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14-03 Convenient TA Cloning System for PCR Products TM TArget Clone (Code No. TAK-101) TM TArget Clone -Plus- (Code No. TAK-201) 取扱説明書 TOYOBO CO., LTD. Life Science Department OSAKA JAPAN A3243K 0 － 目 次 － [１] はじめに ............................................................................................... 1 [２] 本製品に含まれているもの ...................................................................... 2 [３] プロトコール .......................................................................................... 3 （１） PCR .. ...................................................................................... 3 （２） 3’末端のdA付加反応 ................................................................ 4 （３） ライゲーション ............................................................................ 5 （４） 形質転換.................................................................................... 6 （５） 組換え体の確認 ......................................................................... 7 [４] ベクターの配列情報 ................................................................................ 8 （１） pTA2 VectorのMap ................................................................... 8 （２） マルチクローニングサイト周辺の塩基配列 ................................. 8 （３） pTA2塩基配列 ........................................................................... 9 （４） 制限酵素切断部位 ................................................................... 11 [５] トラブルシューティング ........................................................................... 14 [６] 参考資料 ............................................................................................... 16 （１） ご用意いただく培地、試薬の組成 ............................................. 16 （２） 関連商品.................................................................................. 17 ご注意 本試薬は研究用試薬です。診断･臨床用試薬として決して使用しないでください｡ また、本試薬の使用にあたっては実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください｡ 本試薬は日本国内限定で販売されています。 1 [１] はじめに Taq DNAポリメラーゼやTth DNAポリメラーゼをベースとした酵素により増幅されたPCR産物 の多くは、その3’末端にデオキシリボアデノシン（dA）が一塩基付加された形態となっています。 そこで、3’末端にデオキシリボチミジン（dT）を一塩基だけ付加したプラスミドベクター（Tベクタ ー）を用いた場合、PCR産物のdA突出と相補的な関係となり、簡単にPCR産物をクローニン グすることができます。これが、TAクローニング法の原理です。TAクローニング法は特別なプ ライマｰを用いる必要が無く､制限酵素消化等の特別な処理も必要としないので､ＰＣＲ産物の クローニング方法として広く普及しています。 しかし、従来の TA クローニング法では、ライゲーション反応に長い時間を必要とした上、ベク ターのセルフライゲーションに起因する偽陽性が多く見られることがありました。そこで東洋紡 では、これらの問題を改善するため、新たな TA クローニングキット TArget CloneTM を開発し ました。本キットには以下のような特長があります。 特長 迅速 高効率 確実 ： 反応促進剤*の効果により、ライゲーション反応が最短５分間で完了します。 ： 反応促進剤*の効果により、高いクローニング効率を実現しました。 ： セルフライゲーションは陰性（青コロニー）となるようにデザインされており、偽陽 性の発生が低減されています。また、最長 12kb までの増幅産物のクローニン グが可能です。 *特許出願中 また、東洋紡 KOD DNA ポリメラーゼシリーズなどの、α型 DNA ポリメラーゼによって増幅さ れた PCR 産物の多くは、そのプルーフリーディング活性のため平滑末端となっています。従 来、TA クローニング法を利用して効率よくクローニングを行うためには、PCR 産物を精製した 後、Taq DNA ポリメラーゼにより、3’末端に dA を付加する必要がありました。そこで、KOD シリーズにより増幅された PCR 産物でも、精製することなく、TA クローニングができる試薬 “A-attachment Mix”を開発しました*。先の TA クローニングキットと組合わせて、KOD シリー ズ増幅産物専用の TA クローニング用試薬としてご利用いただけます（TArget CloneTM -Plus-に付属）。 *特許出願中 A-attachment Mix の特長 簡便 高効率 ： KOD シリーズにより増幅された PCR 産物に A-attachment Mix を添加して 60℃、 10 分間反応するだけです。PCR 産物の精製を必要としません。 ： Taq DNAポリメラーゼで増幅されたPCR産物をTAクローニングした場合と同等 のクローニング効率を実現しました。 1 A-attachment反応の原理図 ｸﾛｰﾆﾝｸﾞ効率の比較 (挿入DNA：λ2kb PCR産物 ) PCR product 100 C l Cloning o n i n g e fefficiency f i c i e n c y (（%） %) 90 KOD 認識抗体 A-tailing by A-attachment Mix (60℃, 10 min) KOD活性 の抑制 KOD KOD Ｔａｑ dAの付加 ＰＣＲ産物 dA dA A A T T 80 Method 1, TaqのPCR産物 Method 2, KODのPCR産物 Method 3, KODのPCR産物をA-attachment反応した場合 70 60 50 40 30 20 10 0 KOD認識抗体がKODの活性をﾌﾞﾛｯｸ。 Taq がPCR産物の平滑末端にdA付加。 1 pTA2 2 3 M e th od Ligation to pTA2 Taq のPCR産物利用時と同等の効率を実現。 [２] 本製品に含まれているもの 品名 TM TArget Clone コード 使用回数 TAK-101 10回用 TArget CloneTM -Plus- 保存温度 TAK-201 -20℃ 10μl 50μl 10μl 10μl 50μl 10μl 10μl 内容 pTA2 Vector（50ng/μl） 2x Ligation Buffer T4 DNA Ligase pTA2 Vector（50ng/μl） 2x Ligation Buffer T4 DNA Ligase 10x A-attachment Mix 注）pTA2 Vector と2x Ligation Bufferは、室温で溶解後に、必ずスピンダウンを行い、直ちに氷 上に置いてください。特にpTA2 VectorのdＴ突出末端は不安定ですので､室温で長時間放置 することは避けてください｡また､凍結融解の繰り返しも出来るだけ避けるようにしてください（凍 結融解１０回までは、ほとんど性能劣化が認められません）。 注）T4 DNA Ligaseと10x A-attachment Mixについては、ご使用前に必ずスピンダウンを行い、 直ちに氷上に置いてください。またご使用後は、必ず冷凍庫内（-30～-15℃）で保存してくださ い。 ＜その他に必要な試薬＞ LB 寒天培地 100mg/ml アンピシリン 100mM IPTG 4% X-gal 2 [３] プロトコｰル ここでは本製品を使用する場合の､標準的なプロトコｰルを示します｡ （１）PCR Step1. Taq DNAポリメラ－ゼ、Tth DNAポリメラ－ゼ、KOD DNAポリメラ－ゼなどを用いて､ 対象となるDNAの増幅を行います｡増幅の条件は､各反応に応じて設定ください｡ PCR産物の3’-dA-overhangsを確実に起こすために、ＰＣＲの最後のステップで72℃、 5～10分間の伸長反応を行ってください。 注）3’-dA-overhangsは不安定ですので､PCR後すぐに使用するか冷凍（-20℃）保存するようにし､ 室温で放置することは避けてください｡また､凍結融解の繰り返しも出来るだけ避けてください｡ Step2. 反応液の一部をとって､アガロｰスゲル電気泳動により目的のPCR産物の有無を確 認します｡また､ＤＮＡ染色後、PCR産物のバンドの濃さを分子量マｰカｰのバンドの濃 さと比較することにより､おおよそのＤＮＡ量を推定します｡ Step3. 必要に応じてPCR産物を精製します｡通常はPCR産物の精製は不要ですが､純度が 低いと思われる場合や､後のライゲｰション反応の阻害物質が含まれていると考えら れる場合には､精製を実施することにより結果の改善が見られます｡ 注）PCR産物の3’末端にdA付加反応を行う場合には、PCR産物の精製を行わずに、そのまま次 の（２）3’末端のdA付加反応（p.4）へ進んでください（TArget CloneTM -Plus-をご使用の場合の み）。 注） PCR 産物の 精製に は 東洋紡DNA fragment 精製キ ッ ト “ MagExtractorTM -PCR ＆ Gel Cleanup-” （Code No.:NPK-601, 200回用）のご使用をお薦めします｡本キットを用いると、約 5分間でPCR産物の精製ができます｡ 3 （２）3’末端のdA付加反応 （TArget CloneTM -Plus-をご使用の場合） ＊dA付加反応を行わない場合は、次の（３）ライゲーション（P.5）へ進んでください。 ＊3’末端のdA付加反応は、可能な限り、ライゲーション反応の直前に行ってください。 Step1. KODシリーズで増幅したPCR産物9μｌを新しいチューブに分取します。 注）PCR産物は精製せずにそのままお使いください。もし、精製されたPCR産物をお使いの場合 には、最終濃度が1ｘ Taqバッファー、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTPsとなるように試薬を添加 して、以下の操作を継続してください。 Step2. 10x A-attachment Mixを1μｌ添加してよく撹拌します。 Step3. 60℃で10分間反応します。 注) 効率が低い場合には、反応時間を30分間まで延長させてください（ほとんどの場合は10分間 の反応で十分ですが、最大の付加効率は30分間の反応で得られます）。 Step4. 反応液の一部をライゲーション反応に使用します。 注）反応液は、使用まで氷上または低温（2～10℃）で保存してください。 4 （３）ライゲーション Step1. pTA2 Vector、2x Ligation Buffer、T4 DNA Ligaseのチュｰブを取り出します。 注）pTA2 Vector と2x Ligation Bufferは室温で溶解させた後、必ずスピンダウンを行い、直ちに 氷上に置いてください。特にpTA2 VectorのdＴ突出末端は不安定なので､室温で長時間放置 することは避けてください｡また､凍結融解の繰り返しも出来るだけ避けるようにしてください（凍 結融解10回までは、ほとんど性能劣化が認められません）。 Step2. 以下の内容でライゲｰション液を調製します｡ 組成 ライゲｰション液 滅菌蒸留水 チェック （3-X）μｌ 2x Ligation Buffer pTA2 Vector（50ng/μl） 5 μｌ PCＲ産物（クロｰニングの対象） X μｌ T4 DNA Ligase 1 μｌ 1 μｌ 10 μｌ 注）PCR産物の濃度、純度、サイズ、DNA配列等により至適な液量は異なりますが､モル比として pTA2 Vector ： PCR産物を１：３以上の比になるようにすると、一般的によい結果が得られま す。pTA2 Vectorの濃度は50ng/μl、サイズは約3.0kbなので､次式で求められるXμl以上の PCR産物を使用してください。 X = ５０ Y ÷ Z （Ykb：PCR産物のサイズ、Z ng/μl：PCR産物濃度） 例) 20ng/μl のPCR産物（0.5kb）を、モル比でpTA2 Vector ： PCR産物 = 1 ： 3となるように 添加するには、50 ｘ 0.5 ÷ 20 = 1.25μｌ 必要と計算できます。PCR産物量が少ないとクロ ーニング効率が下がります。ご注意ください｡ Step3. ライゲｰション液を室温（15～25℃）で30分間、反応させます｡ 注）短いDNA断片（2kb以下が目安）をライゲーションする場合には、5分間の反応で十分なクロー ニング効率が得られます。 また、反応時間をさらに伸ばすことによって、クローニング効率が向上することがあります。一 晩（12～18時間程度）反応させる場合には、4℃で反応させてください。 5 （４）形質転換 ＊ここでは東洋紡コンピテントセル（Competent high JM109（Code No.：DNA‐900）、Competent high DH5α（Code No.：DNA‐903）など）を使用する場合の標準的な手順を示します。詳細につい ては、製品添付の取扱い説明書をご参照ください。 Step1. Competent Cell（100μｌ）を氷中にて融解します。 Step2. ライゲｰション液を10μｌ加えて混合し､氷中にて30分間放置します。 Step3. 42℃、30秒間ヒｰトショックした後､氷中で2分間冷却します｡ Step4. SOC培地を900μｌ加えて混合し､37℃で1時間振とう培養します。 Step5. LB/アンピシリン/IPTG/X-galプレートに適量をまき、37℃で1晩培養して青/白コロニｰ 判定にて白コロニｰを組換え体の候補として選択します。 注）複数のプレートに20～100μlずつまくことをお勧めします。 以下に本キットの使用例をお示しします。ご参考ください。 クローニング効率 クローン数 100 500bp産物 (%) 80 C l o nCloning i n g e f f i cefficiency ie n cy(% ) 90 70 1kb産物 2kb産物 PCR産物 60 ｒTaq産物 50 (TAK-101使用) 40 KOD-Plus産物 30 (TAK-201使用) 20 挿入DNA 500bp 1kb 2kb 10,400 4,700 1,800 8,950 4,300 2,230 10 ライゲーション反応条件：24℃，5 分間 物 物 産 D O aq コンピテントセル：E.coli DH5α（1 x 109 cfu/μg） K rT D 産 産 物 物 産 O aq rT K 産 D KO rT aq 産 物 物 0 （rTaq 産物：TAK-101 使用、KOD 産物：TAK-201 使用） 6 （５）組換え体の確認 コロニーダイレクトPCR 目的とするDNA断片が組み込まれた組換え体を確認する最も簡便な方法は､大腸菌が持つ プラスミドのインサｰトサイズをコロニｰダイレクトPCRにより推定する方法です｡特に､東洋紡 のコロニｰダイレクトPCR用Premix試薬“Insert Check -Ready-”（Code No.：PIK-101）を使 用すれば、短時間（2～４時間）で簡単に目的とする組換え体の確認ができます。 ここでは、Insert Check -Ready- を使用する場合の標準的な手順を示します。詳細について は、製品添付の取扱い説明書をご参照ください。 ＜Insert Check -Ready- （Code No.：PIK-101）の使用法＞ Step1. 融解したInsert Check -Ready- をPCR用チュｰブに50μlずつ分注します｡ Step2. 爪楊枝またはチップでコロニｰを軽く突き､レプリカ用のプレｰトに爪楊枝またはチップ の先端を突き刺します（レプリカしたプレｰトは37℃で培養します）。 Stcp3. 爪楊枝またはチップの先端をPCR用チュｰブに入れ､すすぎます。 Step4. 必要に応じてミネラルオイルを加え、蓋をして､サｰマルサイクラｰにセットしてPCRを 行います｡ Step5. PCR終了後､Loading Dyeを添加し、各反応液の一部をそのままゲルにアプライし､電 気泳動を行います｡電気泳動の結果からポジティブクロｰンの判定を行います｡ ＊この後、目的とするDNA断片が挿入されたプラスミドDNAを分離するには、レプリカプレｰト上の当 該クローンを液体培養し､そこからプラスミドDNAを抽出してください｡プラスミドDNAの抽出には東 洋紡プラスミドDNA抽出キット“MagExtractorTM -Plasmid-”をお薦めします。 Insert Check -Ready- 従 来 までの 確 認 法 コロニ ー が 出 た プ レー ト コロニ ー が 出 た プ レ ー ト コロニ ー か ら の 液 体 培 養 (Overnight) ・培 地 の 準 備 ・コロニ ー の Pick up ・インキ ュベ ー ション PCR(1～ 1.5hr.) ・分 注 操 作 ・コロニ ー の Pick up ・反 応 サ イ クル の 実 施 Mini Prepに よるプ ラス ミド抽 出 (1.5hr..) ・集 菌 操 作 ・溶 菌 操 作 ・RNase処 理 ・除 蛋 白 質 操 作 制 限 酵 素 に よる切 断 (0.5～ 1.5hr..) ・分 注 操 作 ・インキ ュベ ー ション 電 気 泳 動 (1hr.) 電 気 泳 動 (1hr.) 7 [４] ベクターの配列情報 （１）pTA2 VectorのMap Ampr KpnⅠ T T SacⅠ lac promoter （２）マルチクローニングサイト周辺の塩基配列 BssH II Apa I Hinc II Dra II Acc I Bsp106 I Kpn I EcoO109 I Xho I Sal I Cla I Hind III EcoR V T7 Promoter KS primer binding site T7 primer binding site M13-20 primer binding site 5’ TTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATAT 3’ AACATTTTGCTGCCGGTCACTCGCGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCGCTTAACCCATGGCCCGGGGGGGAGCTCCAGCTGCCATAGCTATTCGAACTATA EcoR I Pst I Sma I BamH I Spe I Xba I Not I BstX I Sac II Sac I Eag I EcoR I CGAATTCCCAATACT3’ GTATTGGGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCC (cloned insert) 3’ TCATAACCCTTAAGGACGTCGGGCCCCCTAGGTGATCAAGATCTCGCCGGCGGTGGCGCCACCTCGAGG GCTTAAGGGTTATG SK primer binding site BssH II AGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC 3’ TCGAAAACAAGGGAAATCACTCCCAATTAACGCGCGAACCGCATTAGTACCAGTATCGACAAAGG 5’ T3 primer binding site T3 Promoter M13 Reverse primer binding site β-gal α-fragment 8 f1 (–) origin 21– 327 β-galactosidase α-fragment 460– 836 multiple cloning site 653– 780 lac promoter 837– 958 pUC origin 1178– 1845 ampicillin resistance ( bla ) ORF 1996– 2853 （３）pTA2塩基配列 （2981 bp） 1 CTGACGCGCC CTGTAGCGGC GCATTAAGCG CGGCGGGTGT 51 CGCAGCGTGA CCGCTACACT TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG 101 TTTCTTCCCT TCCTTTCTCG CCACGTTCGC CGGCTTTCCC 151 TAAATCGGGG GCTCCCTTTA GGGTTCCGAT TTAGTGCTTT 201 GACCCCAAAA AACTTGATTA GGGTGATGGT TCACGTAGTG 251 CTGATAGACG GTTTTTCGCC CTTTGACGTT GGAGTCCACG 301 GTGGACTCTT GTTCCAAACT GGAACAACAC TCAACCCTAT 351 TCTTTTGATT TATAAGGGAT TTTGCCGATT TCGGCCTATT 401 TGAGCTGATT TAACAAAAAT TTAACGCGAA TTTTAACAAA 451 TTACAATTTC CATTCGCCAT TCAGGCTGCG CAACTGTTGG 501 CGGTGCGGGC CTCTTCGCTA TTACGCCAGC TGGCGAAAGG 551 GCAAGGCGAT TAAGTTGGGT AACGCCAGGG TTTTCCCAGT 601 TAAAACGACG GCCAGTGAGC GCGCGTAATA CGACTCACTA 651 TGGGTACCGG GCCCCCCCTC GAGGTCGACG GTATCGATAA 701 GAATTCCCAA TAC*GTATTGGGAATTCCTGC AGCCCGGGGG 751 TCTAGAGCGG CCGCCACCGC GGTGGAGCTC CAGCTTTTGT 801 GAGGGTTAAT TGCGCGCTTG GCGTAATCAT GGTCATAGCT 851 TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AACATACGAG 901 AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC 951 CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC 1001 CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC 1051 CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC 1101 GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT 1151 TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC 1201 CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT 1251 CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG 1301 CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA 1351 GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG 1401 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG 1451 AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC 1501 CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT 1551 ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC 1601 ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT 1651 GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC 1701 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG 1751 CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC 1801 GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT 1851 CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT 1901 TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA 1951 TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC 9 GGTGGTTACG CTCCTTTCGC CGTCAAGCTC ACGGCACCTC GGCCATCGCC TTCTTTAATA CTCGGTCTAT GGTTAAAAAA ATATTAACGC GAAGGGCGAT GGGATGTGCT CACGACGTTG TAGGGCGAAT GCTTGATATC ATCCACTAGT TCCCTTTAGT GTTTCCTGTG CCGGAAGCAT ACATTAATTG GTGCCAGCTG GTATTGGGCG GTTCGGCTGC ATCCACAGAA AGCAAAAGGC AGGCTCCGCC GTGGCGAAAC GCTCCCTCGT TCCGCCTTTC TAGGTATCTC ACGAACCCCC CTTGAGTCCA TGGTAACAGG TGAAGTGGTG TGCGCTCTGC ATCCGGCAAA AGCAGATTAC TCTACGGGGT GGTCATGAGA AATGAAGTTT AGTTACCAAT 2001 2051 2101 2151 2201 2251 2301 2351 2401 2451 2501 2551 2601 2651 2701 2751 2801 2851 2901 2951 GCTTAATCAG ATAGTTGCCT ACCATCTGGC CTCCAGATTT AGTGGTCCTG GGAAGCTAGA CCATTGCTAC TTCAGCTCCG GTGCAAAAAA AGTTGGCCGC CTTACTGTCA AACCAAGTCA CGGCGTCAAT CTCATCATTG GCTGTTGAGA CAGCATCTTT CAAAATGCCG CATACTCTTC TCATGAGCGG GTTCCGCGCA TGAGGCACCT GACTCCCCGT CCCAGTGCTG ATCAGCAATA CAACTTTATC GTAAGTAGTT AGGCATCGTG GTTCCCAACG GCGGTTAGCT AGTGTTATCA TGCCATCCGT TTCTGAGAAT ACGGGATAAT GAAAACGTTC TCCAGTTCGA TACTTTCACC CAAAAAAGGG CTTTTTCAAT ATACATATTT CATTTCCCCG ATCTCAGCGA CGTGTAGATA CAATGATACC AACCAGCCAG CGCCTCCATC CGCCAGTTAA GTGTCACGCT ATCAAGGCGA CCTTCGGTCC CTCATGGTTA AAGATGCTTT AGTGTATGCG ACCGCGCCAC TTCGGGGCGA TGTAACCCAC AGCGTTTCTG AATAAGGGCG ATTATTGAAG GAATGTATTT AAAAGTGCCA ＊3’末端にdTが付加されている部分 10 TCTGTCTATT ACTACGATAC GCGAGACCCA CCGGAAGGGC CAGTCTATTA TAGTTTGCGC CGTCGTTTGG GTTACATGAT TCCGATCGTT TGGCAGCACT TCTGTGACTG GCGACCGAGT ATAGCAGAAC AAACTCTCAA TCGTGCACCC GGTGAGCAAA ACACGGAAAT CATTTATCAG AGAAAAATAA C TCGTTCATCC GGGAGGGCTT CGCTCACCGG CGAGCGCAGA ATTGTTGCCG AACGTTGTTG TATGGCTTCA CCCCCATGTT GTCAGAAGTA GCATAATTCT GTGAGTACTC TGCTCTTGCC TTTAAAAGTG GGATCTTACC AACTGATCTT AACAGGAAGG GTTGAATACT GGTTATTGTC ACAAATAGGG . （４）制限酵素切断部位 制限酵素 切断部位数 Acc65I AccI AflIII AhdI Alw44I AlwI 1 1 1 1 2 10 AlwNI ApaI ApoI AvaI AvaII BamHI BanI BanII BciVI BfaI 1 1 3 2 2 1 4 3 2 6 BglI BpmI BsaAI BsaHI BsaI BsaJI 2 2 1 1 1 6 BsaWI BseMII BsiEI 3 4 6 BsiHKAI BslI 4 8 BsmAI Bsp120I Bsp1286I 2 1 6 BspHI BspLU11I BsrBI BsrDI BssHII BssSI BstF5I BstXI Cfr10I ClaI Csp6I 2 1 5 2 2 2 4 1 2 1 2 切断箇所 653 674 1173 2061 1487, 739, 1911, 1584 659 417, 668, 2204, 739 193, 159, 1382, 81, 2256 466, 778, 232 2602 2133 575, 1333 1379, 1448, 497, 2582 775, 9, 1207, 2133, 659 159, 2733 1893, 1173 88, 2120, 619, 1346, 542, 764 129, 683 654, 2733 740, 1924, 1740, 2388, 1814, 2691, 1826 2709 428, 733 2426 701 653, 659, 2909 746, 917, 775 2014 752, 1668, 1921 733, 734, 767, 912 1526, 1857, 758, 2357 2023, 1086, 2563 1510, 2433 1487, 335, 1373, 2898 2648, 664, 1652 2733 1015, 1189 659, 775, 1487, 2648 863, 1104, 2905 2227, 2514 2180 2151 2901 755, 2302 812 2730 2046, 2146 2545 11 DdeI DraI DraIII DrdI DsaI EaeI EarI Ecl136II Eco52I Eco57I EcoO109I EcoRI EcoRII EcoRV FauI FokI FspI HaeII HgaI HincII HindIII HinfI 4 3 1 2 1 4 3 1 1 2 1 2 5 1 5 4 2 4 4 1 1 8 HphI 6 KpnI MaeII 1 8 MboII 8 MslI MspA1I 4 6 MvaI NaeI NciI 5 1 6 NgoMIV NlaIII 1 8 NotI NspI PleI 1 1 6 Psp1406I PstI PvuI PvuII RsaI SacI SacII SalI 2 1 2 2 2 1 1 1 1448, 1930, 232 275, 767 609, 511, 775 758 1700, 659 701, 575, 695 33, 542, 477, 75, 3, 674 689 282, 1148, 222, 2781 653 123, 1876, 103, 2669, 765, 527, 2699 575, 129 657, 2599 129 828, 2473, 757 1173 282, 2061 2291, 727 497, 527, 654, 775 767 674 1857, 1949, 2023, 2641 2563 1012, 2855 2454 1200, 1321, 1334 87, 2046, 2286 83, 1275, 505, 2227, 965, 2514 1022 1047, 1853, 1417 2603 304, 1544, 1917, 632, 2061 2144, 1008, 1073 2540, 2766 233, 2292, 512, 2747, 2314, 767, 276, 2665 1052, 2856 2473, 995, 288, 595 1823, 1914 2832 1513, 1758 912, 1200, 1321, 1334 733, 734, 1552, 2248 1174, 2509, 1894, 2902 2385, 2395 304, 632, 1073, 1544 1275 758, 1051, 2748 721, 912, 2664 2433 995 2545 12 SapI Sau96I 1 8 ScaI SchI 1 6 SfaNI SfcI 4 6 SmaI SmlI SpeI SspI TaaI 1 5 1 2 8 TaiI 8 TaqI 7 TatI TfiI Tsp45I TspRI 1 2 4 10 VspI XbaI XhoI XhoII 3 1 1 7 XmaI XmnI 1 1 1050 240, 2187, 2544 282, 2061 1261, 11, 2307 733 668, 745 440, 258, 1676, 123, 1876, 199, 1273, 2544 1008, 57, 613, 1859, 943, 751 668 739, 2691, 733 2661 507, 2204, 659, 2426 660, 2108 304, 632, 1073, 1544 2313, 638, 2523, 727, 2753 1438, 1629 1279, 1541, 1818, 2686 2868 483, 1989, 233, 2292, 669, 2717 678, 2504 276, 2665 675, 1135, 1206 288, 595 684, 699 2323, 1069, 2113, 2237 2534 1575, 2460, 1588 2487 1825, 1911, 1923 1148 589, 960, 2008, 1002, 1814, 2708 ＊１－１０ヵ所の切断部位を持つ制限酵素についてまとめています。 切断部位の無い制限酵素 AatII BbeI BlnI BsgI BspMI BstEII EheI MscI NheI Ppu10I SbfI SnaBI SwaI AccIII BbsI Bpu10I BsiWI BsrGI Bsu36I FseI MunI NruI PpuMI SexAI SphI Tth111I AflII BbvCI Bpu1102I BsmBI Bst1107I Eco47III HpaI NarI NsiI PshAI SfiI SrfI Van91I 13 AgeI BclI BsaBI BsmFI BstAPI Eco72I KasI NcoI PacI RsrII SgfI StuI XcmI AscI BglII BseRI BsmI BstBI EcoNI MluI NdeI PmeI SanDI SgrAI StyI [５] トラブルシュｰティング トラブル 考えられる原因 コロニｰが得られ コンピテントセルの 能力が不足している ない プレートの抗生物質 濃度が高すぎる コメント ・10 cfu/μg-pBR322 以上の形質転換効率を 持ったコンピテントセルをご使用ください。 8 ・プレ－トに終濃度50－100μg/mlのアンピシ リンを入れてください。 コロニｰがプレー プレｰトの抗生物質 ・プレ－トに50－100μg/mlのアンピシリンを入 ト一面に出る 量が不足している れてください（アンピシリンを含むプレートは 4℃で約1ヶ月保存できます）。 ・Taqポ リ メ ラ ー ゼ ､ Tthポ リメ ラ ーゼ以外の 白コロニーがほと PCR 産物中に 3’-dA-overhangs が んど得られない DNAポリメラーゼをご使用の際は、3’-dA付加 少ない あるいは 活性があることをご確認ください。 ・Taqポリメラーゼ､Tthポリメラーゼをご使用の 白コロニーが かなり少ない 際も、PCR産物の3’-dA-overhangsを確実に 起こすためにPCRの最後のステップで72℃、 5-10分の伸長反応を追加してください。 ・3’-dA-overhangsは不安定なので､PCR産物 はPCR後すぐに使用するか-20℃で保存し､ 室温での放置は避けてください。 ・10x A-attachment MixによるdA付加反応 は、KODシリーズで増幅されたPCR産物の みに対応しています。その他のPCR酵素で増 幅されたPCR産物に対してdA付加反応を行 う場合には、あらかじめ、PCR産物を精製し てからdA付加反応を実施してください（p.4参 照 ） 。 PCR 産 物 の 精 製 に は 東 洋 紡 DNA fragment精製キット“MagExtractorTM -PCR ＆Gel Clean up-”をお薦めします。 ベクターのdＴ突出末 ・pTA2 Vectorの室温での放置や凍結融解は、 端が分解している できるだけ避けてください。 ライゲーション反応 ・ライゲーション反応時間を30分以上2時間ま の時間が短い で延ばしてください。または、4℃で一晩（12 ～18時間程度）反応を行ってください。 反応温度が高すぎる ・反応温度は25℃以下で行ってください。25℃ を超えると白コロニーの取得効率が低下しま す。 14 白コロニーがほと 挿入DNAの濃度が ・挿入ＤＮＡの濃縮を行なってください。 んど得られない 低い ・ベクター使用量を1/2～1/5に調節してライゲ あるいは ーション反応を行ってください。 白コロニーが PCR産物量が不足し ・PCR産物の濃度、純度、サイズ、ＤＮＡ配列 かなり少ない ている 等により至適な液量は変わりますが、モル比 として、pTA2 ： PCR産物 = １ ： 3 以上に なるようにしてください。 PCR産物に含まれる ・PCR産物の精製を行ってください。PCR産物 きょう雑物の持込み の精製には東洋紡DNA fragment精製キット により、TAライゲー “MagExtractorTM -PCR＆Gel Clean up-”を ション反応が阻害さ お薦めします。 れている PCR産物へのUVの ・PCR産物をゲルから切出す時にはUVの過照 過照射によりピリミジ 射にご注意ください。PCR産物の確認は長波 ンダイマーが形成し 長のUV光源を用いることをお薦めします。 ている PCR 産 物 が 挿 入 さ ・薄い青コロニーをチェックすることにより組換 れてもlacZが発現し え体が得られることがあります。 ている ほ と ん ど 或 は 全 IPTG、 X-gal が低 ・LB/アンピシリン/IPTG/X-galプレートの性能を 濃度で青/白コロニー 部が白コロニー ご確認ください。また、アンピシリン、IPTG、 の判定ができていな X-galの使用濃度を再確認してください。 い 白コロニーを拾っ 目的とする断片の増 ・ライゲーションに使用するPCR産物の液量を ても、目的の長さ 幅量が少ない 増やしてください。本製品は最大3μlのPCR の 断片が 挿入さ 産物を使用することができます。 れていない ・目的とする断片が特異的に増幅されるよう、 PCR条件を検討してください。 PCR産物にプライマ ・PCR産物の精製を行ってください。PCR産物 ーダイマーが多く含 の精製には東洋紡DNA fragment精製キット まれている “MagExtractorTM -PCR＆Gel Clean up-”を お薦めします。本キットは、プライマーダイマ ーなどの短鎖DNA（およそ50bp以下）の除去 に有効です。 ・コロニーダイレクトPCRを利用して、目的の長 さの断片が含まれるコロニーを選別してくださ い。 15 [６] 参考資料 （１）ご用意いただく培地、試薬の組成 ① LB培地 10g bacto-tryptone、 5g bacto-yeast extract、 10g NaCｌを1Lの蒸留水で溶解し､NaOH でpH7.2に調製する｡ ② LB/アンピシリンプレート LB培地調製後、15gの寒天末を加えてオｰトクレｰブする｡約50℃程度になってから､アンピ シリンを終濃度100μg/mlとなるよう加え､シャｰレに適量流し込み､寒天末を固める｡ ③ 100mM IPTG 0.24g IPTGを蒸留水に溶解し、終量10mlとする｡フィルタｰ滅菌後､-20℃にて保存する｡ ④ 4% X-gal 0.4g X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside）をN,N-dimethyl- formamideに 溶解し､終量10mlとする｡-20℃にて遮光保存する｡ ⑤ LB/アンピシリン/IPTG/X-galプレート LB/アンピシリンプレートに100mM IPTG、 4% X-galを各20μl塗布して､乾燥させる｡ 16 （２）関連商品 品 名 内 容 Code No. 25μl （25 回用） TAK-301 T4 DNA Ligase 400U×1 本 LGA-111 rTaq DNA Polymerase ＜Mg 別添タイプ＞ 250U×1 本 TAP-201 rTaq DNA Polymerase ＜Mg 含有タイプ＞ 250U×1 本 TAP-211 rTth DNA Polymerase 250U×1 本 TTH-301 KOD FX 200U×1 本 KFX-101 KOD -Plus- 200U×1 本 KOD-201 KOD -Plus- Ver.2 200U×1 本 KOD-211 KOD Dash 250U×1 本 LDP-101 250U×1 本 BTQ-101 250U×1 本 BTQ-201 500 回用 NPK-301 200 回用 NPK-601 １台 MGS-101 100μl×10 本 DNA-903 1ml×5 本 PIK-101 10 x A-attachment mix ® Blend Taq ® Blend Taq -PlusTM MagExtractor -Plasmid- <磁性ビーズを利用した Plasmid DNA 精製キット> MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up<磁性ビーズを利用した DNA ｆragment 精製キット> Magical Trapper <磁性ビーズ分離用スタンド> Competent high DH5α <大腸菌 DH5αコンピテントセル、SOC 培地付> Insert Check -Ready<E.coli コロニーダイレクト PCR 用 Premix 試薬 > 17 【製造・販売元】 －納期・注文に関するお問い合わせ－ 東洋紡株式会社 ライフサイエンス事業部 (大阪) 〒530-8230 大阪市北区堂島浜二丁目 2 番 8 号 TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833 E-mail : [email protected] 東洋紡株式会社 ライフサイエンス事業部 (東京) 〒104-8345 東京都中央区京橋一丁目 17 番 10 号 住友商事京橋ビル TEL 03-6887-8819 FAX 03-6887-8951 E-mail : [email protected] －製品の内容・技術に関するお問い合わせ－ テクニカルライン TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833 開設時間 9:00～12:00 , 13:00～17:00 (土、日、祝を除く) E-mail : [email protected] ［URL］ http://www.toyobo.co.jp/bio -0-
