Download ThromboPath - 0020005500 HemosIL® ThromboPath

HemosIL®
ThromboPath - 0020005500
ENGLISH - Insert revision 12/2008
Intended Use
Instrument/Test Procedures
Performance characteristics
HemosIL ThromboPath (ThP) is an automated chromogenic assay for the functional
evaluation of the Protein C anticoagulant pathway in human citrated plasma on the IL
Coagulation Systems. The assay is intended as an aid in the diagnosis of thrombophilic
defects such as Protein S (PS), Protein C (PC) deficiencies, Factor V Leiden (FVL) and
Lupus Anticoagulants (LA).
Refer to the appropriate IL instrument’s Operator’s Manual and/or Application Manual.
Precision:
Within run and total (run to run and day to day) precision was assessed over multiple
runs using both normal and abnormal control samples.
ACL 8/9/10000
Mean (PiCi%)
CV % (Within run) CV % (Total)
Normal Control plasma
81.8
0.61
1.55
Low Control plasma
67.6
1.97
3.02
ACL Futura/ACL Advance Mean (PiCi%)
CV % (Within run) CV % (Total)
Normal Control plasma
80.7
0.78
1.36
Low Control plasma
68.8
1.80
2.59
Summary and Principle
The Protein C anticoagulation pathway is one of the most important mechanisms of
regulation of coagulation. In vivo, thrombin bound to the receptor thrombomodulin
activates Protein C to Activated Protein C (APC). In turn APC degrades the
pro-coagulant factors FVa and FVIIIa, and this action is potentiated in the presence of
the APC co-factors, Protein S, Factor V, and phospholipids.
HemosIL ThromboPath determines the dysfunction of the anticoagulant Protein C
pathway by measuring the endogenous Thrombin generation as Protac-induced
Coagulation Inhibition Percent (PiCi%). During the assay, the plasma sample is diluted
with ThP Diluent and tested as two separate aliquots. One aliquot is incubated with
ThP Activator A (with Protac) and the other aliquot is incubated with ThP Activator B
(without Protac). Thrombin generation in both aliquots is started by the addition of ThP
Thromboplastin. Thrombin activity is quantified after addition of ThP Chromogenic
Substrate by an increase in optical density at 405nm. The final result of the assay is
calculated as PiCi% = ((OD with Activator B - OD with Activator A) / (OD with Activator
B)) x 100. A cut-off can be determined for each instrument platform. Below the cut-off,
samples may be pathologic for either PC, PS or APC Resistance and Lupus
Anticoagulants.
Composition
The ThromboPath kit consists of:
D
ThP Diluent (P/N 0020005521): 2 x 10 mL vials of a liquid preparation containing
HEPES buffer, polybrene, bulking agent and preservatives.
S
ThP Substrate (P/N 0020005522): 1 x 8 mL vials of a lyophilized preparation
containing chromogenic substrate S-2796 Z-D-Arg-Sar-Arg-pNA.2HCL 1.46g/L
with bulking agent.
T
ThP Thromboplastin (P/N 0020005523): 2 x 4 mL vials of lyophilized PT reagent
containing HEPES buffer, Tissue Factor, synthetic phospholipids, calcium,
magnesium, manganese, bulking agents and preservatives.
A
ThP Activator A (P/N 0020005524): 1 x 5 mL vial of lyophilized protein C
activator fraction from the venom of Agkistrodon contortrix contortrix (Protac®)
with bulking agent and preservative.
B
ThP Activator B (P/N 0020005525): 1 x 5 mL vials of lyophilized activator B
without Protac and with bulking agent and preservative.
L
Low Control Plasma (P/N 0020005526): 2 x 1 mL vials of lyophilized human
plasma containing a low level of Protein S.
PRECAUTIONS AND WARNINGS:
The materials in this product were tested by FDA approved methods and found nonreactive for Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg), Anti-HCV and HIV antibodies.
Handle as if potential infectious 1
Avoid contact with skin and eyes (S 24/25). Do not empty into drains (S 29). Wear
suitable protective clothing (S 36).
This product is for in vitro Diagnostic Use.
Preparation
ThP Diluent: Ready to use, invert to mix before use.
ThP Substrate: Dissolve the contents with 8 mL of CLSI (formerly NCCLS) type II
water or equivelant.2 Replace the stopper and swirl gently. Make sure of the complete
reconstitution of product. Keep the reagents at 15-25°C for 30 minutes and invert to mix
before use. Do not shake.
ThP Thromboplastin: Dissolve the contents with 4 mL of CLSI type II water or
equivalent.2 Replace the stopper and swirl gently. Make sure of the complete
reconstitution of product. Keep the reagents at 15-25°C for 30 minutes and invert to mix
before use. Do not shake.
ThP Activator A: Dissolve the contents with 5 mL of CLSI type II water or equivalent. 2
Replace the stopper and swirl gently. Make sure of the complete reconstitution of
product. Keep the reagents at 15-25°C for 30 minutes and invert to mix before use. Do
not shake.
ThP Activator B: Dissolve the contents with 5 mL of CLSI type II water or equivalent. 2
Replace the stopper and swirl gently. Make sure of the complete reconstitution of
product. Keep the reagents at 15-25°C for 30 minutes and invert to mix before use. Do
not shake
ThP Low Control Plasma: Dissolve the contents with 1 mL of CLSI type II water or
equivalent. 2 Replace the stopper and swirl gently. Make sure of the complete
reconstitution of product. Keep the reagents at 15-25°C for 30 minutes and invert to mix
before use. Do not shake.
Reagent Storage and Stability
Unopened reagents are stable until the expiration date shown on the vial when stored
at 2-8°C.
ThP Diluent, ThP Substrate, ThP Activator A and B: Stability after reconstitution:
2 days at 2-8°C, 3 weeks at -20°C in the original vial or 32 hours at 15°C on
ACL Futura/ACL Advance Systems and ACL 8000/9000/10000. No stirring is required.
ThP Thromboplastin: Stability after reconstitution: 2 days at 2-8°C in the original vial,
32 hours at 15°C on ACL Futura/ACL Advance Systems and ACL 8000/9000/10000. No
stirring is required.
ThP Low Control Plasma: Stability after reconstitution: 4 hours at 15-25°C in the
sample cup, or 7 days at - 20°C in the original vial.
For optimal stability remove reagents from the system and store them at 2-8°C in the
original vial.
Specimen Collection and Preparation
Nine parts of freshly drawn venous blood are collected into one part tri-sodium citrate.
Refer to CLSI Document H21-A4 for further instructions on specimen collection,
handling and storage.3
Additional Reagents and Control Plasmas
The following are not supplied with the kit and must be purchased separately.
Americas and Pacific Rim
Europe
Cat. No.
Cat. No.
Normal Control
0020003120
0020003110
Quality Control
Normal and low controls are recommended for a complete quality control program.4
Normal Control sold separately and the ThP Low Control Plasma included in this kit is
designed to be part of this program. Each laboratory should establish its own mean and
standard deviation and should establish a quality control program to monitor laboratory
testing. Controls should be analyzed at least once every 8 hour shift in accordance with
good laboratory practice. Refer to the instrument’s Operator’s Manual for additional
information. Refer to Westgard et al for identification and resolution of out-of-control
situtations.5
The Low Control plasma will give results less than 75 PiCi% and will be at a minimum 8
PiCi% lower than the Normal Control plasma.
Results
The following procedure should be used to calculate the PiCi%
(OD with Activator B – OD with Activator A)
PiCi% = ———————————————————— x 100
(OD with Activator B)
See PiCi% Cut-off section for instructions on result interpretation.
Limitations/Interfering Substances
ThromboPath results are not affected by hemoglobin up to 100 mg/dL, bilirubin up to 20
mg/dL, triglycerides up to 700 mg/dL, Heparin up to 0.75 U/mL (UFH and LMWH), FVII
or FVIIa up to 2.0 U/mL, FVIII up to 0.5U/mL and contact activation. High
concentrations of FII, FVII, FVIIa, FX, LA and late pregnancy could decrease PiCi%
values. Likewise low concentrations of FII, FVIII and FX can increase PiCi% values.
Correlation:
Three studies were performed on various instruments. A cut-off was performed for each
study and the respective sensitivity and specificity determined. 6-10
An in-house study of 267 (126 normals/141 abnormals) was performed, using
ThromboPath to screen citrated plasma samples with known deficiencies Protein S, C,
APC R V and Lupus Anticoagulant on an ACL Advance. The abnormal samples were
identified using Instrumentation Laboratory’s assays.
Cut-off 80.9%
Sensitivity = 98%
Normal
PS Def
PC Def
PS & PC Def
FV Leiden
L.A.
No.
Samples
False
Positive
False
Negative
126
11
14
35
44
34
14%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2.5%
0
A second study of 125 (40 Normals/85 abnormals) was performed in an external
laboratory using ThromboPath to screen citrated plasma samples with known
deficiencies of Protein S, C, APC R V and Lupus Anticoagulant on an ACL 9000. The
abnormal samples were identified using Instrumentation Laboratory’s assays.
Cut-off = 85.4%
PiCi% Cut-Off
Thrombophillic defects in the Protein C Pathway may be evident when the PiCi% is
equal to or below the cut-off.
When using the HemosIL ThromboPath kit, a cut-off must be established for each
individual instrument and for each specific lot of HemosIL ThromboPath used.
NOTE: The citrate concentration of the samples should equal that with which the cut-off
was established. (3.2 Or 3.8% citrate)
Procedure to establish the cut-off PiCi% value
1.
For each new lot of ThromboPath, a new normal range should be established.
2.
Use 30 local normal healthy individuals comprised equally of males and females
between the ages of 20 – 65 years of age. Perform testing.
3.
Calculate the mean and standard deviation in PiCi%.
4.
The cut-off is equal to the Mean minus one Standard Deviation.
5.
The ThP Low Control Plasma should be lower than the established cut-off.
6.
The Normal Control Plasma will be higher than the low control and near the
established cut-off.
Specificity = 86%
Study 1
Sensitivity = 91.7%
Specificity = 85%
Study 2
Normal
PS Def
PC Def
PS & PC Def
FV Leiden
L.A.
No.
Samples
False
Positive
False
Negative
40
26
19
8
22
10
15%
0
0
0
0
0
0
23%
5.3%
0
0
0
A third study of 133 samples ( 102 normals / 31 abnormals ) was performed in an
external laboratory using ThromboPath to screen citrated plasma samples with known
deficiencies of Protein S, C, and APC R V on an ACL 9000. The abnormal samples
were identified using Instrumentation Laboratory’s assays.
Cut-off = 86.25%
Sensitivity = 90.3%
Specificity = 94.1%
Interpretation
The cut-off PiCi% value must be established for each instrument platform locally by
customers with each new ThromboPath lot as defined above. Below the cut-off,
samples may be pathologic for PC, PS or APC Resistance and Lupus Anticoagulants.
The established cut-off should be a point below which APCR-V-heterozygous samples,
and samples with PC < 70% and PS<60% fall. Samples with Protein C, Protein S
deficiencies, FV Leiden or Lupus Anticoagulants may present a decreased PiCi%
activity.
In limited studies, results from pregnant women ran below the PiCi% cut-off range.
Females had a lower mean PiCi% by 4.2% than men. Separate cut-off values for males
and females could be used. The number of samples (n) should equal 30 when
establishing gender-based cut-offs.
Expected Values
Study 3
Normal
PS Def
PC Def
PS & PC Def
FV Leiden
L.A.
No.
Samples
False
Positive
False
Negative
102
18
7
1
5
0
5.9%
0
0
0
0
-
0
11.1%
14.2%
0
0
-
The precision and correlation results were obtained using specific lots of reagents and
controls.
A cut-off was performed using the ThP kit on IL Coagulation systems.
System
N
Mean minus 1 Standard Deviation
ACL 8000/9000/10000
126
81.0 PiCi%
ACL Futura/Advance
126
80.6 PiCi%
In an additional study using 30 normal patient samples, the following results were
obtained to conclude that the establishment of a cut-off based on a normal population
sample set of 30 is acceptable.
System
N
Mean minus 1 Standard Deviation
ACL 8000/9000/10000
30
81.1 PiCi%
ACL Futura/ Advance
30
80.9 PiCi%
These results were obtained using a specific lot of reagent. Due to many variables,
which may affect clotting times, each laboratory should establish its own normal range
and cut-off.
ThromboPath - 0020005500
DEUTSCH - Packungsbeilage Version 12/2008
HemosIL ThromboPath (ThP) ist ein vollautomatischer chromogener Test zur
funktionellen Erfassung des gesamten antikoagulatorischen Protein C Systems in
humanem Citratplasma auf IL-Analysensystemen.
Der Test dient als Unterstützung der Diagnose von thrombophilen Defekten wie Protein
S- (PS), Protein C-Mangel (PC), Faktor V Leiden (FVL) und Lupus-Antikoagulantien (LA).
ThP Low Control Plasma - Haltbarkeit nach Rekonstitution:
- bei 15-25°C in einem Probencup: 4 Stunden
- bei -20°C in der Originalflasche: 7 Tage
Für eine optimale Haltbarkeit sollten die Reagenzien nach dem Gebrauch aus dem
Gerät entnommen und im Kühlschrank bei 2-8°C in der Originalflasche aufbewahrt
werden.
Testprinzip und Zusammenfassung
Bestimmungsansatz
Das antikoagulatorische Protein C System ist eines der wichtigsten Mechanismen zur
Regulation der Gerinnung. Das an den Rezeptor Thrombomodulin gebundene Thrombin
aktiviert in vivo Protein C zu aktiviertem Protein C (APC). Daraufhin baut das APC die
prokoagulatorischen Faktoren FVa und FVIIIa ab. Diese Reaktion wird verstärkt durch
die Anwesenheit der APC-Kofaktoren, Protein S und Faktor V, sowie Phospholipide.
Der HemosIL ThromboPath Test bestimmt die Fehlfunktion des antikoagulatorischen
Protein C Systems, indem er die endogene Thrombinbildung als Prozent der Protacinduzierten Protein C-Inhibition (PiCi%) misst.
Im vorliegenden Test wird das Patientenplasma mit ThP Diluent verdünnt und in zwei
verschiedenen Ansätzen gemessen. Ein Ansatz wird mit ThP Aktivator A (enthält
Protac), der zweite Ansatz mit ThP Aktivator B (kein Protac) inkubiert. Die
Thrombinbildung wird in beiden Fällen durch die Zugabe von ThP Thromboplastin
gestartet. Nach der Zugabe des ThP Chromogenen Substrates wird die
Thrombinaktivität durch den Anstieg der optischen Dichte (OD) bei 405 nm gemessen.
Das Endergebnis des Testes wird berechnet als PiCi% = ((OD mit Aktivator B - OD mit
Aktivator A) / (OD mit Aktivator B))* 100.
Es sollte ein Cut-Off-Wert für jede Gerätelinie bestimmt werden. Ergebnisse unterhalb
des Cut-Off-Wertes sind als pathologisch für Protein C, Protein S oder APC Resistenz
und Lupus Antikoagulantien zu betrachten.
Die ausführliche Beschreibung des Bestimmungsansatzes ist dem GeräteBedienerhandbuch und/oder dem Applikationshandbuch zu entnehmen.
Verwendung
Inhalt
Die ThromboPath Packung enthält:
D
ThP Diluent (Art. Nr. 0020005521): 2 Flaschen x 10 mL mit HEPES-Puffer, der
Polybren, Füllmaterialien und Konservierungsmittel enthält.
S
ThP Substrate (Art. Nr. 0020005522): 1 Flasche x 8 mL eines lyophilisierten
chromogenen Substrates: S-2796 Z-D-Arg-Sar-Arg-pNA.2HCL 1.46 g/L mit
Füllmaterialien.
T
ThP Thromboplastin (Art. Nr. 0020005523): 2 Flaschen x 4 mL lyophilisiertes
PT Reagenz, das HEPES-Puffer, Gewebefaktor, synthetische Phospholipide,
Kalzium, Magnesium, Mangan, Füllmaterialien und Konservierungsmittel enthält.
A
ThP Activator A (Art. Nr. 0020005524): 1 Flasche x 5 mL lyophilisierte Protein C
Aktivator-Fraktion aus dem Gift der Kupferkopfschlange (Protac®), das
Füllmaterialien und Konservierungsmittel enthält.
B
ThP Activator B (Art. Nr. 0020005525): 1 Flasche x 5 mL lyophilisierter Aktivator
B ohne Protac, der Füllmaterialien und Konservierungsmittel enthält.
L
Low Control Plasma (Art. Nr. 0020005526): 2 Flaschen x 1 mL lyophilisiertes
Humanplasma mit einer niedrigen Protein S-Konzentration.
WARNUNG:
Das verwendete Material wurde mit FDA-anerkannten Testmethoden auf HIVAntikörper, Hepatitis-B-Antigen und HCV-Antigen geprüft. Bitte beachten Sie die
Bestimmungen zum Umgang mit potentiell infektiösen Materialien.1
Berührung mit den Augen und der Haut vermeiden (S 24/25). Nicht in die Kanalisation
gelangen lassen (S 29). Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen (S 36).
Dieses Produkt ist nur für die in vitro Diagnostik geeignet.
Herstellung
ThP Diluent: Gebrauchsfertig. Vor dem Gebrauch vorsichtig schwenken.
ThP Substrate: Inhalt der Flasche mit 8 mL Aqua dest. lösen.2 Dann die Flasche
verschließen und durch leichtes Schwenken das Lyophilisat lösen. Nach vollständiger
Rekonstitution wird das Reagenz 30 Minuten bei 15-25°C inkubiert und unter
vorsichtigem Schwenken erneut gemischt. Nicht schütteln.
ThP Thromboplastin: Inhalt der Flasche mit 4 mL Aqua dest. lösen.2 Dann die Flasche
verschließen und durch leichtes Schwenken das Lyophilisat lösen. Nach vollständiger
Rekonstitution wird das Reagenz 30 Minuten bei 15-25°C inkubiert und unter
vorsichtigem Schwenken erneut gemischt. Nicht schütteln.
ThP Activator A: Inhalt der Flasche mit 5 mL Aqua dest. lösen.2 Dann die Flasche
verschließen und durch leichtes Schwenken das Lyophilisat lösen. Nach vollständiger
Rekonstitution wird das Reagenz 30 Minuten bei 15-25°C inkubiert und unter
vorsichtigem Schwenken erneut gemischt. Nicht schütteln.
ThP Activator B: Inhalt der Flasche mit 5 mL Aqua dest. lösen.2 Dann die Flasche
verschließen und durch leichtes Schwenken das Lyophilisat lösen. Nach vollständiger
Rekonstitution wird das Reagenz 30 Minuten bei 15-25°C inkubiert und unter
vorsichtigem Schwenken erneut gemischt. Nicht schütteln.
ThP Low Control Plasma: Inhalt der Flasche mit 1 mL Aqua dest. lösen. 2 Dann die
Flasche verschließen und durch leichtes Schwenken das Lyophilisat lösen. Nach
vollständiger Rekonstitution wird das Reagenz 30 Minuten bei 15-25°C inkubiert und
unter vorsichtigem Schwenken erneut gemischt. Nicht schütteln.
Lagerung und Haltbarkeit
Die ungeöffneten Reagenzien sind bei Lagerung von 2-8°C bis zu dem auf dem Etikett
angegebenen Verfallsdatum haltbar.
ThP Diluent, ThP Substrate, ThP Activator A und B
Haltbarkeit nach Rekonstitution in ACL 8000/9000/10000 und ACL Futura/ACL
Advance-Systemen:
- bei 2-8°C in der Originalflasche: 2 Tage
- bei 15°C im Gerät: 32 Stunden
- bei -20°C in der Originalflasche: 3 Wochen
Muss nicht gerührt werden.
Probenmaterial - Antikoaguliertes Plasma
9 Teile frisches venöses Blut und 1 Teil Trinatriumcitratlösung werden sorgfältig in
einem silikonisierten Glasröhrchen gemischt. Hinweise zur Aufbereitung des Blutes sind
den Empfehlungen des Deutschen Instituts für Normung - DIN 58 905 - oder dem CLSI
Dokument H21-A4 zu entnehmen.3
Zusätzliche Reagenzien und Kontrollplasmen
Die folgenden Reagenzien sind nicht in der Packung enthalten und müssen zusätzlich
bestellt werden:
Amerikan. und Pazifischer Raum
Europa
Art. Nr.
Art. Nr.
Normal-Kontroll-Plasma
0020003120
0020003110
Qualitätskontrolle
Es ist gängige Laborpraxis, die Qualität der Analyse mit Kontrollmaterialien im
normalen sowie im pathologischen Bereich zu überprüfen.4 Es wird empfohlen, als
Kontrollmaterial die oben angegebene Normalkontrolle und die ThP Kontrolle (niedriger
Bereich), die in der Packung enthalten ist, zu verwenden. Jedes Labor sollte jedoch für
das Qualitätskontroll-Programm seinen eigenen Kontrollbereich ermitteln. Spätestens
nach jeweils 8 Stunden sollte eine Qualitätskontrolle durchgeführt werden. Algorithmen
zur Beurteilung der Qualitätskontrollergebnisse siehe z.B. Westgard et al.5 Siehe auch
“Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung quantitativer
laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen” in der jeweils gültigen Ausgabe.
Die Kontrolle im niedrigen Bereich liegt bei < 75 PiCi% und ist wenigstens 8 PiCi%
niedriger als die Normalkontrolle.
Ergebnisse
Die folgende Formel wird zur Berechnung der PiCi% herangezogen:
(OD mit Aktivator B – OD mit Aktivator A)
PiCi% = ——————————————————— x 100
(OD mit Aktivator B)
Zur Interpretation der Ergebnisse beachten Sie bitte auch den Abschnitt PiCi% Cut-Off.
Referenzbereiche
Mit dem ThP Kit wurde der Cut-Off-Wert auf IL Gerinnungssystemen bestimmt.
System
N
Mittelwert minus 1s (Standardabweichung)
ACL 8000/9000/10000
126
81.0 PiCi%
ACL Futura/ACL Advance
126
80.6 PiCi%
In einer zweiten Studie wurde unter Verwendung von 30 Normalpatienten bestätigt,
dass die Anzahl 30 ausreichend ist für die Ermittlung eines zuverlässigen Cut-Off-Wertes.
System
ACL 8000/9000/10000
ACL Futura/ACL Advance
ThromboPath Ergebnisse werden durch Konzentrationen an Hämoglobin bis zu 100
mg/dL, Bilirubin bis zu 20 mg/dL, Triglyceriden bis zu 700 mg/dL, Heparin
(unfraktionierte oder niedermolekulare Heparine) bis zu 0,75 U/mL, FVII oder FVIIa bis
zu 2,0 U/mL, FVIII bis zu 0,5 U/mL und Kontaktaktivierung nicht beeinflusst. Hohe
Konzentrationen von FII, FVII, FVIIa, FX, LA und vorangeschrittene Schwangerschaft
können die PiCi%-Ergebnisse erniedrigen. Ebenso können niedrige Konzentrationen
von FII, FVIII und FX die PiCi%-Ergebnisse erhöhen.
PiCi% Cut-Off
Thrombophile Defekte im antikoagulatorischen Protein C System können evident sein,
wenn die PiCi% gleich oder unterhalb des Cut-Off-Wertes liegen.
Bei Verwendung des HemosIL ThromboPath Testes muss ein Cut-Off-Wert für jedes
verwendete Gerät und für jede neue Reagenzcharge des HemosIL ThromboPath
ermittelt werden.
BITTE BEACHTEN: Die Citrat-Konzentration der Proben, die zur Ermittlung des CutOff-Wertes eingesetzt wurde, muss identisch sein mit der Citrat-Konzentration der zu
untersuchenden Patientenplasmen. (3,2 oder 3,8 % Citrat)
Vorgehensweise zur Ermittlung des Cut-Off PiCi%-Wertes
1. Für jede neue Reagenzcharge des ThromboPath sollte ein neuer Normalbereich
ermittelt werden.
2. Führen Sie den Test mit 30 gesunden Normalplasmen gleichermaßen bestehend
aus männlichen und weiblichen Probanden im Alter von 20-65 Jahren durch.
3. Berechnen Sie Mittelwert und Standardabweichung in PiCi%.
4. Der Cut-Off-Wert entspricht dem Mittelwert minus der einfachen Standardabweichung.
5. Die ThP Kontrolle (niedriger Bereich) sollte unterhalb des ermittelten Cut-Off-Wertes
liegen.
6. Die Normalkontrolle muss höher als die ThP Kontrolle (niedriger Bereich), etwa im
Bereich des Cut-Off-Wertes liegen.
Interpretation
Bei Verwendung des HemosIL ThromboPath Testes muss ein Cut-Off-Wert für jedes
verwendete Gerät und für jede neue Reagenzcharge des HemosIL ThromboPath
kundenspezifisch ermittelt werden. Ergebnisse unterhalb des Cut-Off-Wertes sind als
pathologisch für Protein C, Protein S oder APC Resistenz und Lupus Antikoagulantien
zu betrachten.
Der ermittelte Cut-Off-Wert sollte so liegen, dass heterozygote APCR-V Patienten und
Proben mit PC < 70% und PS < 60% unterhalb dieses Wertes liegen. Patienten mit
Protein C-, Protein S-Mangel, FV Leiden oder Lupus Antikoagulantien können eine
verminderte PiCi%-Aktivität aufweisen.
In limitierten Studien zeigten sich bei Schwangeren Ergebnisse unterhalb des PiCi%
Cut-Off Bereiches. Bei Frauen ergaben sich um 4,2 % niedrigere Ergebnisse im Mittel
als bei Männern. Geschlechtsabhängige Cut-Off-Werte können verwendet werden. Die
Anzahl der Untersuchungen (n) sollte bei geschlechtsabhängigen Cut-OffWertermittlungen ebenfalls jeweils bei 30 liegen.
ThP Thromboplastin
Haltbarkeit nach Rekonstitution in ACL 8000/9000/10000 und ACL Futura/ACL
Advance-Systemen:
- bei 2-8°C in der Originalflasche: 2 Tage
- bei 15°C im Gerät: 32 Stunden
Muss nicht gerührt werden.
Mittelwert minus 1s (Standardabweichung)
81.1 PiCi%
80.9 PiCi%
Die Werte wurden mit einer spezifischen Reagenziencharge ermittelt. Aufgrund
verschiedener Variablen, die die Ergebnisse beeinflussen können, wird empfohlen,
dass jedes Labor seinen eigenen Normalbereich und Cut-Off-Wert ermittelt.
Testcharakteristik
Präzision:
Die Präzision im Lauf und von Tag zu Tag wurde bei mehreren Läufen bestimmt.
ACL 8/9/10000
Normal-Kontroll-Plasma
Kontrollplasma (niedrig)
Mittelwert (PiCi%) VK % (im Lauf) VK % (Tag zu Tag)
81.8
0.61
1.55
67.6
1.97
3.02
ACL Futura/ACL Advance Mittelwert (PiCi%) VK % (im Lauf) VK % (Tag zu Tag)
Normal-Kontroll-Plasma
80.7
0.78
1.36
Kontrollplasma (niedrig)
68.8
1.80
2.59
Korrelation:
Insgesamt wurden drei Studien an verschiedenen Geräten durchgeführt. Es wurden
jeweils der Cut-Off-Wert und die entsprechende Sensitivität und Spezifität bestimmt.6-10
In einer inhouse-Studie mit 267 Citratplasmaproben (126 normale/141 abnormale)
wurde der ThromboPath als Screening-Test bei bekanntem Protein C-, Protein SMangel, APCR-V und Lupus Antikoagulantien am ACL Advance durchgeführt. Die
abnormalen Proben wurden unter Verwendung von IL-Testen identifiziert.
Cut-Off 80.9%
Einschränkungen
N
30
30
Sensitivität = 98%
Studie 1
Normal
Anzahl
Proben
Falsch
positiv
Falsch
negativ
126
Spezifität = 86%
PS Mangel PC Mangel PS & PC Mangel FV Leiden LA
11
14
35
44
34
14%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2.5%
0
In einer zweiten externen Studie mit 125 Citratplasmaproben (40 normale/85
abnormale) wurde der ThromboPath als Screening-Test bei bekanntem Protein C-,
Protein S-Mangel, APCR-V und Lupus Antikoagulantien am ACL 9000 durchgeführt. Die
abnormalen Proben wurden unter Verwendung von IL-Testen identifiziert.
Cut-Off = 85.4%
Sensitivität = 91.7%
Spezifität = 85%
Studie 2
Normal
Anzahl
Proben
Falsch
positiv
Falsch
negativ
40
PS Mangel PC Mangel PS & PC Mangel FV Leiden LA
26
19
8
22
10
15%
0
0
0
0
0
0
23%
5.3%
0
0
0
In einer dritten externen Studie mit 133 Citratplasmaproben (102 normale/31
abnormale) wurde der ThromboPath als Screening-Test bei bekanntem Protein C-,
Protein S-Mangel, APCR-V und Lupus Antikoagulantien am ACL 9000 durchgeführt. Die
abnormalen Proben wurden unter Verwendung von IL-Testen identifiziert.
Cut-Off = 86.25%
Sensitivität = 90.3%
Studie 3
Normal
Anzahl
Proben
Falsch
positiv
Falsch
negativ
102
Spezifität = 94.1%
PS Mangel PC Mangel PS & PC Mangel FV Leiden LA
18
7
1
5
0
5.9%
0
0
0
0
-
0
11.1%
14.2%
0
0
-
Die Ergebnisse sind mit spezifischen Reagenzien- und Kontrollchargen ermittelt
worden.
Bibliography / Literatur / Bibliografía / Bibliographie / Bibliografia /Bibliografia / Litteratur / Litteraturförteckning /
1. Richmond JY, McKinney RW eds. Biosafety in Microbiological and Biomedical Labs.
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detecting deficiencies in Protein C and Protein S. Journal of Thrombosis and
Haemostasis 2003; 1 Supplement 1 July: P0016
ACL and ACL Futura are trademarks of Instrumentation Laboratory
Protac® is a registered trademark of Pentapharm Ltd.
®2005 Instrumentation Laboratory.
Issued December 2008
Symbols used / Verwendete Symbole / Símbolos utilizados / Symboles utilisés / Simboli impiegati / Símbolos utilizados / Anvendte symboler / Använda Symboler /
In vitro diagnostic
medical device
In-vitro Diagnostikum
De uso diagnóstico in
vitro
Dispositif mèdical de
diagnostic in vitro
Per uso diagnostico in
vitro
Dispositivo médico para
utilização em diagnóstico
in vitro
“in vitro” diagnostisk udstyr
In vitro diagnostisk
medicinsk produkt
Batch code
Chargen-Bezeichnung
Identificación número
de lote
Désignation du lot
Numero del lotto
Número de lote
Batch nr.
Tillverkningskod
Use by
Verwendbar bis
Caducidad
Utilisable jusqu’à
Da utilizzare prima del
Data límite de
utilização
Anvendelse
Användning
Temperature limitation
Festgelegte
Temperatur
Temperatura de
Almacenamiento
Températures limites
de conservation
Limiti di temperatura
Límite de temperatura
Temperatur
begrænsninger
Temperatur gräns
Consult instructions for use
Beilage beachten
Consultar la metódica
Lire le mode d’emploi
Vedere istruzioni per l’uso
Consultar as instruções de
utilização
Se vejledning for
anvendelse
Ta del av instruktionen före
användning
Control
Kontrollen
Control
Contrôle
Controllo
Controlo
Kontrol
Kontroll
Biological risks
Biologisches Risiko
Riesgo biológico
Risque biologique
Rischio biologico
Risco biológico
Miljø oplysninger
Biologiska risker
Manufacturer
Hergestellt von
Fabricado por
Fabricant
Prodotto da
Fabricado por
Producent
Tillverkare
Authorised representative
Bevollmächtigter
Representante autorizado
Mandataire
Rappresentanza autorizzata
Representante autorizado
Leverandør
Auktoriserad representant
In vitro
Instrumentation Laboratory Company - Bedford, MA 01730-2443 (USA)
Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy)
303485A R1 12/2008
HemosIL®
ThromboPath - 0020005500
ESPAÑOL - Revisión Prospecto 12/2008
Aplicación
Reactivos Adicionales Plasmas de Control
Características de rendimiento
El HemosIL ThromboPath (ThP) es un ensayo cromogénico automatizado para la
evaluación funcional del sistema de anticoagulación de la proteína C en plasma
humano citratado en los Sistemas de Coagulación IL. El ensayo pretende ser una
ayuda al diagnóstico de defectos trombofílicos como la deficiencia de Proteína S (PS),
y Proteína C (PC), Factor V Leiden (FVL) y los Anticoagulantes Lúpicos (AL).
Los siguientes elementos no se proporcionan junto al kit y deben adquirirse por
separado.
Las Américas y el Pacífico
Europa
Nº de Cat.
Nº de Cat.
Control Normal
0020003120
0020003110
Precisión:
Se determinó la precisión intraensayo y total (ensayo a ensayo y día a día) a lo largo
de diversos ensayos utilizando muestras de control normales y anormales.
ACL 8/9/10000
Media (PiCi%)
% CV (Intraserie)
% CV (Total)
Plasma Control Normal
81,8
0,61
1,55
Plasma Control Bajo
67,6
1,97
3,02
ACL Futura/ACL Advance Media (PiCi%)
% CV (Intraserie)
% CV (Total)
Plasma Control Normal
80,7
0,78
1,36
Plasma Control Bajo
68,8
1,80
2,59
Principio del Método
La ruta anticoagulante de la Proteína C es uno de los mecanismos mas importantes de
regulación de la coagulación. “In vivo”, la Trombina unida al receptor Trombomodulina
activa la Proteína C a Proteína C activada (APC). A continuación, la APC degrada los
factores pro-coagulantes FVa y FVIIIa, degradación que se potencia en presencia de
los cofactores de la APC: Proteína S, Factor V y fosfolípidos.
HemosIL ThromboPath determina la disfunción de la ruta anticoagulante de la Proteína
C midiendo la generación endógena de Trombina como Porcentaje de Inhibición de la
Coagulación inducida por Protac (PiCi%). Durante el ensayo, la muestra de plasma se
diluye con Diluyente ThP y se ensaya como dos alícuotas separadas. Una se incuba
con Activador ThP A (con Protac) y la otra se incuba con Activador ThP B (sin Protac).
La generación de Trombina en ambas alícuotas comienza cuando se adiciona ThP
Thromboplastin. La actividad de la Trombina se cuantifica, después de la adición de
Substrato Cromogénico ThP, mediante el incremento de la densidad óptica a 405nm.
El resultado final del ensayo se calcula como PiCi% = ((DO con Activador B – DO con
Activador A) / (DO con Activador B)) x 100. Para cada tipo de instrumento se
establecerá un “cut-off”. Por debajo del “cut-off” las muestras pueden ser patológicas
para PC, o PS, o Resistencia a APC y Anticoagulante lúpico.
Composición
El kit ThromboPath está formado por:
D
Diluyente ThP (P/N 0020005521): 2 viales de 10 ml de una preparación líquida
que contiene tampón HEPES, polibreno, agente excipiente y conservantes.
S
Sustrato ThP (P/N) 0020005522): 1 vial de 8 ml de una preparación liofilizada
que contiene sustrato cromogénico S-2796 Z-D-Arg-Sar-Arg-pNA.2HCL 1,46 g/L
de agente excipiente.
T
Tromboplastina ThP (P/N) 0020005523): 2 viales de 4 ml de reactivo PT
liofilizado con tampón HEPES, Factor Tisular, fosfolípidos sintéticos, calcio,
magnesio, manganeso, agentes excipientes y conservantes.
A
Activador A de ThP (P/N 0020005524): 1 vial de 5 ml de fracción activadora de
la Proteína C liofilizada procedente del veneno de Agkistrodon contortrix
contortrix (Protac®) con agente excipiente y conservante.
B
Activador B de ThP (P/N 0020005525): 1 vial de 5 ml de activador B sin Protac
y con agente excipiente y conservante.
L
Plasma Control Bajo (P/N 0020005526): 2 viales de 1 ml de plasma humano
liofilizado con un nivel reducido de proteína S.
PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
El material usado en este producto ha sido verificado mediante los métodos aprobados
por la FDA y se ha encontrado que no resulta reactivo al Antígeno de Superficie de la
Hepatitis B (HBsAg), Anti-HCV y anticuerpos HIV. Manejar con precaución como si
fuera potencialmente infeccioso.
Evite el contacto con los ojos y la piel (S 24/25). No deseche los residuos por el
desagüe (S 29). Utilice indumentaria protectora adecuada (S 36). Este reactivo es para
uso en diagnóstico in vitro.
Preparación
Diluyente ThP: Listo para su uso: mezclar por inversión del vial antes de su utilización.
Sustrato ThP: Disuelva el contenido en 8 ml de agua CLSI (anteriormente NCCLS) de
tipo II o equivalente.2 Tape el vial y mézclelo suavemente. Asegúrese de la
reconstitución total del producto. Mantenga los reactivos a 15-25º C durante 30
minutos e inviértalos para su mezcla antes de utilizarlos. No lo agite.
Tromboplastina ThP: Disuelva el contenido en 4 ml de agua CLSI de tipo II o
equivalente.2 Tape el vial y mézclelo suavemente . Asegúrese que se produce la
reconstitución total del producto. Mantenga los reactivos a 15-25º C durante 30
minutos e inviértalos para su mezcla antes de utilizarlos. No lo agite.
Activador A de la ThP: Disuelva el contenido en 5 ml de agua CLSI de tipo II o
equivalente.2 Tape el vial y mézclelo suavemente . Asegúrese que se produce la
reconstitución total del producto. Mantenga los reactivos a 15-25º C durante 30
minutos e inviértalos para su mezcla antes de utilizarlos. No lo agite.
Activador B de la ThP: Disuelva el contenido con 5 ml de agua CLSI de tipo II o
equivalente.2 Tape el vial y mézclelo suavemente . Asegúrese que se produce la
reconstitución total del producto. Mantenga los reactivos a 15-25º C durante 30
minutos e inviértalos para su mezcla antes de utilizarlos. No los agite.
Plasma Control Bajo de la ThP: Disuelva el contenido con 1 ml de agua CLSI de tipo
II o equivalente. 2 Tape el vial y mézclelo suavemente . Asegúrese que se produce la
reconstitución total del producto. Mantenga los reactivos a 15-25º C durante 30
minutos e inviértalos para su mezcla antes de utilizarlos. No los agite.
Conservación y Estabilidad de los reactivos
Los reactivos no abiertos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el vial,
si se almacenan entre 2-8°C.
Diluyente ThP, Sustrato ThP, Activadores A y B ThP: Estabilidad después de la
reconstitución: 2 días a 2-8 ºC, 3 semanas a -20ºC en el vial original o 32 horas a 15ºC
en Sistemas ACL Futura/ACL Advance y ACL 8000/9000/10000. No se requiere
agitación continuada.
Tromboplastina ThP: Estabilidad después de la reconstitución: 2 días a 2-8ºC o 32
horas a 15ºC en Sistemas ACL Futura/ACL Advance y ACL 8000/9000/10000. No se
requiere agitación continuada.
Plasma Control Bajo ThP: Estabilidad después de la reconstitución: 4 horas a 1525ºC en un pocillo de muestra o 7 días a -20ºC si se almacena en el vial original.
Para una estabilidad óptima retire los reactivos del sistema y almacénelos a 2-8ºC en
el vial original.
Control de Calidad
Se recomienda la utilización de controles normales y bajos para obtener un programa
de control de calidad completo.4 El Control Normal –vendido por separado- y el Plasma
Control Bajo ThP –incluido en este kit- están diseñados para formar parte de este
programa. Cada laboratorio debería establecer sus valores promedios y desviación
estándar y un programa de control de calidad para controlar las pruebas del
laboratorio. Los controles deberían ser analizados al menos una vez cada turno de 8
horas de acuerdo con buenas prácticas de laboratorio. Consulte el Manual de
Funcionamiento del instrumento para más información. Consulte a Westgard et al para
la identificación y resolución de situaciones fuera de control.5
El plasma de Control Bajo presentará unos resultados inferiores a 75 PiCi% y se será
como mínimo un 8 PiCi% menor que el plasma Control Normal.
Resultados
Deberá utilizar el siguiente procedimiento para calcular el PiCi%
PiCi% =
(DO con Activador B – DO con Activador A)
———————————————————— x 100
(DO con Activador B)
Consulte la sección Cut-off del PiCi% para instrucciones sobre la interpretación de los
resultados.
Limitaciones/Interferencias
Los resultados del ThromboPath no se ven afectados por la hemoglobina hasta 100 mg/dl,
bilirrubina hasta 20 mg/dl, triglicéridos hasta 700 mg/dl, Heparina hasta 0,75 U/ml (UFH
y LMWH), FVII o FVIIa hasta 2,0 U/ml , FVIII hasta 0,5 U/ml y por la activación por
contacto. Unas concentraciones elevadas de FII, FVII, FVIIa, FX, AL y una situación
avanzada de gestación podrían hacer disminuir los valores de PiCi%. Asimismo, unas
concentraciones reducidas de FII, FVIII y FX pueden aumentar los valores de PiCi%.
Cut-Off PiCi%
Los defectos trombofílicos en el sistema de la Proteína C pueden resultar evidentes
cuando el PiCi% es igual o inferior al cut-off. Se debe establecer un valor de cut-off
para cada instrumento y para cada lote específico de ThromboPath HemosIL.
NOTA: La concentración de citrato de las muestras debe ser la misma utilizada para
establecer el valor del cut-off (citrato de 3,2 o 3,8%).
Procedimiento para establecer el cut-off PiCi%
1. Deberá establecerse un nuevo Rango Normal para cada nuevo lote de
ThromboPath.
2. Utilice 30 individuos locales normales sanos. Escoja la misma proporción de
hombres que mujeres con edades de 20-65 años. Realice el test.
3. Calcule la media y la Desviación Estándar en PiCi%.
4. El valor del cut-off es igual a la media menos una Desviación Estándar.
5. El Plasma Control Bajo ThP debe ser inferior que el cut-off establecido.
6. El Plasma Control Normal será superior al Control Bajo y cercano al cut-off.
Interpretación
El valor de cut-off de PiCi% de cada lote ThromboPath debe ser establecido localmente
por los usuarios para cada familia de instrumentos, tal y como se describe arriba. Las
muestras pueden resultar patológicas debido a PC, PS o Resistencia a la APC y
anticoagulantes lúpicos si se encuentran por debajo del cut-off establecido.
El cut-off establecido debe ser un punto por debajo del cual se sitúan muestras
heterocigotas para la APCR-V y muestras con PC<70% y PS<60%. Las muestras con
deficiencias de Proteína C y Proteína S, FV Leiden o Anticoagulantes lúpico pueden
presentar una actividad PiCi% más reducida.
En estudios concretos, los resultados procedentes de mujeres embarazadas se
mantuvieron por debajo del cut-off de PiCi%. En mujeres se obtuvo un promedio de un
4,2 % de PiCi% inferior respecto a los hombres. Podrían utilizarse valores de cut-off
distintos para la población masculina y femenina. La cantidad de muestras (n) debe ser
de 30 si se desea establecer un cut-off basados en el género.
Valores esperados
Se determinó el cut-off utilizando el kit ThP en sistemas de Coagulación IL.
Sistema
N
Media menos 1 Desviación Estándar
ACL 8000/9000/10000
126
81,0 PiCi%
ACL Futura/Advance
126
80,6 PiCi%
En un estudio adicional utilizando 30 muestras de pacientes normales, se obtuvieron
los siguientes resultados, concluyendo que resulta aceptable la fijación de un cut-off
basado en un conjunto de 30 muestras de población normal.
Correlación:
Se realizaron tres estudios utilizando varios instrumentos. Se generó un cut-off para
cada estudio y se determinó la sensibilidad y especificidad respectivas.6-10
Se realizó un estudio interno de 267 muestras (126 normales/141 anormales) utilizando
ThromboPath en muestras de plasma citratado con deficiencias conocidas de Proteína
S, C, APC R V y Anticoagulante lúpico utilizando un ACL Advance. Se identificaron las
muestras anormales utilizando los ensayos de Instrumentation Laboratory.
Cut-off = 80.9%
Sensibilidad = 98%
Especificidad = 86%
Estudio 1
Normal
Def de PS
Def de PC
N° de
muestras
Falsos
positivos
Falsos
negativos
126
11
14
Def de PS & PC FV Leiden
35
A.L.
44
34
14%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2.5%
0
Se realizó un segundo estudio de 125 muestras (40 normales/85 anormales) en un
laboratorio externo utilizando ThromboPath en muestras de plasma citrado con
deficiencias conocidas de Proteína S, C, APC R V y Anticoagulantes lúpicos en un ACL
9000. Se identificaron las muestras anormales utilizando los ensayos de
Instrumentation Laboratory.
Cut-off = 85.4%
Sensibilidad = 91.7%
Especificidad = 85%
Estudio 2
Normal
Def de PS
Def de PC
Def de PS & PC FV Leiden
A.L.
N° de
muestras
Falsos
positivos
Falsos
negativos
40
26
19
8
22
10
15%
0
0
0
0
0
0
23%
5.3%
0
0
0
Se realizó un tercer estudio de 133 muestras (102 normales/31 anormales) en un
laboratorio externo utilizando ThromboPath para filtrar las muestras de plasma citrado
con deficiencias conocidas de Proteína S, C, APC R V y Anticoagulantes del lupus en
un ACL 9000. Se identificaron las muestras anormales utilizando los ensayos de
Instrumentation Laboratory.
Cut-off = 86.25%
Sensibilidad = 90.3%
Especificidad = 94.1%
Estudio 3
Normal
Def de PS
Def de PC
Def de PS & PC FV Leiden
A.L.
N° de
muestras
Falsos
positivos
Falsos
negativos
102
18
7
1
5
0
5.9%
0
0
0
0
-
0
11.1%
14.2%
0
0
-
Los resultados de precisión y correlación se obtuvieron utilizando lotes específicos de
reactivos y controles.
Sistema
N
Media menos 1 Desviación Estándar
ACL 8000/9000/10000
30
81,1 PiCi%
ACL Futura/ Advance
30
80,9 PiCi%
Estos resultados se obtuvieron utilizando un lote específico de reactivo. Debido a
muchas variables que pueden afectar a los tiempos de coagulación, cada laboratorio
debe establecer su propio rango normal y cut-off.
Método de ensayo
Consulte el Manual de Funcionamiento de IL adecuado y/o el Manual de Aplicación.
Recolección y Preparación de las Muestras
Se recolectan nueve partes de sangre venosa fresca en una parte de citrato trisódico.
Consulte el Documento H21-A4 del CLSI para más instrucciones sobre la recolección,
manipulación y almacenamiento de la muestra.3
ThromboPath - 0020005500
FRANÇAIS - Révision de la notice 12/2008
Utilisation
Conservation et stabilité des réactifs
Valeurs attendues
HemosIL ThromboPath (ThP) est un test automatisé permettant l’évaluation de l’activité
anticoagulante du complexe de la protéine C par méthode chromogénique, dans les
plasmas humains citratés sur les analyseurs de coagulation IL. Ce test est une aide au
diagnostic de la thrombophilie liée à des anomalies telles que les déficits en Protéine S
(PS), Protéine C (PC), la mutation du Facteur V Leiden (FVL) et les Lupus
Anticoagulants (LA).
Conservés à 2-8°C, les réactifs sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur
les flacons.
ThP Diluent, ThP Substrate, ThP Activator A and B: Stabilité après reconstitution : 2
jours à 2-8°C, 3 semaines à -20°C dans le flacon d’origine ou 32 heures à 15°C sur les
analyseurs ACL Futura/ACL Advance et ACL 8000/9000/10000. Aucune agitation n’est
nécessaire.
ThP Thromboplastin: Stabilité après reconstitution : 2 jours à 2-8°C ou 32 heures à
15°C sur les analyseurs ACL Futura/ACL Advance et ACL 8000/9000/10000. Aucune
agitation n’est nécessaire.
ThP Low Control Plasma: Stabilité après reconstitution : 4 heures à 15-25°C en
cupule ou 7 jours à -20°C dans le flacon d’origine.
Pour une stabilité optimale, conserver le réactif à 2-8°C dans le flacon d’origine entre
chaque utilisation.
Un « cut-off » a été déterminé en utilisant le réactif ThP sur les analyseurs de
Coagulation IL.
Analyseur
N
Moyenne diminuée d’1 Ecart Type
ACL 8000/9000/10000
126
81.0 PiCi%
ACL Futura/Advance
126
80.6 PiCi%
Dans une étude complémentaire utilisant 30 échantillons de patients normaux, les
résultats suivants ont été obtenus montrant que l’établissement du « cut-off » sur une
population normale de 30 échantillons est acceptable.
Principe
Le complexe de la Protéine C est l’un des mécanismes majeurs de régulation de la
coagulation. In vivo, l’intéraction de la Thrombine avec le récepteur Thrombomoduline
induit la transformation de la Protéine C en Protéine C activée (PCA). La PCA dégrade
les protéines pro-coagulantes FVa et FVIIIa. Cette action est potentialisée par les
cofacteurs de la PCA, Protéine S, Facteur V et phospholipides.
Le test HemosIL Thrombopath (ThP) permet d’évaluer le dysfonctionnement de
l’activité anticoagulante du complexe Protéine C en mesurant le taux de génération
endogène de Thrombine comme le Pourcentage d’Inhibition de la Coagulation induite
par le Protac (PiCi%). Pour le test, l’échantillon de plasma est dilué avec le diluant ThP
et analysé lors de deux essais distincts. Le premier essai consiste en une incubation du
plasma dilué avec le réactif ThP Activator A (avec Protac), le second en une incubation
du plasma dilué avec le réactif ThP Activator B (sans Protac). La génération de
Thrombine lors de chaque essai est initiée par l’addition de réactif ThP Thromboplastin.
L’activité de la Thrombine est quantifiée après addition du réactif ThP Chromogenic
Substrate, par la mesure de l’augmentation de la densité optique à 405nm. Le résultat
final du test est calculé comme PiCi% = ((DO avec Activateur B - DO avec Activateur A)
/ (DO avec Activateur B))* 100.
Il est recommandé de déterminer un « cut-off » pour chaque système analytique
(instrument/réactifs). Lorsque le résultat est inférieur à la valeur du « cut-off »,
l’échantillon peut être considéré comme pathologique soit pour la PC, soit pour la PS
ou en raison de la présence d’une Résistance à la PCA ou de Lupus Anticoagulants.
Composition
Le coffret ThromboPath contient :
D
ThP Diluent (Réf. 0020005521): 2 flacons de 10 mL d’une préparation liquide
contenant du tampon HEPES, du polybrène, un agent de remplissage et des
conservateurs.
S
ThP Substrate (Réf. 0020005522): 1 flacon de 8 mL d’un lyophilisat contenant le
substrat chromogène S-2796 Z-D-Arg-Sar-Arg-pNA.2HCL 1.46g/L avec un agent
de remplissage.
T
ThP Thromboplastin (Réf. 0020005523): 2 flacons de 4 mL d’un lyophilisat
contenant du tampon HEPES, du Facteur Tissulaire, des phospholipides
synthétiques, du calcium, du magnésium, du manganèse, des agents de
remplissage et des conservateurs.
A
ThP Activator A (Réf. 0020005524): 1 flacon de 5 mL d’un lyophilisat contenant
la fraction de l’activateur de la protéine C provenant du venin d’Agkistrodon
contortrix contortrix (Protac®) avec un agent de remplissage et un conservateur.
B
ThP Activator B (Réf. 0020005525): 1 flacon de 5 mL d’un lyophilisat contenant
l’activateur B sans Protac avec un agent de remplissage et un conservateur.
L
Low Control Plasma (Réf. 0020005526): 2 flacons de 1 mL d’un lyophilisat de
plasma humain contenant une faible concentration de Protéine S.
PRECAUTIONS :
Ces réactifs contiennent des produits d’origine humaine. Ils ont été trouvés négatifs
pour les anticorps anti VIH 1/2, anti VHC et l’antigène de surface de l’hépatite B
(AgHBs), en utilisant des trousses de dépistage de 3ème génération. Cependant,
aucune technique ne permettant d’assurer l’absence totale du virus HIV ou de l’hépatite
B ou de tout autre agent infectieux, ces réactifs sont à manipuler avec les précautions
d’usage.1
Éviter le contact avec la peau et les yeux (S 24/25). Ne pas jeter les résidus à l’égout
(S 29). Porter un vêtement de protection approprié (S 36).
Ce produit est à usage diagnostique in vitro.
Procédure
Se référer au mode d’emploi de l’instrument IL approprié et/ou manuel d’application.
Recueil des spécimens, préparation et manipulation
9 parts de sang fraîchement prélevé sont collectées avec 1 part de citrate trisodique.
Se référer au document NCCLS H21-A4 ou au document GEHT (STV, numéro spécial,
1-40, 1998) pour plus d’informations sur le prélèvement des échantillons, leur
manipulation et leur stockage.3
Réactifs auxiliaires et plasmas de contrôle
Non fournis avec la trousse, ils doivent faire l’objet d’une commande séparée.
Amériques et Pacifique
Europe
Réf.
Réf.
Contrôle normal
0020003120
0020003110
Contrôle de qualité
Le Contrôle Normal et le Contrôle Bas sont recommandés pour un programme de
contrôle de qualité complet.4 Le Contrôle Normal est fourni séparément et le ThP
Contrôle Bas inclus dans le coffret est prévu pour être incorporé à ce programme.
Chaque laboratoire doit établir sa propre moyenne et déviation standard et son
programme de contrôle de qualité afin de vérifier l’état de fonctionnement de son
système analytique. Les contrôles doivent être analysés au minimum toutes les 8
heures en concordance avec une bonne pratique de laboratoire. Se référer au mode
d’emploi de l’instrument pour des informations complémentaires. Se reporter à
Westgard et al pour l’identification et la résolution des contrôles hors limites.5
Le Contrôle Bas donne des résultats inférieurs à 75 PiCi% et doit être au minimum 8
PiCi% plus bas que le Contrôle Normal.
Résultats
La procédure suivante doit être appliquée pour calculer le PiCi%
(DO avec Activateur B – DO avec Activateur A)
PiCi% = —————————————————————— x 100
(DO avec Activateur B)
Se référer au paragraphe relatif au « Cut-off » PiCi% pour l’interprétation des résultats.
Limites de la méthode et substances interférant avec celle-ci
Les résultats de ThromboPath ne sont pas affectés par l’hémoglobine jusqu’à 100mg/dl
(1 g/l), la bilirubine jusqu’à 20 mg/dl (200 mg/l), par les triglycérides jusqu’à 700 mg/dl
(7 g/l), par l’héparine jusqu’à 0.75 U/ml (HNF et HBPM), le FVII ou le FVIIa jusqu’à
2.0 U/mL, FVIII jusqu’à 0.5U/mL et les facteurs de la phase contact. Une diminution des
valeurs de PiCi% peut être constatée pour des concentrations élevées de FII, FVII,
FVIIa, FX, LA et lors du dernier trimestre de la grossesse. Inversement, une
augmentation des valeurs de PiCi% peut être constatée pour des concentrations faibles
de FII, FVIII et FX.
Détermination du « Cut-Off » PiCi%
Préparation
ThP Diluent: Réactif prêt à l’emploi. Mélanger par inversion avant utilisation.
ThP Substrate : Dissoudre le contenu de chaque flacon avec 8 ml d’eau déminéralisée
de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.2 Replacer le capuchon et agiter
doucement. Assurez-vous de la complète reconstitution du produit. Conserver le réactif
à 15-25°C pendant au moins 30 minutes et retourner le flacon pour mélanger le
contenu avant utilisation. Ne pas agiter violemment.
ThP Thromboplastin: Dissoudre le contenu de chaque flacon avec 4 ml d’eau
déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.2 Replacer le
capuchon et agiter doucement. Assurez-vous de la complète reconstitution du produit.
Conserver le réactif à 15-25°C pendant au moins 30 minutes et retourner le flacon pour
mélanger le contenu avant utilisation. Ne pas agiter violemment.
ThP Activator A: Dissoudre le contenu de chaque flacon avec 5 ml d’eau
déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.2 Replacer le
capuchon et agiter doucement. Assurez-vous de la complète reconstitution du produit.
Conserver le réactif à 15-25°C pendant au moins 30 minutes et retourner le flacon pour
mélanger le contenu avant utilisation. Ne pas agiter violemment.
ThP Activator B: Dissoudre le contenu de chaque flacon avec 5 ml d’eau
déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.2 Replacer le
capuchon et agiter doucement. Assurez-vous de la complète reconstitution du produit.
Conserver le réactif à 15-25°C pendant au moins 30 minutes et retourner le flacon pour
mélanger le contenu avant utilisation. Ne pas agiter violemment.
ThP Low Control Plasma: Dissoudre le contenu de chaque flacon avec 1 ml d’eau
déminéralisée de type II selon les normes NCCLS ou équivalent.2 Replacer le
capuchon et agiter doucement. Assurez-vous de la complète reconstitution du produit.
Conserver le réactif à 15-25°C pendant au moins 30 minutes et retourner le flacon pour
mélanger le contenu avant utilisation. Ne pas agiter violemment.
Un dysfonctionnement du complexe Protéine C peut être mis en évidence lorsque le
résultat du PiCi% est inférieur ou égal au « Cut-off ».
Une valeur de « Cut-off » doit être établie pour chaque analyseur et pour chaque lot de
réactif HemosIL ThromboPath.
NOTE: La concentration en citrate des échantillons de patients doit être égale à celle
utilisée lors de la détermination du « Cut-off » (3.2 ou 3.8%).
Procédure de détermination de la valeur du « cut-off » du PiCi%
1. Pour chaque nouveau lot de ThromboPath, une nouvelle limite de normalité doit être
établie.
2. Utiliser le plasma provenant de 30 patients normaux comprenant autant de femmes
que d’hommes et dont les âges se situent entre 20 et 65 ans. Réaliser les tests sur
chacun des échantillons.
3. Calculer la moyenne et l’écart type en PiCi%.
4. La valeur du « cut-off » est égale à la moyenne diminuée d’un écart type.
5. La valeur du Contrôle Bas ThP doit être inférieure à celle du « cut-off ».
6. La valeur du Contrôle Normal doit être supérieure à celle du Contrôle bas et proche
de celle du « cut-off ».
Interprétation
Chaque laboratoire doit établir la valeur du « cut-off » PiCi% pour son analyseur et pour
chaque nouveau lot de réactif ThromboPath, comme décrit précédemment. L’obtention,
pour un échantillon de patient, d’une valeur inférieure à celle du « cut-off », peut
permettre de le considérer comme pathologique avec une anomalie de la PC, de la PS
ou la présence d’une Résistance à la PCA ou d’un LA.
Les échantillons avec des deficits en Protéine C, Protéine S, un FV Leiden ou un Lupus
Anticoagulant peuvent présenter une valeur abaissée du PiCi%.
Dans des études limitées, les valeurs obtenues à partir d’échantillons de plasmas de
femmes enceintes étaient inférieures aux limites du « cut-off » PiCi%. La moyenne des
valeurs était inférieure de 4,2% à celle obtenue pour des hommes. Des valeurs de
« cut-off » séparées, hommes et femmes, sont recommandées. Ces valeurs doivent
être établies à partir d’un échantillonnage de 30 patients normaux de chacun des deux
sexes.
ThromboPath - 0020005500
ThromboPath - 0020005500
DANSK - Metodeforskrift revision 12/2008
SVENSK - Bruksanvisning Revision 12/2008
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FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER
Indholdet i dette produkt er testet med analysemetoder godkendt af FDA og fundet
negative for Hepatitis B overflade antigen (HBsAg), Anti-HCV og HIV antistoffer.
På trods af dette skal indholdet behandles som potentielt smitte-farligt.
Undgå kontakt med huden og øjnene (S 24/25).
Må ikke tømmes i kloakafløb (S 29). Brug særligt arbejdstøj (S 36).
Dette produkt er til in-vitro diagnostisk anvendelse.
Vänligen kontakta ILS Laboratories AB för den senast uppdaterade svenska upplagan
av bruksanvisningen.
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER OCH VARNINGAR:
Materialet i denna produkt har testats med FDA godkända metoder och befunnits
negativt för Hepatit B ytantigen (HBsAg), Anti-HCV och HIV antikroppar. Produkten skall
hanteras som potentiellt smittsam.
Undvik kontakt med huden och ögonen (S 24/25). Töm ej i avloppet. (S 29).
Använd lämpliga skyddskläder (S 36).
Denna produkt är för in vitro diagnostiskt användande.
Instrumentation Laboratory Company - Bedford, MA 01730-2443 (USA)
Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy)
Analyseur
N
Moyenne diminuée d’1 Ecart Type
ACL 8000/9000/10000
30
81.1 PiCi%
ACL Futura/ Advance
30
80.9 PiCi%
Ces résultats sont obtenus en utilisant un lot spécifique de réactifs. Du fait qu’un grand
nombre de variables, peuvent affecter les résultats, nous recommandons à chaque
laboratoire d’établir ses propres valeurs normales et son « cut-off ».
Caractéristiques et performances
Précision :
La précision intra-séries et totale (inter-séries et de jour à jour) a été évaluée au cours
d’essais multiples, en utilisant des échantillons de contrôles normaux et anormaux.
ACL 8/9/10000
Moyenne (PiCi%) CV % (Intra-séries) CV % (Total)
Plasma de Contrôle Normal
81.8
0.61
1.55
Plasma de Contrôle Bas
67.6
1.97
3.02
ACL Futura/ACL Advance
Plasma de Contrôle Normal
Plasma de Contrôle Bas
Moyenne (PiCi%) CV % (Intra-séries)
80.7
0.78
68.8
1.80
CV % (Total)
1.36
2.59
Corrélation:
3 études ont été réalisées sur différents analyseurs. Un cut-off a été établi dans chaque
étude. La sensibilité et la spécificité ont été déterminées. 6-10
Une étude interne portant sur 267 échantillons de patients (126 normaux/141
pathologiques avec soit des déficits connus en Protéines C et/ou S, soit la présence
d’une mutation V Leiden soit la présence d’un LA), utilisant le réactif ThromboPath, a
été conduite sur un ACL Advance afin de réaliser un screening. Les échantillons
pathologiques ont été identifiés en utilisant des tests Instrumentation Laboratory.
Cut-off 80.9%
Sensibilité = 98%
Spécificité = 86%
Etude 1
Normal
PS Def
PC Def
PS & PC Def
FV Leiden
L.A.
Nombre
D’échantillons
Faux
Positif(s)
Faux
Négatif(s)
126
11
14
35
44
34
14%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2.5%
0
Une seconde étude portant sur 125 échantillons de patients (40 Normaux/85
pathologiques avec soit des déficits connus en Protéines C et/ou S, soit la présence
d’une mutation V Leiden soit la présence d’un LA) utilisant le réactif ThromboPath, a été
conduite sur un ACL 9000 dans un laboratoire externe. Les échantillons pathologiques
ont été identifiés en utilisant des tests Instrumentation Laboratory.
Cut-off = 85.4%
Sensibilité = 91.7%
Etude 2
Normal
PS Def
PC Def
Nombre
D’échantillons
Faux
Positif(s)
Faux
Négatif(s)
40
26
15%
0
0
23%
Spécificité = 85%
PS & PC Def
FV Leiden
L.A.
19
8
22
10
0
0
0
0
5.3%
0
0
0
Une troisième étude portant sur 133 échantillons de patients (102 Normaux/31
pathologiques avec soit des déficits connus en Protéines C et/ou S, soit la présence
d’une mutation V Leiden soit la présence d’un LA) utilisant le réactif ThromboPath, a été
conduite sur un ACL 9000 dans un laboratoire externe à des fins de screening. Les
échantillons pathologiques ont été identifiés en utilisant des tests Instrumentation
Laboratory.
Cut-off = 86.25%
Sensibilité = 90.3%
Spécificité = 94.1%
Etude 3
Normal
PS Def
PC Def
PS & PC Def
FV Leiden
L.A.
Nombre
D’échantillons
Faux
Positif(s)
Faux
Négatif(s)
102
18
7
1
5
0
5.9%
0
0
0
0
-
0
11.1%
14.2%
0
0
-
La précision et la corrélation des résultats ont été obtenus en utilisant des lots
spécifiques de réactifs et de contrôles.
ThromboPath - 0020005500
12/2008
303485A R1 12/2008
ThromboPath
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303485A
R1
December 2008
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Front - Top band Green Pantone 382, all remaining type in black.
Back - All type in black.
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Instrumentation Laboratory SpA - V.le Monza 338 - 20128 Milano (Italy)
303485A R1 12/2008