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Transdirect.book 1 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 292-30011B Feb. 2007 取扱説明書 この文書をよく読んで正しくご使用ください。 いつでも使用できるように大切に保管してください。 Transdirect.book ii ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 保証について こ のたびは本製品を ご購入いただ き ま し て あ り が と う ご ざい ます。 本製品に対 し 、 下記の保証を し てお り ます。 保証内容を よ く お読みにな り 本 製品を ご使用 く だ さ い。 ･ 保証期間 有効期限は、 試薬キ ッ ト 外袋に記載 し てい ます。 有効期限以内にご使用 く だ さ い。 ･ 保証内容 取扱説明書に記載 し た品質を保証 し ます。 ただ し お客様所有の遺伝子か ら タ ンパ ク 質が合成 し 得 る こ と を保証す る も のではあ り ません。 保証期間内 に品質に異常があ っ た場合は、 製品の代替を無償 でいた し ます。 ･ 保証で き ない事項 保証期間内に品質に異常があ っ た場合で も 、 下記 に該当す る 場合は保証の対象か ら 除外 さ せていた だ き ます。 (1) 誤っ てお取 り 扱いにな ら れた場合 (2) 保存方法が不適切な場合 (3) 異常の原因が本製品以外の理由に よ る 場合 注記 有効期限を過ぎた も のを ご使用にな っ た場合、 本来の合成能が 得ら れない可能性があ り ます。 ご注意 く だ さ い。 使用目的について ･ 本製品は研究用試薬です。 本製品の研究目的以外の使用にあ た っ ては、 別 途 ラ イ セ ン ス契約を結ぶ必要があ り ます。 ･ 本製品に よ り 合成 し た タ ンパ ク 質を商品化す る 場合は、 別途 ラ イ セ ン ス契 約を結ぶ必要があ り ます。 おこ とわり ･ 本書の著作権は、 株式会社 島津製作所 が所有 し てい ます。 当社の許可 な く 内容の一部ま たは全部を転載 ・ 複製す る こ と はおやめ く だ さ い。 ･ 本書の内容は改良のため、 将来予告な く 変更す る こ と があ り ます。 ･ 本書の内容は作成にあ た り 万全を期 し てお り ますが、 万一誤 り や記載 も れ な ど が発見 さ れて も 、 ただちに修正で き ない こ と があ り ます。 2004-2007 Shimadzu Corporation. All rights reserved. ii Transdirect.book iii ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 警告表示について こ の取扱説明書では、 注意事項を危険や損害の大 き さ に応 じ て、 次の表示で 区分 し てい ます。 警告 その事象を避けなければ、 死亡ま たは重傷に至る可能性のあ る場合 に用いています。 注意 その事象を避けなければ、 軽傷ま たは中程度の傷害を負 う 可能性の あ る場合、 およ び物的損害の可能性のあ る場合に用いています。 注記 試薬を正 し く ご使用 し ていただ く ための情報を記載 し ています。 ※ ※ 軽傷ま たは中程度の傷害 と は、 治療に入院や長期の通院を要 さ ない 場合を示 し ています。 物的損害 と は、 家屋 ・ 家財な ど製品以外の周辺の物におよぼす拡大 損害を示 し ています。 安全にお使いいただ く ために 本製品を安全にお使いいただ く ために、 次の こ と をお守 り く だ さ い。 警告 一般に合成 さ れた タ ンパ ク 質やペプ チ ド が予期で き ない毒性や病原 性を有す る おそれがあ り ます。 実験操作を行 う 場合は、 手袋、 ゴー グル、 マス ク およ び安全キ ャ ビ ネ ッ ト な どの安全器具や装置を正 し く 使用 し て く だ さ い。 生成物を廃棄す る場合は、 オー ト ク レ ーブ な どの不活性化処理を確実に行 っ て く だ さ い。 警告 万一試薬や反応液、 生成物な どが目や皮膚に付着 し た場合、 飲み込 んだ り 吸い込んだ り し た場合は、 すみやかに医師に相談 し 、 その指 示に従 っ て く だ さ い。 注意 実験室での一般的注意事項を厳守 し 、 安全に留意 し て く だ さ い。 注意 ラ ジ オア イ ソ ト ープ （RI） を用いた実験は、 専用の RI 実験施設内で 行 う 必要があ り ます。 RI を取扱 う 場合には、 国や自治体、 所属する 施設な どの定める法律、 省令お よび規則に従 っ て く だ さ い。 ･ 未使用や使用残 り の試薬を取扱 う 際には、 MSDS を参考に し て く だ さ い。 iii は じ め に Transdirect.book iv ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 目 次 は じ めに ...........................................................................................................................ii 製品内容 ...........................................................................................................................1 概要 ....................................................................................................................................................... 1 構成 ....................................................................................................................................................... 1 Insect Cell Extract （黄） について .................................................................................................... 2 準備する も の.................................................................................................................................... 2 機器および器具類...................................................................................................................................... 2 試薬類............................................................................................................................................................... 2 ご使用にあた っ て .......................................................................................................................... 3 フ ローチ ャ ー ト ............................................................................................................................... 3 プ ロ ト コ ル ......................................................................................................................4 In vitro タ ンパク 質合成用の DNA テ ン プ レ ー ト の調製............................................. 4 pTD1 Vector................................................................................................................................................... 4 目的遺伝子の挿入位置について ........................................................................................................ 5 発現プ ラ ス ミ ド の構築............................................................................................................................ 6 mRNA の調製 .................................................................................................................................... 7 DNA テ ン プ レー ト の直鎖化 ................................................................................................................. 7 mRNA の合成 ................................................................................................................................................ 8 mRNA の精製 ................................................................................................................................................ 8 mRNA 濃度測定 .........................................................................................................................................10 タ ンパク質合成反応...................................................................................................................11 標準反応プ ロ ト コル...............................................................................................................................11 標識反応プ ロ ト コル...............................................................................................................................13 RI 標識 し た タ ンパ ク質の検出...........................................................................................................14 蛍光標識 し た タ ンパ ク質の検出 ......................................................................................................14 β- ガ ラ ク ト シダーゼ コ ン ト ロール反応....................................................................................14 β- ガ ラ ク ト シダーゼの検出 ............................................................................................................15 付録 .................................................................................................................................. 17 ト ラ ブルシ ュ ーテ ィ ン グ .........................................................................................................17 参考文献............................................................................................................................................19 MSDS の請求について ...............................................................................................................19 お問い合わせ窓口........................................................................................................................19 iv Transdirect.book 1 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 製品内容 概要 Transdirect insect cell は、 昆虫培養細胞抽出液を用いた無細胞 タ ンパ ク 質合成試薬 キ ッ ト です。 以下の特徴があ り ます。 ･ あ ら か じ め調製 し た mRNA よ り 、 生細胞を用いる こ と な く 翻訳反応を行 う こ と が で き ます。 ･ バキ ュ ロウ イルス を用いた組み換え タ ンパク 質生産に も 広 く 利用 さ れている Sf21 昆虫細胞 （Spodoptera frugiperda 卵巣細胞由来） の抽出液を使用 し ています。 ･ タ ンパク 質合成能を高める ために、 抽出方法を工夫 し 、 反応液組成を最適化 し て います （特許出願中）。 ･ 昆虫培養細胞抽出液を用いた無細胞 タ ンパク 質合成に適する翻訳促進配列 (Malacosma neustria nucleopolyhedrovirus 由来ポ リ へ ド リ ン遺伝子の 5' 非翻訳領域 ) を有する発現ベ ク タ ーが付属 し ています （特許出願中）。 構成 本製品 (P/N 292-30000-91) は、 表 1 に示す各試薬 と 取扱説明書 ( 本書 : P/N 29230011) で構成 さ れてい ます。 表 1 ： 試薬 （50 μL 反応系で 40 回相当分） フ タ色 ラ ベル （品名） 容量 本数 保存条件 備考 黄 Insect Cell Extract 210 μL 5 本 -80 ℃ 細胞抽出液 青 Reaction Buffer 630 μL 1 本 -80 ℃ 緩衝液、 19 種ア ミ ノ 酸 （－ メ チオニ ン）、 エネルギー源等 赤 4 mM Methionine メ チオニ ン （ア ミ ノ 50 μL 1 本 -20 ℃以下 酸） 緑 0.5 μg/μL pTD1 Vector 10 μL 1 本 -20 ℃以下 発現ベ ク タ ー 白 0.5 μg/μL Control DNA β- ガ ラ ク ト シ ダー 10 μL 1 本 -20 ℃以下 ゼ遺伝子を pTD1 に 組込み直鎖化 し た コ ン ト ロール DNA 注記 ･ 本製品には転写用試薬が含まれてい ません。 別途ご準備 く だ さ い。 ･ Insect Cell Extract （黄） お よび Reaction Buffer （青） は、 製品到着 後、 すみやかに -80 ℃で保存 し て く だ さ い。 保存状態に よ り 合成能 が失われる こ と があ り ますので ご注意 く だ さ い。 ･ 4 mM Methionine （赤）、 0.5 μg/μL pTD1 Vector （緑）、 0.5 μg/μL Control DNA （白） は、 -20 ℃以下 （-80 ℃で も 可） で保存 し て く だ さ い。 ･ 本製品は、 【35S】 Methionine に よ る効率的な RI 標識のために メ チオ ニ ン を Reaction Buffer （青） 中には含めず、 別途添付 と し ています。 1 製 品 内 容 Transdirect.book 2 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 準備する も の Insect Cell Extract （黄） について (1) 異な る Lot No. の試薬を混合 し て使用 し ないで く だ さ い。 タ ンパク 質合成能が低 下する場合があ り ます。 (2) Lot 間で タ ンパク 質合成能が異な る場合があ り ます。 (3) Insect Cell Extract は CO2 によ り 劣化するおそれがあ り ます。 製品開封後は、 CO2 への極端な暴露はお避け く だ さ い。 Lot No. 図 1 ： Lot No. 凍結融解 Insect Cell Extract （黄） の凍結 と 融解の繰 り 返 し は、 8 回以内 と し て く だ さ い。 融解は必ず氷上で行っ て く だ さ い。 融解後はす ぐ に使用 し 、 使用後はすみやかに -80 ℃で保存 し て く だ さ い。 準備する も の 機器および器具類 ･ ･ ･ ･ ･ ･ 恒温槽 （25 ℃お よび 37 ℃に調節可能な もの） 分光光度計 ピペ ッ タ ー 滅菌済みのチ ッ プ、 チ ュ ーブ デ ィ スポーザブル手袋 デ ィ スポーザブルゲルろ過カ ラ ム （必要に応 じ て） 試薬類 ･ 大量 mRNA 合成キ ッ ト （T7） ･ 滅菌蒸留水 ･ 直鎖化に用い る制限酵素 （Hind III、 Not I な ど） ･ TE ･ 3M 酢酸カ リ ウム (pH5.5) ･ TE 飽和 フ ェ ノ ール ･ ク ロ ロ ホルム ･ エ タ ノ ール ･ 70% エ タ ノ ール 2 Transdirect.book 3 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 ご使用にあた っ て ご使用にあ た っ て、 以下の点について ご留意 く だ さ い。 (1) タ ンパ ク質の種類によ っ ては合成で き ない場合があ り ます。 (2) 本製品のみでは、 N- グ リ コ シル化な どの小胞体膜を介 し た翻訳後修飾は起こ り ま せん。 上記翻訳後修飾の解析には市販のイ ヌ すい臓 ミ ク ロ ソ ーム膜を添加 し て く だ さ い。 （推奨品 ： Promega 社 Code No.Y4041） フ ローチ ャ ー ト 目的遺伝子 pTD1 ベ ク タ ー ク ローニ ング 4 ページ 直鎖化－制限酵素 処理または PCR 7 ページ mRNA の合成 8 ページ mRNA の精製 8 ページ 発現プ ラ ス ミ ド 直鎖状 DNA mRNA Transdirect insect cell を用いた 11 ページ タ ンパ ク質合成反応 目的 タ ンパ ク質 3 製 品 内 容 Transdirect.book 4 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 In vitro タ ンパ ク質合成用の DNA テ ン プ レー ト の調製 プロ ト コル In vitro タ ンパ ク 質合成用の DNA テ ン プ レ ー ト の調製 pTD1 Vector pTD1 Vector は、 本製品を用いた タ ンパ ク 質合成を行 う ために至適化 さ れた ベ ク タ ーです （図 2）。 pTD1 Vector は mRNA 合成に必要な T7 プ ロ モー タ ー 配列、 タ ンパ ク 質合成反応を促進す る ポ リ ヘ ド リ ン 5' 非翻訳領域 ( ポ リ ヘ ド リ ン 5'UTR)、 マルチ ク ロ ーニ ン グサ イ ト （MCS） な ど、 mRNA の合成か ら タ ンパ ク 質合成に関わ るすべての因子を含んでい ます。 ま た ア ン ピ シ リ ン耐性遺伝子を含んでい ます。 形質転換体を培養す る 際はア ン ピ シ リ ン が 50 ～ 100 μg/mL と な る よ う に培地に添加 し て く だ さ い。 pTD1 Vector の全塩基配列は下記の DNA デー タ バン ク に登録 し てい ます。 DDBJ/GenBank®/EMBL Accession Number: AB194742 注記 pTD1 Vector 以外のプ ラ ス ミ ド から も タ ンパク 質合成を行 う こ と は可能ですが、 タ ンパ ク質合成量が減少するおそれがあ り ま す。 pTD1 Vector に目的遺伝子を ク ローニ ングする こ と を推奨 し ます。 また pTD1 ベ ク タ ーには、 翻訳促進配列であるポ リ ヘ ド リ ン 5'UTR が挿入 さ れているため、 mRNA 合成時にキ ャ ッ プ アナロ グを用いてキ ャ ッ プ構造を導入する必要はあ り ません。 表 2 ： pTD1 Vector における各領域の位置 240-258 259-304 305-343 359-731 736-757 758-805 835-1104 1992-2852 T7 RNA polymerase promoter Polyhedrin 5' untranslated region Multiple cloning region 3' Untranslated region PolyA region T7 transcription terminator ColE1 ori β-lactamase(Ampr)coding region 図 2 ： pTD1 Vector マ ッ プ 4 Transdirect.book 5 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 GCAGATTGTA CTGAGAGTGC Forward primer ACCATATGCG GTGTGAAATA AAAATACCGC ATCAGGCCTT AATACGACTC ACTATAGGAG T7 Promoter AAAATTAGAA AAATAAAATA TAAAGATATC GAATTCGAGC プロ ト コル CCGCACAGAT 付録 GCGTAAGGAG 220 TATTTTTATT CTTTCGTAAA Polyhedrin 5'UTR Sma I TCGGTACCCG GGGATCCTCT 280 340 Eco RV AGAGTCGGGC GGCTGTAAAA CACGATACAT Eco RI Sac I Kpn I TGTTATTAGT ACATTTATTA Bam HI Xba I AGCGCTAGAT 400 TCTGTGCGTT GTTGATTTAC Reverse primer 420 プ ロ ト コ ル 図 3 ： pTD1 Vector のマルチ ク ローニ ングサイ ト 付近の塩基配列 目的遺伝子の挿入位置について pTD1 Vector に目的遺伝子を ク ロ ーニ ン グす る と き は、 ポ リ ヘ ド リ ン 5'UTR の下流に目的遺伝子の開始 コ ド ン を挿入 し て く だ さ い。 ポ リ ヘ ド リ ン 5'UTR と 開始 コ ド ン の距離が長 く な る と 合成量が低下 し ます。 な るべ く Eco RV サ イ ト に挿入す る こ と を推奨 し ます。 ポ リ ヘ ド リ ン 5'UTR の直下に開始 コ ド ン を挿入す る 場合は、 PCR でポ リ ヘ ド リ ン 5'UTR が 3' 末端 と な る DNA を調製 し 、 そ こ に目的遺伝子の開始 コ ド ン を挿入 し て く だ さ い。 注記 PCR に関する特許は、 Hoffman-La Roche 社が保有 し てお り ま す。 本書の内容は、 PCR に関する特許の使用許諾を示唆する ものではあ り ません。 5 Transdirect.book 6 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 In vitro タ ンパ ク質合成用の DNA テ ン プ レー ト の調製 発現プ ラ ス ミ ド の構築 以下に、 Eco RV サ イ ト に目的遺伝子を挿入す る 場合の一般的な発現プ ラ ス ミ ド の構築方法を示 し ます。 1 目的遺伝子の ORF 部分 *1 を PCR*2 で増幅 し ます。 このとき N 末端側プライマーは、開始コドンからの配列としてください。 C 末端側プライマーは、平滑末端クローニングする場合を除き、挿入する 制限酵素サイトの配列を 5' 末端に導入してください。また制限酵素の種 類によっては、末端に付加配列がなければ切断できない場合があります。 制限酵素による効率的な切断を行うため、C 末端側プライマーの 5' 末端 に 2 塩基付加配列を導入することを推奨します。付加配列および制限酵素 サイトの後に終止コドン、またはそれよりも下流からはじまる配列として ください。 注記 *1 真核生物のゲ ノ ムから の PCR は、 イ ン ト ロ ン を含む場合が 考え ら れますので、 cDNA から PCR を行っ て く だ さ い。 *2 PCR によ る エ ラ ーを防ぐ ために Fidelity の高い酵素を お選び く だ さ い。 また、 開始コ ド ン を平滑末端ク ローニ ングする ため、 Terminal transferase 活性の少ない PCR 用酵素の使用 を推奨 し ます ( 例えば東洋紡績㈱ KODplus (Code No. KOD201) な ど )。 N 末端側プ ラ イ マー 5'- ATG ･･････････････ -3' ATG TGA 目的遺伝子の ORF ACT 3'- ･･･ ACT ･･･ CTTAAG GG-5' 制限酵素サイ ト （例えば Eco RI） 付加配列 （必要に応 じ て） C 末端側プ ラ イ マー 図 4 ： プ ラ イ マーの設計方法 2 3 4 5 6 PCR 産物を リ ン酸化 し ます。 PCR産物に導入 し た制限酵素サイ ト と 同 じ 制限酵素で PCR産物を消 化 し ます。 pTD1 Vector を挿入サイ ト であ る Eco RV と 目的遺伝子に導入 し た制 限酵素 と 同 じ 突出末端を も つ制限酵素で消化 し ます。 こ れら を用いて、 目的遺伝子を pTD1 Vector に挿入 し ます。 Transdirect.book 7 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 シー ク エ ン スによ り イ ンサー ト を確認する場合 注記 以下の配列プ ラ イ マーの使用を推奨 し ます。 （アニー リ ング温度 ： 50 ℃） ･ フ ォ ワー ド プ ラ イ マー （N 末端側） ： 5'-GCAGATTGTACTGAGAGTG-3' (161-179) ･ リ バース プ ラ イ マー （C 末端側） ： 5'-ACAACGCACAGAATCTAGC-3' (412-394) mRNA の調製 DNA テ ン プ レー ト の直鎖化 注記 ･ DNA テ ン プ レー ト は、 タ ー ミ ネー タ ー配列よ り 下流の制限 酵素 （例えば Hind Ⅲ , Not Ⅰ） を用いて直鎖化 し て く だ さ い。 制限酵素で直鎖化 し た後は、 RNase の コ ン タ ミ ネーシ ョ ン を防ぐ ために フ ェ ノ －ル / ク ロ ロ ホルム抽出、 エ タ ノ ール 沈殿を行 っ て く だ さ い。 ･ PCR によ り 直鎖状 DNA テ ン プ レー ト を調製する こ と も で き ます。 この場合 も フ ェ ノ －ル / ク ロ ロ ホルム抽出、 エ タ ノ ー ル沈殿を行 っ て く だ さ い。 以下の配列プ ラ イ マーの使用を推 奨 し ます。 （アニー リ ング温度 ： 50 ℃） 1) フ ォ ワー ド プ ラ イ マー （N 末端側） ： 5'-GCAGATTGTACTGAGAGTG-3' (161-179) 2) M13 系の リ バース プ ラ イ マー （C 末端側） ： 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (845-827) 表 3 ： pTD1Vector の直鎖化に適する制限酵素 制限酵素 Cfr 10I Eco 52I Eco T14I Hind III 切断位置 制限酵素 2145 806 769 813 Nde I Not I Pvu II Sca I Stu I 切断位置 183 805 994 2543 234 7 プ ロ ト コ ル Transdirect.book 8 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 mRNA の調製 mRNA の合成 準備する もの ･ 恒温槽 （37 ℃に保温可能な もの） 注記 ･ 以下のキ ッ ト で調製 し た mRNA を用いて、 タ ンパク 質が合 成で き る こ と を確認 し ています。 mRNA は各社の取扱説明書 に従っ て合成 し て く だ さ い。 ･ すべての操作は手袋を着用 し て く だ さ い。 表 4 ： 大量 mRNA 合成キ ッ ト （品名のアルフ ァ ベ ッ ト 順に記載） 品名 メ ーカー Code No. AmpliScribe T7-Flash TM Transcription Kit Epicentre 社 ASF3257 AmpliScribeTM T7 Transcription Kit Epicentre 社 AS3107 CUGA® 7 in vitro Transcription Kit ㈱ニ ッ ポン ジーン テ ク 304-14641 MEGA script® T7 High Yield Transcription Kit Ambion 社 1334 RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7 Promega 社 P1300 RNAMaxxTM High Yield Transcription Kit Stratagene 社 200339 ScriptMAXTM Thermo T7 Transcription Kit 東洋紡績㈱ TSK101 TM T7 RiboMAXTM Express Large Promega 社 Scale RNA Production System P1320 mRNA の精製 mRNA の精製方法は下記の 2 つがあ り ます。 再現性を高め安定 し た反応を必 要 と す る合成には、 塩 と 未反応 NTPs を ゲルろ過に よ り 除去す る A の方法を 推奨 し ます。 簡便に精製す る方法 と し て B の方法があ り ます。 こ の方法では未反応 NTPs が完全に除去 さ れないため、 見かけ上 mRNA 濃度が上昇 し ます。 最大の合成 量を得 る ためには、 最適な mRNA 添加量を検討す る こ と を推奨 し ます。 8 A ゲルろ過カ ラ ム と エ タ ノ ール沈殿を用いた精製法 ( B エ タ ノ ール沈殿に よ る精製法 ( 10 ページ ) 9 ページ ) Transdirect.book 9 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 ゲルろ過カ ラ ム と エ タ ノ －ル沈殿を用いた精製法 準備する もの ･ プ レパ ッ ク デ ィ スポーザブルゲルろ過カ ラ ム *1 ･ 3M 酢酸カ リ ウム (pH 5.5)*2 ･ エ タ ノ ール ･ 70% エ タ ノ ール ･ 滅菌蒸留水 （120 ℃で 20 分間オー ト ク レーブ処理 し た蒸留水） 注記 *1 Amersham Biosciences 社 NICKTM Columns (Code No. 170855-01) を推奨 し ます。 *2 エ タ ノ ール沈殿に用いる塩は、 酢酸カ リ ウムを使用 し て く だ さ い。 それ以外の塩を使用する と タ ンパク 質合成量が低 下する場合があ り ます。 操作手順 NICKTM Columns のプ ロ ト コルに従 っ た場合の mRNA 精製方法について 説明 し ます。 詳細は、 Amersham Biosciences 社の取扱説明書を参照 し て く だ さ い。 注記 1 2 3 4 5 6 すべての操作は手袋を着用 し て く だ さ い。 カ ラ ムの上フ タ を外 し 、 溶液を捨て ます。 3 mL の滅菌蒸留水で リ ン ス を し て、 再度滅菌蒸留水を捨て ます。 カ ラ ム先端のキ ャ ッ プ を外 し 、 ス タ ン ド に立て ます。 ゲルを平衡化する ため 3 mL の滅菌蒸留水を加え、 完全に流 し き り ます。 mRNA 溶液をゲル上端にのせ （最大 100 μL まで）、 完全に流 し き り ます。 400 μL の滅菌蒸留水を加え、 完全に流 し き り ます。 9 プ ロ ト コ ル Transdirect.book 10 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 mRNA の調製 7 8 9 10 mRNA 溶液を受け る ために、 1.5 mL 容チ ュ ーブ を カ ラ ムの下に配置 し ます。 400 μL の滅菌蒸留水を加え、 mRNA 溶液を回収 し ます （約 400 μL 回収で き ます）。 回収 し たmRNA溶液に40 μLの酢酸カ リ ウム と 950 μLのエ タ ノ ール を加え、 よ く 混合 し 15,000 rpm、 4 ℃で 20 分間遠心 し ます。 上清を捨て 70 ％エ タ ノ ールで リ ン ス を行い、mRNA の合成スケール に応 じ て 20 ～ 100 μL の滅菌蒸留水に溶解 し ます。 注記 mRNA 濃度は 2 μg/μL 以上に調整 く だ さ い。 エ タ ノ ール沈殿に よ る精製法 操作手順 1 2 mRNA 合成溶液を 400 μL にな る よ う に滅菌蒸留水で調整 し ます。 " ゲルろ過カ ラム と エ タ ノ －ル沈殿を用いた精製法 "( の手順 9 ～ 10 に従っ て、 精製し て く だ さ い。 注記 9 ページ ) この と き、 未反応の NTPs によ り 溶解 し に く く な る ため、 リ ン ス後は完全に ド ラ イ ア ッ プせずに、 滅菌蒸留水で溶解 し て く だ さ い。 mRNA 濃度測定 精製後、 mRNA 溶液の吸光度を測定 し 濃度を決定 し ます。 mRNA 溶液を TE で希釈 （100 ～ 400 倍） し 、 石英セルを用いて吸光度を測定 し て く だ さ い。 ま た測定時のブ ラ ン ク には TE を用いて く だ さ い。 mRNA 濃度（μg/μL）= A260 値× 0.04 ×希釈倍率 10 Transdirect.book 11 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 タ ンパ ク 質合成反応 本製品は高い タ ンパ ク 質合成能を得 る ために、 反応液組成を最適化 し てい ま す。 ま た RI 標識お よ び蛍光標識実験に も 対応 し てい ます。 準備する もの ･ 滅菌蒸留水 （121 ℃で 20 分オー ト ク レ ーブ処理 し た蒸留水） ･ 恒温槽 （25 ℃に保温可能な もの） ･ 精製 し た mRNA RI 標識実験を行 う 場合 ･ 【35S】 Methionine 蛍光標識実験を行 う 場合 ･ Promega 社 FluoroTectTM GreenLys in vitro Translation Labeling System (Code No. L5001) プ ロ ト コ ル 標準反応プ ロ ト コ ル 下記は 50 μL ス ケールでの反応液組成です。 用途に応 じ て ス ケールア ッ プ ・ ス ケールダ ウ ン が可能です。 表 5 ： 50 μL スケールでの反応液組成 mRNA 16 μg Reaction Buffer （青） 15 μL Insect Cell Extract （黄） 25 μL 4 mM Methionine （赤） 1 μL 滅菌蒸留水 50 μL に調整 11 Transdirect.book 12 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 タ ンパク 質合成反応 操作手順 注記 1 必要な本数の Insect Cell Extract （黄） を -80 ℃か ら取 り 出 し て、 氷 上で融解 し ます。 注記 2 3 4 5 12 すべての操作は手袋を着用 し 、 氷上または 4 ℃で行っ て く だ さ い。 ･ 30 分程度で融解 し ます。 融解後はす ぐ に使用 し 、 使用後は すみやかに -80 ℃で保存 し て く だ さ い。 ･ Reaction Buffer （青） と 4 mM Methionine （赤） は室温で融解 可能です。 融解後は、 氷上に置いて く だ さ い。 使用後はすみ やかに所定の温度で保存 し て く だ さ い。 新 し く 用意 し たチ ュ ーブに各成分を混合 し てい き ます。 最後に mRNA を添加 し 、 軽 く タ ッ ピ ン グ し てか ら ス ピ ン ダウン し ま す。 合成反応が開始 し ます。 25 ℃に調整 し た恒温槽にて、 反応チ ュ ーブ を 5 時間イ ン キ ュ ベー ト し ます。 合成反応が終了 し た ら すみやかに氷上に移 し 、 目的の研究にご使用 く だ さ い。 Transdirect.book 13 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 標識反応プ ロ ト コ ル 【35S】 Methionine お よ び Promega 社 FluoroTectTM GreenLys in vitro Translation Labeling System(Code No. L5001) を用いた標識方法を示 し ます。 下記は 50 μL ス ケールでの反応液組成です。 用途に応 じ て ス ケールア ッ プ ・ ス ケールダ ウ ン が可能です。 注記 RI 標識に 【3H】 Leucine を用いる こ と も 可能です。 その場合は、 4 mM Methionine を標準反応 と 同様に添加 し て反応 し 、 検出の 際に露光時間を長 く し て く だ さ い。 表 6 ： 50 μL スケールでの反応液組成 （標識反応プ ロ ト コ ル） 【35S】 Met 標識 FluoroTectTM 標識 mRNA 16 μg 16 μg Reaction Buffer （青） 15 μL 15 μL Insect Cell Extract （黄） 25 μL 25 μL 1 μL － 4 mM Methionine （赤） － 1 μL FluoroTect － 1 μL 標識方法 プ ロ ト コ ル 35 【 S】 Methionine （1200 Ci/mmoL） 10 mCi/mL TM GreenLystRNA 滅菌蒸留水 注意 50 μL に調整 RI 標識実験は、 専用の RI 実験施設内で行 う 必要があ り ます。 RI を取扱 う 場合には、 国や自治体、 所属する施設な どの定める法律、 省令お よ び規則に従 っ て く だ さ い。 操作手順 標準反応プ ロ ト コ ル （ く だ さ い。 12 ページ） の手順 1 ～ 5 に従っ て合成反応を行っ て 13 Transdirect.book 14 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 タ ンパク 質合成反応 RI 標識 し た タ ンパ ク質の検出 RI 標識 し た タ ンパ ク 質は、 反応液の一部を SDS-PAGE に供与 し た後、 オー ト ラ ジオグ ラ フ ィ を行 う こ と に よ り バン ド と し て検出す る こ と が可能です。 1 2 3 SDS-PAGE 後のゲルを通常の方法で CBB 染色 し ます。 CBB 染色の脱色液にて脱色 し た後、 ゲルを乾燥 さ せます。 乾燥 し たゲルを用いて、 オー ト ラ ジオグ ラ フ ィ を行います。 注記 ･ 露光は X 線 フ ィ ルムの場合、 6 時間～ 1 日程度を目安に し て く だ さ い。 ･ よ り 高い感度を得る ためには、 増感剤 （例えば Amersham Biosciences 社 Amplify Fluorographic Reagents(Code No. NAMP100) な ど） の使用 と -80 ℃ での露光によ る フルオ ログ ラ フ ィ を行っ て く だ さ い。 蛍光標識 し た タ ンパク質の検出 Promega 社 FluoroTectTM GreenLys in vitro Translation Labeling System(Code No. L5001) を用いて蛍光標識 し た タ ンパ ク 質は、 反応液の一部を SDS-PAGE に 供与 し た後、 蛍光 イ メ ージ アナ ラ イ ザーに よ り バン ド と し て検出す る こ と が 可能です。 β- ガ ラ ク ト シダーゼ コ ン ト ロール反応 添付の 0.5 μg/μL Control DNA （白） は β- ガ ラ ク ト シダーゼ コ ン ト ロ ール 反応を行 う ための鋳型 DNA です。 すでに直鎖化 し てい ます。 1 2 14 0.5 μg/μL Control DNA （白） を用い、 "mRNA の調製 " （ 7 ページ） に従 っ て、 β- ガ ラ ク ト シダーゼ mRNA を調製 し ます。 β- ガ ラ ク ト シダーゼ mRNA を用い、" 標準反応プ ロ ト コ ル " （ 12 ページ） に従っ て、 β- ガ ラ ク ト シダーゼを合成 し ます。 Transdirect.book 15 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 β- ガ ラ ク ト シダーゼの検出 コ ン ト ロ ール タ ンパ ク 質であ る β- ガ ラ ク ト シダーゼの合成確認は、 定量的 方法 と 定性的方法があ り ます。 定量的方法 準備する もの ･ Promega 社の β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer (Code No. E2000) ･ 分光光度計 （㈱島津製作所 Biospec-mini な ど） 操作手順 以下に β- ガ ラ ク ト シダーゼの定量的方法について示 し ます。 標準曲線の作成 と 活性値の算出についての詳細は Promega 社の取扱説明書を参照 し て く だ さ い。 1 2 3 4 10 μL の合成反応液に 1× Reporter Lysis Buffer を 490 μL加え、50倍 希釈 し ます。 50 倍希釈液を 10 μL と り 、 1 × Reporter Lysis Buffer を 140 μL、 Assay 2 × Buffer を 150 μL 加え、 37 ℃で 30 分間イ ンキ ュ ベー ト し ます。 30 分後、ただ ち に 1M Sodium Carbonate を 500 μL 加え て、反応を停 止 さ せます。 分光光度計を用い、 420 nm の吸光度を測定 し ます。 その値に希釈倍 率の 50 を掛けて、 標準曲線よ り 得ら れた数値よ り β- ガ ラ ク ト シ ダーゼの活性 （U/mL） を算出 し ます。 注記 β- ガ ラ ク ト シダーゼ コ ン ト ロール反応を行っ た場合、 10 U/mL の β- ガ ラ ク ト シ ダーゼが合成可能です。 15 プ ロ ト コ ル Transdirect.book 16 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 タ ンパク 質合成反応 定性的方法 準備する もの ･ プ ロ ト コ ルに従っ て タ ンパ ク質合成 さ せた反応溶液 ･ X-Gal 溶液 （20 mg/mL ： ジ メ チルホルムア ミ ド 反応液 3 μL X-Gal 溶液 1 μL 滅菌蒸留水 16 μL Total 20 μL 操作手順 1 2 16 37 ℃で、 20 分間イ ン キ ュ ベー ト し ます。 正常に合成 さ れた場合、 青色に呈色 し ます。 ･ mRNA 未添加の反応液では呈色はみら れません。 / ) Transdirect.book 17 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 付録 ト ラ ブルシ ュ ーテ ィ ン グ ト ラ ブル 原因 プ ラ ス ミ ド の回収量 菌株が不適切であ る が少ない mRNA の合成量が少 ない 対策 プ ラ ス ミ ド 調製用の大腸菌は、 DH5αTM (Invitrogen Code No.18258-012) を推奨 し ま す。 ま た LB 培地を使用 し て培養する こ と を推奨 し ます。 鋳型 DNA に塩な どの夾雑物 が混入 し てい る フ ェ ノ ール／ ク ロ ロ ホルム抽出、 エ タ ノ ール沈殿を行い、 最後の 70 ％エ タ ノ ー ルに よ る洗浄を確実に行 っ て く だ さ い。 ( 7 ページ ) mRNA が分解 さ れてい る フ ェ ノ ール／ ク ロ ロ ホルム抽出な ど で鋳 型 DNA 溶液中の RNase を完全に不活化 し て く だ さ い。 キ ッ ト の保存状態が不適当 であ る Insect Cell Extract （黄） お よび Reaction Buffer （青） は -80 ℃で保存 し て く だ さ い。 4 mM Methionine （赤）、 50 μg/μL pTD1 Vector （緑） お よび 0.5 μg/μL Control DNA （白） は、 -20 ℃以下で保存 し て く だ さ い。 ( 1 ページ ) フ ェ ノ ール／ ク ロ ロ ホルム抽出な ど で mRNA 溶液中の RNase を完全に不活化 し て く だ さ い。 コ ン ト ロール タ ンパ mRNA が分解 さ れてい る ク 質の合成量が少な い RNase inhibitor （ ヒ ト 胎盤由来） （推奨品 : タ カ ラ バ イ オ㈱ Code No.2310A、 Promega 社 Code No.N2611） を 50 μL の系 に対 し 、 5 units 添加 し て く だ さ い。 合成 量が改善 さ れる場合があ り ます。 反応液中の塩濃度は最適化 さ れています。 mRNA 溶液か ら の塩の混入に よ り タ ンパ ク mRNA 溶液中にマグネ シウム 質合成量が低下する場合があ り ます。 エ な どの塩が混入 し てい る タ ノ ール沈殿に よ り 塩を除去 し て く だ さ い。 エ タ ノ ールの混入に よ り タ ンパ ク 質合成 mRNA 溶液中にエ タ ノ ールが 量が低下する場合があ り ます。 mRNA 調整 混入 し てい る の際、 で き る だけエ タ ノ ールの混入を避 けて く だ さ い。 17 付 録 Transdirect.book 18 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 ト ラ ブルシ ュ ーテ ィ ング ト ラ ブル 原因 mRNA 濃度が不適切であ る 凍結 / 融解の回数が多い 凍結融解の繰 り 返 し は、 8 回以内 と し て く だ さ い。 ま た融解は必ず氷上で行 っ て く だ さ い。 融解後はす ぐ に使用 し 、 使用後 はすみやかに -80 ℃で保存 し て く だ さ い。 ( 2 ページ ) ク ロ ーニ ン グ位置が不適当 であ る ベ ク タ ーに目的遺伝子を挿入する場合、 cDNA の ORF の開始 コ ド ン と エ ンハン サー配列か ら の距離を な るべ く 短 く し て く だ さ い （Eco RV サイ ト への挿入を推奨 し ます）。 ( 5 ページ ) コ ン ト ロ ール タ ンパ ク 質の合成量が少な い コ ン ト ロ ール タ ンパ ク 質は十分量合成 さ れるが、 目的 タ ンパ ベ ク タ ーが不適当であ る ク 質が合成 さ れな い、 あ る いは合成量 直鎖化に用い る制限酵素が 不適切であ る が少ない 添付のベ ク タ ー （0.5 μg/μL pTD1 Vector （緑）） をお使い く だ さ い。 7 ページの表 3 記載で、 かつ作製プ ラ ス ミ ド のイ ンサー ト を切断 し ない制限酵素を 使用 し て く だ さ い。 遺伝子中の塩基配列中に変 異が入 っ てい る シー ク エ ン スに よ り イ ンサー ト の配列を 確認 し て く だ さ い。 開始 コ ド ンが欠失 し てい る シー ク エ ン スに よ り イ ンサー ト の配列を 確認 し て く だ さ い。 タ ンパ ク 質が正常に フ ォ ー ルデ ィ ン グ さ れてい ない フ ォ ールデ ィ ン グに特別なシ ャ ペ ロ ンが 関与する場合は、 正常な フ ォ ールデ ィ ン グが起き ない可能性があ り ます。 また膜 タ ンパ ク 質な ど、 疎水性の高い タ ンパ ク 質の場合は凝集する おそれがあ り ます。 ジ スル フ ィ ド 結合が形成 さ れていない タ ンパ ク 質合成反応は還元条件下で行 う ため、 ジ スル フ ィ ド 結合が活性に必須な タ ンパ ク 質の場合、 活性の低下ま たは欠 失がみ ら れる こ と があ り ます。 活性が検出で き ない タ ンパ ク 質の精製が 塩が影響 し てい る で き ない タ ンパ ク 質合成試薬は高濃度の塩が含ま れる ため、 イ オ ン交換カ ラ ムでの精製の と きは脱塩操作が必要にな り ます。 露光時間が長い 露光時間が長い と 目的以外の非特異的な バン ド が検出 さ れる こ と があ り ます。 露 光時間を調整 し て く だ さ い。 RI 添加量が不適当であ る RI 添加量が多い と 目的以外の非特異的な バン ド が検出 さ れる こ と があ り ます。 ま た添加量が少ない と 露光に時間がかか り ます。 添加量を調整 し て く だ さ い。 RI 検出時にバ ッ ク グ ラ ン ド が高い 18 対策 エ タ ノ ール沈殿に よ る精製法では未反応 NTPs が完全に除去 さ れないため、 見かけ 上 mRNA 濃度が上昇 し ます。 最適な mRNA の添加量を検討 し て く だ さ い。 ( 8 ページ ) Transdirect.book 19 ページ ２００７年１月２６日 金曜日 午前９時４２分 は じ めに 目次 製品内容 プロ ト コル 付録 参考文献 伊東昌章 「昆虫由来抽出液を用いた無細胞 タ ンパ ク質合成法の確立―実験目的に応 じ た様々な特性を も つ抽出液を求めて－」 化学 と 生物 , 2004, 42, 639-641 四方正光 ら 「昆虫由来新規無細胞 タ ンパク質合成試薬キ ッ ト の開発」 生物工学会誌 , 2005, 83, 390-391 Ezure, T. et al. Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing Biotechnol. Prog., 2006, 22, 1570-1577 Suzuki, T. et al. Performance of expression vector, pTD1, for insect cell-free translation system J. Biosci. Bioeng., 2006, 102, 69-71 Suzuki, T. et al. N-terminal protein modifications in an insect cell-free protein synthesis system and their identification by mass spectrometry Proteomics, 2006, 6, 4486-4495 付 録 Suzuki, T. et al. Preparation of N-acylated proteins modified with fatty acids having a specific chain length using an insect cell-free protein synthesis system Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71, 261-264 MSDS の請求について 各試薬の MSDS について無料で資料を提供 し てお り ます。 下記お問い合わせ 窓口に直接請求 し ていただ く か、 Web サイ ト から ダウ ン ロ ー ド し て く だ さ い。 お問い合わせ窓口 株式会社 島津製作所 分析計測事業部 ラ イ フサイ エ ン ス ビ ジネスユニ ッ ト ラ イ フサイ エ ン ス研究所 〒 604-8511 京都市中京区西 ノ 京桑原町 1 番地 TEL ： 075-823-1351 FAX ： 075-823-1364 E-MAIL ： [email protected] http://www.shimadzu-biotech.jp 19
