 む PCR 産 物 を 増 幅 し 、
得 ら れ た PCR 産 物 を ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 お よ び ア ガ ロ ー ス ゲ ル か ら 抽 出 し
た 。 得 ら れ た DNA 断 片 （ PCR 産 物 ） を T4 DNA ligase に よ っ て 連 結 し 、 T7 RNAP
変 異 体 delta-F644Y の 発 現 ベ ク タ ー を 構 築 し た 。 構 築 し た T7 RNAP 変 異 体
delta-F644Y の 発 現 ベ ク タ ー を 用 い て 4 章 実 験 方 法 （ 4.2.2.） と 同 様 の 方 法 に
よ り T7 RNAP 変 異 体 delta-F644Y 酵 素 標 品 を 得 た 。
EGFR PCR 産 物 の TS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 は 、 以 下 の 反 応 条 件 を 用
い て 行 っ た 。 反 応 液 と し て は 、 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2, 5 mM DTT,
2 mM spermidine(HCl)3, 0.4 mM MnCl2、 0.05% Tween 20、 1 mM GMP, 250 μ M ATP,
500 μ M ITP, 250 μ M CTP, 250 μ M 5-Br-UTP, 0.1 μ M BODIPY R6G-3'-dATP、
0.2 μ M BODIPY FL-3'-dGTP、 0.4 μ M BODIPY 564/570-3'-dUTP、 0.3 μ M BODIPY
581/591-3'-dCTP を 調 製 し 、 さ ら に 鋳 型 DNA と し て PCR 産 物 10 ng を 反 応 液 に
添 加 し た 。 こ の 反 応 液 に 50 units T7 RNAP 変 異 体 delta-F644Y お よ び 0.005
u n i t s P P a s e を 添 加 し て 3 7 ℃ で 1 時 間 反 応 し た の ち 、C e n t r i S e p c o l u m n ( A p p l i e d
Biosystems, Tokyo, Japan)を 用 い て ゲ ル ろ 過 を 行 う こ と に よ り RNA 産 物 を 精 製
した。精製した
RNA 合 成 産 物 は 蒸 発 乾 固 せ ず に
ABI Prism 310 Genetic
Analyzer(Applied Biosystems, Tokyo, Japan)で 泳 動 し 、 取 扱 説 明 書 に 従 っ て
泳動結果を解析した。
6.2.3. pTS1 ベ ク タ ー の 構 築
pTS1 ベ ク タ ー の 構 築 は 、 以 下 の 方 法 を 用 い て 行 っ た 。 ま ず T7 promoter お よ
び T3 promoter を 含 む DNA 断 片 を 調 製 す る 目 的 で つ ぎ の 8 つ の オ リ ゴ ヌ ク レ オ
チ ド (5'-AGC,TGT,GCG,CGC,AAA,TTA,ACC,CTC,ACT,AAA,GGG,AGA,GAG,CT-3';5'-CTC
,TCC,CTT,TAG,TGA,GGG,TTA,ATT,TGC,GCG,AC-3';5'-CCT,GCA,GGC,TAG,CTT,GCG,CA
A,GGA,TCC,TAG,GCC,TGA,AGC,TT-3'； 5'-GTC,GAC,AAG,CTT,CAG,GCC,TAG,GAT,CCT,
TGC,GCA,AGC,TAG,CCT,GCA,GGA,GCT-3';5'-GTC,GAC,GAA,TTC,ACC,CGG,GAA,GAT,CT
T,GCT,TAC,GTA,CGC,GTG,GTA,CCA,TGC,A-3';5'-TGG,TAC,CAC,GCG,TAC,GTA,AGC,AA
63
G,ATC,TTC,CCG,GGT,GAA,TTC-3';5'-TTC,TCC,CTA,TAG,TGA,GTC,GA,TTA,TGC,GCG,C
‐ 3'; 5'-TTC,TCC,CTA,TAG,TGA,GTC,GTA,TTA,TGC,GCG,C-3'； 5'-AAT,TGC,GCG,CA
T , A A T , A C G , A C T , C A C , T A T , A G G , G A G , A A T , G C A - 3 ' ) を 化 学 合 成 に よ り 調 製 し た 。つ ぎ に
8 つ の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド の 5'末 端 を T4 polynucleotide kinase(Nippon gene,
Tokyo,
Japan) を 用 い て リ ン 酸 化 し た の ち に ア ニ ー ニ ン グ し 、 T4
DNA
ligase(Nippon gene, Tokyo, Japan)に よ っ て ラ イ ゲ ー シ ョ ン す る こ と で 全 て を
連 結 し た 1 本 の D N A と し た 。得 ら れ た D N A 断 片 の 両 末 端 は 制 限 酵 素 E c o R I ま た
は H i n d I I I の 切 断 末 端 と 対 合 で き る 突 出 末 端 と な る よ う に 設 計 し て あ り 、こ の
DNA 断 片 を 制 限 酵 素 Eco RI と Hind III に よ り 切 断 し た pUC19 と ラ イ ゲ ー シ ョ
ン す る こ と で ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー pTS1 を 構 築 し た 。
6.2.4.
CS 法 と TS 法 の 反 応 時 間 の 比 較 実 験
TS 反 応 に つ い て は 、鋳 型 DNA 以 外 の 反 応 条 件 は 本 章 実 験 方 法（ 6.2.2.）と 同
条 件 で 反 応 を 行 っ た 。C S 反 応 に つ い て は 、B i g D y e t e r m i n a t o r C y c l e S e q u e n c i n g
kit ver. 3(Applied Biosystems, Tokyo, Japan)の 製 品 説 明 書 に 従 っ て 行 っ た 。
TS 反 応 お よ び CS 反 応 に よ っ て 調 製 さ れ た RNA お よ び DNA 産 物 は ABI Prism 310
Genetic Analyzer で 泳 動 し 、 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 泳 動 結 果 を 解 析 し た 。 本 実 験
に お い て は 鋳 型 D N A と し て 環 状 p B l u e s c r i p t S K （ S t r a t a g e n e , C A , U . S . A . ）、
pGEM3Zf(Promega, Tokyo, Japan)お よ び pTS1 DNA を 用 い た 。 プ ラ ス ミ ド DNA
は ア ル カ リ SDS 法 に よ る 大 腸 菌 か ら の プ ラ ス ミ ド DNA の 抽 出 に 引 き 続 き CsCl
密度勾配超遠心法により精製したものを用いた。
6.3. 実 験 結 果
6.3.1.
TS 法 に お け る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 評 価
本 章 で は 、 近 年 開 発 さ れ た キ ャ ピ ラ リ ー DNA シ ー ク エ ン サ ー (4)を DNA シ ー ク
エ ン ス 解 析 機 器 と し て 用 い た 。 キ ャ ピ ラ リ ー DNA シ ー ク エ ン サ ー は 、 泳 動 ゲ ル
を流動ゲルとすることで機械的に充填できることやジデオキシ法で調製された
DNA 産 物 も 機 械 的 に 自 動 で 高 電 圧 を 利 用 す る こ と に よ り 、 ゲ ル 中 に イ ン ジ ェ ク
シ ョ ン す る こ と が 可 能 で あ る 。 こ の た め ス ラ ブ ゲ ル 型 DNA シ ー ク エ ン サ ー よ り
も 人 的 作 業 が 少 な く 簡 便 な 操 作 法 で あ る こ と か ら キ ャ ピ ラ リ ー DNA シ ー ク エ ン
サ ー に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 主 流 と な り つ つ あ る 。
以 上 を 背 景 と し て 、 本 章 に お け る 検 討 に お い て は こ の キ ャ ピ ラ リ ー DNA シ ー
ク エ ン サ ー を 用 い て T S 法 に つ い て の 検 討 を 行 う こ と と し た 。し か し 、流 動 ゲ ル
と 架 橋 ゲ ル で は 核 酸 の 分 離 能 が 異 な り 、 ス ラ ブ 型 DNA シ ー ク エ ン サ ー 用 に 構 築
し て い た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を キ ャ ピ ラ リ ー DNA シ ー ク エ ン サ ー で 解 析 す る た
64
めに、蛍光ターミネーターにおける蛍光色素とリボースを連結するリンカー鎖
長の変更による分子量の調整を行う必要がある。そこで、3 章で得られた成果
を 基 に し て リ ン カ ー 鎖 長 を 変 更 し 、 合 わ せ て rhodamine 色 素 と 比 較 し て 量 子 収
率が高く効率の良い蛍光の励起によるシグナル強度の上昇が期待される
B O D I P Y 色 素 ( 5 ) を 含 む 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を 構 築 し 、本 章 に お け る 検 討 を 行 う こ
ととした。
ま た 、本 章 で は 4 章 で 構 築 し た T 7 R N A P 変 異 体 F 6 4 4 Y に さ ら に 1 7 2 お よ び 1 7 3
の ア ミ ノ 酸 残 基 の 欠 損 を 導 入 し た T7 RNAP 変 異 体 delta-F644Y を 構 築 し 、 本 章
に お け る 検 討 に 用 い て い る 。 Lykanov(2,
3)
らの報告においてこれらのアミノ酸
残 基 が 欠 損 し た T7 RNAP を 用 い て 、 T7 RNAP に よ る 転 写 反 応 の 終 結 配 列 と し て
知 ら れ て い る ヒ ト 由 来 preproparathyroid hormone(PTH)遺 伝 子 配 列 や T7 フ ァ
ー ジ DNA の 複 製 の 際 に 見 ら れ る concatemer junction(CJ)配 列 な ど を 鋳 型 DNA
に し て RNA 合 成 し た 場 合 で も 転 写 反 応 の 終 結 が 抑 制 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る
(3)
。本 章 で は 、T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う 上 で P T H 遺 伝 子 配 列 や
CJ 配 列 の よ う な 転 写 反 応 終 結 配 列 に 類 似 し た 遺 伝 子 配 列 の DNA シ ー ク エ ン ス 解
析 を 行 う こ と が 必 要 な 場 合 も 十 分 に 想 定 さ れ る た め 、 T7 RNAP 変 異 体
delta-F644Y を 構 築 し 、 以 下 の 検 討 実 験 に 用 い る こ と に し た 。
本 章 に お い て は ま ず 、 TS 法 と CS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に お け る シ
ークエンス反応時間とシークエンス精度の関係について比較を行った。シーク
エ ン ス 反 応 時 間 に つ い て 考 え る 上 で TS 法 お よ び CS 法 で 用 い て い る polymerase
の 違 い と そ れ に 起 因 す る 反 応 機 構 の 相 違 が 大 き な 要 因 と 考 え ら れ る 。T S 法 で は
T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 を 用 い て お り 、 CS 法 で は Taq DNAP に よ る DNA 合 成
反 応 を 用 い て い る が 、 T7 RNAP お よ び Taq DNAP は 伸 長 速 度 に お い て 顕 著 な 差 が
あ り 、 そ の 伸 長 速 度 は Taq DNAP の 60 塩 基 /秒 (6)に 対 し て T7 RNAP の 伸 長 速 度
は 240 塩 基 /秒 (7)と 約 4 倍 で あ る 。 さ ら に 、 T7 フ ァ ー ジ の 宿 主 で あ る 大 腸 菌 由
来 の E. coli RNAP や E. coli DNAP の 伸 長 速 度 が そ れ ぞ れ 40 塩 基 /秒 (8)お よ び
50 塩 基 /秒 (9)で あ る こ と か ら も T7 RNAP が 高 い 伸 長 活 性 を 有 し て い る こ と が わ
か る 。T a q D N A P と T 7 R N A P の 間 に は 、こ の よ う に 大 き な 伸 長 速 度 の 違 い が あ り 、
こ の 伸 長 速 度 の 相 違 に よ っ て 、 TS 法 と CS 法 で 同 じ 精 度 の DNA シ ー ク エ ン ス 解
析を行いたい場合には反応時間の差として顕著に現れることが示唆される。ま
た 、C S 法 は サ ー マ ル サ イ ク ラ ー の よ う な 温 調 機 器 に よ り 各 反 応 ス テ ッ プ が 進 行
する方法であるが、このためにシークエンス反応時間は機器による温度上昇お
よび下降に要する時間や各動作に関する機器の応答時間などが必要になり、シ
ー ク エ ン ス 反 応 時 間 に 上 乗 せ さ れ る こ と に な る 。 一 方 、 TS 法 は CS 法 の よ う な
温 調 機 器 に よ る 温 度 変 化 は 必 要 な く 3 7 ℃ の 恒 温 で 反 応 進 行 が 可 能 で あ り 、各 反
応 過 程 は 酵 素 自 身 が 有 す る polymerase 活 性 と helicase 様 活 性 に よ り 進 行 さ せ
る こ と が 可 能 で あ る 。 helicase は 2 本 鎖 DNA 解 離 さ せ 、 1 本 鎖 DNA と す る 酵 素
活 性 を 有 す る も の で あ り 、 T7 RNAP は こ れ と 同 等 の 酵 素 活 性 を 有 し て い る 。 以
65
上 の 背 景 に よ り 、 TS 法 は CS 法 と 比 較 し て 短 い シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 で DNA シ
ー ク エ ン ス 解 析 が 行 え る 可 能 性 を 予 想 し た 。 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 短 時 間 で
行うことが可能になれば、感染症の原因菌の検査や手術中の病理検査などを現
場で行い結果をすぐにフィードバックすることも可能になる。すなわち、短時
間 で 結 果 を 知 る こ と が 可 能 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 は 利 便 性 の あ る 方 法 と し て
極めて有望視される。
以 上 を 背 景 と し て 、本 章 で は ま ず T S 法 に お け る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 に つ い
て の 検 討 を 行 っ た 。 Fig. 6.2 は EGFR エ キ ソ ン 19 遺 伝 子 領 域 を 含 む PCR 産 物 を
鋳 型 DNA と し て TS 法 に よ る 解 析 を 行 う に あ た り シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 を 5 分 と
し た 場 合 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 示 し て い る 。 EGFR エ キ ソ ン 19 遺 伝 子
領 域 は 進 行 性 非 小 細 胞 肺 が ん ( N S C L C ) 患 者 に お い て 、こ の 領 域 中 に 存 在 す る 欠 損
変 異 が 最 近 の 研 究 に お い て 肺 が ん 治 療 薬 で あ る Gefitiniv(商 品 名 Iressa)に よ
る副作用発現のマーカーとなることが明らかとなっており、この領域を調べる
ことで抗がん剤の投与前に重篤な副作用の出現の有無を予測するマーカーとし
て 期 待 さ れ て い る (1)。 Fig. 6.2 で 示 す EGFR エ キ ソ ン 19 遺 伝 子 領 域 を 含 む PCR
産 物 を 鋳 型 DNA と し た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 は 5 分 で 、 極 め て 短 時 間 （ CS
法 で は 約 6 0 分 ）で あ り な が ら シ ー ク エ ン ス エ ラ ー も な く 解 析 が 可 能 な こ と を 明
ら か に し た 。一 方 、CS 法 で 同 じ 反 応 時 間 で D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た 場 合
に は 、 蛍 光 シ グ ナ ル の 検 出 が 不 能 で 検 出 限 界 値 以 下 と な り 、 DNA シ ー ク エ ン ス
解 析 は 不 可 能 で あ っ た （ デ ー タ 省 略 ）。
Fig． 6.2
Rapid TS for PCR product.
Detection of deletion by direct TS method. The T7 and T3 phage promoter
sequences can be appended to both of the PCR primers and incorporated into
the EGFR PCR product(281 bp)． Using T7 RNAP, the EGFR gene could be
transcribed from both ends for 5 minutes. The electrophoresis shows only
T 7 s i d e - s e q u e n c e o f t h e E G F R e x o n 1 9 ．T h e l i n e s s h o w t h e l o c a t i o n s o f d e l e t i o n
in NSCLC.
66
6.3.2.
pTS1 ベ ク タ ー の 構 築
本 章 の 検 討 に お い て は ま ず 、T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 で 用 い る 鋳 型
DNA と し て の 使 用 に 適 し た ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー の 構 築 を 試 み た 。 TS 法 で 用 い
る 鋳 型 DNA に は DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 い た い DNA 領 域 の 上 流 に T7 Promoter
を 有 す る 必 要 が あ る 。T 7 p r o m o t e r に は T 7 フ ァ ー ジ の 大 腸 菌 へ の 感 染 お よ び T 7
ファージ粒子の構築の過程で働くいくつかの種類があり、それぞれの種類は
class I、 class II お よ び class III の 3 つ に 分 類 さ れ る 。 中 で も class III
は T7 フ ァ ー ジ を 構 築 す る た め の 基 礎 と な る タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 遺 伝 子 の
発 現 に か か わ る も の が 多 く 、 3 つ の T7 promoter の 種 類 の 中 で T7 promoter の
活 性 が 最 強 で あ る こ と が 知 ら れ て い る (10)。こ の た め T7 promoter を 有 す る 従 来
の ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー に お い て は class III の T7 promoter に お い て 保 存 さ
れ て い る コ ン セ ン サ ス 配 列 を T7 promoter と し て 用 い て い る 。 し か し な が ら 、
従 来 の ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー は class III で 保 存 さ れ て い る 23 塩 基 の コ ン サ ン
サ ス 配 列 ( 5 ' - T A A , T A C , G A C , T C A , C T A , T A G , G G G , A G A - 3 ' ) の 内 、- 1 7 か ら + 3 ま で の 領
域 (5'-TAA,TAC,GAC,TCA,CTA,TAG,GG-3')を T7 promoter 配 列 と し て 導 入 し て い
る も の が 多 い が 、T 7 p r o m o t e r 配 列 の 転 写 開 始 点 + 1 か ら + 6 の 領 域 に お け る c l a s s
III の コ ン セ ン サ ス 配 列 か ら の 置 換 は T7 promoter 活 性 を 低 下 さ せ る こ と が 報
告 さ れ て い る （ 11,
12）
。 さ ら に 、 +4 か ら +6 位 ま で の 領 域 に つ い て も T7 promoter
の class III の コ ン セ ン サ ス 配 列 と 異 な る 場 合 に RNA 合 成 効 率 が 低 下 す る こ と
が 報 告 さ れ て お り 、 +4 か ら +6 の 領 域 の 重 要 性 も 報 告 さ れ て い る (13)。 こ の よ う
な 報 告 か ら 推 察 す る と 、 T7 promoter を 持 つ 従 来 の ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー は +4
か ら +6 の 領 域 に お い て 置 換 さ れ て お り 、 本 来 T7 promoter が 有 す る promoter
活性が発揮出来ていない可能性もある。クローニングベクターを構築するにあ
た り 、 上 記 以 外 の 要 素 と し て T7 promoter を 有 す る 従 来 の ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ
ー は マ ル チ ク ロ ー ニ ン グ 部 位（ M C S ）に お い て 外 来 D N A 断 片 を ク ロ ー ニ ン グ す る
た め の 様 々 な 制 限 酵 素 に よ る 切 断 部 位 を 持 つ が 、 本 章 に お け る pBS を 鋳 型 DNA
に 用 い た 検 討 に よ っ て 制 限 酵 素 Not I(5'-GCG,GCC,GC-3')の よ う な GC リ ッ チ な
DNA 配 列 を 有 す る 制 限 酵 素 切 断 部 位 が MCS に 存 在 す る 場 合 に は 、 こ の よ う な 配
列 を 含 む DNA を 鋳 型 と し て T7 RNAP を 用 い て RNA 合 成 に し た 場 合 に 、 RNA 合 成
効 率 の 低 下 傾 向 が 認 め ら れ た（ デ ー タ 省 略 ）。以 上 の よ う な 知 見 を 踏 ま え て F i g .
6 . 3 に 示 す M C S の 配 列 を 有 す る ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー p T S 1 を 構 築 し 、T S 法 に お
い て pTS1 の 特 長 と T7 promoter を 有 す る 他 の ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー と の 比 較 を
行い、その性能を評価した。
67
Fig. 6.3
Structure of pTS1 multiple-cloning sites.
Multiple-cloning site flanked by minimum T3 and T7 promoters in pTS1 vector.
Directions of each arrow show directions of transcription.
6.3.3. TS 法 と CS 法 に お け る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 比 較
本 章 に お い て は 、T S 法 の シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 に つ い て C S 法 と の 比 較 実 験 を
行 っ た (Fig. 6.4)。 さ ら に 本 章 実 験 結 果 （ 6.3.2.） に お い て 構 築 し た ク ロ ー ニ
ン グ ベ ク タ ー pTS1 と T7 promoter 配 列 を 有 す る 既 存 の ク ロ ー ニ ン グ 用 ベ ク タ ー
を 鋳 型 D N A と し て 用 い 、T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お け る シ ー ク エ ン
ス 精 度 と い く つ か の シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 で 得 ら れ た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結
果 に お け る シ ー ク エ ン ス 精 度 を 比 較 す る こ と で pTS1 の 有 用 性 の 評 価 を 行 っ た 。
こ の 検 討 に お い て は 、p T S 1 と 比 較 す る ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー と し て p B S お よ び
pGEM3Zf(pGEM)を 用 い た 。Fig. 6.4 に 示 す 実 験 結 果 に お い て 、pTS1、pBS お よ び
p G E M を 鋳 型 D N A と し て D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た 場 合 、T S 法 に お い て は シ
ー ク エ ン ス 反 応 時 間 5 分 の 場 合 に す べ て の 鋳 型 DNA 種 に お い て 400 塩 基 ま で の
解 読 鎖 長 に お い て 99.5%以 上 の シ ー ク エ ン ス 精 度 で DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 行
え る こ と が 明 ら か と な っ た 。一 方 、C S 法 で は す べ て の 鋳 型 D NA を 用 い た い ず れ
の 条 件 に お い て も 、シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 5 分 で お こ な っ た T S 法 の D N A シ ー ク
エ ン ス 解 析 結 果 と 同 等 な シ ー ク エ ン ス 精 度 を 示 す DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 が
得 ら れ た の は 、シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 6 0 分 の 条 件 の み で あ っ た 。以 上 の 実 験 結
果 か ら TS 法 で は 、 シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 を 、 CS 法 の シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の
8%に 短 縮 可 能 な こ と が 明 ら か と な っ た 。
つ ぎ に 、 TS 法 に お い て pTS1、 pBS お よ び pGEM を 鋳 型 DNA と し て 用 い て DNA
シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た 場 合 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 の 比 較 を 行 っ た と
こ ろ 、 シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 1 分 の 反 応 条 件 に お い て も 99%以 上 の シ ー ク エ ン
ス 精 度 で の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 で あ り 、p B S と p G E M で は そ れ ぞ れ 8 9 . 5 %
と 9 1 . 0 % の シ ー ク エ ン ス 精 度 に と ど ま っ た 。こ の 実 験 結 果 か ら p T S 1 ベ ク タ ー は
T7 promoter を 持 つ 従 来 の ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー と 比 較 し て 短 い シ ー ク エ ン ス
反 応 時 間 で T S 法 を 行 っ た 場 合 に シ ー ク エ ン ス 精 度 の 上 昇 が 可 能 で あ り 、短 時 間
で DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 行 え る TS 法 の 特 長 を さ ら に 向 上 さ せ る 効 果 が 認 め ら
れた。
68
Fig． 6.4
Comparison of sequence accuracy with pTS1 and commercial vectors.
Comparison of sequence accuracy within 400 base-long regions of TS and CS
by various plasmids, pTS１ ， pGEM and pBS． 200 ng of each plasmid were
incubated for 1, 5, 10, 15 and 30 min using both methods. The individual
quality of the sequences was assessed by calculating the percentage of
correct basecalls with in 400 base-long sections from the first signal.
6.4. 考 察
本 章 で は 、 TS 法 は CS 法 と 比 較 し て 短 時 間 で の DNA シ ー ク エ ン ス 反 応 が 可 能
であることを明らかにした。本章で明らかとなった同等のシークエンス精度で
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う 場 合 、 CS 法 の 60 分 と 比 較 し て TS 法 で は 5 分 の シ
ークエンス反応時間で十分であることや 5 章において明らかになった未精製の
PCR 産 物 を 鋳 型 DNA の 使 用 が 可 能 な こ と 、 さ ら に 温 調 機 器 の 必 要 が 無 い な ど の
特 長 は 、 最 近 の 研 究 で 進 め ら れ て い る Micro electro mechanical systems
(MEMS)技 術 な ど に よ る 微 細 加 工 技 術 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 デ バ イ ス な ど
へ の 応 用 の 面 で CS 法 の 場 合 と 比 較 し て 搭 載 す べ き 機 能 が 少 な く で き る こ と か
ら 、T S 法 を 用 い た 場 合 に こ の よ う な デ バ イ ス 開 発 が 促 進 さ れ る 可 能 性 を 示 唆 し
て い る (14)。
つ ぎ に 、本 章 に お い て 構 築 し た p T S 1 と 従 来 の ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー の 性 能 を
比 較 し た 。 pTS1 の 優 位 性 は MCS の 配 列 お よ び promoter 配 列 に よ る こ と が 示 唆
さ れ た が 、 promoter 配 列 に 起 因 す る と 仮 定 し た 場 合 、 T7 RNAP に よ る RNA 合 成
反 応 に お け る 二 つ の 反 応 機 構 、i n i t i a t i o n p h a s e お よ び p r o c e s s i v e e l o n g a t i o n
phase の 違 い に 関 与 し て い る 可 能 性 が あ る 。 initiation phase は T7 promoter
の 転 写 開 始 点 か ら +8 塩 基 ま で の 領 域 の RNA 合 成 反 応 機 構 で あ り 、 initiation
phase は processive elongation phase と 比 較 し て 伸 長 速 度 が 遅 く 、 さ ら に 非
特 異 的 な 転 写 終 結 等 を 起 こ し や す い こ と が 報 告 さ れ て い る ( 1 2 ) 。こ の た め 転 写 開
69
始 点 か ら +8 塩 基 ま で の 領 域 に お い て T7 RNAP に よ る RNA 合 成 反 応 に お い て 効 率
を 下 げ る 配 列 が 存 在 す る こ と は 最 終 的 に 得 ら れ る RNA 合 成 産 物 量 に 大 き く 影 響
を 与 え る こ と が 示 唆 さ れ る 。 一 方 、 processive elongation phase に 入 っ た あ
と は 早 い 伸 長 速 度 で R N A 合 成 反 応 が 進 行 し 、こ の p r o c e s s i v e e l o n g a t i o n p h a s e
に お い て は RNA 合 成 効 率 の 低 い 配 列 の 影 響 を 受 け に く い こ と が 示 唆 さ れ る 。 こ
の た め T7 promoter の 転 写 開 始 点 以 降 の +4 か ら +6 の 領 域 の コ ン セ ン サ ス 配 列 か
ら の 置 換 は i n i t i a t i o n p h a s e に お け る R N A 合 成 反 応 の 進 行 に 影 響 し 、最 終 的 に
得 ら れ る RNA 合 成 産 物 の 量 に 顕 著 に 影 響 を 与 え る こ と が 想 定 さ れ る 。
Fig. 6.4 の 実 験 結 果 に お い て 、 シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 1 分 の 反 応 条 件 で TS
法 を 行 っ た 場 合 の シ ー ク エ ン ス 精 度 が pBS と pGEM で 比 較 す る と pGEM を 鋳 型 DNA
と し て 用 い た 場 合 の シ ー ク エ ン ス 精 度 が 良 好 で あ っ た 。p B S と p G E M を 用 い た 場
合 の シ ー ク エ ン ス 精 度 の 違 い が 認 め ら れ る が 、p B S と p G E M の 有 す る T 7 p r o m o t e r
は 同 一 で あ る た め 、 T7 promoter の 以 外 の 配 列 の 違 い が 存 在 し て い る と 考 え ら
れ る 。 そ こ で T7 promoter 以 外 の 違 い に 注 目 し て 調 べ た 結 果 、 pBS と pGEM が 有
す る MCS に は 、 G 塩 基 ま た は C 塩 基 の み で 構 成 さ れ た 7 塩 基 以 上 の 配 列 が そ れ
ぞ れ 3 箇 所 と 1 箇 所 あ る こ と が わ か っ た 。こ の 違 い が p B S と p G E M を 用 い た 場 合
のシークエンス精度の違いを引き起こす一因ではないかと考えられる。なお、
pTS1 の MCS に は 7 塩 基 以 上 の G 塩 基 ま た は C 塩 基 の み で 構 成 さ れ た DNA 配 列 は
存在していない。
ま た 、本 章 で 明 ら か と な っ た T S 法 に よ る 極 め て 短 時 間 で D N A シ ー ク エ ン ス 解
析 が 行 う こ と の で き る こ の 特 長 は 迅 速 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 必 要 な 場 合 に
お い て 極 め て 重 要 と 考 え ら れ る 。 一 例 と し て は human hepatitis B virus(hHBV)
に 存 在 す る DNA 変 異 が 重 症 度 に 関 与 し 、 劇 症 肝 炎 お よ び 急 性 肝 炎 の 発 症 に 関 与
し て い る こ と が 知 ら れ て い る ( 1 5 ) 。劇 症 肝 炎 は 急 速 に 肝 機 能 異 常 が 進 み 、数 日 か
ら 1 0 日 前 後 で 肝 不 全 、肝 性 脳 症 に 至 り 死 亡 す る 予 後 不 良 の も の で あ る 。治 療 に
あ た っ て は HBV の 変 異 を 早 期 に 診 断 す る こ と が 必 要 と な る 。 こ の よ う な 早 期 に
診 断 す る 必 要 が あ る 感 染 症 の 診 断 や 術 中 の 病 理 検 査 な ど に お い て 、T S 法 に よ る
短 時 間 で の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 は 現 場 で の 使 用 の 可 能 性 な ど 用 途 の 拡 大 を も
予想させることから、技術的な優位性とともに実用面でも有用と考えられる。
6.5. 結 語
第 6 章 で は 、 TS 法 と CS 法 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に お け る シ ー ク エ ン ス 反
応 時 間 の 相 違 に つ い て キ ャ ピ ラ リ ー DNA シ ー ク エ ン サ ー を 用 い て 評 価 を 行 っ た 。
T S 反 応 は 、3 7 ℃ の 恒 温 反 応 で あ り 温 調 機 器 が 不 要 な こ と 、さ ら に T 7 R N A P は T a q
DNAP と 比 較 し て 伸 長 速 度 が 約 4 倍 速 い こ と か ら 、 CS 反 応 と 比 較 し て 、 シ ー ク
エ ン ス 反 応 時 間 の 顕 著 な 短 縮 が 期 待 さ れ た 。 こ の 検 証 を 目 的 に EGFR エ キ ソ ン
19 遺 伝 子 領 域 を 含 む PCR 産 物 や pBS、 pGEM お よ び 本 章 に お い て 構 築 し た TS 法
70
の 鋳 型 DNA と し て 適 し た pTS1 の 各 プ ラ ス ミ ド DNA を 鋳 型 と し て 用 い 、 TS 法 お
よ び CS 法 に よ る シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 比 較 を 行 っ た と こ ろ 、 TS 法 で は 、 シ
ー ク エ ン ス 反 応 時 間 5 分 で 9 9 . 5 ％ 以 上（ 解 読 鎖 長 4 0 0 塩 基 ）の シ ー ク エ ン ス 精
度 で の 解 析 が 可 能 で あ っ た 。シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 5 分 で は 、C S 法 で は 同 じ シ
ー ク エ ン ス 反 応 解 析 は 不 可 能 で あ る 。以 上 の 検 討 に よ り 、TS 法 で は 、シ ー ク エ
ン ス 反 応 時 間 を 、C S 法 の シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 8 % に 短 縮 で き る こ と を 明 ら か
にした。
参考文献
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71
第 7章
T S 法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の DN Aシ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 構 築
7.1. 緒 言
CS 法 で は シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル の 急 激 な 減 衰 や 停 止 を 伴 い DNA シ ー ク エ ン ス
解 析 が 困 難 な DNA 領 域 （ 難 解 読 領 域 ） の 存 在 が 知 ら れ て い る 。 こ の よ う な 難 解
読 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 可 能 と す る こ と を 目 的 と し て 、 2 本 の DNA 鎖
に お い て 対 向 す る GC 間 と AT 間 の 水 素 結 合 形 成 能 を 弱 め る 添 加 剤 の 使 用 や シ ー
ク エ ン ス 反 応 の た め の 温 度 の 変 更 な ど が 試 み ら れ て い る が 、 鋳 型 DNA の 配 列 や
GC 含 有 率 、読 み 取 り 対 象 の D N A の 鎖 長 の 違 い な ど の 要 因 に よ っ て 、そ の 対 処 法
は異なり、どの方法も完全ではなく一般的な方法ではなかった。
本 章 で は 、 上 記 の よ う な 難 解 読 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 可 能 と す る 方
法 と し て 、T S 法 に よ る 難 解 読 領 域 の シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 構 築 と そ の 評 価 を 行
っ た 。 す な わ ち 、 CS 法 で DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 困 難 で あ っ た ヒ ト ゲ ノ ム DNA
断 片 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を TS 法 お よ び CS 法 を 用 い て 得 ら れ た 実 験 結 果 の
比 較 を 行 う こ と に よ り 、難 解 読 領 域 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お け る T S 法 の 優
位 性 を 評 価 し た 。 さ ら に 、 難 解 読 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 に お い て 、 難
解 読 領 域 を 有 す る 鋳 型
DNA の 調 製 方 法 と し て 、 Multiple displacement
amplification(MDA)法 を 用 い る こ と に よ る DNA 増 幅 お よ び MDA 産 物 の TS 法 に よ
る 鋳 型 DNA と し て の 使 用 に つ い て 検 討 を 行 う こ と と し た 。
7.2. 実 験 方 法
7.2.1.
TS 法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析
T S 法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 実 験 に つ い て は 、以 下 の 反
応 を 用 い て 行 っ た 。 反 応 液 と し て 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 mM MgCl2, 5 mM DTT,
2 mM spermidine(HCl)3, 0.4 mM MnCl2、 0.05% Tween 20、 1 mM GMP, 250 μ M ATP,
500 μ M ITP, 250 μ M CTP, 250 μ M 5-Br-UTP, 0.1 μ M BODIPY R6G-3'-dATP、
0.2 μ M BODIPY FL-3'-dGTP 、 0.4 μ M BODIPY 564/570-3'-dUTP 、 0.3 μ M
BODIPY-3'-dCTP を 調 製 し 、 鋳 型 DNA と し て 難 解 読 領 域 を 有 す る ヒ ト ゲ ノ ム DNA
断 片 を pTS1 の 制 限 酵 素 Hinc II 切 断 部 位 に 挿 入 し た 環 状 プ ラ ス ミ ド DNA 100 ng
を 反 応 液 に 添 加 し た 。 こ の 反 応 液 に 50 units T7 RNAP 変 異 体 delta-F644Y お
よ び 0.005 units PPase を 添 加 し て 37℃ で 1 時 間 反 応 し た の ち 、 終 濃 度 56 mM
と な る よ う に e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d ( E D T A ) を 添 加 し 、9 9 . 5 % ( v / v )
EtOH お よ び 70%(v/v) EtOH を 用 い て エ タ ノ ー ル 沈 殿 を 行 う こ と で RNA 産 物 を 沈
殿 さ せ た 。 沈 殿 し た RNA 産 物 は 、 Template Suppression Reagent
25 μ l に 溶
解 し 、 ABI Prism 310 Genetic Analyzer を 用 い て 機 器 添 付 の 取 扱 説 明 書 に 従 っ
72
て電気泳動したのちに泳動結果を解析した。
CS 法 に つ い て は 、 Big Dye terminator Cycle Sequencing kit ver. 3.0 を 用
い て 、 TS 法 と 同 じ 鋳 型 DNA 量 で 製 品 添 付 の 取 扱 説 明 書 に 従 っ て CS 反 応 お よ び
反 応 産 物 の 精 製 を 行 い 、 ABI Prism 310 Genetic Analyzer を 用 い て 機 器 添 付 の
取扱説明書に従って、電気泳動したのちに泳動結果を解析した。
得 ら れ た D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 は 、U C S C G e n o m e B r o w s e r ( h t t p : / / g e n o m e .
ucsc.edu/)を 用 い て 、 ヒ ト ゲ ノ ム DNA デ ー タ ー ベ ー ス と の 比 較 を 行 っ た 。
7.2.2.
難 解 読 領 域 を 有 す る MDA 産 物 の TS 法 を 用 い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析
難 解 読 領 域 を 有 す る MDA 産 物 お よ び PCR 産 物 の 調 製 は 、 以 下 の 方 法 を 用 い て
行 っ た 。 ま ず 、 MDA 産 物 の 調 製 は 、 難 解 読 領 域 を 有 す る ヒ ト ゲ ノ ム DNA 断 片 を
pTS1 の 制 限 酵 素 Hinc II 切 断 部 位 に 挿 入 し た 環 状 プ ラ ス ミ ド DNA を 保 持 し た 大
腸菌のコ ロニー を滅菌し た爪楊 枝を用い て採取 した。つ ぎに
Templiphi
amplification kit(Amersham Bioscience, Tokyo, Japan)を 用 い 、 製 品 添 付 の
取 扱 説 明 書 に 従 っ て 調 製 し た 反 応 液 に 大 腸 菌 の コ ロ ニ ー を 添 加 し 、 MDA 反 応 を
行 う こ と で MDA 産 物 の 調 製 を 行 っ た 。 PCR 産 物 の 調 製 は 、 0.1 M PCR プ ラ イ マ ー
M13
Forward(5'-GTA,AAA,CGA,CGG,CCA,GT-3') お よ び
PCR
Reverse(5'-CAG,GAA,ACA,GCT,ATG,AC-3') を 用 い 、 0.5
プ ラ イ マ ー M13
units
Ex
Taq
DNA
polymerase(Takara Bio, Shiga, Japan)を 添 加 し た 反 応 液 に 鋳 型 DNA サ ン プ ル
と し て MDA 産 物 の 調 製 の 場 合 と 同 様 に 大 腸 菌 の コ ロ ニ ー を 爪 楊 枝 を 用 い て 添 加
し 、P C R 反 応 を 行 う こ と に よ り P C R 産 物 を 調 製 し た 。P C R 法 に 用 い る サ ー マ ル サ
イ ク ラ ー と し て は PTC-200 DNA Engine(MJ Research, CA , U.S.A)を 使 用 し た 。
P C R 反 応 プ ロ グ ラ ム は ま ず 9 4 ℃ で 3 分 間 の 予 備 変 性 処 理 し 、9 4 ℃ で 4 5 秒 、5 5 ℃
で 4 5 秒 、7 2 ℃ で 2 分 の 増 幅 反 応 を 3 0 回 繰 り 返 し た の ち に 7 2 ℃ で 5 分 の 後 処 理
を 行 っ た 。P C R 産 物 お よ び M D A 産 物 を 鋳 型 D N A と し て C S 法 を 用 い て D N A シ ー ク
エ ン ス 解 析 す る 場 合 に は 、 Exonuclease I お よ び Shrimp alkaline phosphatase
(Amersham Bioscience, Tokyo, Japan)を MDA 産 物 お よ び PCR 産 物 に 添 加 し た 。
添 加 し た の ち 、 37℃ で 30 分 の 処 理 に 引 き 続 き 80℃ で 15 分 処 理 す る こ と で PCR
プ ラ イ マ ー と dNTPs を 不 活 性 化 し て 、 鋳 型 DNA と し て 用 い た 。 MDA 産 物 と PCR
産 物 を TS 法 を 用 い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 で 鋳 型 DNA と し て 用 い る 場 合 に は 、
Exonuclease I お よ び Shrimp alkaline phosphatase に よ る 不 活 性 化 処 理 は 行
わ ず 、 TS 反 応 に 添 加 し た 。
上 記 の 方 法 に よ り 調 製 し た M D A 産 物 お よ び P C R 産 物 は 、0 . 8 % ア ガ ロ ー ス ゲ ル
を 用 い た 電 気 泳 動 に よ り 、 DNA 増 幅 の 有 無 を 確 認 し た 。 電 気 泳 動 に よ る 確 認 の
の ち 、 TS 反 応 お よ び CS 反 応 と も に 鋳 型 DNA 量 は 同 量 で 反 応 を 行 っ た 。 TS 反 応
は 反 応 時 間 5 分 で 行 い 、 CS 反 応 は 1 時 間 で 行 っ た 。 TS 反 応 お よ び CS 反 応 は 本
章 実 験 方 法 (7.2.1)と 同 様 に 行 っ た 。 TS 反 応 お よ び CS 反 応 に よ り 調 製 し た RNA
73
産 物 お よ び DNA 産 物 は 、 Centri Sep column を 用 い て ゲ ル ろ 過 を 行 う こ と に よ
り 精 製 し た 。精 製 し た R N A 産 物 お よ び D N A 産 物 は 蒸 発 乾 固 せ ず に A B I P r i s m 3 1 0
Genetic Analyzer で 取 扱 説 明 書 に 従 っ て 電 気 泳 動 し た の ち に 泳 動 結 果 を 解 析 し
た。
7.3. 実 験 結 果
7.3.1.
難 解 読 領 域 の TS 法 を 用 い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析
CS 法 を 用 い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 、 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 困 難
で あ る 難 解 読 領 域 と し て 、G C リ ッ チ な 配 列 、p o l y G な ど の ポ リ モ ノ ヌ ク レ オ チ
ド 配 列 、パ リ ン ド ロ ー ム 配 列 、G T な ど の 塩 基 配 列 の 繰 返 し で あ る ジ ヌ ク レ オ チ
ド リ ピ ー ト な ど が 知 ら れ て い る (1,
2)
。こ の よ う な 難 解 読 領 域 を CS 法 に よ り DNA
シークエンス解析した場合には、シークエンスシグナルの減衰や消失が生じる
こ と に よ り 、 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 の 難 し い こ と が 知 ら れ て い る が 、 こ の 問 題
は CS 反 応 中 に 鋳 型 DNA が 1 本 鎖 DNA と な っ た こ と に よ り 生 ず る と 考 え ら れ る 二
次 構 造 に よ る D N A P の 伸 長 反 応 進 行 へ の 阻 害 が 原 因 と 考 え ら れ る 。こ の 問 題 へ の
対 処 法 と し て 、 核 酸 に お け る 水 素 結 合 形 成 を 弱 め る 効 果 の あ る formamide や
dimethyl sulphoxide(DMSO)な ど の CS 反 応 へ の 添 加 (3,
4)
や c7-dGTP、 dITP な ど
の ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ の CS 反 応 へ の 添 加 (5)に よ る 鋳 型 DNA 中 の 二 次 構 造 形
成の抑制による対応が試みられているが、いずれの方法を用いた場合でも完全
にこの問題を解決することが出来ていない。
し か し 、 こ の よ う な 難 解 読 領 域 は 、 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 の 必 要 が な い 無 駄
な 配 列 と い う こ と で は な く 、た と え ば G C リ ッ チ な D N A 領 域 は 遺 伝 子 発 現 調 節 機
能 を 有 す る プ ロ モ ー タ ー や エ ン ハ ン サ ー 等 の 重 要 な DNA 領 域 お よ び そ の 近 傍 に
位 置 す る こ と が 多 く (6)、 エ ピ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク な 遺 伝 子 発 現 制 御 に も 関 連 す る 極
め て 重 要 な DNA 領 域 で あ る (7)。 ま た 、 産 業 面 で は 、 た と え ば 抗 生 物 質 産 生 菌 で
あ る 放 線 菌 の ゲ ノ ム DNA は 極 め て GC リ ッ チ な DNA 領 域 で あ る こ と が 明 ら か と な
っているが、抗生物質の産生機構には不明な部分が多く、新たな抗生物質の創
製 な ど に お い て 、解 読 す べ き 重 要 な DNA 領 域 と な る (8)。さ ら に 、CS 法 を 用 い た
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 を 使 用 し て 行 わ れ て い る 国 際 ヒ ト ゲ ノ ム 解 析 プ ロ ジ ェ
ク ト に お い て は 、 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 の 難 し い 341 の ギ ャ ッ プ 領 域 の 存 在 を
報 告 し て い る (9)。 こ の よ う な ギ ャ ッ プ 領 域 に は 、 新 た な 転 写 単 位 や 遺 伝 子 発 現
に か か わ る 重 要 な 遺 伝 子 、 さ ら に 疾 患 に 関 与 す る
single nucleotide
polymorphism(SNPs)な ど の 存 在 が 示 唆 さ れ て お り 、 そ の 解 読 が 待 た れ て い る と
こ ろ で あ る (10,
11)
。
難 解 読 領 域 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 、C S 法 を 用 い た D N A シ ー ク エ ン
ス 解 析 で の 問 題 は 、C S 反 応 に お い て 、熱 変 性 に よ り 鋳 型 D NA が 1 本 鎖 と な る こ
74
と に よ り 、GC リ ッ チ な DNA 配 列 、ポ リ モ ノ ヌ ク レ オ チ ド 配 列 、ジ ヌ ク レ オ チ ド
配 列 を 有 す る 1 本 鎖 DNA は Fig. 7.1 に 示 す よ う に 二 次 構 造 を 形 成 し や す く な り 、
そ の 結 果 と し て 強 固 な 二 次 構 造 を 形 成 す る こ と で DNAP に よ る 伸 長 反 応 の 進 行
を 妨 げ 、 CS 反 応 が 停 止 す る こ と に 起 因 す る と 考 え ら れ る 。 一 方 、 TS 法 は RNAP
に よ る 伸 長 反 応 を 利 用 し て お り 、 RNAP は Fig. 1.8 に 示 す よ う に 自 ら が 有 す る
酵 素 活 性 に よ っ て 、2 本 鎖 で あ る 鋳 型 D N A を R N A P に よ る 伸 長 反 応 に お い て 最 低
限 必 要 な 領 域 の み 1 本 鎖 と す る こ と に よ り 、C S 法 に お い て 問 題 と な る 二 次 構 造
の形成のリスクが少ないと考えられた。
さ ら に T7 RNAP は 、 d(GC)16 DNA の よ う な Z 型 構 造 を 示 す DNA を 鋳 型 と し て
RNA 合 成 で き る と い う 報 告 が あ り (12)、T7 RNAP 以 外 で も 大 腸 菌 由 来 RNAP や 小 麦
由 来 RNAP に つ い て 、 d(GC)n の よ う な Z 型 構 造 を 示 す DNA を 鋳 型 DNA と し て 反
応 で き る と の 報 告 が あ る (13)。 2 本 鎖 DNA は 、 一 般 的 に は B 型 構 造 を 示 す こ と が
知 ら れ て い る が 、Z 型 構 造 を 形 成 し や す い D N A と し て d ( C G ) n 、d ( C A / T G ) n 、d ( T A ) n
な ど に 加 え (14)、 d(GGGC)n(15)な ど の 配 列 を 有 す る こ と が 報 告 さ れ て お り 、 こ れ
ら の 配 列 は CS 法 で 解 析 の 困 難 な 難 解 読 領 域 と 合 致 す る 。 加 え て 、 RNAP と 鋳 型
DNA の elongation complex 形 成 時 に 鋳 型 DNA が Z 型 構 造 を と っ て い る こ と も 報
告 さ れ て お り (16)、Z 型 構 造 を 示 す DNA は 真 核 生 物 に お い て プ ロ モ ー タ ー 配 列 や
そ の 周 辺 に 位 置 し 、 転 写 機 構 の 制 御 に 関 与 し て い る こ と も 示 唆 さ れ て お り (17)、
こ の 報 告 は RNAP と Z 型 構 造 を 示 す DNA の 関 与 を 示 唆 す る も の と 考 え ら れ る 。
以 上 か ら 、T S 法 を 用 い る こ と で 、C S 法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の D N A シ ー ク エ ン
ス 解 析 に お け る 問 題 の 解 消 が 可 能 と 考 え 、 難 解 読 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 領 域
に お け る TS 法 使 用 に よ る 効 果 の 評 価 を 目 的 に 難 解 読 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解
析 を TS 法 お よ び CS 法 で 行 い 、 解 析 結 果 の 比 較 検 討 を 行 っ た 。
75
Fig. 7.1
Comparison of TS and CS reaction mechanisms for difficult-to
-sequence template.
Fig. 7.2、 Fig. 7.3、 Fig. 7.4 に 示 す 実 験 結 果 は 、 ヒ ト ゲ ノ ム DNA に お い て
CS 法 を 用 い た 場 合 に DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 が 困 難 で あ っ た 難 解 読 領 域 の TS
法 お よ び C S 法 を 用 い た D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 で あ る 。こ れ ら の 実 験 に 用 い
た 難 解 読 領 域 を 有 す る DNA は 、 国 際 ヒ ト ゲ ノ ム シ ー ク エ ン ス 解 析 プ ロ ジ ェ ク ト
に お い て 、C S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 が 困 難 な も の と し て 選 択 さ れ た D N A
クローンである。
ま ず 、 Fig. 7.2 に 示 す 実 験 結 果 は 、 GC リ ッ チ な 配 列 を 有 す る ヒ ト ゲ ノ ム DNA
の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 示 し て い る 。 こ の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 に
お い て 、 CS 法 で は GC リ ッ チ な 領 域 に お け る 図 中 の 矢 印 で 示 す 部 位 で シ ー ク エ
ンスシグナルが急激に減衰し、その領域以降ではシークエンスシグナルが認め
ら れ な か っ た 。こ の 結 果 は 、矢 印 で 示 す 領 域 の 近 傍 で C S 反 応 が 停 止 し た こ と を
示 し て い る 。一 方 、T S 法 に よ る 解 析 で は 、C S 法 を 用 い た D N A シ ー ク エ ン ス 解 析
に お い て 認 め ら れ た シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル の 急 激 な 減 衰 は 認 め ら れ ず 、 DNA シ
ークエンス解析が可能であった。
76
Fig. 7.2
Comparison of sequence analyses by TS and CS methodsfor DNA
sequence of GC-rich region.
One GC-rich region picked up from human genomic clones was selected and
sequenced by TS and CS methods. The upper and lower panels show electro
-pherograms with CS and TS, respectively. Peaks suddenly disappear at the
points indicated by arrows in CS.To the contrary, peaks continue beyond the
termination points in TS.
つ ぎ に 、 Fig. 7.3 に 示 す 実 験 結 果 は 、 GT ジ ヌ ク レ オ チ ド リ ピ ー ト 配 列 の TS
法 と C S 法 を 用 い た D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 示 し て い る 。こ の 実 験 結 果 に お
い て 、 CS 法 を 用 い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 で は GT ジ ヌ ク レ オ チ ド リ ピ ー
ト配列近傍の矢印で示す領域において、シークエンスシグナルが急激に減衰し
た 。 一 方 、 TS 法 を 用 い た 場 合 に は CS 法 を 用 い た 場 合 に 見 ら れ る シ ー ク エ ン ス
シ グ ナ ル の 急 激 な 減 衰 は 無 く 、 そ れ 以 降 の 領 域 に つ い て も DNA シ ー ク エ ン ス 解
析が可能であった。
77
Fig. 7.3
Comparison of sequence analyses by TS and CS methods results for
DNA sequence of GT dinucleotide repetitive region.
One GT dinucleotide repetitive region picked up from human genomic clones
was selected and sequenced by TS and CS methods. The upper and lower panels
show electropherograms with CS and TS, respectively. Peaks suddenly
disappear at the points indicated by arrows in CS. To the contrary, peaks
continue beyond the termination points in TS.
さ ら に 、 Fig. 7.4 に 示 す 実 験 結 果 は 、 poly G 配 列 の TS 法 お よ び CS 法 を 用 い
た D NA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 示 し て い る 。こ の 実 験 結 果 に お い て 、C S 法 を 用
い た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 で は poly G 配 列 近 傍 の 矢 印 で 示 す 領 域 に お い て 、
シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 急 激 に 減 衰 し た 。一 方 、T S 法 を 用 い た 場 合 に は p ol y G
配 列 に お い て も シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル の 急 激 な 減 衰 は 無 く 、 poly G 配 列 以 降 の
領 域 に つ い て も DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 で あ っ た 。
78
Fig. 7.4
Comparison of sequence analyses by TS and CS methods for DNA
sequence of poly G region.
One poly G region pecked up from human genomic clone was selected and
sequenced by TS and CS methods. The upper and lower panels show
electropherograms with CS and TS, respectively. Peaks suddenly disappear
at the points indicated by arrows in CS. To the contrary, peaks continue
beyond the termination points in TS.
7.3.2.
難 解 読 領 域 を 有 す る MDA 産 物 の TS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析
本 章 に お い て 、 難 解 読 領 域 の DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 で の TS法 使 用 の 優 位 性 が 明
ら か と な っ た が 難 解 読 領 域 で あ る GCリ ッ チ な 配 列 を 有 す る DNAは 、 PCR法 に よ る
DNA増 幅 の 難 し い 領 域 と し て も 知 ら れ て い る 。 こ の 問 題 の 解 決 の た め に DMSOや
formamideや ヌ ク レ オ チ ド ア ナ ロ グ の PCR反 応 へ の 添 加 (18,
イクルプログラムの変更
(20)
19)
および反応温度のサ
などによる対処法が報告されているが、完全ではな
い 。 TS法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 、 PCR法 に よ る DNA
増 幅 が 難 し い 配 列 を 有 す る DNAに つ い て も 、 TS法 で の 解 析 を 可 能 と す る こ と を 目
的 と し て 以 下 の 検 討 を 行 っ た 。P C R 法 で D N A 増 幅 の 難 し い G C リ ッ チ な 配 列 を 有 す る
DNAの 増 幅 法 の 候 補 と し て 、 MDA法 を 用 い て 、 GCリ ッ チ な 配 列 を 有 す る DNAの DNA
増 幅 に つ い て 検 討 を 行 い 、 MDA法 に よ り 調 製 し た MDA産 物 が TS法 に お い て 鋳 型 DNA
と し て 使 用 可 能 か に つ い て の 評 価 を 行 っ た 。 MDA法 は 、 φ 29 DNAPを 用 い た DNA増
幅 法 で あ り 、φ 29 DNAPが 有 す る 恒 温 条 件 で の 鎖 置 換 活 性 を 利 用 す る こ と で 、PCR
79
法 に お い て 必 要 な 反 応 温 度 変 化 無 し に DNA伸 長 反 応 を 進 行 す る こ と が 可 能 な DNA
増 幅 法 で あ る (21)。 MDA法 に 関 し て は Yan(22)ら の 報 告 に お い て 、 GCリ ッ チ な 配 列 を
有 す る DNAの DNA増 幅 に つ い て 、 PCR法 と 比 較 し て 優 位 性 を 示 す 結 果 が あ る 。 そ こ
で 、本 章 で は こ の 報 告 に 基 づ い て 、G C リ ッ チ な 配 列 を 有 す る D N A の D N A 増 幅 に 関 し
て M D A 法 と P C R 法 に よ る D N A 増 幅 結 果 の 相 違 点 を 調 べ 、さ ら に M D A 産 物 が T S 法 に お い
て 鋳 型 D N A と し て 用 い る こ と が 可 能 か ど う か に つ い て 検 討 を 行 っ た（ F i g . 7 . 5 ）。
Fig. 7.5に 示 す 実 験 結 果 は 、 ヒ ト ゲ ノ ム DNA由 来 の GCリ ッ チ な DNA配 列 を 有 す る 7
つ の サ ブ ク ロ ー ン を 鋳 型 D N A に し て 、P C R 法 お よ び M D A 法 に よ り D N A 増 幅 を 行 っ た 結
果 を 示 し て い る 。こ の 実 験 結 果 に お い て 、P C R 法 を 用 い た 場 合 、D N A 増 幅 が 確 認 さ
れ な い か (Lanes 1、 4、 6、 7)、 ま た は 副 産 物 の 増 幅 を 含 む 複 数 の DNA増 幅 が 認 め
ら れ （ Lanes 2、 3、 5） 、 目 的 の DNA断 片 の み DNA増 幅 し た 例 は な か っ た 。 こ れ ら
の 結 果 は PCRサ イ ク ル を 45サ イ ク ル ま で 増 加 さ せ た 場 合 や DMSOを 添 加 し た 場 合 で
も 改 善 さ れ な か っ た 。 一 方 、 MDA法 を 使 用 し た 場 合 に は す べ て の ク ロ ー ン で DNA
増幅が確認された。
Fig. 7.5
Comparison of DNA amplification patterns by PCR and MDA methods.
Template was DNA extracted E. coli clones harboring human chromosome 21 and
11 DNA fragment.Agarose gel electrophoresis of PCR products (upper panel)
and MDA products (lower panel) amplified from seven human genomic GC-rich
clones. M represents the molecular weight marker. The results show that all
fragments can be obtained with a high yield (more than 1 μ g DNA in 10
μ l of MDA reaction mixture).
80
つ ぎ に MDA法 に よ る DNA増 幅 で 得 ら れ た MDA産 物 が DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 の 鋳 型
D N A と し て 用 い る こ と が 可 能 か ど う か に つ い て 検 討 を 行 っ た（ F i g . 7 . 6 ）。F i g . 7 . 6
の DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 で 示 す 配 列 は 、 GC含 有 率 82.4%と 高 い 値 を 示 し て い
る 。F i g . 7 . 6 に 示 す 実 験 結 果 か ら T S 法 に お い て M D A 産 物 を 鋳 型 D N A と し て 使 用 可 能
で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 は 、本 章 ( 7 . 3 . 1 ) と 同 様
に CS法 に よ る DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 で は 難 解 読 領 域 で シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル
の 急 激 な 減 衰 が 確 認 さ れ 、T S 法 で は シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル の 減 衰 や 消 失 は 認 め ら
れ ず 、 DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 で あ っ た 。 ま た 、 Fig. 7.6に 示 し た 実 験 で 用
い た 以 外 の 鋳 型 D N A を 用 い た 場 合 で も 、T S 法 を 用 い た D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に よ り 、
G C 含 有 率 6 0 % か ら 8 5 % の 配 列 を 有 す る D N A の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 、シ ー ク
エ ン ス シ グ ナ ル の 低 下 を 伴 わ ず 、高 い シ ー ク エ ン ス 精 度（ 9 9 . 5 % 以 上 ）で D N A シ ー
ク エ ン ス 解 析 が 可 能 で あ っ た （ デ ー タ 省 略 ） 。 こ れ ら の 実 験 結 果 か ら 、 PCR法 に
よ る DNA増 幅 が 難 し い GCリ ッ チ な 配 列 を 有 す る DNAの DNA増 幅 が MDA法 を 用 い る こ
と に よ り 可 能 で あ り 、さ ら に M D A 産 物 は T S 法 に お い て 鋳 型 D N A と し て 用 い る 場 合 に
精 製 操 作 を 行 わ ず 、 鋳 型 DNAと し て 使 用 可 能 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 以 上
よ り 、 TS法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の DNAシ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て MDA法 が 適 し た
DNA増 幅 法 で あ る こ と を 明 ら か に し た 。
81
Fig. 7.6
DNA sequencing electropherogram of a highly GC-rich MDA product
using CS and TS.
Sample No． 2 of MDA reaction in Fig. 7.5 was subjected to direct-sequencing
using CS（ upper panel） and TS（ lower panel） ． CS yielded a greatly reduced
signal and finally became unreadable. In contrast to the results, all MDA
clones could be analyzed completely by TS（ data not shown） ．
本 章 の 結 果 を 総 括 し て 、T S 法 を 用 い る こ と に よ り 、こ れ ま で 難 解 読 と さ れ て
い た D N A 領 域 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 で あ り 、C S 法 で は 困 難 で あ っ た 難
解読シークエンス解析において、その優位性を明らかにした。
本 章 に お け る TS 法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の 解 析 法 を 用 い る こ と で 未 知 の 遺 伝
子の発見や疾患遺伝子の探索、微生物の産業利用等において、有用な遺伝子情
報が得られるものと考えられる。
7.3.3.
TS 法 に よ る 難 解 読 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 の 応 用
本 章 (7.3.1)で 解 析 し た ヒ ト ゲ ノ ム DNA ク ロ ー ン の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果
82
を 用 い て 、 ヒ ト ゲ ノ ム DNA ク ロ ー ン の ヒ ト 染 色 体 上 の 位 置 と DNA シ ー ク エ ン ス
解析結果のシークエンス精度を最新版のヒトゲノムシークエンスデーターベー
ス を 用 い て 確 認 し た と こ ろ 、こ れ ら の D N A ク ロ ー ン は ヒ ト 染 色 体 1 1 番 の 長 腕 に
位 置 す る DNA 断 片 で あ る こ と が 確 認 さ れ 、 そ れ ぞ れ q12.2、 q25、 q24.2 に 位 置
し 、4 0 0 塩 基 の 解 読 鎖 長 で 1 0 0 % の 相 同 性 を 示 す こ と が 確 認 で き た ( デ ー タ 省 略 ) 。
q12.2 お よ び q25 に 位 置 し た DNA 領 域 は 、 こ れ ま で の と こ ろ 遺 伝 子 機 能 に つ い
て の 報 告 は な さ れ て い な い が 、 q24.2 に 位 置 し た DNA 領 域 は 、 FAD-dependent
oxidoreductase domain containing 1(FOXRED1)遺 伝 子 の エ キ ソ ン 8 と 9 の 間 に
存 在 す る イ ン ト ロ ン 領 域 に 位 置 し て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 こ の 結 果 か ら 、 TS
法 を 用 い た 難 解 読 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 は 高 精 度 に DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 行
えるものであることが、この結果から示された。
さ ら に 、本 研 究 に よ り 開 発 し た T S 法 を 用 い た D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 技 術 は 現
在、研究段階から実用化段階に移行しており、上記のような知見以外に、実用
化 し た TS 法 を 用 い た 難 解 読 シ ー ク エ ン ス 解 析 の 一 例 と し て 、 Table 7.1 に 示 す
報 告 が な さ れ て い る 。ま ず 、様 々 な 生 物 種 の ゲ ノ ム DNA 解 析 に お い て 、CS 法 で
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 困 難 で あ っ た た め 、 難 解 読 領 域 と し て 残 っ た ギ ャ ッ プ
領 域 の 解 読 例 が 報 告 さ れ て い る 。 た と え ば 、 病 原 性 放 線 菌 Nocardia farcinica
IFM10152(23)ゲ ノ ム DNA や ロ ド コ ッ カ ス 属 細 菌 Rhodococcus eryhtropolis ゲ ノ
ム D N A ( 2 4 ) の ギ ャ ッ プ 領 域 、ハ ナ タ バ コ N i c o t i a n a s y l v e s t r i s お よ び N i c o t i a n a
tomentosiformis ゲ ノ ム DNA に 存 在 す る 短 い イ ン バ ー ト リ ピ ー ト 配 列 (25)、ミ ド
リ ム シ Euglena gracilis ゲ ノ ム DNA の fibrillarin 遺 伝 子 領 域 近 傍 に 位 置 す る
リ ピ ー ト 配 列 (26)な ど が TS 法 を 用 い る こ と に よ り 解 読 さ れ た こ と が 報 告 さ れ て
い る 。 ゲ ノ ム DNA 以 外 で は 、 レ タ ス Lactuca sativa お よ び Lactuca Cisco の
plastids の ギ ャ ッ プ 領 域 の 解 読 の 報 告 も な さ れ て い る (27)。
つ ぎ に 、C S 法 で 難 解 読 領 域 と な っ て い た ヒ ト N e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 )
遺 伝 子 に 存 在 す る パ リ ン ド ロ ー ム な AT リ ッ チ リ ピ ー ト (Palindromic AT-rich
repeat, PATRR)配 列 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 、 TS 法 を 用 い る こ と に よ り 可 能
と な る こ と が 報 告 さ れ て い る (28)。NF1 遺 伝 子 の PATRR 配 列 は 常 染 色 体 優 性 遺 伝
病 で あ る 神 経 線 維 腫 症 Neurofibromatosis の 発 症 に 関 与 す る 染 色 体 の 転 座 部 位
と し て 知 ら れ て い る 。 ま た 、 PATRR 配 列 は 、 一 般 的 に ヒ ト ゲ ノ ム DNA に お い て
転 座 に 関 与 す る 配 列 と し て 知 ら れ て お り 、加 え て C S 法 を 用 い た D N A シ ー ク エ ン
ス 解 析 が 困 難 で あ る DNA 領 域 で あ る 。
さらに疾患発症に関する例として、男性における脱毛症発症に関与する
Androgen receptor 遺 伝 子 の エ キ ソ ン １ に 存 在 す る GGC 塩 基 の 反 復 配 列 に つ い
て 、2 2 回 以 上 の 3 塩 基 反 復 配 列 の 場 合 は 、C S 法 を 用 い る こ と に よ る D N A シ ー ク
エ ン ス 解 析 が 難 し い が 、T S 法 を 用 い る こ と に よ り D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能
で あ り 、T S 法 を 用 い る こ と に よ り 反 復 回 数 が 正 確 に 判 定 で き た こ と が 報 告 さ れ
て い る ( 2 9 ) 。こ の よ う な 3 塩 基 反 復 配 列 は 一 般 的 に は 、ト リ プ レ ッ ト リ ピ ー ト と
83
呼ばれているが、筋緊張性ジストロフィーや脆弱 X 症候群のような遺伝性神経
疾 患 に も 関 与 し て い る こ と が 広 く 知 ら れ て い る (30、 31)。 た と え ば 脆 弱 X 症 候 群
(Fragile X syndrome) の 場 合 に は 、 疾 患 の 原 因 遺 伝 子 と し て 同 定 さ れ て い る
Fragile X mental retardation-1(FMR-1)遺 伝 子 の 5’ 上 流 領 域 に CGG 塩 基 の 反
復 配 列 が 存 在 し 、 Fragile X syndrome 患 者 で は 劇 的 に 反 復 回 数 が 多 く な っ て い
る 。 反 復 回 数 の 増 大 は FMR-1 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 し 、 こ の た め Fragile X
s y n d r o m e を 発 症 す る と 考 え ら れ て い る 。加 え て 反 復 回 数 の 数 に よ る 疾 患 の 診 断
も 行 わ れ て い る 。 Fragile X syndrome の 例 の よ う な CGG 塩 基 の 反 復 配 列 も 反 復
回 数 が 増 え る と GC リ ッ チ な DNA 配 列 と な り 、 CS 法 で の 解 析 は 困 難 で あ る と 考
え ら れ る が 、 TS 法 を 用 い る こ と に よ り 解 読 が 可 能 で あ る と 考 え ら れ る 。
Table 7.1
DNA sequence analyses by TS method for difficult-to-sequence
template.
DNA origin
Nocardia
farcinica
IFM10152
Rhodococcus
eryhtropolis
Nicotiana
sylvestris,
Nicotiana
tomentosiformi
s
Euglena
gracilis
Lactuca Cisco
Human
Human
siRNA
expression
vector
The type of difficult
-to-sequence template
Gap region of genomic
DNA
Gap region
genomic DNA
Invert repeat of genomic
DNA
Repeat region at the
vicinity of Fibrillarin
gene
Gap region of plastids
DNA
Palindromic AT-rich
repeat of
Neurofibromatosis type1
gene
GGC triplet repeat of
Androgen receptor gene
siRNA region of Krüppel
-like factor(KLF5)gene
Reference
Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 101, 14925-14930
(2004)
Environ. Microbiol., 8,
334-336(2006)
Mol. Gen. Genomics, 275,
367-373(2006)
Nucleic Acids Res., 33,
2781-2791(2005)
Trans. Res., 15, 205
-217(2006)
Hum. Mut., 26, 332-342
(2005)
J. Investig. Dermatol.
Symp. Proc., 10, 293
-294(2005)
J. Biol. Chem., 280,
12867-12875(2005)
以 上 の よ う に 、 TS 法 を 用 い る こ と に よ り CS 法 で DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 難
しい多様な難解読配列の解読が可能であることが明らかとなっており、現在の
84
と こ ろ 未 知 と な っ て い る DNA 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 や 疾 患 の 関 連 遺 伝 子
の探索および疾患の遺伝子診断等において、従来法と比較して効率良くかつ迅
速に診断を行える可能性が示唆される。
7.4. 考 察
本 章 で は 、T S 法 を 用 い た 難 解 読 領 域 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 構 築 に つ い て
検 討 し た 。す な わ ち 、難 解 読 領 域 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て C S 法 を 用 い
て DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 し た 場 合 に 、 難 解 読 領 域 に お い て シ ー ク エ ン ス シ グ ナ
ル の 急 激 な 減 衰 を 伴 い 、 難 解 読 領 域 部 分 お よ び そ れ 以 降 の DNA シ ー ク エ ン ス 解
析 が 困 難 に な る こ と が あ る 。し か し 、TS 法 を 用 い た 場 合 に は 、こ の よ う な 難 解
読 領 域 に お い て 、 シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル の 減 衰 お よ び 消 失 は な く 、 DNA シ ー ク
エ ン ス 解 析 を 行 う こ と が 可 能 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。T S 法 で 難 解 読 領 域
が 解 析 で き る 理 由 は 、 Fig. 7.1 に 示 す よ う に 、 CS 反 応 中 に 形 成 さ れ る 鋳 型 DNA
の 二 次 構 造 形 成 が 、T S 反 応 で は 形 成 さ れ る 可 能 性 が 低 い こ と に よ る と 考 え ら れ
る 。 TS 反 応 で 用 い て い る T7 RNAP は 伸 長 反 応 中 に T7 RNAP 自 身 が 有 す る 酵 素 活
性 に よ っ て 、2 本 鎖 D N A を 1 本 鎖 D N A に 解 離 し 、R N A 合 成 反 応 の の ち 、再 度 巻 き
戻 さ れ て 2 本 鎖 DNA と な る 。 こ の RNA 合 成 反 応 に お い て は 、 T7 RNAP に よ り 形
成 さ れ た 1 本 鎖 DNA と 相 補 的 な 配 列 を 有 す る RNA 産 物 が 合 成 さ れ る こ と に な る 。
そ の 際 、 鋳 型 DNA と 合 成 さ れ た RNA 産 物 が 水 素 結 合 を 介 し て DNA・ RNA hybrid
を 形 成 し て い る 鎖 長 は 約 7 塩 基 と 短 く (32)、 伸 長 反 応 の 進 行 に 伴 い 、 DNA・ RNA
hybrid が 解 離 し た の ち に 速 や か に 鋳 型 DNA は 巻 き 戻 さ れ て 2 本 鎖 DNA と な る 。
さ ら に 、 DNA・ RNA hybrid と 鋳 型 DNA は T7 RNAP タ ン パ ク 質 と も 相 互 作 用 す る
こ と で elongation complex(EC)を 形 成 し て い る 。 EC の 形 成 に よ っ て 、 鋳 型 DNA
中の二次構造形成が抑制されていると考えられる。以上のような理由により、
難 解 読 領 域 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 、T S 法 の 優 位 性 が 発 揮 さ れ て い る
と考えられる。
TS 法 は 、 ゲ ノ ム DNA や cDNA の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に お け る 難 解 読 領 域 の
解 析 の み な ら ず 、 以 下 に 示 す siRNA の 発 現 ベ ク タ ー の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に
お い て 、 そ の 有 用 性 が 認 め ら れ て い る 。 siRNA は 21 mer 程 度 の 短 い 2 本 鎖 RNA
で あ り 、R N Ai と よ ば れ る 遺 伝 子 発 現 を 抑 制 す る 現 象 を 用 い て 、遺 伝 子 発 現 の 抑
制を行う実験に用いられるものである。この方法はマウス個体などを用いた遺
伝子のノックアウト法よりも簡便かつ安価に標的遺伝子のノックアウトを行う
こ と が 可 能 な こ と か ら 、近 年 、広 く 用 い ら れ て い る も の で あ る (33)。こ の 方 法 で
は 化 学 合 成 法 や 酵 素 合 成 法 に よ り 調 製 し た siRNA の 他 に 、 標 的 遺 伝 子 を 発 現 し
て い る 細 胞 内 で siRNA を 発 現 で き る siRNA の 発 現 ベ ク タ ー も 用 い ら れ る 。 発 現
ベ ク タ ー に 挿 入 さ れ て い る siRNA を コ ー ド す る DNA 領 域 は 、 パ リ ン ド ロ ー ム 配
列となっており、パリンドローム構造によって分子内で 2 本鎖を形成すること
85
に よ り 、s i R N A を 合 成 で き る も の で あ る 。s i R N A を コ ー ド す る 配 列 中 に 、も し 予
期 し な い 点 変 異 な ど が 実 験 過 程 な ど で 導 入 さ れ た 場 合 、 生 理 活 性 の な い siRNA
が 最 終 的 に 形 成 さ れ る こ と に な り 問 題 で あ る 。 こ の よ う な 理 由 か ら 、 siRNA 発
現 ベ ク タ ー の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 が 必 要 で あ る が 、C S 法 で は パ リ ン ド ロ ー ム
配 列 も GC リ ッ チ な 配 列 や リ ピ ー ト 配 列 と 同 様 に DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 難 し く 、
こ の よ う な siRNA 発 現 ベ ク タ ー の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 困 難 で あ る こ と が 報
告 さ れ て い る (34)。 こ の よ う な siRNA 発 現 ベ ク タ ー の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を
TS 法 を 用 い て 行 っ た 場 合 、 シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル の 減 衰 な く 、 DNA シ ー ク エ ン
ス 解 析 が 行 え る こ と が 実 験 結 果 に よ り 明 ら か と な っ て い る（ デ ー タ 省 略 ）。s i R N A
発 現 ベ ク タ ー の TS 法 を 用 い た 解 析 例 に つ い て は 、 Zn finger 型 の 転 写 因 子
Krüppel-like factor(KLF15)の 遺 伝 子 を 標 的 に し た siRNA 発 現 ベ ク タ ー の DNA
シ ー ク エ ン ス 解 析 例 の 報 告 が な さ れ て い る (35)。
本 章 で 示 し た 実 験 結 果 に お い て は 、M D A 法 は G C リ ッ チ な 配 列 を 有 す る D N A の
DN A 増 幅 に お い て 、PC R 法 と 比 較 し て 優 位 性 を 示 し た が 、M DA 法 と 同 様 に 恒 温 条
件 下 で 鎖 置 換 活 性 を 有 す る DNAP を 用 い た DNA 増 幅 法 で あ る Loop-mediated
isothermal amplification(LAMP)法 (36)や Strand displacement amplification
(SDA)法 (37)を 用 い た 場 合 で も 同 様 の 効 果 を 示 す 可 能 性 が あ る 。
本 章 ま で の 研 究 成 果 に よ っ て 、T S 法 の 開 発 に 成 功 し 、C S 法 の 問 題 点 を 解 決 し 、
CS 法 を 凌 駕 す る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 で あ る こ と を 明 ら か に し た 。
本 研 究 論 文 は 、 新 規 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 開 発 を 行 い 、 そ の 成 果 を ま
と め た も の で あ る が 、近 年 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 技 術 開 発 ( 3 8 ) に お い て 有 望 な
技術として、パイロシークエンス法が注目されている。なお、パイロシークエ
ン ス 法 以 外 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 に つ い て も 研 究 開 発 が 進 め ら れ て い る が 、
現 在 の と こ ろ 研 究 段 階 で あ り 、解 読 鎖 長 が 5 0 塩 基 以 下 の も の が ほ と ん ど で あ る
な ど 、 実 用 化 に は 至 っ て い な い の が 現 状 で あ る (39)。 パ イ ロ シ ー ク エ ン ス 法 は 、
ジ デ オ キ シ 法 の よ う な 電 気 泳 動 に よ る 分 離 が 必 要 な く 、D N A P に よ る 伸 長 反 応 の
副 産 物 と し て 生 じ た ピ ロ リ ン 酸 を A T P に 変 化 さ せ 、l u c i f e r a s e に よ る 発 光 反 応
を 利 用 す る こ と で DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う (40、 41)方 法 で あ る 。 さ ら に パ イ
ロ シ ー ク エ ン ス 法 を 応 用 し た DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 シ ス テ ム の 開 発 が 2005 年 に
報 告 さ れ ( 4 2 ) 、こ の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 シ ス テ ム を 用 い る こ と に よ り 、数 百 万
塩 基 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 が 1 回 の 解 析 で 得 ら れ る こ と か ら 、 安 価 に 大
量 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果 を 得 る こ と が で き る 。 こ の よ う な 利 点 か ら 、 こ
の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 シ ス テ ム は 大 規 模 な SNPs 探 索 や ゲ ノ ム DNA の 大 規 模
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 な ど に 用 い ら れ て い る 。 し か し 、 こ の 方 法 は 一 反 応 あ た
り の 解 読 鎖 長 が 約 100 塩 基 と CS 法 や TS 法 の 解 読 鎖 長 の 約 400∼ 500 塩 基 と 比 較
して顕著に短いという難点があり、解読鎖長が短いことに起因してリピート配
列 や ギ ャ ッ プ 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う こ と が 困 難 で あ る 。 ま た 、 5
塩基以上のホモポリマー配列では、塩基数を定量することが技術的に容易では
86
な く 、 ホ モ ポ リ マ ー の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う こ と が 困 難 と の 問 題 も あ る
(38)
。 パ イ ロ シ ー ク エ ン ス 法 に は こ れ ら の 大 き な 問 題 点 が あ り 、 TS 法 と 同 様 な
難 解 読 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う こ と が 困 難 で 、 現 在 の DNA シ ー ク エ ン ス 解
析 技 術 に お い て は TS 法 が 難 解 読 シ ー ク エ ン ス 解 析 法 と し て も っ と も 優 れ た 方
法 で あ る と 考 え ら れ る 。ま た 、パ イ ロ シ ー ク エ ン ス 法 は C S 法 と 比 較 し て エ ラ ー
率 が 高 い と い う 報 告 も あ り ( 4 2 ) 、加 え て 鋳 型 D N A の 前 処 理 と し て 数 百 塩 基 程 度 へ
の 断 片 化 が 必 要 な こ と や emulsion PCR と 呼 ば れ る 油 水 エ マ ル ジ ョ ン 中 で の PCR
反応を行うためにクリーンルームのような管理された実験環境で行う必要があ
る な ど 、シ ー ク エ ン ス 精 度 や 簡 便 性 に も 問 題 が あ る (42)。以 上 よ り 、ジ デ オ キ シ
法 と パ イ ロ シ ー ク エ ン ス 法 は 大 規 模 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 プ ロ ジ ェ ク ト に お
い て は 、相 互 に 補 完 的 な 技 術 と 考 え ら れ て い る (43)。一 方 、遺 伝 子 診 断 な ど の 分
野 で は 今 後 も ジ デ オ キ シ 法 が 中 心 的 な 役 割 を 果 た し て い く と 考 え ら れ 、T S 法 に
つ い て も 難 解 読 DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 の み な ら ず 、 迅 速 な DNA シ ー ク エ ン ス 解
析 に 有 用 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 と し て 用 い ら れ る と 考 え ら れ る 。
7.5. 結 語
CS 法 で は シ グ ナ ル の 急 激 な 減 衰 や 停 止 を 伴 い DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 困 難 な
DNA 領 域 （ 難 解 読 領 域 ） に 関 し て 、 TS 法 に よ る DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 と そ の 評
価 を 行 っ た 。難 解 読 領 域 で あ る G C リ ッ チ な D N A 領 域 は 、遺 伝 子 発 現 調 節 機 能 を
有 す る プ ロ モ ー タ ー や エ ン ハ ン サ ー 等 の 重 要 な DNA 領 域 お よ び そ の 近 傍 に 位 置
することが多い。さらに、産業面では、たとえば抗生物質産生菌である放線菌
の ゲ ノ ム DNA は 極 め て GC リ ッ チ な DNA 領 域 で あ り 解 読 す べ き 重 要 な DNA 領 域 で
あ る 。 本 章 に お い て は 、 CS 法 で 解 析 が 困 難 で あ っ た ヒ ト ゲ ノ ム DNA 由 来 の DNA
断 片 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を TS 法 に よ っ て 行 い 、 GC 含 有 率 80%以 上 の DNA
領 域 や G T リ ピ ー ト 領 域 な ど に つ い て 、シ グ ナ ル 停 止 等 を 伴 わ ず 、高 い シ ー ク エ
ン ス 精 度 で の 解 析 が 可 能 で あ る こ と を 明 ら か と し TS 法 の 優 位 性 を 示 し た 。
ま た 、G C リ ッ チ な 配 列 を 有 す る D N A の D N A 増 幅 に 適 し て い る M D A 法 を 用 い た
MDA 産 物 を 精 製 無 し に 直 接 、 TS 法 に お い て 鋳 型 DNA と し て 用 い る こ と が 可 能 で
あ り 、T S 法 を 用 い た D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 法 に お い て 有 用 な D N A 増 幅 法 で あ る
ことを明らかにした。
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90
第 8章
総括
DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に つ い て 、 1977 年 に ジ デ オ キ シ 法 が サ ン ガ ー ら に よ っ て
開 発 さ れ た 。現 在 は 耐 熱 性 D N A p o l y m e r a s e を 用 い た サ イ ク ル シ ー ク エ ン ス（ C S ）
法がその主流となっており、学術研究における利用のみならず、臨床診断分野
に も 広 く 利 用 さ れ て い る 。し か し 、C S 法 に は 以 下 に 示 す よ う に 解 決 す べ き 問 題
点 が あ る 。第 一 に 、P C R 産 物 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う 場 合 、P C R 産 物 中 の
deoxyribonucleic acid triphosphate (dNTP)や PCR プ ラ イ マ ー の 不 活 性 化 が 必
要であるが、この操作は処理時間の増加に加え、煩雑かつコスト増の要因とな
っ て い る 。ま た 、PCR 産 物 中 に は 未 反 応 の dNTP や PCR プ ラ イ マ ー が 残 存 し 、正
確 な シ ー ク エ ン ス 解 析 を 困 難 に す る 要 因 と な っ て い る 。第 二 に 、C S 法 は 原 理 上
必ず専用機器による温度変化を必要とするため、温度変化に伴う時間的ロスが
大 き く 、反 応 時 間 の 大 幅 な 短 縮 が 困 難 で あ る 。第 三 に 、CS 法 を 利 用 し て DNA シ
ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た 場 合 、GC 含 量 が 多 い（ GC リ ッ チ な ）DNA 領 域 な ど は 解
読 不 能 と な る こ と が 多 い 。以 上 を 背 景 と し て 、C S 法 と は 原 理 が 異 な る 新 規 な D N A
シークエンス解析の方法と技術が求められていた。
本 論 文 に お い て は 、 大 腸 菌 フ ァ ー ジ T7 由 来 の T7 RNA polymerase（ T7 RNAP）
を 用 い た in vitro 転 写 反 応 を ジ デ オ キ シ 法 へ 応 用 し 、 CS 法 の 持 つ 問 題 を 解 決
す る 新 規 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 と し て の 「 転 写 シ ー ク エ ン ス （ TS） 法 」 の
開 発 を 目 的 と し て 研 究 を 行 い 、 そ の 成 果 を ま と め た 。 具 体 的 に は 、 T7 RNAP に
よ り ジ デ オ キ シ 反 応 を 行 う た め に 必 要 な 蛍 光 標 識
3'-deoxynucleoside
triphosphate（ 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー ） の 開 発 と 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み
活 性 が 上 昇 し た T7 RNAP 変 異 体 の 開 発 を 行 い 、 TS 法 の 効 率 的 な 実 施 に 必 要 な 試
薬 類 の 開 発 に 成 功 し た 。さ ら に 、未 精 製 PCR 産 物 が 解 析 で き る こ と 、CS 法 と 比
べ 反 応 時 間 の 大 幅 な 短 縮 が で き る こ と 、G C リ ッ チ な D N A 領 域 の D N A シ ー ク エ ン
ス 解 析 が 可 能 な こ と を 示 し 、 CS 法 を 凌 駕 す る 新 規 方 法 と し て の TS 法 の 特 長 を
示した。
第 １ 章 で は 、C S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 原 理 を 概 説 す る こ と に よ
り、解決すべき問題点を明らかにして、本研究の意義と目的を明らかにした。
第２章では、本研究で用いた主な実験方法について説明した。すなわち、プ
ラ ス ミ ド D N A の 抽 出 、D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 方 法 、P C R な ど に よ る 遺 伝 子 増 幅 方
法などについて記述した。
第 ３ 章 で は 、 T7 RNAP の 基 質 と し て 認 識 可 能 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 開 発 を
行 っ た 。蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー は 、T7 RNAP の 基 質 と し て 認 識 さ れ 、RNA 鎖 に 取 り
込 ま れ た 場 合 、 DNA polymerase の 場 合 の ddNTP と 同 様 に 、 反 応 終 結 を 引 き 起 こ
す も の で あ る 。 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー と し て 、 DNA シ ー ク エ ン サ ー に お い て 異 な
る 蛍 光 と し て 検 出 可 能 で あ る 4 種 の 蛍 光 体 6-carboxy tetramethyl rhodamine
（ T M R ）、6 - c a r b o x y X - r h o d a m i n e（ R O X ）、5 - c a r b o x y r h o d a m i n e 6 G（ R 6 G ）、5 - c a r b o x y
91
r h o d a m i n e 1 1 0 ( R 1 1 0 ) を 3 ' - d U T P 、3 ' - d C T P 、3 ' - d A T P 、3 ' - d G T P に そ れ ぞ れ 付 加 し
た TMR-3'-dUTP(Dye-U)、 ROX-3'-dCTP(Dye-C)、 R6G-3'-dATP(Dye-A), R110-3'dGTP(Dye-G)の 構 築 を 行 っ た 。 構 築 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー が 、 T7 RNAP の 基 質
と な り う る の か ど う か に つ い て 、 T7 RNAP を 用 い た in vitro 転 写 反 応 へ 蛍 光 タ
ー ミ ネ ー タ ー を 添 加 し 、 RNA 産 物 由 来 の 蛍 光 シ グ ナ ル を DNA シ ー ク エ ン サ ー で
検 出 す る こ と に よ り 検 討 し た 。 Dye-U お よ び Dye-G で は 、 シ ー ク エ ン ス シ グ ナ
ル が 検 出 さ れ た が 、 Dye-A お よ び Dye-C で は 検 出 さ れ な か っ た 。 こ れ ら の 結 果
は 、 蛍 光 物 質 に 起 因 す る 何 ら か の 立 体 障 害 に よ っ て T7 RNAP の 転 写 反 応 の 阻 害
が 起 こ っ た こ と を 示 唆 し た 。 そ こ で 、 3'-dNTP と 蛍 光 物 質 間 の リ ン カ ー で あ る
メ チ レ ン 鎖 (CH2) 長 を (CH2)1 か ら (CH2)4 に 変 更 し た と こ ろ 、 Dye-A(n=4) と
D y e - C ( n = 4 ) の 両 者 に 、分 離 し た シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た 。以 上 よ り 、
TS 法 に 適 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 開 発 に 成 功 し た 。
第 ４ 章 で は 、 3'-dNTP の 取 り 込 み に 関 与 す る T7 RNAP の ア ミ ノ 酸 残 基 を 特 定
す る こ と に よ り 、 各 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み が 改 善 し た T7 RNAP 変 異 体
を構築した。第３章の検討では、蛍光ターミネーター由来の蛍光シグナルが弱
い こ と に よ る シ ー ク エ ン ス エ ラ ー が し ば し ば 認 め ら れ た 。 こ の 原 因 と し て 、 T7
R N A P の 示 す 3 ' - d N T P と N T P に 対 す る 基 質 特 異 性 の 違 い に よ り 、N T P と 比 較 し て 、
効 率 よ く 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー が 取 り 込 ま れ て い な い こ と が 推 測 さ れ た 。そ こ で 、
T7 RNAP の polymerase ド メ イ ン に お い て 、 NTP 結 合 に 関 与 す る 部 位 と 考 え ら れ
る 領 域 お よ び そ の 近 傍 に 位 置 す る 6 つ の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 残 基 を 選 択 し 、3 ' - O H
基との相互作用部位の候補とした。つぎに、各フェニルアラニン残基のチロシ
ン 残 基 へ の 置 換 に よ り 、 3'-dNTP と の 相 互 作 用 を 形 成 さ せ る 点 変 異 体 遺 伝 子 を
構築し、大腸菌におけるタンパク質発現系を用いて、酵素標品を得た。得られ
た 各 酵 素 標 品 を 用 い 、 pBluescript(pBS)DNA 由 来 の 線 状 DNA を 鋳 型 と し た [α
- 3 2 P ] U T P 存 在 下 で の 3 ' - d A T P を 添 加 し た i n v i t r o 転 写 反 応 を 行 っ た 。生 成 し た
R N A 産 物 中 の 放 射 活 性 を 測 定 し 、3 ' - d A T P の 取 り 込 み に つ い て 、酵 素 種 間 の 違 い
を 評 価 し た 。 T7 RNAP F644Y お よ び F667Y を 用 い た 場 合 、 野 生 型 T7 RNAP を 用
い た 場 合 と 比 較 し て 、 放 射 活 性 の 値 が 約 20%に そ れ ぞ れ 減 少 す る こ と を 見 出 し
た 。 ま た 、 こ の 事 実 は 、 F644Y お よ び F667Y の 3'-dATP の 取 り 込 み 活 性 が 野 生
型 T7 RNAP と 比 較 し て 上 昇 し た こ と を 示 唆 し た 。 そ こ で 、 F644Y を 用 い て 環 状
pBS DNA を 鋳 型 と し 、 50 μ M
3'-dATP を 添 加 し て in vitro 転 写 反 応 を 行 っ た
と こ ろ 、 野 生 型 T7 RNAP よ り も 優 位 に 転 写 終 結 し 、 取 り 込 み 効 率 の 顕 著 な 上 昇
を 示 し た 。さ ら に TS 法 に お い て も 、F644Y お よ び F667Y の 使 用 に よ り 、蛍 光 タ
ーミネーター由来のシークエンスシグナルが上昇し、シークエンスエラーが減
少し性能的に改善されたことを確認した。
第 ５ 章 で は 、T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 、シ ー ク エ ン ス ピ ー
クの重なりによるシークエンスエラーが確認されたことを受けて、その解消を
目 的 と し て 検 討 を 行 っ た 。 シ ー ク エ ン ス エ ラ ー に つ い て は 、 RNA 分 子 内 の 二 次
92
構造が、電気泳動中に形成されることにより、分子量による分離が困難になる
た め と 考 え ら れ た 。 そ こ で 、 核 酸 分 子 内 に お い て は 、 guanosine triphosphate
（ rGTP ） と 比 較 し て 、 水 素 結 合 を 介 し た 二 重 鎖 形 成 能 が 弱 い
inosine
7
triphosphate（ rITP） や 7-deaza-guanosine triphosphate（ c -rGTP） を rGTP
と 置 換 す る こ と で 、 二 次 構 造 の 解 消 を 試 み た 。 λ フ ァ ー ジ ゲ ノ ム DNA 断 片 お よ
び ほ 乳 類 由 来 の c D N A 断 片 を 有 す る サ ブ ク ロ ー ン を 用 い て そ の 効 果 を 調 べ 、シ ー
ク エ ン ス エ ラ ー の 解 消 を 確 認 し た 。 さ ら に 、 c7-rGTP を 使 用 し て 、 ヒ ト 大 腸 が
ん 細 胞 株 HT29 の p53 遺 伝 子 配 列 を 有 す る PCR 産 物 中 に 存 在 す る 点 変 異 (R274H)
の 正 確 な 解 析 が 可 能 と な っ た 。 同 時 に 、 こ の 解 析 を 通 じ て 、 未 精 製 の PCR 産 物
の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 な こ と を 明 ら か に し た 。 ま た 、 TS 法 お よ び CS 法 に お
い て 鋳 型 DNA 量 と シ ー ク エ ン ス 精 度 と の 関 係 を 調 べ 、 DNA 量 が わ ず か な 場 合 で
も TS 法 に よ る 解 析 結 果 は CS 法 よ り も 優 れ た シ ー ク エ ン ス 精 度 を 示 す こ と を 明
ら か に し た 。 一 例 と し て 、 1,8-diaminooctane の 使 用 に よ り 、 10 ng の 微 量 な
DNA か ら も 高 い シ ー ク エ ン ス 精 度 に よ る 解 析 が 可 能 と な っ た 。
第 ６ 章 で は 、 TS 法 と CS 法 の シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 に つ い て 評 価 を 行 っ た 。
T S 反 応 は 、3 7 ℃ の 等 温 反 応 の た め 、温 調 機 器 が 必 要 な く 、さ ら に 、T 7 R N A P は 、
Taq DNA polymerase と 比 較 し て 伸 長 速 度 が 約 4 倍 速 い こ と か ら 、 CS 反 応 と 比
較 し て 、 反 応 時 間 の 顕 著 な 短 縮 が 期 待 さ れ た 。 こ の 検 証 を 目 的 に pBS、 pGEM お
よ び p T S 1 の 各 プ ラ ス ミ ド D N A を 鋳 型 と し て 用 い 、T S 法 お よ び C S 法 に よ る 解 析
を 行 っ た 場 合 、 TS 法 で は 、 5 分 反 応 で 99.5％ 以 上 （ 解 読 鎖 長 400 bp） の シ ー ク
エ ン ス 精 度 で の 解 析 が 可 能 で あ っ た が 、C S 法 で は 解 読 可 能 な シ ー ク エ ン ス シ グ
ナ ル が 得 る こ と は で き な か っ た 。 以 上 の 検 討 に よ り 、 TS 法 で は 、 DNA シ ー ク エ
ン ス 反 応 時 間 を 、 CS 法 の DNA シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 約 8%に 短 縮 し た 。
第 ７ 章 で は 、C S 法 で は シ グ ナ ル の 急 激 な 減 衰 や 停 止 を 伴 い D N A シ ー ク エ ン ス
解 析 が 困 難 な DNA 領 域（ 難 解 読 領 域 ）に 関 し て 、TS 法 に よ る 解 析 と そ の 評 価 を
行 っ た 。難 解 読 領 域 で あ る G C リ ッ チ な D N A 領 域 は 、遺 伝 子 発 現 調 節 機 能 を 有 す
る プ ロ モ ー タ ー や エ ン ハ ン サ ー 等 の 重 要 な DNA 領 域 お よ び そ の 近 傍 に 位 置 す る
こ と が 多 い 。さ ら に 、抗 生 物 質 生 産 菌 で あ る 放 線 菌 の ゲ ノ ム D N A に は 極 め て G C
リ ッ チ な 領 域 が あ る 。本 章 に お い て は 、C S 法 で 解 析 が 困 難 で あ っ た ヒ ト ゲ ノ ム
DNA 由 来 の DNA 断 片 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 を TS 法 に よ っ て 行 い 、 GC 含 有 率
80%以 上 の DNA 領 域 や GT リ ピ ー ト 領 域 な ど に つ い て 、 シ グ ナ ル 停 止 等 を 伴 わ ず
高 い シ ー ク エ ン ス 精 度 で の 解 析 が 可 能 で あ る こ と を 明 ら か に し て TS 法 の 優 位
性を示した。
以 上 よ り 、 反 応 時 間 の 顕 著 な 短 縮 や 未 精 製 PCR 産 物 を 直 接 解 析 可 能 な こ と 、
さ ら に こ れ ま で 難 解 読 と さ れ て い た DNA 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 で
あ る こ と な ど の 優 れ た 特 長 を 明 ら か に し て 、 新 規 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 と
し て の TS 法 の 開 発 に 成 功 し た 。
第８章では、本研究の総括を行った。
93
研 究 業 績
種 類 別
題名、
発表・発行掲載誌名、
発表・発行年月、
連名者（申請者含む）
1. 論文
○（報文） 1 . M . I z a w a , N . K i t a m u r a , N . O d a k e , F . M a k i , K . K a n e h i r a , H . N e m o t o ,
M. Yamaguchi, A. Yamashita, N. Sasaki, M. Hattori, S. Kanayama,
and Y. Yoneda.
A Rapid and Simple Transcriptional Sequencing Method for GC-rich
DNA Regions.
Jpn. J.Vet.Res., 53(3-4): 159-169, 2006
（報文） ２ . K . S h i b a t a , M . I z a w a , Y . H a y a s h i z a k i , a n d M . W a t a h i k i .
Practical Application of Transcriptional Sequencing for GC-rich
Templates.
J. Struct. Funct. Genomics., 4(1): 35-39, 2003
（報文） ３ . Y . S h i b a t a , P . C a r n i n c i , K . S a t o , N H a y a t s u , T . S h i r a k i , Y .
Ishii, T Arakawa, A. Hara, N. Ohsato, M. Izawa, K. Aizawa, M. Itoh,
K. Shibata, A. Shinagawa, J. Kawai, Y. Ota, S. Kikuchi, N.
Kishimoto, M. Muramatsu, and Y. Hayashizaki.
Removal of Poly A Tails from Full-Length cDNA Libraries for
High-Efficiency Sequencing.
Biotechniques, 31(5): 1042-1049, 2001
（報文） ４ . J . K a w a i , A . S h i n a g a w a , K . S h i b a t a , M . Y o s h i n o , M . I t o h , Y .
Ishii, T. Arakawa, A. Hara, Y. Fukunishi, H. Konno, J. Adachi, S.
Fukuda, K. Aizawa, M. Izawa, (以 下 82 名 ).
Functional Annotation of a Full-Length Mouse cDNA Collection.
Nature, 409: 685-690, 2001
○（報文） ５ . M . I w a t a , M . I z a w a , N . S a s a k i , Y . N a g u m o , H . S a s a b e , a n d Y .
Hayashizaki.
T7
RNA
Polymerase
Activation
and
Improvement
of
the
Transcriptional Sequencing by Polyamines.
Bioorg. Med. Chem., 8 (8): 2185-2194, 2000
（報文） ６ . K . S h i b a t a , M . I t o h , K . A i z a w a , S . N a g a o k a , N . S a s a k i , P .
Carninci, H. Konno, J. Akiyama, K. Nishi, T. Kitsunai, H. Tashiro,
M. Itoh, N. Sumi, Y. Ishii, S. Nakamura, M. Hazama, T. Nishine,
A. Harada, R. Yamamoto, H. Matsumoto, S. Sakaguchi, T. Ikegami,
K. Kashiwagi, S. Fujiwake, K. Inoue, Y. Togawa, M. Izawa, E. Ohara,
M. Watahiki, Y. Yoneda, T. Ishikawa, K. Ozawa, T. Tanaka, S.
Matsuura, J. Kawai, Y. Okazaki, M. Muramatsu, Y. Inoue, A. Kira,
and Y. Hayashizaki.
RIKEN Integrated Sequence Analysis (RISA) System-384-Format
Sequencing Pipeline with 384 Multi Capillary Sequencer.
Genome Res., 10 (11): 1757-1771, 2000
95
（報文） ７ . M . I t o h , T . K i t s u n a i , J . A k i y a m a , K . S h i b a t a , M . I z a w a , J .
Kawai, Y. Tomaru, P. Carninci, Y. Shibata, Y. Ozawa, M. Muramatsu,
Y. Okazaki, and Hayashizaki Y.
Automated Filtration-Based High-Throughput Plasmid Preparation
System.
Genome Res., 9 (5): 463-470, 1999
○（報文） ８ . N . S a s a k i , M . I z a w a , Y . S u g a h a r a , T . T a n a k a , M . W a t a h i k i , K .
Ozawa, E. Ohara, H. Funaki, Y. Yoneda, S. Matsuura, M. Muramatsu,
Y. Okazaki, and Y. Hayashizaki.
Identification of Stable RNA Hairpins Causing Band Compression in
Transcriptional Sequencing and Their Elimination by Use of Inosine
Triphosphate.
Gene, 222 (1): 17-23, 1998
○（報文） ９ . M . I z a w a , N . S a s a k i , M . W a t a h i k i , E . O h a r a , Y . Y o n e d a , M .
Muramatsu,Y. Okazaki, and Y. Hayashizaki.
Recognition Sites of 3'-OH Group by T7 RNA Polymerase and Its
Application to Transcriptional Sequencing.
J. Biol. Chem., 273 (23): 14242-14246, 1998
○（報文） １ ０ . N . S a s a k i , M . I z a w a , M . W a t a h i k i , K . O z a w a , T . T a n a k a , Y .
Yoneda, S. Matsuura, P. Carninci, M. Muramatsu, Y. Okazaki, and
Y. Hayashizaki.
Transcriptional Sequencing: A Method for DNA Sequencing Using RNA
Polymerase.
Proc. Natl. Acad. Sci., U S A. 95 (7): 3455-3460, 1998
（報文） １ １ . N . S a s a k i , S . N a g a o k a , M . I t o h , M . I z a w a , H . K o n n o , P .
Carninci, A. Yoshiki, M. Kusakabe, T. Moriuchi, M. Muramatsu, Y.
Okazaki, and Y. Hayashizaki.
Characterization of Gene Expression in Mouse Blastocyst Using
Single-Pass Sequencing of 3995 Clones.
Genomics, 49 (2): 167-179, 1998
（報文） １ ２ . N . S a s a k i , M . I z a w a , M . S h i m o j o , K . S h i b a t a , J . A k i y a m a , M .
Itoh, S. Nagaoka, P. Carninci, Y. Okazaki, T. Moriuchi, M.
Muramatsu, S. Watanabe, and Y. Hayashizaki.
A Novel Control System for Polymerase Chain Reaction Using a RIKEN
GS384 Thermal Cycler.
DNA Res., 4 (6): 387-391, 1997
（報文） １ ３ . P . C a r n i n c i , C . K v a m , A . K i t a m u r a , T . O h s u m i , Y . O k a z a k i ,
M. Itoh, M. Kamiya, K. Shibata, N. Sasaki, M. Izawa, M. Muramatsu,
Y. Hayashizaki, and C. Schneider.
High-Efficiency Full-Length cDNA Cloning by Biotinylated CAP
Trapper.
Genomics, 37 (3): 327-336, 1996
96
研 究 業 績
種 類 別
題名、
発表・発行掲載誌名、
発表・発行年月、
連名者（申請者含む）
2. 講演
１ . 転写シークエンス用クローニングベクターを用いた転写シークエンス法による
Dual End Sequencing
日 本 農 芸 化 学 会 、仙台（講 演 要 旨 集 p . 1 3 8 ）、2 0 0 2 年 3 月
伊 澤 真 樹 、小 竹 七 々 恵 、北 村 暢 夫 、大 原 英 治 、山 口 光 代 、長 谷 川 千 巳 、
石 井 克 典 、糸 岡 利 行 、米 田 祐 康 、綿 引 正 則
２. 転写シークエンス法の改良とその有用性
日 本 分 子 生 物 学 会 、 福 岡 （ 講 演 要 旨 集 p . 5 0 2 ）、 1 9 9 9 年 1 2 月
伊澤真樹、石川友一、柴田一浩、伊藤昌可、綿引正則、大原英治、船
木 弘 子 、 米 田 祐 康 、田 中 巧 、 小 澤 香 織 、 松 浦 修 治 、 村 松 正 実 、 林 崎 良
英
３ . T7 RNAP の 伸 長 反 応 機 構 の 解 析 及 び 活 性 化 因 子 の 探 索
日 本 分 子 生 物 学 会 、 横 浜 (講 演 要 旨 集 p. 322)、 1998 年 12 月
伊 澤 真 樹 、 佐 々 木 宣 哉 ， 綿 引 正 則 、 大 原 英 治 、 米 田 祐 康 、岩 田 正 彰 、
南雲葉子、雀部博之，田中巧、小澤香織、松浦修治、村松正実、岡崎
康司、林崎良英
他 20 件
3. その他
（報文） １ . S . O s a d a , M . I z a w a , R . S a i t o , K . M i z u n o , A . S u z u k i , S . H i r a i ,
and S. Ohno
YSK1, a Novel Mammalian Protein Kinase Structurally Related to
Ste20 and SPS1, But Is Not Involved in the Known MAPK Pathways.
Oncogene, 14 (17): 2047-2057, 1997
（報文） ２ . S . O s a d a , M . I z a w a , T . K o y a m a , S . H i r a i , a n d S O h n o .
A Domain Containing the Cdc42/Rac Interactive Binding (CRIB)
Region of p65PAK Inhibits Transcriptional Activation and Cell
Transformation Mediated by the Ras-Rac Pathway.
FEBS Lett., 404 (2-3): 227-233, 1997
（報文） ３ . S . H i r a i , M . I z a w a , S . O s a d a , G . S p y r o u , a n d S O h n o .
Activation of the JNK Pathway by Distantly Related Protein
Kinases, MEKK and MUK.
Oncogene, 12 (3): 641-650, 1996
（特許） ４ . 牧 文 典 、平 野 久 夫 、米 田 祐 康 、金 山 晋 治 、廣 世 志 津 子 、伊 澤 真 樹 .
イ ン ・ ビ ト ロ 転 写 反 応 を 利 用 し た 機 能 性 RNA 分 子 の 製 造 方 法
特 開 2005-006578
97
謝辞
本研究をまとめるにあたり、御指導、御高配を賜りました早稲田大学理工学術
院先進理工学部・桐村光太郎教授、木野邦器教授、常田聡教授に深く感謝の意
を表し、厚く御礼申し上げます。また、本論文をご査読いただき、懇切丁寧な
御指導と御鞭撻を賜りました桐村光太郎教授にあらためて深く感謝いたします。
本研究を遂行するにあたり、御指導をいただいた独立行政法人理化学研究所
ゲノム科学総合研究センター遺伝子構造・機能研究グループ林崎良英プロジェ
クトディレクター、北海道大学獣医学部実験動物学講座佐々木宣哉准教授、株
式会社ニッポンジーン金山晋治ゼネラルマネージャー、富山県衛生研究所綿引
正則博士、和光純薬工業株式会社化成品研究所田中巧所長、東京大学新領域創
成科学研究科服部正平教授、独立行政法人理化学研究所岩田正彰博士に深く感
謝いたします。
また、本研究の機会を与えていただき、御指導、御協力を賜りました株式会
社ニッポンジーン米田祐康社長、株式会社ニッポンジーンおよび株式会社ニッ
ポンジーンテクの社員の皆様に深く感謝いたします。
最後に、勉学、研究の機会を与えてくださいました両親ならびに家族に深く
感謝いたします。
2007 年 7 月
伊澤 真樹
98