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【原著】 和漢薬配合胃腸錠の製剤研究 一一一 原料生薬 の品質評価 一一一 St u d ie s on Pharmac eu t ic a l Preparat i o no f Gastrointest in a l Remedi es Cont ai n ing Oriental Drugs 一一一 Qual i ty Evaluat ion o f Material Crude Durgs一 一 0日 水 裕 子 Yuko HIMIZU 西浦桂子 石黒文子 Fumiko I SHIGURO K e i k o NISHIURA 大協薬品工業株式会社 Taikyo P h a r m a c e u t i c a lC o . , L t d 小貫峰男 Mineo ONUKI 前川利玄 Tos hi h a r u MAEKAWA G - 株式会社陽進室 Yoshindo Co.Ltd 緒 <=I アロエ.アカメガシワ,ガジュツ及び動物胆など和漢薬を有効成分とする胃腸薬錠剤の製剤化を目的とし,原料生 薬の品質評価,薬理学的研究を行った。 本研究では.アロエ末.アカメガシワ及びガジュツ末の確認試験及び定量試験を行い,産地及び形態による品質の 違いを評価した。 o e f e l o xM叫を主とする。)の葉から得られる液汁を乾燥.固化した後.粉砕したもの アロエ末は.ケープアロエ (Al で . 主成分であるパルパロインを指標成分として確認試験及び液体クロマ トグラフにより定量試験を行った。 アカメガシワは. r b i a c e a e)のアカメガシワ M a / l o t u sj a p o n i c u sM u E t . 1 . .A同.の樹皮を乾燥した トウダイグサ科( Eupho もので.樹皮に含まれるベルゲニンの抗潰寝作用について報告がある。ベルゲニンを指標成分として.確認試験及び 液体クロマトグラフにより定量試験を行い,アカメガシワ末及び各エキスの違いを評価した。 umaz e d o a r i aRos c o e) は,ショウガ科( Zi n g i b e r a c e a e)に屈し根茎を乾燥後,粉砕したもので, ガジュツ( Cuc 中国産または台湾産が多く,日 本では屋久島で栽培されている 。ガジ ュツは,芳香性健胃薬として胃腸薬に配合され, シネオール, ピネンなどのモノテルぺノイドとセスキテルぺノイドを含む。セスキテルぺノイドは,胆汁分泌促進作 用H や抗泊寝作用2:について報告されている 。このそノテルペノイド及びセ スキテ ルぺ.ノイドについて薄層クロマトグ ラフ及びガスクロマトグラフにより比較し産地による品質の違いを評価した。 実験の部 実 験材料: アロエ末( 4社から購入した, 局方品を用いた。) アカメガシワ末(局外生規) ,乾燥エキス及び軟エキス。( 4社から購入した。日本四国文は九州産) ガシュツ末( 4社から購入した局方品を用いた。中国広西省,四川省産及び台湾産)。 日本屋久島産ガジュ山末を配合した市販胃腸薬。 試薬: パルパロイン( Si gma社),ベルゲニン標準品(松浦薬業), αーピネ ン( Al dr i c h社 ) . シネオール. d . ( 1ー カンフ ・ ? d 内 qL ル及びカンフェン(東京化成)。 測定機器. 液体クロマトグラフ装置 6A) 島津製作所製ポンプ( LC6A),カラム恒温槽( CTO-SA), UV検出器( SPD- 及びデータ処理装置( CR 5A。 ) ガスクロマトグラフ装置 島津製作所製 GC-14A及びデータ処理装置( CR-3A。 ) 実験方法 1. ア ロ エ 末 日本薬局方及び文献J)に準じて.確認及び定量試験を行った。 1 )確認試験 標準溶液・パルパロイン lOmgに1 .6mMシュウ酸 ・メタノール溶液l O m . Qを加えて溶かし標準溶液とする。 試 料 溶 液 : ア ロ エ 末200mgに1 .6mMシュウ酸 ・メタノール溶液 l O m . Qを加えて 5分間振り混ぜた後.ろ紙で ~ ’ 4 ろ過し,ろ液を試料溶液とする。 試料溶波及び標準溶液の lOμQにつき ,薄層クロマトグラフにより試験を行う。 TLC条件 薄層板:シリカゲル薄層板(蛍光剤入り) 展 開 溶 媒 :クロロホルム・エタノール ・水混液( 3 0:1 5:1) 展 開 距 離 : lOcm 検出方法:紫外線(主波長3 6 5nm)照射 2 ) パルパロインの定量 , 2 4時間乾燥)約 20mgを精密にとり, l .6mMシ 標準溶液:パルノ〈 ロイ ン( Sigma社,減圧 5mmHg以下 0m 1 !とする。こ の液 5m . eを正確に量り ,1 .6mM ュウ酸 ・メタノ ール溶液を加えて溶かし,正確に 2 シュウ酸 ・メタ ノール溶液を加えて正確に 5 0 m . Qとする 。こ の液 5m eを正確に量り.内標準溶液 2m eを正確に加えて振り混ぜ.標準溶液とする。 試 料 熔 液 : ア ロ エ 末 約Z O Omgを精密にとり, 1 .6mMシュウ酸 ・メタノール溶液7 0 m . Qを加えて' 3 0 分間激しく .6mMシュウ酸 ・メタノール溶液を加えて正確に i o om eとする。この液を遠 振り混ぜた後.更に l 心分離し上澄液 5 m.Qを正確に量り.内標準溶液2m eを正確に加えて振り混ぜ,試料溶液とする。 .6mMシュウ酸 ・メタノ ール溶液 (1→ 5 0 , 0 0 0 。 ) 内標準溶液: p−ジメチルアミノベンスアルデヒ ドの l 試料溶液及び標準溶液 1 0μ . ( ! につき.液体クロマトグラフにより試験を行う。 HPLC条件 検 出 器 . 紫 外 吸 光 光 度 計 (3 5 4nm) カ ラ ム : YMC ODS-A 6 .Ommx150mm . 移 動 相 : 薄 め た リ ン 酸 ( 1→1 , 0 0 0)・アセ卜 ニ トリル混液 ( 1 7:5 ) カラム温度 :4 0 ° 流速: 1 .0m e/min 2.ア カ メ ガ シ ワ 局外生規及び文献“を参考にして.確認及び定量試験を行った。 1 ) 篠認試験 標 準 溶 液 : ベ ル ゲ ニ ン lOmgにメタノール i om eを加えて溶かし標準溶液とする。 試料溶液:アカメガシワ末500mg又はアカメガシワ 500mgに対応する乾燥エキ ス文は軟エキ スにメタノ ール l O m . Qを加えて 5分間加熱する。冷後.ろ紙でろ過し,ろ液を試料溶液とする。 qJ ︽べu 試料溶液及び標準溶液 1 0μ . Qにつき .薄層クロマ トグラフにより試験を行う。 T LC条 件 薄 層 板 :シ リカゲル薄層板(蛍光剤入り ) 展 開 溶 媒 : ク ロロホルム ・メタノ ール・水混液( 6:4:1) 展 開 距 離 :lOcm 検出方法:紫外線(主波長2 5 4nm)照射 2 ) ベルゲニ ンの定量 0 m . Qとする。この 標準浴液:ベルゲニン標準品約20mgを精密にとり.メタノ ールを加えてとかし正確に 5 m l ?を正確に量り.内標準溶液 5m.Qを正確に加え.更に移動相を加えて 5 0 m . Qとし.標準溶液 液5 とする。 試料溶液:アカメガシワ来約 Z O Omg,乾燥エキス文は軟エキス約 l O Omgを精密にとり,移動相7 0 m l ?を加え て1 5分間超音波抽出した後.更に移動相を加えて正確に 1 0 0m.Qとする。この液を遠心分離し上 澄液 l O m l ?を正確に量り ,内標準溶液 5 m l ?を正確に加え,更に移動相を加えて 5 0m.Qとし,試料 溶液とする。 内標準溶液: 4-Hydroxy-3-met hoxy benzoi ca c i dの移動相溶液( 1→5 0 0 0 。 ) 試料溶液及び標準溶液 1 0μ . Qにつき,液体クロマトグラフにより試験を行う。 HPLC条件 ‘ F 検 出 器 :紫外眼光光度計( 2 7 2nm) カ ラ ム : YMC ODS-AM 6 .Ommx150mm 移 動 相 : 薄 め た リ ン 酸 ( 1→ 1 0 0 0)・アセトニトリル混液( 9 :1) カラム温度: 4 0。 流速:0 .8 m l ?/min 3 .ガ ジュツ末 1) 精油含量の測定 日本薬局方。一般試験法。生薬試験法の精油含量の項に準じて行う。 )確認試験 2 1 )で得られたキシレン液 1μ . Qにつき,薄層クロマトグラフにより試験を行う。 TLC条件 簿 層 坂 : 濃 縮 ゾー ン付きシリカゲル薄層板(蛍光剤入り) 展開溶媒:トルエン ・ギ酸エチル混液( 9:1) 展 開 距 離 : 15cm 検 出 方 法 : 氷 酢 酸 ・硫酸 ・p−アニスアルデヒド混液 ( 1 0 0:2:1)噴霧後, 1 0 5。 5分間.加熱。 3 ) セスキテルぺノイド 文献剖に準じて行った。 0gにメタノール6 0 m . Qを加え.還流抽出器を付け 5 0。の水浴で 3時間抽出し 精油分画試料の調製:ガジュツ末 1 た後.ろ紙でろ過する 。この操作を 3回繰り返す。メ タノール抽出液を合わせ,減圧( 2 5。以下) m l ?を加えて溶かし, で 留 去 し メ タ ノ ール抽出物を得る。このメタノ ール抽出物にメタノール 5 n−ヘキサン 5 0m.Q で 5 回抽出する 。 n -ヘキサン抽出液を合わせ.減圧( 25。 以下)で留去し• n −ヘキサン抽出物を得る。次に, n− ヘキサ ン抽出物に n− ヘキサン 5 m . £ を加えて浴かし. SEP-PAK SI LICA( Water s社製)に通し更に n− ヘキサン2 0 m . Q及び n−ヘキサン ・エーテル混液( 4:1) 5 m l ?を通す。 全流出液を合わせ,減圧( 2 5 ・以下)で留去する。得ら れた精油分画試料の重量を 測定する。 -3 4- ・ ト セスキテルペノイドの確認試験:得られた精油分画試料にメタノー ル z m eを加えて溶かす。こ 0. u . eにつき 2)の TLC条件に従って薄層クロマトグラフ法により試験を行う。 の1 4 ) モノテルぺノイドの定量 標 準 溶 液 : αーピネン.シネオ ール. d . Q−カンフル及びカンフェンをそれぞれ約 l OOmgずつ精密にとり, nヘキサンを加えて溶かし正確に 5 0 m . eとする。この液2 0 m . ' 1を 正 確 に 量 以 内 標 準 溶 液 5m.Qを正 確に加えて振り混ぜ,標準溶液とする。 0gを精密にとり.精製水7 0 0m.Q及びシリコーン樹脂 lm.Qを加え. n−ヘキサン 1 5 試料溶液: ; ガジュツ来約5 m . Qで 2時間ずつ 3回水蒸気蒸留を行う。抽出後, n ヘ キ サ ン 層 を 分 離 し 正 確 に 5 0 r n . Qとする。 この液2 0m eを正確に量り,内標準溶液 5m eを正確に加えて振り混ぜ.話料溶液とする 。 内標準溶液: n−ヘプチルアルコ ールの n−ヘキサン溶液 (1→ 1 2 5 。 ) dにつき,ガスクロマトグラフ法により試験を行う。 試料・ 溶 液及び標準溶液 1t GC条件 カ ラ ム : J& W 社製. DB-WAX ( 3 0m x o .53mm ID) カラム温度:初期温度6 0 ° .1 0 分間保持。昇温速度 5。 /minで 1 1 0。まで昇温。 1 1 0。で 2 0 分間保持。 多 キャリアガス:窒素 量: n−へプチルアルコ ール(内標)の保持時間が約 2 2 分になるよう調整する。 流 実 馬 食 1 .ア 結 果 ロ エ Photo.1 ア ロ エ 末 の 確 認 試 験 I .・ ~;~;· ー一・ − ・・ .~ ~- 』 ' t " ' . − ぃ :-~· .・ − : ・ 司 '' , ‘唱』~· - · -U 九. − ‘ − ; _ . . . , , ,, ・ " , ' . _ . ー' f i . 、 " t ー , ; − : ・ ? 官 日 ' _ 1 ' 1; ' £ ; ≪ -" ' ..1~ i " 末 1 ) 確 認 試 験 一門ト ・' 一 a ; . . . . . ' 同 唱 a B , 唱 ’ J H Rf 値約0 .3 付近に赤色のスポットを認める(パ ノレパロイン)。 4社から購入した日局アロエ末は.いずれも 同様の TLCパターンを示し,目立った違いは見 られなかった。 ( Pho t o . l ) 2 ) ノりレパロインの定量 1 ・ アロエ末中のパルパロイン含量は. Table1 に示す通りである 。 アロエ末は.日本薬局方で A l o e f e r o xM, L レな ど起源植物が限定されているが,パルパロイン の含量は,ぱらつきがみられた。 Tab l e 1 アロエ末中のパルバロン含量 ( % ) A ーinJUつU リ ノ ・ Eha ロ 平均 社 6. 14 % 7.25 6-43 B 社 6. 14 % 5.34 3.98 5.50 ± 1.18 % C 社 4.20 % D 社 4.53 % お T a b l e 2 ベルゲニンの含量 00 A 社 アカメヵ・シワ末 乾燥エキス (8 :1 ) 乾燥.エキス (8 1) 2.95 % 2.84 2.47 1 4.66 % 1 4. 6 9 12.13 14.67 % 1 4. 2 2 1 3. 00% 1 2.82 1 3. 1 3 1 . 4 .36土 0.44% 1 2.98±0 1 5 % ロット i 2 3 平 B 社 均 l 日危大分量 中のへ・ルゲニ y 2.75±0. 2 5% 1 3. 83土 1.47% 4 1 .3 mg 86. 4 mg A 1 日最大分量 中のへ.帥.ニン 社 B 89.8 皿g c 社 乾燥エキス (10 :1 ) ・ 社 64.9 血g D 社 軟エキス (l0 :1) 軟エキス (4 1) 軟エキス (10 :1) (5 :1 ) 1 1 .7 5% 4.34 % 8.58% 6.74 % 5 7. 2 5m g 5 4. 25 mg 42.9 m g 67.4 由g ・ ; 軌 エキス も P h o t o .2 ア カ メ ガ シ ワ の 確 認 試 験 2 . ア カ メ ガ シワ 1 )確認試験 Rf 値約0.4 付近に青色のスポッ トを認める(ベ ルゲニン)。 アカメガシワ末は.乾燥エキス及び軟エキス に比べてベルゲニン以外のスポットが多く見ら れたが.大きな違いは見られなかった。また, 産地による違いはなかった。( Photo . 2 ) 2 ) ベルゲニンの定量 アカメガシワ末,乾燥エキス及び軟エキス中 le 2に示す通りで のベルゲニンの含量は. Tab ある 。ベ ルゲニンの含量は, f 1日最大分量中の ベルゲニンの量として比較し,アカメガシワ末 は1 500mg,エキスは原生約5000mgに換算した Ph o t o . 2 量である。 原 生 薬:エキスの比の違いによって,ベルゲニンの含量に違いがみられ.乾燥エキスは軟エキスに比べて ベルゲニンの含量が高い。 乾燥エキスでは,産地によるベルゲニンの含量の違いはなく.同じエキス中のロット 聞のば らつき は小さい。 3 .ガ シュツ末 ガシュツ末の結果は, Tabl e 3に示す通りである。 1 )精油含量 精油含量は,サンプル I∼I I I (中国.広西省産).サンプルW∼V I (中国. 四川省産及び台湾産)のI ) 阪に多く. nc 屋久島産ガ ジュツ を使用した製剤)が最も多い。また,キシ レン液の色は暗紫色文は黄色を呈した。 サンプル v 2 )確認試験 得られたキシレン液について薄層クロマトグラフにより試験を行ったところ . I∼ EとW∼ v nは,そ れぞれ異 ハ D qu サンプル T a b l e3 ガ ッシ ュ末 1 n m ~· v ¥ 1 A 汁− B社 D ~l C~.上 AH A 社 1~ ガジュツ 配合胃腸議 台 I 有 _ , _ . u i 勾 ロ 本 屋久島 o . 2 s.e 0. 20 m e 目 指銀色 0.32 m e 0.32 m e 0.35 m e 0. 1 8m e U 荷主意色 9 i色 黄色 暗然色 0 .42 % 0.73 % 0.53 % 1 .72 % 1.33 % ‘ 1.25% 0. 067 % 0. 096 % 0.059 % 0.033 b' J 7I v Sン7/ Y ~" J 7f , カ" 1 71 ' 58.0 % . j 5 1. 3% 56. 9 x x 0.032 % シネ t - ~ 49. 3% 55. 2% 黄 色 0.031% J. 7 1% 0. 1 0 1% シ ネオ ール 51. 1% Photo.3 ガ ジ ュ ツ 末 の 確 認 試 験 を向 百四日 a ’ 句 、 , s ‘ t m ・Mh ・ 一四 ︵ 判 v ( ハ日 間 ' N . , . , ( u ニ ’ . ,.,,’~ .tol 町 ︵H ・ : 中川 ・時凶 '~ ,..,, ~ν. ...... - ’• ,,.ド子、 ( 1 なる パタ ー ンを示した。( Ph o t o .3 ) 尺f 値0 .4 5∼0 .5 3にみられる 3個のスポットは こ よ り 抗漬寝作用 を示す 渡辺.柴田らの報告2; ' f u r a n o d i e n o n e ,c ur z e r e none .f u r a n o g enne non e I Iでは含量の差が と推定されるが. I∼皿と W∼V , ‘ ’ 母 明確だった。また. その他のスポット について. I∼ Eでは Rf値約0 .4 t こ赤紫色のスポッ トが見ら れ るが W∼ V I Iでは小さい。 −本長 e 網 目 ド 事 ’‘;1,:.•. ー − ・ 圃 E 3 ) セスキテルペノイ ド (精油分画試料の重量) )の精油含量で比較したセスキテルぺノイドを 1 精油分画としてカ’ ジュツ末よ り分離 し 重量を比 ‘ . Photo.3 l l (中国広西省 較した。その結果. サンプル I∼ i 産)約0 .4 ∼0 .7%, V ・V I (台湾産)約 1 .3%. I V( 中園田川省産)及びV l i (製剤.屋久島産)約 1 .7%となり. 1 )精油含量の結果とほぼ一致した。 )確認試験 と同様のパタ ー ンを示し た。 また, セスキテルペノイドの薄居 クロマトグラフは. 2 4 ) モノテルぺノイド αーピネン. シネ オール及び de−カンフルなどモノテルペノイドの含有率は. サンプル I∼Eが多く. セスキテ Iでは I∼ Eの約 1 / 2と少なか った。 ルペノイドを多く含む W∼ V また, I∼W (中国産)の主成分は de−カンフ ルで. V ・V I (台湾産)の主成分はシネオールだった。 V I Iは , モノテルペノ イドの含有率が多いが.製剤であるためガジュツ末由来のものであるかどうかは不明であ る 。 以上の*・ ' ; . ! + ! : よ り . ガジュツは産地により 2種類に分けられ. 含ま れる成分の比に違いがあ った - 37 - 本 車 と め 1 .アロエ末 日本薬局方で起源植物が限定されているが,パルパロインの含量にばらつきがみられた。 2 . アカメガ シワ 原生薬:エキスの比によって,ベルゲニンの含霊に違いがあった。 乾燥エキスは,軟エキスに比べてベルゲニン含量が高しばらつきはわずかだった。また,産地による違いはな かった。 3 . ガジュツ末 産地により.ガジュツ末中に含まれるセスキテルペノイド及びモノテルぺノイドの含量に違いが見られた。 台湾産,中園田川省産及び日本 ・匡久島産はセスキテルペノイ ドの含量が多い。 モノテルペノイドは,中国広西省産の方が多い。 以上の結果を胃腸薬の原料生薬及び産地の選定.また規格範囲設定の参考と して.製剤研究を進めていきたいと ‘ 考えている 。 文 F 献 1 ) 前回初代.砂金信義,久保田和彦:;ヴジュツ宋の消化器系におよぼす薬理作用.薬誌, 1 0 4 ,6 4 0 6 4 3 ,( 1 9 8 6 ) 2 ) 渡辺和夫,柴田 昌裕,矢野真吾ら:屋久島産ガジュツ抽出物及び単離成分の抗潰蕗作用,薬誌. 1 0 6 .1 1 3 7 一1 1 4 2 ,( 1 9 8 6 ) 3 ) 鈴 木 弥 生.森田 武,羽田 正利ら.アロ エ中のパルパロインの高速液体クロマトグラフィーによる定量及び 同定.医薬品研究, 1 7 ,9 8 49 9 0 ,( 1 9 8 6 ) 4 ) 浜 野 朋 子,安田一郎.瀬戸隆子ら:高速液体クロマトグラフィー によるアカメガシワ含有無添認無許可医 薬品中のベルゲニンの定量,東京衛研年報. 3 ・ 8 ,7 3 7 9 ( 1 9 8 7) 5 ) 渋 谷 博 孝 . 吉 原 実,北野栄作ら:中国,台湾及び屋久島産ガジュツ精油成分の GasL i qui dChromatograp hy ーMass Spectrometry法による定性及び定量分析,薬誌, 1 0 6 ,2 1 2 2 1 6, ( 1 9 8 6 ) ‘ 卜 -3 8- 和漢薬配合胃腸錠の製剤研究 一一一 ラット急性胃潰蕩に及ぼす影響一一一 St udies on Pharmaceut i c al Preparation of Gastrointestinal Remedies Containing Ori ent al Drugs 一 一 一 一 Effect on Acute Gastric Ulcer i n Rat − 一 一 ー 0西 浦控子 Keiko NISHIURA 石黒文子 日水裕子 Fumiko ISHIGURO Yuko HIMIZU 大協薬品工業株式会社 Taikyo Pharmace u t i c a lC o . , Lt d . 小貫峰 男前 川利玄 Mineo ONUKI Toshihar u MAEKAWA 株式会社陽進室 Yoshindo C o . , L t d . ’ A 緒 百 アロエ.アカメガシワ ,ガジュツ及び動物胆など和漢薬を有効成分とする胃腸薬錠剤の製剤化を目的とし.原料生 薬の品質.薬理学的及び製剤学的研究を行った。 本研究では,アカメガシワ(以下 A K)の抗損傷作用に注目し.アカメガシワ単独及びアロエ(以下 AL).ガジュ ツ(以下 GA),牛阻(以下 GU)を添加した場合の抗損傷作用の評価を行った。 アカメガシワはトウダイグサ科( Euphorbiaceae)のアカメガシワ( Mallotusjaponicusl ' v l u r u . .A . c .)の樹皮を乾燥 したもので胃腸薬製造(輸入)承認基準には .粘膜修復剤の欄に収載されている。 実験の部 ’ 1 . 処方及び被験薬 処方及び被験薬は Table lに示す通り。 Ta b l e 1 処方及び彼験薬 薬 生 名 l日I目 E メ ー カー 320 アカメガシワエキス 原生薬:エキス= 8:1 アルプス薬品工業開 300 日本日未薬品館 FH3107 末 150 7J vプス薬品工業関 4G62K 担 100 関括本天海堂 CB369 ガ ジュツ末 ア 午 口 工 アカメガシワは日本 ・四国産,ガジュツは中国 ・広西省産,アロエはアフリカ産,牛胆はアメリカ産のものを用 いf こ 。 -3 9- 2 .実 験 方 法 1 ) 塩酸・エタノ ール胃損傷に対する抗潰蕩作用 ( 1) AKの抗漬窃作用 2 4時間絶食した Wi s tar系雄性ラ ット(体重 1 5 0∼ 2 10g)に AKを経口投与し. 1時間後に 150mMの塩酷を 含む60%エタノール溶液(塩酸エタノール)を 5m i !/kgの割合で経口投与した。 塩厳エタノ ール投与の 3時間後にぺントパルビタール Na60mg/kgの割合で麻酔し,胃を摘出。胃内に 10% ホルマリン生理食塩水を 6m i !注入後,同液に浸潰しホルマリン固定した。 大雪に沿って切開し腺胃部に発生す る損傷を実体顕微鏡下で観察した。 損傷の長さ( m m)を測定し. l匹あたりの損傷の長さの合計を損傷強度の指標とし抑制率を求めた。 AKは水に懸濁し 2 5∼lOOmg/m.Qに調整し. l O m i !/kgの割合で投与した。 ( 2 ) AKと GA. AL. GUとの相互作用 ( 1)と同様に実験を行い損傷強度を求めた。 AKは250mg/kgの割合となるように,配合生薬は本製剤の処方と同率,及びその 1 / 2 用量を添加した。(Tabl e . 2 ) 2 3 4 . 4 1 1 7 .2 AL 1 50 . GU 1 0 0 17 日.5 ・ n1SE AMudv J 0 0 2 5 0 P ‘ qa u GA 2 5 0 ‘ − 5 0 2 ~0 2 OAU 3 2 ~ ︶ − AK U E 一日 AKxGA AKxAL (r n gIkgl (mgIkgl n u’ K 一qL X // 一 −nu 方 g) vnFb ([ I l ︵ 処 A m 一日 Tab l e 2 AKと GA. AL.GUの配合量 2 ) 拘束水浸ストレス潰壊に対する抗潰窮作用 2 4時間絶食した Wistar系雄性ラット(体重 1 4 0∼180g)に 1 ) ー (2 )と同様に経口技与し 3 0 分後にストレスケー ジに入れ剣状突起の下ま で2 1。 Cの水槽に浸潰し 6時間後に屠殺して胃を摘出した。ホルマリン固定後,腺胃部に発 生する償蕩を観察した。損壊の個数及び出震の長径を測定し. l匹当たりの漬寝の長さの合計を損傷強度とした。 被験薬の投与は Table3のように行った。 T a b l e 3 拘束水浸ストレス潰窓モデルにおける被験薬 思方 ( I l lg ) 肉 ’ qu ’ rh1U 4 ι υ 倫叶 - 40 - nHwa n wu 対照群との有意差検定は Studentの ト t e s tを用いて行った。 AHvnu 3 .統 計 処 理 − 5 0 0 7 5 0 ANNUM 2 5 0 I 0 0 (r n gIkgl fhEυηt ’ 3 z 0 (mgIkgl AKxGU 命”’’ u AK GU AE単 独 f 実験結果及び考察 1 . 塩酸・エタノ ール胃損傷に対する抗漬信作用 1 ) AKの抗漬蕩作用 AKの抗損壊作用について用量依存的な傾向がみられた。 L ic h f i el d Wilcoxon法により ED 由値を算出すると A Kの ED 国 ( 95%信頼限界) 2 7 5 .Omg/kg ( 1 6 6 .7 ∼4 3 5 .8 ) となっ f こ。( Tabl e4) 主 酸 ・エタ ノーJf,胃損傷に対する AKの抗潰蕩作用 T a b le 4 主 量 (E g / k g ) 用 抑 制 率 ( 見 ) o .0 水 ~• 250 53 .4 375 80 . 0I 500 . 21 91 750 87.91 1000 90 .2I キ < 0 . 0 5 キ キ < 0 .0 1 2 ) A Kと GA, AL. GUとの相互作用 AK と GAの組み合わせでは AKの抗償額作用を抑制する効果がみられた。 特に GA117.Zmg/kgを添加したものについては危険率 5%で有意差が得られた。 (Table 5 ) T a b l e 5 AKと GAの相互作用 被験薬( m g / t g ) 例数 日 ) 損 傷 強度 ( ( m e a n ±S . E . ) i J .1 ± 1 . 1 水 A Ki 5 0 J .H 1 . 1 A K2 5 0 + G A2H.~ 1 2. ± J4 . 8 H2 50 + G A1 1 7 . 2 H3 .7 1 1 3. キ く -4 1- 0 . 0 5 AKとALの組み合わせでも AKの抗i 損傷作用を抑制する効果がみ られた。 A L 1 1 7. Omg/ k g添加したものにつ いては危険率0 . 1 %で有意差が得られた。 (Table 6) T a b l e6 被 験 薬 (a g / k g ) A KとA しの相E作用 例数 ( n) 損 傷 強 度 ( a e a n ±S . E . ) 水 H 25~ ~9.1± 1 1 .5 l~ .9 ± 2 . 1 H no + A L1 1 1 . 0 3 8 . 1 ±2 . 2 11 Hi 5 o + A L5 8 . 5 2 0 . 8 ± 1. 7 * * * <0 . 0 0 1 AKとGUの組み合わせにおいては, AKの抗出信作用をt 首強 させる傾向がみら れた。 しかし G U 7 8 m g ) / k g ,3 9mg/ k gのどちらの場合にも 有意差は得られなかっ た。 (Table 7 一方, Tab l e 7A Kと G Uの相E作用 被験薬( 1 g H gl 例 数 ( 日 ) 損 傷 強 度 ( m e a n ±S . E . ) 1 9 . 5±6 . 5 水 H2 5 0 1 3 . 2 ± 2 . 1 . H2 5 0 + G U7 8. 0 2 . 1 ±1 . 1 H2 5 0 + G U3 9. 0 6 .2 ±3 . 2 GA,A L , GUと漬震の生成について検討した。 GA2 34mg/ k g ,A L 1 1 7 m g/ k g ,G U 1 2 0 m g/ k gの割合で投与し塩酸エタノール胃損傷モデルに対する試験 これらのことか ら , を行った。 GAは損傷強度を増大させる傾向を示したが有意差は認めら れず , A Lは 5 %の危険率で有意差が認められた。 Uは損傷強度を低下させる傾向があ ったが有意差は認められなかった。( Table8) また, G 巴 T a b l 被援薬( 1 g / k g ) ‘ P 8G A. A L. G Uと潰湾の生成 例 数 (I I ) 損 傷 強 度 ( me a ± nS . E. ) 2 2. H8 . 2 水 G A2H H . 7 ±1 7 . 8 A L1 1 7 5 2 . 9 ± 8. 6 ! G U1 20 5 .5 士1 .8 宇 く - 42 - 0 .0 5 ・ F 2 . 拘束水浸ストレス潰蕩に対する抗潰扇作用 AKは250mg/kg, 750mg/kgの用量で.拘束水浸 6時間によるストレス漬寝に対してそれぞれ抑制作用を示し た 。 500mg/kgでは.抑制傾向を示したが.有意差は認められなかった。( Tab le9 ) T a b l e 9 拘束水浸ストレスモデルにおける AKの抗;貴傷作用 被験菜( m g / k g ) 例数 損 傷 強 度 ( n) ( m e a ± nS . E . ) 9 .7 ±2 .I 水 A K2 5 ~ 2 .H 0 .5 t A K5 ~0 3 . 5 ±1 . 5 A KH O 0 . 7 ± 0 . 0 1 キ<0 . 0 5 ~• 付く 0 .0 I AKとGUの相互作用 にお いては, AK単独 , AK+GU78mg/ k g , AK +GU39mg/kgの間に差はなく,いず rolに対して有意差が認められた。( Tab le 1 0 ) れも cont T a b l e1 0 拘束氷浸ストレスモデルにおける AKと GUの相互作用 被験薬( m g / K g ) a n宮 内 ‘ u A Ki s o+ G U3 9 '0 η‘u A K25 0+G~ 7 8 .0 る A K250 d4 水 例数 損傷強度(日) ( m e a n± S .L) 1 7 . 2 ±2 . 8 5 . ± 42 . I I 7 . 8± 1 . 7 * 7 . 6 ±2 . 2 1 ネく 0 . 05 $ 4 m と め 1 . アカメガシワが顕著な抗演寝作用を示すこ とを実験によ り確認した。 2.アカメガシワの抗損傷作用は.今回使用した鍵胃効果のある生薬との併用では効果がなかった。 3 . ~IJ胆剤である牛胆 も漬富生成を抑制する傾向がみられたが,アカメガシワとの相互作用については確認できなか った。 謝 辞 本研究に対し,ご指導を賜りました富山県薬事研究所斉藤昭夫所長,松原利行主任研究員に深謝致します。 - 43 - ウサギ血小板凝集 に対する 各種和漢薬 の影響 一一一黄連解毒湯を中心 に一一一 Effects of Tr adi t ionalChinese Med ici n es on Rabbit Platel e t Aggr egat i on ー− A det ai led study of Oren-gedoku-t o− 一 一 富山県薬事研究会生物部会 Di vi s i on ofPharmacology, Toyama Pharmaceutical Resear ch Association 沢田聡美 SatomiSAWADA 株式会社蹟貫堂 Kokando C o . ,Ltd . 貢 笹倉 Mitsugu SASAKURA リー ドケミカル株式会社 Lead ChemicalCo. . Lt d . 永井喜美 Ki m i NAGAI 株式会社延寿堂 Enjudo C o . , L t d . 寺崎正之 Masayuki TERASAKI 中新薬業株式会社 Chushin Yakugyo Co. , Ltd. 浅水敬子 Keiko ASAMI ZU 明生薬品工業株式会社 Mei s eiPharmaceut i c alCo. , Lt d . 音域 優 Masaru AOKI 日本医薬品工業株式会社 Nihon Iyakuhin Kogyou C o ., L t d . 篠原達雄 Tatsuo SHINOHARA ダイト株式会社 Dai t o Co. , Ltd. 地上良− Ryoichi IKEGAMI 松原利行 Toshiyuki MATSUBARA 緒 富山県薬事研究所 Toyama Pr e f e c t ur a lI n st i t ute f o r Phar maceutical Res e ar ch − Fコ 三大死亡原因のうち心臓病と脳卒中の循環器系疾患を合わせれば, l位のガンを上回以これからさらに進む高齢 化社会において,これら循環器系疾患の予防・治療は重要な課題である。 近年.心筋梗塞や脳梗塞の原因である血栓 の形成に血小板が重要な役割を果たすことが明らかになるにつれて抗血小板剤の研究が進み.生薬においても,桂皮, 人参,当帰.牡丹皮など に抗血小板作用が見出だされている。今回.我々は駆痕血剤を中心に各種和漢薬のウサギ血 小板凝集抑制作用を調べるとともに.作用の顕著な和漢薬の構成生薬についても その関与の程度を調べ,さらに最近 注目を集めている細胞内 Ca濃度の変化および凝集抑制機序も若干検討したので報告する。 実験材料および方法 1. 実 験 動 物 日本白色種雄性ウサギ(体重 3 . 0 ∼4 .Okg)を三協ラボサービス(紛より購入して用いた。 - 44 - t - 2.使 用 薬 物 オウレ ン,オウ バク, オウゴン.サン シシ.ケイヒ,ブクリョウ,シャクヤク.ホ’ タンピ. トウニン, トウキ, センキュウ.ビャクジュツ,タクシャ.サイコ,カンゾウ.ショウキョウ.ハッカ.ボウショウ,ダイオウ.チョ a (オリエンタル酵母) .~富化カルシウム(和光 レイなどの生薬は池田匡安兵衛商店から購入した。また, ADP-2N 純薬).コラーゲンリエ ージェン卜“ホルム”( NYCOMED). PAF (フナコシ薬品),牛血清アルブミン( BSA, シグマ) ,アデノ シン(和光純薬) ,イ ンドメタシン(和光純薬). CV3988 ( 和光純薬 ) A23187 (和光純薬) ,塩酸 ベルペ リン(和光純薬) . PGE,(シグマ) . EDTA-2Na ( 同仁化学), HEPES (同仁化学) , Fura-2A M (同仁 化学 ) . クエン酸ナトリ ウム (和光純薬)については試薬を購入して使用した。 3 . 和漢薬 ・生薬エキスの調製 黄連解毒湯,桂枝夜苓丸, 当帰巧薬散.加味泊遥散,桃核承気湯また は五苓散のそれぞれについてヒトの 3日量に 5 0 0 m £ の蒸留水を加え.市販の漢方煎じ器(栃本天海室)で 5 0分間煎じたのち.ガーゼ 3枚を用いて熱時漉過しそ の錨液を凍結乾燥した。 また,黄連解毒湯 (1日量:オウレン 3g,オウ バク 2g,オウ ゴン2g,サンシシ 2g)の 0日量に 3 0 0 m £ または 4 0 0 m £ ( オウ レンのみ)の蒸留水を加え.上記同様の方 構成生薬について,それぞれの生薬 1 ⑩ 法により乾燥エキスを得た。収量は.オウレン 6 .7g ( 2 2 .3%),オウバク 4 .42g ( 2 2 .1%),オウゴン 7 .4g (問). .38g ( 2 6 .9%)であった。 サ− ンシシ5 4 . ウサキ’ 血小坂の調製 ウサギをエーテル麻酔下, 3 .8%クエン酪ナトリウムを l容入れたディスポ注射筒に心臓穿刺により血液を 9容採 .lOOrpmで 1 0分間遠心 し,上層の多血小板血祭( pl a t e l et r i c h plasma :PRP)を得る と 取した。この血液を 1 ,0 0 0rpmで 1 0分間遠心し,乏血小板血授( p l a t e letpoor plasma :PPP)を得た。 PRPの ともに, 下層を更に 3 0 ' 個I t &となるよう自 己の PPP 血小板数を自動血球計数器 (セルタック.日本光電)で測定し, 血小板数が 5∼ 6× 1 にて希釈した。以下,この血小板を調製 PRPと称す。 5 . 血小板凝集能の測定 Bornの方法。に従い.血小板凝集を細胞内カルシウム測定装置( 日本分光, CAF1 0 0)を用 いて測定した。す ’ なわち.微小回転子が 1 ,2 0 0rpmで回転撹持する 3 7 ℃のキュベットに,調製 PRP400μ.R,を入れ 2分間前後安定させ 0 μ . R ,を加え, 2分後下記の凝集誘発剤5 0 μ . R ,を加え凝集能を測定した。凝集能は調製 PRP, PPPの た。次に被験液5 光透過率をそれぞれ 0%. 100%とした 時の最大光透過率(最大凝集率) で示 した。また.凝集抑制率は次式から求 めた。 / 凝集抑制率(覧) = [1ー ¥ 薬物添加時の最大凝集率\ |× 1 0 0 溶媒添加時の最大凝集率 J 今回の実験では.凝集誘発剤として主に以下の 3種類を用いた(濃度は終濃度で表示した)。 1 ) 生食に溶かした 1 0瓜4の ADP2Na (凝集促進のため 5mMの CaCkを前処置した) 。 2 ) SKF bufferに溶解した 1 0μg/m. Qのコラーゲン。 3 ) 0 .25%BSAを含む生理食塩水に溶解した 3∼10ng/m £ の PAF。 6 . 血小板の細胞内 Ca濃度の測定 により検討し た。す なわ ち,上記の方法 と同様の操作に より PRPを得たのち.活性化を防ぐため 唐木らの方法 2) 1μMPGE : を 添 加 し さ ら に2 ,200rpm× 8minで遠心した( KUBOTA 5 1 0 0 型)。得ら れた沈撞に l品'1PGE ,を含 l . 5mMKC1. lmMMg S O , , 0.5mMNaH , P O, ,5mMGl uc o s e , O.OOlmMEDTA. む血小板栄養液 (145mMNaC 1 0m MHEPES;NaOHにより pH7.4に調整) 5m.Qを加え.ピペット で吸引 ・排出を繰り返し血小板を均一に再浮 -4 5- 遊させた。この浮遊液に l μMF ura-2AM を添加し, 3 7℃で 1 0 分間インキュベー卜するこ とにより蛍光指示薬の Fu r a を細胞内に導入した c 2 ,2 0 0rpmx4minで遠心後上清を捨て,血小板栄養液の添加による再浮遊と, 2200rpmx 2 4minでの遠心分離を 2回繰り返し,余分の Fura-2AMを除去した。最後に血小板栄養液 5mQを加え血小板を再 浮遊させ,血小板数を約 5× 1 0' 個I μ . R .に調整し, F ura-2 負荷洗浄血小板を得た。 測定は,微小回転子の入ったキュベットに F ura-2負荷洗浄血小板4 0 0μ . R .をいれ,安定した後,被験液 または溶媒 (蒸留水) 5 0μ £ を加えた。 2分後 PAF溶液 5 0£ μ を加え,凝集能 と同時に細胞内 Ca濃度変化を細胞内カルシウム 測定装置(日本分光, CAF-100 )を用いて励起波長340nm,蛍光波長500nmで測定 した。 7.黄連解毒湯,オウレン,オウバクの各エキスに含有されるベルペリンの定量 正確に秤量した黄連解毒湯,オウレン,オウバクの各エキス( 2 0 0mgまたは 500mg)を l O OmQのメタノ ールに溶 解し, 1 0分間超音波処理したのち, 0 . 4 5 μ のメンブレンフィルターで櫨過し試料溶液とした。標準溶液および試料溶 液について.以下に示す HPLC条件によりそれぞれのピーク面積を測定しベルペリン含量を求めた。 [HPLC条件] カ ラ ム :カプセルパック C18UG12 0 (資生堂) ‘ φ 4 .6x20mm 移 動 相 :lOm M ラウリル硫酸ナ ト リ ウム/ア セトニトリル' 5 6/ 4 4 b 涜量: 1 .5 m. QImin カラム温度: 4 0℃ 視 j l 定披長 :3 45nm 試料注入量 :2 0μ . R . 実験結果および考察 1 . 血小板凝集に対する各種和漢薬の ヤー汁マ ! ?で"( ーτ - ! ~て l 「---v ·t 「日行 4 二一一三~·中戸斗管?空母ーミ対4令長三? 渓 : o 里 子 主 主 主 乃 モ ; 字 三託 子 三 三 豆 影響 0 " ' 今回の実験では, 各被験薬の 1 0・ 'g/ mQの 2種類の g/mQおよ び1 司 、 E ウセ?ヰ< 終濃度について検討した。黄連解毒 . : m/j、 U宣 σ~PA a, P A f 1 0吋 J 刷 0• . F 漫 己f. . . .l こ実寸ヲ戸吾 M i 且 免 寧 ミ: : i ;; 晶コ ニ ~さ耳障者;A (,向I ) ' / /,'"' - ヰス αコ 家 主 主温 厚 ・ " " 湯エキスは,高濃度でコラ ーゲン凝 t ・ 程度抑制した。また, ADP凝 集および PAF凝集を 50% 集も 25%抑制した。これらの作用は低濃度ではかなり減 弱するかもしくは消失した。桂技沃苓丸エキスも,高濃 表 1 ウサギ血小板凝集に対する各種和漢薬の影響 世 喧 畠 度でコラーゲン凝集を顕著に抑制するとともに, ADP凝 集も抑制したが, PAF凝集に対し ては抑制効果は若干 語圏*【討周1 認められたのみであった。他の 4種類のエキ スについて 置理府=坦 エキ ス は,高濃度で抑制効果が認められたが,その効果はいず 桂信荏事丸エキス れも顕著なものではなかった。また,低濃度については, いずれの凝集にお いてもほとんど影響が認められなかっ 間後遺逼泊三乎 ス た。黄連解毒湯エキスの PAF凝集に対する抑制作用の 銚伝承民渇エ""ス 一例を図 lに示すとともに,各和漢薬エキスの凝集抑制 率を表 lに示す。 五苓; ' dX 亭 ス 2 . 黄連解毒湯およびその構成生薬の血小板凝集抑制作用 黄連解毒湯の 4種類の構成生薬について.黄連解毒湯 コラーゲン 。 1日 4 ! .0土 ' g 1 1 . 5全I J9 v. o 主 31 P A F (1 0ng/ 園1 ) 。。 SU±IJ.2 0 . 1 ± 5.1 8" < S . l土 1 10 ~ 1 0I ± 5 .9 S .l ±1 0 .3 0 .8土 J .O 10 3 11 l主 8 . 1 o. as . r 1 0 . i土 6 .6 10-~ 1日3 1 5.5 ± I . I 2 日土 3 .5 ι o±rJ o l O. 0 企 " ・ 之 u 2 " ・ a土 r . s 5I ± 5 .9 9 .C±IO .l I . l e ! : 2! l0 3 土 2 . 3 1 9 .J l 8.I : :l . 5 1 15 : ; I.I I0 • 10 3 , .a 土 : ’ 0' 1 3 1 0 8± 6I z o , 1 . 1 <5.J±ll 5 I0 • 5'M CV-398自 I0 ' M - 46 - P − インドメタシ;, "回目 0 (I 0 ug/ 巴I ) 目 アデノシン A (1 0 u M ) 10 l 当箱司苗 ; aエキス Ql 毘釘 制 皐 ( l j )•) 健司度 (z/ml) n.., ,,ま S Oo l1 6s o o p l e s 28 土1 3 . l 3 .3 ]2 ± 5] s !.1 ± a . 22a : : 1 J .2 0s 主 l −'・ 1 6.5 主 6 .6 全1 1 . 8 5 0.2 s . r 土1 0 .0 ' ° "土 l.3 o .as.1 1 18 ± 5 .6 。 JO. 2 ±I D . の1 0 ・ ' g/m . eに相当する濃度での凝集活性に対する影響を 表 2 ウサギ血小仮凝集に対する責連解毒湯 および後成生慈の影響 比較したところ, オウレンおよびオウ バク エキスがコラー 2 .1 > 1 0 g/ m l -4 b) サンシシエキス <g/mlb) 2. 5•10 - オウゴンヱキス 3 . 5•10 g / m l 4 b) 。 , r 才つパクエキス F リ オウレンエヰス 一 ︷ − % 一 phu えて比較したところ.ベルペリンでも顕著な抑制作用が認 0 1 .O• 1 0J g / ml ・4 b) J .2 r 1 Q g / m lI d A 刊 1− B / m R .ベルペリンの凝集抑制活性を, PAFの濃度を種々変 ﹀ 1x1 0・ 'g /m . eオウレンエキスと 3 .6 × 10·• g 率一 ることから. i ' l ' l連軍再考温エキス 割一 京 留 水 {対 照} さらに. オウレンエキスにベルペリンが3 .6%含有され 鈎一 ) 認められなかった(表 2。 h w コ れ ラ 0 路温度 − l > l 益段 方 , オウゴンおよびサンシシエキスによる抑制はほとんど 集一 ン 刷 直一ゲ d w ゲンまたは PAFによる血小板凝集を顕著に抑制した。一 0 5 0 φ5 ±1 8. 0 5 2 .3 ±2 5.5 2 8. 8± 4 . 9 5 1 .3土1 3 .8 3 1 .0 ± 6 .1 1 8 .0 士1 2 .5 2 .5 土 3 .1 .3 3 .5 ± 3 . es ± 0 . 5 ± 5 .5 3 .1 a)4例の平均値± S0. b) ll!差解~滋エキスの I. O• I D・ J g/ I O Iに相当する 漬反. ) . オウレ ンの抑制より若干弱い傾向を められたが ( 表3 示. し オウレ ンの凝集抑制作用にはベルベリン以外の物質 も関与していることが示唆された。 (%) ・ } ︼ 議 官 氷 (対照} 号 ω 機穏 PAFの終 i l i皮 3 ng/ml 6 ng/mI 1 0ng / ~I 5 3 . 6 ± 6 . 4 9 4. 3 ± 5 .7 9 4. e 土 3 .1 才ウレンエキス 1 . 0 1 1 04 9/ m l . 1 3 8 .6± 4 土1(7 6 5. 6 7 8. 5 ± 3 .0 i :包ベルベリン 3 .6 < 1 0 g/ ml 4 4. 0±12. 1 8 .1主 e . 4 9 1 .5土 2 .5 : 主1 1 1ベ ,.ベリン 3. 6•10 s g / m l 29.3±12. 8 -6 b) 。 1 4 . 1± 2 . 2 - ) ー p AFの 3 0ng/m1 による袈集活性に対する百分患を示す. 3-5倒 的 平 勾 盛 土 SE. b) オ ワレン エキスの 1 .0 X 1 0' o / m lに絹当する 温度. z寸llE寸11 11Jli ﹂ 4ll 忍~:s 終温度 0 01 03 20 30 45 E 主 E 主蕊 、 表 3 ウサギ血小板凝集に対するオウレ ンエキ ス および塩酸ベルベリンの影響 渇 . ; イ 斗F 主 雪 包 2 fu,.·2負荷したつサギ血小 Iii:~町高Jli,音堂およ U鎗n円h量互に討する rワレン=牟スのE曹 耳 So l• . .高官水: P J . f .I Ona/ •I P I• uI <t ・c t1 •nt 1司...... . 。 a ・1110. ・ . E 皐 ・ ' ・ , .,すヲレンエキス . CVJ!B&, 10・• CVJ!88. 3 . 細胞内 Ca濃度に対するオウレンの影響 オウレンによる血小板凝集の抑制が認められた時.血小板細胞内 Ca濃度の上昇も抑制された。また,陽性対照で の前処理 よ り 凝 集 お よ び 細 胞内 Ca濃度の上昇がオウ レンよりさ らに強く抑制され,細胞内 Ca濃度の ある CV3988 上昇が抑制 されることにより凝集が抑制されたことが明らかとなった(図 2。 ) 4. 各種刺激剤により惹起される凝 集に対するオウレンの影響 め , アラキドン酸, トロンボキサ ンA,の安定誘導体の U 4 6 6 1 9 , さら にカルシウムイオノフォアの A23187により惹起される凝集につ ︵主 導 諸 問 オウレンの作用点、 の解明のた ; ! ! 年 を 草 壁 − ι」語量子 ・‘ 30~ 」 一 一一一一一一一一 よよ二=二与ζ ニ一一ー一一一 川 ! } s o J一一」二三=−−−..:!三ム一一一ι ー : : : : -~i:-二=司ー;ニ1 いても検討したところ, オウレン ) 。 はいずれの凝集も抑制した ( 図3 このよ うに,オウレンは, PA F. 図 3 各獲刺激 1111 によるウサギ血小毎夜祭に対するオウレンヱキスの~ 響 Solv..蒸留水; D R E x t , l X l 049/ml オつレンエキス, A r a .A . 200uM アラキドン磁−N a ; コラーゲ ン, U 4 6 6 1 9などの受容体 - 47 - U4 5 6 1 9 . 4uM: A 2 3 1 8 7 .1 0u岨 目 活性化薬による凝集,さらには細胞膜に働き直接 Caイオンを細胞内に疏入させる A23187に惹起される凝集に対し でも抑制することが分かった。このように各種刺激剤による凝集が非特異的に抑制されることから.オウレンの作 用点については.受容体詰抗作用に基づくと考えるより血小板膜のカルシウム透過性に影響を与えている可能性が 大きいと恩われる 。 。みか 1 士 口 呈ム 面開 ウサギ血小板凝集に対する黄連解毒湯,桂枝夜苓丸.当帰巧薬散,加味迫遥散,桃核承気湯,五苓散の各エキスの 影響を調べたところ .黄連解毒湯および桂枝夜苓丸エキスに顕著な抑制効果が認められ.これらの漢方薬が脳卒中や 心筋梗塞などの血栓症の予防に寄与する可能性が示唆された。さらに.黄連解毒湯の構成生薬の影響を調べたところ. オウレンおよびオウパクに凝集抑制作用がみられるとともに,これら生薬に含有されるベルペリンがこの抑制作用に 大きく関わっていることも明らかとなった。 文 献 1 ) Born.G .V .R . :Aggr egat i o no fb l o o dp l a t el et s by adenosine diphosphate and i t sr e v e r s a l ,Natur e , 1 9 4,9 2 7 9 2 9( 1 9 6 2 ) ‘ ? 2 ) Karaki,H . ,M i t s u i , M. Nagase. H. Ozaki ,H. S h i b a t a ,S . and Uemur a ,D .:I n h i b it or ye f f e c t o fa t oxi n okadai ca c id ,i s ol a ted from t he b l a c k sponge on smooth mus c l e and p l a t el e t s , Br i t . J . Pharmaco. l,9 8 ,5 9 0 5 9 6( 1 9 8 9 ) e ト - 48 - 漢方製剤の品質に関する研究〈第 9報 ) 一一一 桂枝中のケイアルデヒドの動向 一一一 一 一 一 Studie s on Qual i t y Evaluat ion of Kanpo Medicine 医 The Changes o ft he C innami c al dehyde Content si n Ci nnamon Bark一一 一 0吉 井 美 矢 子 Miyako YOSHI! 石田裕子 Yuko ! SIDA 西本初博 Hatsuhiro NISHIMOTO 中田るり子 Ruriko NAKADA 成川 郎 I c h i r o NARIKAWA 東亜製薬株式会社試験研究室 R e s e a r c hI n s t i t u t e , Toa Phar maceut i c a lC o . , L t d . l . 緒 芯 − i : : : i 桂枝はー股用漢方 2 1 0 処方中 6 2 処方に配合され.発汗.解表,鎮痛.健胃剤として重要な役割を果たしている。しか し桂技中の主成分であるケイアルデヒドは揮散性があり,湯液の調製あるいはエキス製剤製造時には著しく揮散す ることが考えられる。そこで.その実際的な動向を経時的に確認した。 実験の部 1 .被験材料 葛根湯構成生薬( l日量 1 7g :葛根 4g,麻黄 3g . 大葉 3g'桂枝 2g,巧薬 2g,甘草 2g,生萎 lg)はい ずれも市販の日局品を用いた。 なお,佳枝については,以下 2種類を用いた。 広南産桂枝(ケイアルデヒド含有率 ベ トナム産桂枝(ケイアルデヒド含有率 , . = - 2 .68%) 4 .77%) 2 実験方法 1 ) 抽出液及び留出液中のケイアルデヒドの動向 ( 1 ) 広南産桂技とベトナム産桂技との比較 , 7 0 0 m . I Zを加え,F i g .lの装置を用いて抽出し. 控枝20gに水1 沸鵬開始時及び以後3 0 分, 6 0 分. 9 0 分 , 1 2 0 分経過時にそれぞれ 抽出液及び留出液中のケイアルデヒド含量を求めた。 ( 2 ) 広南産控枝とこれを配合した葛根湯との比較 桂枝 1 7 0g及び葛根湯 1 7 0g( 1 0日分)のそれぞれに 7 1 < 1 .7 0 0 m . I Z を加え, ( 1 )と同様に操作して抽出波及び留出液中のケイアルデ ヒド含量を求めた。 2 ) 葛根湯を土ぴん煎出した場合のケイアルデヒドの動向 葛根湯85g(5日分)を土びんに入れ.水8 5 0 m . I Zを加えて加熱 F i g.1 精油定量装置付 き還流抽出装 置 抽出し,沸騰開始時及び以後3 0 分. 6 0分経過時にそれぞれ抽出液中のケイアルデヒド含量を求めた。 3 ) 抽出液濃縮時のケイアルデヒ ドの動向 葛根湯8 5g(5日分) ' こ 水8 5 0 m . I Zを加えて6 0分間土びん煎出した液を熱時ろ過しろ液をエパポレーター(4 0 ∼ -4 9- 6 0 ° )で 1 / 2量にまで濃縮後.抽出液中のケイアルデヒド含量を求めた。 3 .測 定 条 件 HPLC法(絶対検量線法) .ARφ4.6mmx1 5 0m m カ ラ ム : Cosmosi 5C, 検出器.紫外吸光光度計(測定波長: 2 7 4nm) 移 動 相 : 水 ・メタノール混液( 1 :1) 実験結果 ケ1 0 0 1 . 抽出液及び留出液中のケ イアルデヒドの動向 1 ) 広南産桂枝とべトナ ム産桂枝との比較 広南産桂枝及びベト ナム産桂技をそれぞれ 還流抽出したときのケ イアルデヒドの経時的 g. 2で比較し 動向を Fi た。抽出液中のケイア 。留 出 液 イ ア B O 2 0 j レ デ 6 0 ~ 累 計 口広南径筏 4 0( す ) 図ベトナム由主 C .A .4 .7 7% ヒ ド 4 0 6 0 j 白 出 液 中 の 量 2 0 ( % ) ‘ F の 量 。 ( % ) 60 90 120 他出時間(分) ルデヒド含量はいずれ Fi g.2 桂設中のケイアルデヒドの他出率(%) 0分後に最 も沸騰開始 3 高値を示し,留出した ケイアルデヒド量は沸 騰開始後しだいに増加 し,いずれも沸騰開始 9 0分後には抽出液中濃 度を上回った。文抽出 液中のケイアルデヒド 7 口径 イ ? 1 0 l レ 図 蹴 呂 (土ぴん) 1 百 出 ; ) (J I1 0 ! 音 デ ( 咽 ) ヒ ド 含量及び留出したケイ アルデヒド量ともに, いずれの時点において L 国 恒 図脇島 ( i . ! ! ; j ; !) 明/. 1 昌 E夜 19 「「 民 「 I l! 国 閃 「 1 官 邑 ( 咽 ) も広南産桂枝がベトナ ム産桂技よりも高い値 60 1 自 を示した。 2 ) 広南産桂枝とこれを配 出 時 間 90 120 { 分) Fi g 3 径校中のケイアルデヒドの動向 目 合した葛根湯との比較 i g .3で 広南産桂枝及びこれを配合した葛根湯をそれぞれ還流抽出したときのケイアルデヒドの経時的動向を F 比較した。抽出液中のケイアルデヒド含量は沸騰開始時を除合桂枝と葛根湯はほぼ同程度の値を示した。留出 したケイアルデヒド量はいずれも沸騰開始9 0分後には抽出液中の濃度を上回った。 2 . 葛根湯を土ぴん煎出した場合のケイアルデヒドの動向 i g .3に示した。抽出液中のケイア 葛根湯を土びん煎出したときのケイアルデヒドの経時的動向を Table l及び F ・ ? 円 u pb ルデヒド含量は沸騰開始時から以後6 0 分経過時まで 3 .Omg前後のほぼ一定量を示した。 Ta b le 1 広南佳枝. 葛根湯(還流).葛根湯(土びん)中のケイアルデヒ ド ( mg/ 佳枝 lg ) ∼抽∼出∼液∼∼∼ー「∼抽∼出 ∼∼ 時 ∼ 間 ー( 分 ) 広 南 bp 30 60 90 120 6 .8 6.0 4.6 3 .6 2 .6 還流抽出 2.6 6.5 4 .9 2 .7 2.6 土びん煎出 3 .1 3.0 2 .3 桂 枝 葛根湯 3 . 抽出液濃縮時のケイアルデヒドの動向 / 2 量にまで濃縮した液からケイアルデヒドはほとんど検出されなかった。 葛根湯を土びん煎出した抽出液を 1 出 。 考 察 Tabl e 2に Fi g .3の結果をケイアルデヒドの利用率(%)として取りまとめた。葛根湯を還流抽出した場合は沸騰 0 分後抽出液中のケイアルデヒド量は最大24%となり.以後減少した。しかし古来一般的な湯液調製法である土 開始3 ぴん煎出では溺騰開始時から以後6 0 分後まで約 10%と低レベルながらほぼ一定値を示した。葛根湯中の主成分麻黄アル カロイドやグリチルリチン酸を効果的に利用するための最適な煎出時間についてはすでに漢方処方の抽出条件とエキ )リ及び甘草中のグリチルリチンの湯液への移行率(第 1報 )剖で約 1時間と報告したが,今回のケイアル ス量(第 l報 デヒド. についても 1時間煎出で特に問題はないものと考える。ところが この湯液を濃縮する ことによりケイアルデヒ ドのほ とんどが揮散消失することが判明した 。エキス製剤とする場合は,濃縮・乾燥の工程は避けられない。ケイア ルデ ヒ ドが漢方処方それぞれの効果にどのように関わっているかは明らかではない。しかし漢方湯液をエキス製剤 とする場合可能な限り湯液に近い品質を目指すならば.せめて土びん煎出の場合のケイアルデヒド濃度は確保したい ものと考える 。 しかし現実の葛根湯エキス製剤の薄層クロマトグラフ展開ではわずかなケイアルデヒド残存量は認 . められるものの,通常の液体クロマトグラフ法では検出が困難なくらいまでに揮散してしまう。ともかく今回の実験 結果によれば漢方処方をエキス製剤とする場合の品質に限界を認めざるを得ない。 これがエキ ス製剤は煎じ薬よりも 効力的に落ちるのではないかと言われる原因のひとつなのかも知れない。天産物の生薬を原料とした製剤の品質設計 のあり方 について”限界を容認したままに放置するか”それとも“伺らかの方法で是正して,より湯液に近いものに するか”あらためて検討すべきであると考える。 Tabl e 2 径校中のケイアルデヒド の利用率 ( % ) 孟;---E: 竺 竺 分) 広 南 bp 30 60 90 120 桂 .枝 25 22 17 13 10 選流抽出 10 24 18 10 10 土びん煎出 12 11 9 葛橿湯 注)抽出水量1 0 倍 参 考文献 1 ) 漢方処方の抽出条件と エキス量(第 l報)家庭薬研究 No.l 2 ) 甘筆中のグリチルリチンの湯液への移行率(第 1報)家庭薬研究 N o .5 Bゐ 宅 RM 1L . 且 hu n v y −− 02 ’ r且 , A V し o b , eo 部制 nu p b 町 同市 ah −− d 市内 aCEu m・ a P High Performax:ice . 旧L YAY Construction 。’ 液体クロマトグラフィーのデータベース化について 富山県薬事研究会分析部会 D i v i s i o n of AnalyticalChemi st ry , Toyama Pharma c e u t i c a l Research a s s o c i a t i o n 江野本 加詩雄 Kazuo ENOMOTO 株式会社贋貫堂 Kokando Co.Ltd 川島 剛 富士薬品工業株式会社 TsuyoshiKAWASHIMA F u j i Chemi c a lI ndust r i e s .Ltd 0河 原 康 映 YasuakiKAWAHARA 大協薬品工業株式会社 Taikyo Pharmaceut icalC o ., Lt d 島谷隆夫 Takao SHIMATANI テイカ製薬株式会社 Teika Pharmaceu t i ca lC o . , L t d 同橋 浩美 Hiromi TAKAHASHI 株式会社内外薬品商会 Nai g a i Medi c i n eC o . ,Ltd 舘 智恵 Tomoe TA CHI 株式会社内外薬品商会 Naig a i Medicine Co., L t d 利 明 ‘ b Toshiaki TACHI 明治薬品株式会社 M e i j i Yakuhi n Co, .Ltd 花染 功 l s ao HANAZOME 東E薬品株式会社 Toa Medicene Co.,Ltd 横田洋 Youi ch i YOKOTA 富山県薬事研究所 Toyama Pre f e ct u a lI n s t i t u t e for Pharmaceut i c a l Research 舘 f ' l 一 = E 緒 司 医薬品の分析条件の設定は,似通っ た製剤の分析例などを参考 にしておこなう場合が多いものと考えられるが, そ の際. 過去におこな った分析チャ ートを探すのに大変苦労することがある。またカラム メーカーから送られてくるア プリケ ー ション集やダイレクトメールにも有益な情報が掲載されているが, いざ参考にしようとすると所在がわから 方 ない・−−− ということもある。 パーソ ナルコンビュ ーターの普及には目覚ましいものがあり, 医薬品の FD申請が導入されることもあって, z z ロ − 4l すでに導入済みの医薬品メーカーも多いことと恩われる。 しかし これまでのコンビュ ータの利用は文書の作成. 算などが主であり医薬品の開発に対して積極的な利用はなされてなかったのではないかと 考えら れる 。 そこで,医薬品の分析条件の検討に要する時聞を短縮するためこれらの条件,特に分析方法として主流である液体 クロマトグラフィーでの分析条件を中心としてデータの蓄積を行い.コ ンビュー タを利用して必要なときに必要な情 報を検索, 表示できるデー タベースを構築することを目的として検討を行ったので報告する。 u 丹 ’ 区U 実験の部 1 . ハー ドウェアの構成 使用したノ、ードウェ 口 比 アの構成・機器名を F i g .l こ '示した。パーソ ナルコンビュータとし ては.現在もっとも一 般的と考えられる PC- 9 8 0 1シリ ーズを用い, 本体.ハ ードディス ク とプリンターという構 成で行った。 ¥ ; ! . / \ − ト e テe イ ス ク ハ .ーソ ナ J~ コンビューヲー 7 • リンタ ー Corsair PC-9801RX PC-=PR201X (Logi tec) (NEC) ( NEC) Fi g.1 使用したハードウヱア ・ 徴器名 2 . 市 販 HPLCデータ ベースを用いた検討 データベ ースの構築に際しては立ち上げがもっとも大変であり .そ の膨大なデータの入力に労力が費やされる。 そこで.既にデータの蓄積が行われている市販の液体クロマトグラフィーデータベースを用い.それにデータを追 加することによって目的とするデータベ ースを構築する可能性について検討した。データベ ースとしては高速液体 クロマトグラ フィ一分析例デー タベ ース(株式会社ウォ ーター クロス製),高速液体クロマ トグラフ ィー データベー ス(株式会社アイピーシー製)を用いた。 3 . データベースの構築に関する検討 成分の保持時間.溶出順序などがただ数字で示されるだけよりは.ク ロマ トグラムが表示された方が理解しやす いと考えられた。そこで.チャートを画像として読み込み. この画像をデータベース化する可能性について調査を . 行ったところ.可能であると考えられたので以下の検討を行った。 l ) ハ ードウエア コンビュ ータ の入力方法としてはキ ーボードからの入力が一般的であるが,今回の画像を読み込むことはキー ボードからでは不可能である。そこで,イメージスキャナーで画像の入力を行うこととした。イメージスキャナ ー IN503Gを RS-232Cでコンビュータと接続した。" として PC- 2 ) ソフ トウェア データベースソフトウェアを調査したと ころ.画像データも菅理できる ソフトウ ェア が市阪されており,画像・ 文字を共にデータベ ース化し菅理することは可能と考えられた。 d (株式会社クレスト製)を用いた。 今回は.それらのうち比較的安価なデータベースソフトである F-Car ' STAFF K id9 8(株式会社ツァイト製)を用い.ベタファイル また.画像を読み込むためのソフトとしては Z’ として保存した。 3) 入力フォーマット データの検索を行うためには.現在のところ文字(キーワード)によるしか方法が無い。しかしキーボード からの入力は手聞がかか非能率的である。そこで,イメ ージス キャナーでの入力に重点をおき. キーボードか らの入力は極力少なくした。 4 ) ファイルサイズと画像形式 id98では. 一般に画像ファイルは通常の文書等に比較してそのファイルサイズが大きくなる。今回使用した K ベタ ・ファイルの場合 R, G, B. Eの 4ファイルが作成さるる。そこで,ファイルサイズを小さくするために O 内 E J V L . : . 寸ーー ファイル圧縮ソフトの利用について検討を行い. D i e t 2 1 を使用した。また,画像形式について検討を行い, 1フ J ) を使用した。 ァイルで利用可能な MAG形 式 と し こ れ を 表 示 さ せ るソフト として Magd 5 )画像の出力 表示した画像の印刷方法としては,ハ ー ドコピ ー,すなわちディスプレーに表示されている画像をそのまま印 igitalTool s (DigitalWave I nc .)を使用した。 刷する方法を用い.そのためのソフトとして D 結果及び考察 1 . 市販 HPLCデータベースの評価 2種類の市販 HPLCデータベースをテス卜した。 高速液体クロマトグラフィ一分析例データベース(株式会社ウォータ ークロス製)は表計算ソフトであるロ ータ ス 1-2-3 ( ロ ータス株式会社製)上で稼働するデータ集であり.高速液体ク ロマトグラフィーデータベース(株式会 社アイピー シー製) は単独で稼働しデジタイザによるチャートの入力も可能である。しかしながら e いずれも機能, 操作性の点で今回の目的には不向きと考えられた。 ~ 2.データベースの構築 画像をデータベース化す ることは可能と考えられたことから,本デー タベ ースの概略を Fig 2に示す通りとし 導入コストがかからず,さらに操作性に優れたものにしたいと考えた。 1 ) ハードウェア・ソフトウェア コ ンビュ ータとしては PC-9801R Xを主として使用した。速度の点で違いはあるものの, PC-9801シリーズ(ま l e1 たは互換機)であれば本データベースの利用は可能である。本データベースが稼働したコンビュ ータを Tab に示す。ただし.デー タザイズが大 きくなることから ハー ドディスクは必要と考えられる。 画像情報 (チャート等 ) T 文字 情報 (分類 ・キーワード等 ) タベ ー ス Ta b l e 1 本シ ス テムの動作確認機種 メーカ− 機種 OS NEC P C -9 8 01R X MS-DO S Ver.3. 30 P C- 9 8 0 1 E X MS-DOS V er. 5. 0 検索 報 一 ’−報 文字情報印刷 示 一 制 表一印 一回 一 一 回 情 一J − 情 像一 像 文字情報表示 H9 8SModel U 8 I I PC- 98 0 1SX/ E MS-DOS V e r .3 .3 C P C- 9801 N S/ A MS-DOS V er. 5. 0 E P S0 N P C- 28 6N 0T E f MS-DOS Ver. 2. 1 PC-386NOTEA I I F i g.2 データベースの綴略 ハ ードウェアとしてイメー ジスキャナを追加したが.実際にスキャナ ーで入力を行ってみると,キ ーボー ドか らの入力に比べてその労力ははるかに少なくてすむ。さらに本来ならキ ーボードから入力するのが普通である分 析条件等もチャ ート に書き込む,あるいは張り付けることによってキ ーボー ドからの入力を 減 ら し キ ー ボー ド から入力するのは検索に最低限必要な事項にとどめ手聞をはぶ〈工夫をした。 また.データベースソフトとして今回は F-Cardを使用した。この ソフトは外部プロ グラムの実行機能叫があ り.書式に画像表示プ ログラム(今回は Magd)を指定すれば. SHIFTキー+リターンキーで画像表示プログラ ムが立ち上がり画像が表示される。したがって重要なのは外部プログラムの実行機能であり.この機能が付属す - 54 - f ' ) るデータベースソフトであれば,文字デ ータのわずかの変更で本システムの運用が可能と考えられる。この際. 別のファイルになっている画像情報には何ら影響を与えない。 2 ) 入力フォーマット イメ ー ジスキャナー Table 2 入力フォーマット による画像の読み込み を採用したこともあっ て,キーボードからの 入力は検索に必要な最 低限の項目とし , Tabl e 2に示すような フォーマットで行うこ ととした。これらの項 目のうち不可欠である 93/06/10 [HPLC DATABASE A i番 号 B i分類 1 l 分類 2 DI キーワード El キーワード 2 c F| カラム名 G Iチ ャ ー ト フ ァ イ ル 名 H Iメ ー カー・ 資料名 ] No. 54 I54 |ビタミン |水溶性ビタミン | へスへ.リシ’ン.ハ・ンカI~. 812,86,81.82 I b .干shiseido¥cap_054. mag |資生堂 カラム ・充境剤総合カタログ第 1版 のはチャ ートファイル = . 名とキーワードの 2項 目である。検索はキ ー ワード(成分名) ,分類(薬効)で絞り込みを行い,チャ ー トファイル名の項で SHIFTキー+リターンキーを押 せば外部プログラム実行機能が働きチャ ー 卜が表示されることになる。 3 ) ファイルサイズと画像形式 今回使用した Kid98 では.ベタファイルの 場合拡張子が R, G. B . Eの 4 ファイルが 作成され日.サイズはそ れぞれ 32.000bytes. 合計 128,OOObytesが必 Table 3 D i gによる圧縮の効果 圧縮前 圧縮後 C A P0 0 1 C A P_ 0 0 1 C A P_ 0 0 1 C A P _ 0 0 1 8 1 R 1 G 1 E 1 3 2 0 0 094 -•ψー牢* 3 2 0 0 09 4− 字 傘 ー キ * *ー 中 ・ 3 2 0 0 09 4− * * ー 事 掌 3 2 0 0 09 4− 9: 1 s 9: 1 s 9: 1 5 9: 1 5 C A P_ 0 0 1 8 1 C A P0 0 1R 1 C A P _ 0 0 1 G 1 参 事 2 8 8 39 4 . .− 2 8 8 39 4 − ・ 宇 ー 傘 本 2 8 8 394 -•• $$ 9: 1 5 9: 1 5 9: 1 5 C A P_ 0 0 2 C A P_ 0 0 2 C A P_ 0 0 2 C A P _ 0 0 2 8 1 R 1 G 1 E 1 事事 _ 3 2 0 0 09 4. . ー キ ・ − 牢 $ 3 2 0 0 09 4 3 2 0 0 09 4 ー ホ * ー キ 噂 − ・ 牢 3 2 0 0 09 4 -. . 9: 1 7 9 : 1 7 9: 1 7 9: 1 7 C A P _ 0 0 28 1 C A P _ 0 0 2R 1 C A P _ 00 2G 1 3 0 8 494-•本ーホ事 − 事 事 ー 政 事 3 0 8 49 4 3 0 8 49 4 − 念 宇ー 傘 牟 9; 1 7 9: 1 7 9 : 1 7 C A P0 5 9 C A P _ 0 5 9 C A P0 5 9 C A P0 5 9 8 1 R 1 G 1 E 1 ー ホ * 3 2 0 0 09 4-o 3 2 0 0 09 4− * * ー ホ $ 3 2 0 0 09 4 ー . . ・ 宇 事 ー 常 命 ー ・ * 3 2 0 0 09 4 1 5: 0 1 1 5 : 0 1 1 5: 0 1 1 5: 0 1 C A P0 5 9 8 1 C A P_ 0 5 9 R l C A P0 5 9 G 1 5 9 4 99 4− *− 噂 場 1 5: 0 1 ホ$ ー・ 事 $ 1s: o 1 5 9 4 99 4 s: ・ 0 1 5 9 4 99 4− ・ ・ ー * * i C A P0 6 0 C A P _ 0 6 0 C A P_ 0 6 0 C A P _ 0 6 0 8 1 R l G l E l 3 2 0 0 09 4 − * * ー $ $ . 3 2 0 0 094 -•寧- . 3 2 0 0 09 4 * * * * ー 事 傘 ー 傘 $ 3 2 0 0 09 4 1 5 : 0 3 1 5・ : 0 4 1 5: 0 4 1 5: 0 4 C A P0 6 0 8 1 C A P _ 0 6 0 R 1 C A P _ 0 6 0G l − . 本 3 1 4 19 4 -. . 3 1 4 1 94 -•寧-·事 . . ー 取 * 3 1 419 4 - 要となる。これはフロ : : J ッピーデ ィスク l枚に 9枚の画像しか入らな いことを意味する。そ こで, 4ファイルのう ち表示に必要でない拡 張子が Eのファイルを 2 4 0ファイ jレ 640000 Bytes I 1 80 ファイル 1 5: 0 3 1 5 : 0 4 1 5: 0 4 54297 Bytes 削除しさらにファイ ル を 圧 縮 するソフト Dietを用いることにより , l枚の画像に要するファイル容量を約 10分の lに減らすことができた。 Table 3に圧 くイ卜必要であったが圧 縮の前後を比較した例を示した。この例では 60枚分の画像で圧縮前は 240ファイル,64万ノ 縮後は 180ファイル 5万 4千バイトとなり圧縮の効果がみられる。 Dietは . メモリに常駐し圧縮された画像ファイ ルは読み出しの際,展開・表示されるためその存在を意識する必要はなく初心者にも利用しやすい。 当初は前述した Kid98のベタファイル形式でデータの蓄積を進めたが.画像 200枚. 300枚と多くなるにつれ. ファイル菅理が繁雑になり,また,データのサイズも大きくなってきた。そこで画像ファイルの形式について検 討を行った。検討の結果. lファイルで画像表示が可能な M AG形式を採用しそれまで蓄積したデータの変換を行 った。画像ファイル形式として MAG形式を用いることにより従来は l枚の画像につ いて 3ファイル必要であった FD pb L 』 ものが lファイルです T a b l e4 函像形式によるファイル数の変化 むようになりファイル 菅理が容易になった。 また.それにつれて必 要なファイルサイズも 約2 分の lになった。 Tab l e4に画像形式変換 前後のファイル数を比 較した例を示した。こ MAG形式 ベタ ファイル形式 C A P_ 0 0 1 B l C A P_ 0 0 1 R l C A P_ 0 0 1 G l . 2 8 8 394-••-. 2 8 8 39 4 * * -. . 2 8 8 394 -•,・H 9: 1 5 9 :1 5 9: 1 5 C A P _0 0 1 M A G − ・ ・ ー ・ ・ 3 2 0 19 4 a: s s C A P _ 0 0 2 8 1 C A P _ 0 0 2 R l C A P _ 0 0 2 G l 3 0 8 49 4 ・H 吋 . 3 0 8 49 4 − ・ ←H 3 0 8 49 4 -. . . . 9: 1 7 9: 1 7 g: 1 7 C A P _0 0 2 M A G 3 4 9 69 4 -. . -. . 8: 5 7 C A P _ 0 0 3 8 1 C A P _ 0 0 3 R 1 C A P _ 0 0 3 G1 ・ * ・ − ・ ・ 3 0 4 29 4 3 0 4 29 4・帥 叶 $ 3 0 4 294-•トH 9: 2 1 C A P _ 0 0 3M A G − ・ ・ 3 6 4 09 4 -. . 日: 5 7 9・ 2 1 C A P _ 0 5 9 6 1 C A P0 5 9 R l C A P0 5 9 G l 5 9 4 99 4 ・ + + − + + 5 9 4 99 4 ・ ・ 9・ H 5 9 4 99 4 1 s: o 1 1 s: o 1 1 s: o 1 C A P0 5 9 MAG 6 6 1 39 4 -. . ・ . g : o s CAP _ 0 6 0 B l CAP0 6 0 R l CAP0 6 0 G l 3 1 4 19 4 − ・ ・ − ・ ・ 3 1 4 19 4 − ・− ・・ 3 1 4 19 4 -h. . 1 50 3 1 5: 0 4 1 5: 0 4 C A P _ 0 6 0M A G 3 5 9 99 4 − ・− ・・ ・ 9: 0 4 9: z 1 こに示した例では 6 0枚 の画像分で 1 8 0ファイル 5万 4千バイトであった ものが変換することに 0ファイル 2万バ より 6 イトになったことを示 ・ . ・ - 18 0 ファイ l レ 5 4 2 9 7Bytes 6 0 ファイ J し 2 0 5 4 9 Bytes ・ b しており,ファイル菅 理は容易に行えるよう になった。 1 異 ‘4・ IO> ( ’ . . . . ’ 叫 1シ ・'""" "ルレ?•・< ’ •. . 2 ・ ‘’ ’. , } ’ Z , ァ3パ , , , .. .. , , , . , '~•,ψ,,. . 該 , . t ・ “ ’ , , , ,. ., , .( ン ,’, 8 . ,, . , . , , . . . . . . . . . . ’ ,, ・ ; i : . I I !• 4 )画像の出力 1・: ~r ゐ•1:,.u •r:it,,ピ,, ' . L F i g3に出力した画像 の例を示した。左側が 官、 入力した画像,右側が ~ 出力した画像で,出力 した場合画質としては かなり荒くなるが,理 解することはできると ¥ 1 J 』 _,J _一 , .一 暗 号 " 与 N H, . ・ 5‘ . 。 . , , ・ ・ ・ , 向 附 . :" ' 叫C 側 主 UV ,_ ( , ご, S , . ・” .・ ・ 叫 ’ ,, ,, , IJU•,ァt ’ニドJル/ U mMIC”,p。.... " ' J l... 注 入' " " " ' 考えられる。出力に用 し 、f こD i g i t a lT o o l sは . 出力した画像 入力した画像 様々な画面でハードコ F i g .3 画像の例 ピーを取ることができ るが. 一部のソフトで は利用できない可能性もある。 5 ) 構築したシステムと利用 以上の検討の結果構築した本データベスシステムの機器ソフトの構成を Fig4に利用の手順を Fig5に示す。 本 A日 と め 今回の検討により,比較的安価なソフ トウェアーやフリーソフトウェア ーを利用し十分実用 に耐える画像データ ベー スの構築をおこなうことができた。本データベ ースはデータを画像情報として表示するため, ピークの形状 ・分離の 状態もわかり理解しやすいものとなった。さらに,今回おこなった HPLC以外にも GCなどのデータを追加するこ ともでき,汎用性の高いシステムとすることができた。 e n o pb I U I国 I AB cDI 百 像 情 報 ( キーワード ・ ( チャート等〉 イ メ ーγス キャ ナーによる入力 (Ki d98) K id 9 8 文 字 情 報 テ ャ ート77イ品名等) キーボー ドからの入力 CF- Card) ベヲファイル形式 形式変換 C M ag dl F - C a rd M AG形式 F-Card ファイル圧縮( Di e t) 函像フ ァイル MAG 文字情報ファイル 後索 CF- Card) ;函像表示プログラム実行 1 章表結果 同 a 1 . CMag d) 「- g三三~I I U I Fig 目 文 , . CF -Card) 百像表示 文字情報表示 ハードコピ ー CFーC a rdl ( D i git alT o ol s ) I 画像印刷 4 機器・ソフトの権成 文字情報印 刷 Fig.5 *システムの利用手順 献 1 ) PC-IN503G取扱説明書,日本電気株式会社. 1 9 8 8 2 ) 秀作フ リーソフトウニア 1 00 選 PART3,株式会社アスキー, 1 9 9 2 3 ) 秀作フリー ソフトウェア 1 0 0 選 PART2,株式会社アスキー. 1 9 9 3 4 ) F-C ard V 5取扱説明書,株式会社クレスト. 1 9 9 3 5 ) Z・ s sTAFF Kid9 8リファレンスマニュアル,株式会社ツァイト, 1 9 9 3 本文,図表中の機器 . ソフ トウェ アはそれぞれの会社の製品名です。 MS-DOSは米 国マイクロ ソフト社の登録商標です。 D i e tは Teddy Matsumoto (松本孝)氏の著作物, Magdは TAK/ARAKAW A Laboratory 氏の著作物で す 。 t 勾 FD ~ フ ル ノ レビ、 プロフ ェンの経皮適用後の組織移行性の検討 一一 ラット i ns it u試験 一一 St udy of D i s t r i but i o ni nto Subcutaneous Tisse o fF lurb iprofen a ft er Topical Appli c a t i on 一 一 − Rat in situ test一 一 一 0浜 本 哲 和 笹倉 貢 Tetsukazu HAMAMOTO Mitsugu SASAKURA 松海孝泰 住吉晴美 Takayasu MATSUZAWA Harumi SUMIYOSHI 玉沖英垣 Hidetsune TAMAOKI リー ドケミカル株式会社 医薬研究部 Pharmaceut ic a l Research Depar tment, Lead Chemic a l Co.L t d . 緒 ・ b ~ Eコ 一般に経度適用後の薬物は速やかに真皮中の血管より吸収され全身へと送られると考えられている。しかしながら 一方で,薬物適用部位直下の組織内濃度が非適用部位に比べて有意に高いことが明らかにされている。このことは, 。 皮膚から吸収された薬物の一部が血流に乗らずに直接組織に移行することを示唆する 1) 今回我々は局所適用消炎鎮痛剤であるフルルビプロフェンを用いて薬物適用部位直下への薬物移行について検討す ns i t u試験を行ったので報告する。 るためラット i 実験の部 1 .実 験 材 料 1 )使用 f) 動物 生後 9∼ 1 0 週齢のウイスタ ー ST系雄性ラットを使用した。ラットはあらかじめ室温2 2 ± 1。’湿度 5 0 ∼ 60%の動 物飼育室で一週間予備飼育 し,飼料としてラ ッ ト周囲形飼料(船橋農場製. MM-3)を用いて.飼料,水ともに自 由摂取させた。 2 ) 使用薬物 サリチル酸(和光純薬工業) フルルビプロフェン 以下.フルルビプロフェンを FP,サリチル酷を SAと省略する。 3 )被験薬剤 FPおよび SAを以下に示す処方でゲ jレを調整した。 (w/w%) Drug f l .-Ment hol 2 EtOH 3 0 PVA 5 日0 6 2 口 D EV −邑三壬ι セル 被験薬剤 ー 唖 ー ー ー一 F i g . 1I ns i t us y s t e m =~• 2.実 験 方 法 1 ) i ns i t u 試験 ラットを l群 3匹使用し.背部を電気ノ 〈 リ カンでせん毛後,背部皮膚の中央部を切開しアクリル製フローセル(拡 散有効面積 2cmつ を皮下に 2個挿入した。 ( Fi g . I)一方を薬物適用部位とし,他方を対照とした。ラットをポー の等張緩衝液を 3m.(!/hで ルマンケージ内に固定した後,ペリスターポンプを用いて各々のフローセルに pH7.4 濯流した。一方のセルに薬物用量lOmg/kgを適用した後,経時的に両セルの濯涜液および尾静脈より血液を採取 し 各 々 の 薬 物 濃 度 を HPLCで測定した。 2 ) 薬物速度論的パラメータ ーの解析 ラット( 3 5 0g)を l群 3匹使用した。大腿静脈より薬物 lmg/kgを投与後.経時的に採血し HPLCで測定した。 0.4 のf − ’ ︵ EO \凶ミ︶ N . . 2 . 5「ー←− A p p li c a t1 o np a r t −・ − ・ Non-appI ic a t i o np a r t ~ 0 .3 . . r : : : . 、\ ι 2 T ime (h) F i g . 2P e r m e a t i o np r o f i l eofFPt os u b c u t a n e o u st i s s u e a f t ert o p i c ala p pl ic a t i o n - 59 - VE222 占・﹄ EEa nH 4 リV T ime (h) , a 。 ・内 , , n = 3 − 0 .1 τ aEA L ι E iT 。 ﹃申i 05 aA − VEa TEι bl) コ H 1 a . ~ T EEhFEEL ~. . 処3 : : : t0 .2 VEBESEAT﹃EEEEa bl) . . α3 ’ .. . . − − − . − ・ . . . . . コ て C l ) . . ’ ・ , . ’ ’ ’ .. . . . . . ’ . . ’ . . r吋︾ ε 、\ 一+− Applicationp a r t 1 .2 − ・Non-appIicationpart 6 −・ ︵ 日 、 NEU ~ ~ 0.8 bO ミ . . . _ , 0. 6 un x : : i l . L . s 凶コ﹂O , − ‘ 勾mwE﹂由 a \凶ミ︶ヨニ伺 waay F ( = 」 、 e﹄’ n=3 。 。 0. 4 n=3 0. 2 0 2 4 6 T ime (h) 8 0 2 4 6 8 Ti me (h) F i g . 3Pe rmea t i o np r o f i l eofSAt os u b c u t a n e o ust i ss ue a 丘e rt o p ic ala p p l i c a t i o n • 結 果 1.謹流液中薬物濃度 FPと SAの薬物経皮適用後の濯疏液中への累積移行量と移行速度の結果を Fig.2 , 3に示す。薬物適用部位のセ f 音量移行した。移行速度も非適用部位と比べて適用部位のほうが約 ル濯流液中 FP量は非適用部位のそれに比べて 2 2 f 音高かった。一方, SAでは累積移行量.移行速度ともに適用部位と非適用部位に有意な差は認められなかった。 2 . 血捜中薬物濃度の時間的推移 FPと SAの薬物適用後の血授中程度の時間的推移を Fi g. 4に示す。 FPゲルの経皮適用後の血捜中盤度は 2時間 , , . , 5 .3h)になったカ〈, で定常状態( C~. .1 0 .4μ . g/m.Q, T. SAゲルの血紫中濃度は 4時間で最大 ( Cm .3 3 .8μ . gI m.Q• ・ . T 4 .7h)となった。 b ー ・ . S A 干 − r − i ti ,F r −i aF dF , , ・− − FP τ a 1 5 aF , ,, ,, , , , , ,, , 2 0 1φ4i 4 内 U 2 5 A Ial , ︵ 一 ε\凶 ミ︶ co 一判団﹂HCUOCOO 3 5 / E 同国一色 問 1 0 5 。 。 n=3 2 T im 巴 4 (h) 6 F i g . 4Plasmac onc en t r a t ionofFPa ndSA a 丘e rt op ic ala p p l ic a t i on -6 0- ・ 8 Table1P h a r m a c o k i n e t i cp a r a m e t e r so fFPa n dSA a f t e ri n t r a v e n o u sa d m i n i s t r a t i o n( n = 3 ) D o s e ( m g / k g ) A 3 . 5 6 0 F P 1 .0 1 .0 S A B 4. 0 3 4 9 .8 0 8 0 .2 9 4 0 0 .3 8 9 0 7 5. 0 0 0 . 3 3 6 1 . 2 9 3 0 .5 8 2 4. 9 8 4 2 9 .7 4 8 .6 3 0 0 .1 2 2 0 0 . 2 6 3 0 6 4.1 6 → ー − ← → − → − → − →ー 3 . 8 4 0 →− 0. 5 0 8 4・ 0. 01 4 9 0 .1 0 7 7 AUC ( μ g ・ h / m l ) 1 0 5. 4 4・ ± 0 . 0 0 4 0 0 . 0 1 51 → − 1 .6 1 6 a . • p K e V e ( h 1 ) ( h 1) ( mり α ( h 1 ) + 3 .7 9 →ー 2 6. 7 3 5 .0 3 73. 7 → − 1 3 .2 4 0 0 , \ I I I 3 0 0 ¥ 』 二 、 守 、 . I E I u 、\ 凶 ミ 2 0 0 H コ 一 斗 I 1 0 0 \ ~SA 、 、 、 、 \ \ \ \ 、 、 ー← ー ーー ー−ーーー. ーー− -− 一 . 6 8 T i m e(h) F i g . 5Cal c u la t e ds k i np e r m e a t i o np r o f i l ebyd e convol u t ion Table2 P h a r m a c o k i n e t i cp a r a m e t e r so fFPa n dSA a f t e rt o p ic ala p p l i c a t i o n( n = 3 ) FP C m a x(μ g / m ) l h ) T m a x( ・ h / m l ) A U G (μg a b s o r p t i o nr a t i o( 覧 ) a p pl ic at i o np a rt F r 『 1 a x( μ g / c m 2 / h ) T m a xC h ) n o n -a p pl ic a t i onp a r t F r 『 1 a x( μ g/ c m 2/ h ) T ma xC h ) 1 0. 4±0. 6 5 .3±0.9 1 0 5 .5±5. 8 . 6 。 SA 3 3. 8±3. 9 4 . 7 土0 . 9 3 7 3 . 8±13. 2 1 5. 8 0. 40±0 . 0 8 6 . 0±1.6 1 . 06±0. 3 9 4 . 7 ±0. 9 0.1 8±0.0 5 5 . 3±0. 9 1 .1 1±0. 4 0 4 .7±0. 9 -6 1- 3 . 全身血への薬物移行速度 薬物静脈内投与により求めた薬物速度論的パラメーター( Tabl e 1)を用いて,経皮適用後の血紫中薬物濃度推 移により薬物の血中への移行速度を求めた。( F i g .5) FPの移行速度は薬物適用後 4 5分で最大となり 2∼ 8時間の間ほぼ一定の速度を維持した。 SAの移行速度は薬物 適用後 2時間で最大となり以降徐々に低下し' 6時間後にはほとんど吸収が終了していること が確認された。また. .6%で SAが 1 5 .8%だった。( Table 2) 薬物の吸収率は FPが 8 考 察 今回の実験により,累積移行量の推移と血集中薬物濃度の推移から FPは SAに比べて局所適用による深部組織への 移行性が高い薬物であると考えられる。そこで,局所適用による深部組織への移行性は薬物により異なり,その移行 速度は必ずしも全身血への移行速度に依存しないと考えられる。 今後の課題として.局所適用後の直接皮下組織への移行性と薬物の物理化学的性質の関係,および皮下組織移行メ カニズムについて検討していきたいと考えている。 文 ・ b 献 1 ) 斎藤晴夫,元山貢: T h e rR e s1 0:9 7 79 7 9 ,1 9 8 9 f) - 62 - 生薬試験用標準品の規格設定に関する検討 ( 第八報) 一一一市販抱合胆汁酸標準品の 品質評価一一一 S tudies on Standardization of Crude Drug Component s( V I I l ) 一 一一Evaluation of CommercialConjugated Bil e Acids一 一一 富山県薬事研究会分析部会(抱合胆汁厳分科会) D i v i s i o n of A n a l y t i c a l Chemis t r y , Toyama Pharmaceut ic a l Reserch A s s o c i a t i o n I . 長谷香織 Kaori HASE 共栄製薬(株) Kyoei Pharmaceutical Co.LTD 大塚明美 Akemi OTSUKA 第一薬品(紛 Daii c h i Medicine C o . , LTD 石田貴日 TakahiISHIDA 吉崎真由美 第一薬品工業側 Mayumi YOSHIZAKI D a i i c h i Pharmaceutical C o . ,LTD 0中 野 秀 子 ’ . 緒 Hideko NAKANO 大同製薬(紛 Daido Pharmaceuti c alC o . , LTD 藤田惇子 Hiroko FUJITA 中央薬品(栂 Chuo Yakuhi nC o . , LTD 大間知幸子 Yukiko OMACHI 松井製薬(紛 Matsui Pharmac e u t i c alC o . ,LTD 青木真知子 Machiko AOKI 明治製薬(紛 M e i j i Pharmaceuti c alCo.•LTD 浅水敬子 Kei ko ASAMIZU 明生薬品工業側 Mei se i Pharmaceutical Co. , LTD 横田洋一 Yo u i c h i YOKOTA 富山県薬事研究所 Toyama P r e f e c t u r a lI n s ti t u t e f o r Pharmaceutical Research 百 動物胆は胆汁酸分泌促進.整腸などの薬理作用があり,古くから胃腸薬等に数多く配合されている。勤物胆中の匝 汁酸は,ほと んどがタウリン及びグリシン抱合体であるため.これまで動物胆の品質評価法としては,抱合胆汁酸を 加水分解後,各種の誘導体とし,液体クロマトグラフ法やガスクロマトグラフ法により定量する方法が知られている が . これ らの方法は非常に煩雑であり.加水分解率にも問題があるという報告もある。最近.抱合体のまま胆汁酸を 液体ク ロマトグラフ法 により定量する方法も報告されているが.基準となる標準品の規格設定はなされていない。 そこで我々は.製剤に配合されることの多い熊胆及び牛胆の主抱合胆汁酸である,タウロウルソデオキシコ ール酸, タウロコ ール酸,タウロケノデオキシコール酸.タウロデオキシ コール酸, グリココール酸,グリコデオキシ コー ル 酸(以下, TUDC, TC, TCDC, TDC. GC, GDCと略す)の 6成分につき,標準品の試験方法と市販標準品の 品質評価を目的とし,共同研究を行った。 回 実験の部 1 .試験法の設定 1 ) TLC i 法 横田ら I)の方法に準じて,試料溶液の副スポットと.試料溶液を 1 0 0 倍希釈した標準溶液から得たスポ ットとの比較を行った。 ( 1 ) 試料溶液の調製 試料溶液 各抱合胆汁酸 標準溶液 試料溶液 6mg→ 2m. Q (メタノ ール ) 1m . e→lOOm.Q (メタノ ール) ( 2) 操 作 条 件 簿層板:薄層クロマトグラフ用シリガゲルを用いて調製した薄層板 展開溶媒:トルエン・氷酢酸 ・水混液 ( 1 0:1 0:1) 展 開 距 離 :約 lOcm スポット量: 1 0μ . Q 検出方法:ノ〈ニ リン 0 .8gを硫酸・エタノ ール混液( 4:1 )l O m . eに溶かした液を均等に噴霧後 1 0 5。 1 0 分加熱 2 ) HPLC法 横田ら 2)の方法に準じて.面積百分率法により求めた。 ( 1 ) 試料溶液の調製 試料洛液 各抱合胆汁酸 1)試料溶液 標準溶液 ( 15mg→ 5m . e (移動相) • 1m . e→ lOOm.Q (移動相) )標準溶液 ( 1 ) 1m . e→2 0 m . Q( 移動相) 標準溶液( 2 ( 2) 操 作 条 件 検出器:紫外吸光光度計(測定波長: 2 1 0nm) カ ラ ム:内径 4∼ 6mm,長さ 1 0∼30cmのス テ ンレス菅に 5∼lOμm の液体クロマトグラフ用オクタデシ ルシ リル化シリカゲルを充填したもの。 。付近の一定温度 カラム温度: 40 移 動 相 :0 .02Mリン酸 ー水素カリウム液( pH3.0 )・メタノ ール混液( 3 3:67 ) 流 量:各保持時聞が TUDC約 7分 , TC約 9分 , GC約 1 2 分 , TC DC約 1 5分. TDC約 1 8分. GDC約 2 5 分になるように調整する。 注 入 量 :1 0μ . Q 検出感度:標準溶液( 2 )1 0 μ . Qから得た各抱合胆汁酸のピーク面積が自動積分法により測定されるように調整す 1 ) 1 0 μ . Qから得た各抱合胆汁酸のピ ーク高さが記録計のフルスケ ールの約 2 0 る。また,標準溶液 ( %になるように調整する 。 面積測定範囲:溶媒ピークの後から各抱合胆汁酸の保持時間の約 3倍の範囲 3 ) 比吸光度( E値) 0nmと し 吸 光 度 が0 .5 付近になるように濃度 測定波長は吸収極大である 207nm及び HPLC測定波長である 21 を調整する。 4 ) 滴 定 法 電位差滴定法(グリシン抱合体) :GC, GDC 各々 0 .1gをとか非水滴定用氷酢酷 5 0 m . Qに溶解し. 0 .OZN 過塩素厳で滴定を行 った。 中和滴定法(タウリン抱合体):標準品が Na塩となっていることから .強酸性陽イオン交換樹脂でイ オ ン交換 し , 0 .OlN水酸化ナト リウム液で滴定した。 5 ) 融 点 、 日局一般試験法・融点測定第一法により試験した。 一白 一 @ 2 .品質評価 Lの方法に よ り , S社 ・N社の市販標準品の品質評価を行った。 結果及び考察 図 1 カラムの選定クロマ トグラムの一例 1 . 試験法の設定 1 ) T L C法 展開温度により分離が悪くなるが,約30。で展開 したと ころ,良好な分離が得られた。 H P L Cc o n d i t i o n x 1 5 0 1 t CC o l u o nT e o p .:40• C o lu t in: S T RO D S!ゆ t6 F l o wr a t e: . a7 m £ /ロ i n f o b il ep h a s e :0 .02~ K z H P O . ( p H 3. 0 ) ・C H i O H( 3 3: 6 7 ) D e t e c t i o nU V2 1 0 n o 2 ) H PLC法のカラムの選定 繁用性の高い ODS系カラムを中心にカラムの選 1 . 定を検討した結果を図 lに示す。今回評価を行う 6成分に加えて,グリ コウ ルソデオキシコール酸 (G UDC).グリコヒヨデオキ シコール酸 ( GHD C ) . グリ コケ ノデオキシ コール酸( GCDC)の 3成分 b 《 F D 成分の混合液を調製し.前記の操作 を加えた合計 9 』 ’ , , " =・ ・・ 条件に従って数本のカラムで分離を検討した。 1. TUDC STR-ODSI I(島津テク ノリサ ーチ). L-column 6. TCDC 2. TC 3. GUDC 4. GHDC 7. TDC 8.GCDC 9.GDC 5.GC (化学品検査協会). CAPCELL PAK Cl8 (資生堂), Wakosil 5Cl 8 -2 0 0 , Wakosil-II 5Cl 8 HG (和光純 ectB (MERCK)で比較的分離も良く.分析時間も 3 0分以内と良好だった。 そ 薬工業). Lichrospher Rp-Sel の性質にはあまり関係無く.広い範囲のカラムで分析が可能であることがわかった。 . 3 ) 比吸光度( E値 ) 吸収極大である 207nm付近では実験者聞のばらつきが非常に大きかったため,波長を 210nmに設定して測定し たが表 1のように.ぱら つ きが大きく信頼できる結果が得られなかった。吸収曲線のピークが非常に シャ ープな こ と,数値自体が小さいこと.測定波長が低波長であるために.測定機関による差が大きく現れる こと などが原因 . と考えられる。 4) 滴 定 法 llPL.Cによる : t且I i i n-6(指〉 比吸光度にかわる絶対的純度を求める方法 とし て滴定法の検討を行った。グリシン抱合体である Slt 99. l & Nll 97 .2 t : . Sil 99.5 企 N社 97. 7 ゐ TUDC GCとGDCでは.電位差滴定で良好な結果が得ら れるが,タウリン抱合体では終点が読みとれなか TC sit 98. 4 企 N仕 9 : . l .7 t : . Slt 98.7 Nll ) 98.! TCDC ( 210nm) 将司 I a , 16・13 b i c I13. 15 I 12.33 I13.00 ! 17・00 d TUDC事 1s i1 I・ i i i ! TC ITCDC • I ・icc TDC ICDC TDC !14.89 I12・40 I2s. 32 14. 33 1s. 50 14. 34 13. 22 I13・72 I io.83 12.04 I・ i・ 26 05 認定による) ; 0 . ' 1 1 1 1 n-6(出〉 25 28 I13 io !ユl.93 ! 12. 19 111. 98 I 10・67 ;25・09 GC S栓 ド ー ー ー ーー ー ー Nit " : > ; j14 373113. 2331 13.4781 14. 3981 11. 485126.185 SD !・ CV I1043" 1 971'• l 500 jl 284 I l・419 I I2・107 o. 864 I i. 483 1053"1 14. 63. .,7 52,. j 5.66" • N a祖 表 1 各抱合胆汁磁の比吸光度 C E値 〕 99. 2 一 99 一一 .2 Si t 99. l Nll 99. 2 GDC −0 TL .C判定 ・ n-6 訓スポットな L t ¥ 。 一 一 。 ・ llPL.C・ ' 1 0 : n-6(%) 日7.5 98. 3 Tl..C判定・ n-6 )( 企 96.6 )( 97.7 t : . : Q スポット t : ! ! l . < i S波より砲いむの 1 ) ( 凶l スポヲ ト鹿市福i l lより 櫓い bの 3倍以上 表 2 市販標準品試験結果 『 2創 った。そこで前記のように中和滴定を行った結果 1 05%という高めの値が得られ,タウリンやアミノ酸の混在が考 えられたが.タウリンを定量してみると極わずかで滴定に影響のない程度であり,アミ ノ酸も検出されなかった ため,なぜ高い値がでるのかわからなかった。 5 ) 融 点 温度を上昇させると途中で発泡し.さらに温度を上げると再び凝固してしまうため.融点を明確に読みとるこ とはできなかった。 以上の結果より,グリシン抱合体は純度試験として TLC法及び HPLC法,定量法として電位差滴定を用い,タ ウリン抱合体は.純度試験として TL Ci 法.定量法として HPLCi 法を用いることにし,それぞれ試験法を設定した。 2 . 市販標準品の品質評価 2社の市販標準品の 6成分の試験結果を表 2に示した。 HPLC法による定量文は純度試験ではカラム間,実験者間 の変動は小さかったが, 99%以上のものは少なく,胆汁酸の種類によってばらつきがあり, N社の TC DCのように かなり低いものもあった。 TLC法による純度試験では,そのほとんどに標準溶液より濃い副スポットがあり,不純 物が多いことがわかった。また, HPLC法で 99%以上のものでも副スポットがあり, HPLC法では検出されない不 純物の確認ができたものと考えている。しかし, GCもGDCも滴定による定量値は 9 9. 1 %. 9 9 .2%と高い値を示し. これは HP LC法や TLC法で認められた不純物が胆汁酸と同様に腿を持つものであり,これらがすべて滴定され ⑥ るためと考えられる。クロマトグラムを図 2,図 3に示す。 図 2 N社製標準品(タウリン抱合体}の液体クロマトグラム TDC TCDC liJL~ • 図 3 薄層クロマトグラム Rf 1 .0 0.5ト 0l . 。 . . 。 . 。 。 . . . . . . . . . . ’ − − . . . −. ・ ー . 。. TC T U O C TCOC { メ ーカー名} s~土 r o e GC GDC .主 ス ポ ッ ト TC TUDC T CD C Nr . 土 ス ポ ッ ト ・ 概湖沼海と同等か浪い : l J B書湖沼j在より簿い I~ スポ γ ト 0 - 66 - TDC GC GOC 古 4F と め 1 . 以上のように抱合胆汁酸の試験法を設定したが,タウリン抱合体に関しては絶対的純度を求める方法が設定でき ず,今後の検討が必要である。 2. 2社の市販標準品について品質評価を行ったが,純度99%以上のものは少なく,高価であるにもかかわらず,メー カーによっても,胆汁酸の種類によっても品質にばらつきがあり.標準品として使うには若干問題のあるものもみ うけられた。他のメーカーのものにヲいても.その品質評価を検討していく予定であるが.今後これらを使用する 際には注意が必要である。 文 献 1 ) 富山県薬事研究所所報(昭和6 3 年度):高速液体ク ロマ トグラフ法による市販熊胆及び牛黄中の胆汁酸の分析, 横田洋ーら' p . 1 0 3 2 ) 富山県薬事研究所所報(平成 2年度):高速液体クロマトグラフ法による市販動物匝中の抱合胆汁酸の分析,横 田洋ーら. p . 8 8 . nb , 勾