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Plateforme Métabolisme-Métabolome, IFR87, Bâtiment 630 - IBP, Université Paris Sud XI, 91405 Orsay cedex, France
Référence Qualité--PROCEDURE _ PMM
PCRE4_PO3006
201005
Méthode de traitement des données GC/TOF-MS
DIFFUSION
SOMMAIRE
I.
OBJECT ET DOMAINE D’APPLICATION
II. REFERENCES
III.
TERMES, ABREVIATIONS ET DEFINITIONS
IV.
SECTIONS DE PROTOCOLE
IV.1 CONTACT :
IV.2 PRINCIPE DE LA METHODE
IV.3 MATERIELS NECESSAIRES
IV.4 ETAPE 1 : Traitement de base
IV.5 ETAPE 2 : Calcul des indices de rétention
IV.6 ETAPE 3 : Application du Module de Référence
Standard
IV.7 ETAPE 4 : Vérification des identifications et des
quantifications
IV.8 ETAPE 5 : Calcul des ratios et des moyennes
V. CHANGEMENT DU PROTOCOLE
VI.
ANNEXES
Rédacteur
Mme GILARD
Indice/Version
1
Date
Lecteurs
M. TCHERKEZ
Melle. MAUVE
Nature de l’évolution
12/05/10
Comité exécutif
Direction
Responsable qualité
Ingénieurs
Techniciens
Thésards
Approbateurs
M. TCHERKEZ
Melle. MAUVE
Responsable de
l’évolution
Visa
Date
1
Plateforme Métabolisme-Métabolome de l'IFR87, Bâtiment 630 - IBP, Université Paris-Sud XI, 91405 Orsay cedex, France
I. OBJECT ET DOMAINE D’APPLICATION
Traitement des données GC/TOF-MS
II. REFERENCES
Cette méthode de traitement de données fait suite :
• au protocole d’injection des échantillons en GC-TOF-MS PCRE_PO3005
• à la procédure de récupération des données PCR_PO7055.
III. TERMES, ABREVIATIONS ET DEFINITIONS
GC : Gas chromatography (Chromatographie gazeuse)
MS : Mass Spectrometry (Spectrométrie de masse)
TOF : Time Of Flight (temps de vol)
GC/TOF-MS : Spectrométrie de masse avec analyseur à temps de vol couplé à la
Chromatographie gazeuse
QM : Masse utilisée pour la quantification des composés (Quant Mass)
MRS : Module de Référence Standard
Il constitue une bibliothèque privée de métabolites dont l’identification a été vérifiée et
validée par la plateforme et qui sont caractérisés par un spectre de masse, un indice de
rétention, une QM … Son application permet de rechercher et quantifier dans un
échantillon donné tous les métabolites référencés par ce module.
IV. SECTIONS DE PROTOCOLE
IV.1 CONTACT :
Pilote procédé :
poste :
mail :
Françoise Gilard
5 33 95
[email protected]
IV.2 PRINCIPE DE LA METHODE
Cette méthode s’applique aux données brutes obtenues avec le GC/TOF-MS pour une série
d’échantillons d’un même projet et pour le blanc réalisé lors du protocole d’extraction. Elle a
pour but l’identification et la quantification de tous les métabolites présents dans les
échantillons, sans à priori sur la nature des composés à rechercher.
Elle est basée sur l’utilisation, grâce au logiciel ChromaTOF, d’un module de référence
standard qui constitue une base de données de métabolites caractérisés par leur indice de
rétention et leur spectre de masse. L’identification des composés contenus dans cette base a
été vérifiée. Cette base de données est régulièrement mise à jour.
Les composés identifiés sont quantifiés en mesurant l’abondance d’un ion fragment ou
moléculaire de masse QM (intégration du pic chromatographique sur le courant ionique de l’ion
choisi). Les aires obtenues sont normalisées par rapport à l’étalon interne (Adonitol ou ribitol) et
au poids des échantillons ayant servi à l’extraction. Des calculs de moyennes et écarts-types
sont réalisés dans Excel.
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Contenu du mode opératoire
Etape 1 : Traitement de base
Etape 2 : Calcul des indices de rétentions
Etape 3 : Application du module de référence standard
Etape 4 : Vérification des identifications et des quantifications
Etape 5 : Calcul des ratios et des moyennes
IV.3 MATERIELS NECESSAIRES
•
Logiciels ChromaTOF (version 2.22), NISTMS (version 2008) et Excel
•
La langue d’entrée par défaut du PC doit être le français. (Dans le cas contraire, le tri
par ordre alphabétique dans les tableaux excel risque d’être modifié et cela peut
entraîner des erreurs dans les formules de calcul). Pour modifier la langue par défaut
des programmes Office, il suffit de se référer au lien suivant : Utilisation d'une autre
langue (http://office.microsoft.com/fr-fr/excel/CH100648301036.aspx).
•
Dans excel, il est vivement recommandé d’utiliser également par défaut le point comme
séparateur décimal. (Dans le cas contraire, les nombres non entiers copiés depuis
ChromaTOF ne seront pas reconnus en tant que tels.) Le choix de ce séparateur
décimal peut être appliqué en modifiant, dans le panneau de configuration, les "Options
régionales et linguistiques" : Options régionales/Personnaliser.
•
Contenu du répertoire MRSx (x = 5). x est la version la plus récente du Module de
Référence Standard
Localisation : \\Clementine (\\129.175.60.22)
Nom du répertoire :
\Partage-Caro\MRSx
login : metabolome
password : plateforme
Le répertoire BDDIR_IBP_avr09 se place sous le dossier NISTMS.
Le répertoire MRS5 doit être restauré dans ChromaTOF. (A la restauration, choisir
References / ModUnivTRrecalc / MRSx).
Le fichier MRSversionx.xls sert à recalculer les Temps de Rétention des métabolites
avant d'appliquer le module de référence. Un mode d'emploi est indiqué dans la feuille
"Recalcul TR MRS". Les formules de calcul sont compatibles avec toutes les versions
d'excel.
Les fichiers verifInteg30Echx.xls et verifInteg100Echx.xls servent aux vérifications
d'intégration et aux calculs de ratio et de moyennes.
IV.4 ETAPE 1 : Traitement de base
Le traitement de base des chromatogrammes inclut :
• la correction de la ligne de base et le lissage du chromatogramme
• la recherche de pics (apex)
• l’identification par recherche dans les librairies de spectres
• le calcul d’aire et de hauteur sous le pic pour quantifier chaque composé
Pour appliquer ce traitement, il est nécessaire de créer et d’appliquer une méthode DP (Data
Processing) avec les paramètres suivants :
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Détection des pics
Ligne de base
Lissage du chromatogramme
Largeur attendue des pics
Nombre maximum de pics inconnus à détecter
Rapport Signal/Bruit (S/N)
Identification des pics
Nombre de propositions
Poids moléculaire minimum autorisé
Poids moléculaire maximum autorisé
Seuil de masse
Similarité minimale
0.25
5 points
3 sec.
1000
5
10
0
1000
50
750
Librairies utilisées
NIST (mainlib et replib 2008)
BDD_IBPdec05
BDD_IBPoct07
BDD_IBPnov07
GolmAnnotee
POL_FA_NIST
Calcul des aires
Masse unique
IV.5 ETAPE 2 : Calcul des indices de rétention
La valeur moyenne du temps de rétention de chaque alcane est relevée pour la série d’échantillons
étudiées. Elle est notée dans une table d’indices de rétention de ChromaTOF (Retention Index
Method) avec le format suivant :
#
Name
Absolute R.T. (s)
Retention Index
1
2
3
4
5
6
7
8
C10
C15
C18
C19
C22
C28
C32
C36
317
588.3
726
767.4
880.4
1068.3
1178
1325
1000.0
1500.0
1800.0
1900.0
2200.0
2800.0
3200.0
3600.0
Verification
Masses
85
85
85
85
85
85
85
85
Pour rappel, m/z 85 est un ion fragment caractéristique de tous les alcanes et son affichage permet
de situer facilement les alcanes dans un chromatogramme.
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Une méthode DP (Data Processing) de calcul des indices de rétention appelant la table précédente
(Retention Index Method) est créée et appliquée.
IV.6 ETAPE 3 : Application du Module de Référence Standard
Le fichier MRSversionx.xls sert à recalculer les Temps de Rétention des métabolites avant
d'appliquer le module de référence. Un mode d'emploi est indiqué dans la feuille "Recalcul TR MRS".
Une méthode DP (Data Processing) appliquant le module de référence standard MRSx est utilisée.
Elle permet de rechercher dans chaque chromatogramme l’ensemble des métabolites présents dans
notre base de données et pour lesquels l’identification a été vérifiée.
Paramètres de la méthode DP utilisant le module de référence
Comparaison
Seuil de masse
Module de référence utilisé
50
MRSx
IV.7 ETAPE 4 : Vérification des identifications et des quantifications
Les fichiers verifInteg30echx.xls et verifInteg100echx.xls sont utilisés pour traiter une série pouvant
aller respectivement jusqu’à 30 ou 100 échantillons. Les premiers onglets du fichier sont prévus pour
contenir la liste de composés trouvés par MRSx (Peak Table) dans chaque chromatogramme. Le
premier onglet [B] se rapporte au blanc réalisé lors du protocole d’extraction. Les onglets suivants (1,
2, …) se rapportent aux échantillons successifs. Il est donc préférable de nommer les échantillons
d’un projet donné en les numérotant à partir de 1.
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Le fichier verifInteg.xls contient également un onglet [Poids] qui doit être complété pour permettre de
renormaliser par rapport au poids de chaque échantillon. Cet onglet donne aussi un mode d’emploi
du fichier VerifInteg.xls.
¾ Dans Chromatof, décocher l’affichage des contaminants, et vérifier que l’ordre des colonnes
correspond au même ordre que celui du fichier verifInteg.xls
¾ Pour chaque chromatogramme à traiter :
o copier la « Peak table » par la commande Copy Selection
o coller dans un onglet de verifInteg.xls
o classer par ordre croissant de la colonne « Quantification »
L’onglet [BilanAires] donne pour chaque métabolite l’aire mesurée dans chaque chromatogramme.
L’onglet [BilanCorrections] redonne pour chaque métabolite l’aire mesurée dans chaque
chromatogramme. Toutes les corrections sont effectuées dans cet onglet. A chaque fois qu’une aire
est corrigée, la case correspondante apparaît en jaune. Par défaut, les aires nulles sont mises en
évidence par une case orangée.
La colonne « Commentaire » peut être complétée pour spécifier différentes remarques. Par
exemple :
¾ trop présent dans blanc lorsque les aires sont mises à 0 pour les échantillons parce qu’elles
sont du même ordre de grandeur que celle trouvée dans le blanc.
¾ identification incertaine lorsque les aires sont mises à 0 pour les échantillons parce que
l’identification du métabolite est incertaine.
¾ QM=86 préférable, lorsque l’on veut suggérer une modification du MRSx
¾ QM=86, lorsque l’on a modifié l’ion servant à la quantification
¾ …
Afin d’améliorer le Module de Référence Standard, 3 nouveaux onglets ont été ajoutés :
[BilanMatch] permet de savoir combien de fois chaque métabolite a été trouvé par le MRSx et calcule
le match moyen lorsqu’un métabolite est trouvé.
[BilanRI] calcule l’indice de rétention moyen trouvé.
Pour chaque métabolite trouvé par le MRSx, [BilanUM] détermine le nombre d’échantillons pour
lesquels la masse unique (UM) correspond à la masse utilisée pour la quantification (QM). S’il existe
une UM différente de QM et plus fréquente, elle est calculée.
IV.8 ETAPE 5 : Calcul des ratios et des moyennes
Le fichier verifInteg.xls permet d’automatiser les étapes suivantes du traitement des données.
Une fois les corrections effectuées dans [BilanCorrections], l’onglet [BilanRatioRibitol] calcule les
ratio au ribitol. Vérifier toujours que la formule utilisée est correcte (vérifier les numéros de ligne des
cellules).
Pour chaque métabolite, l’onglet [BilanMoinsB] calcule la différence entre le ratio au ribitol mesuré
dans l’échantillon et dans le blanc. Si le résultat est négatif, il est remplacé par une valeur seuil très
faible. Cette valeur correspond à une aire de 500 divisée par l’aire maximale du ribitol dans les
échantillons.
L’onglet [BilanPoids] rapporte les résultats obtenus dans [BilanMoinsB] au poids initial de chaque
échantillon qui doit être précisé dans l’onglet [Poids]. La colonne « Max » calcule le ratio maximal
obtenu pour chaque composé. S’il est nul, le composé est absent.
Le tri des métabolites est effectué dans l’onglet [BilanSansStds]. Dans cet onglet, la colonne « STD »
notifie les standards qui seront éliminés des Résultats (alcanes, AABA, ribitol). La colonne « A
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supp » renvoie vrai si le composé est un standard ou s’il est absent. On filtre les résultats à
conserver par filtre automatique « faux » sur la colonne « A supp ».
Ces résultats sont copiés et collés dans l’onglet [ResultatsBruts] par collage spécial des valeurs.
L’onglet [histoMoy] contient un exemple de formule pour calculer les moyennes et les écarts-types
pour des séries de 3 répliquats.
V. CHANGEMENT DU PROTOCOLE
Ce protocole devra être complété par :
ƒ une « ETAPE 6 : Mise en forme des résultats bruts » qui décrira la création des
histogrammes et le contenu du compte-rendu.
ƒ une « ETAPE 7 : Analyse statistique »
ƒ une « ETAPE 8 : Archivage des données »
VI. ANNEXES
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