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3LP6619―E
この説明書をよく読んでから使用してください。
＊＊ 2010 年 9 月改訂（第 5 版）
＊ 2008 年 1 月改訂（第 4 版）
環境衛生検査用
®
（5）小型冷却遠心機で 4℃，13,000 ×g，10 分間遠心した後、氷上に移し上清をサンプル
溶液とします。（約 2,000 倍濃縮検水に相当）
４．操作法
1）マスターミックスとサンプル溶液の混合（氷上で行ってください。）
レジオネラ検出試薬 キット E
（1）反応チューブにマスターミックス 20μL を分注します。
（2）サンプル溶液 5μL を添加し全量 25μL とします。このとき、ピペッティング又は
キャップを閉めた上でのタッピングにより良く混合した後、スピンダウンします。
【特徴】
また、混合の際は気泡が立たないように注意します。
LAMP（Loop－mediated Isothermal Amplification）法は、① 1 種類の酵素のみ
を使用して遺伝子増幅反応が等温で進行する 1）, 2）、② 6 領域を認識する 4 種類の Primer
を使用するため特異性が高い、③ 増幅効率が高く、短時間に増幅可能である、④ 増幅産物
量が多く、簡易検出に適している 3）, 4）, 5）、等の特徴を有する新しい遺伝子増幅法です。
本キットは、LAMP 法によるレジオネラ属菌の検出キットで、レジオネラ属菌の保持
する 16S rRNA をコードする遺伝子領域内に LAMP 法用のプライマーを設計し開発した
ものです。プライマーを設定した領域は非レジオネラ属菌とのホモロジーが低く、逆に
Legionella pneumophila の 11 種の serogroup を含む 11 菌種 21 株のレジオネラ属菌で
は比較的保存された領域で、LAMP 法で増幅することにより、極めて特異的にレジオネラ
属菌を検出することができます。
専用の Loopamp リアルタイム濁度測定装置（適応機種 LA－320C，RT－160C，LA－
200F）を用いることにより、検出に電気泳動を必要とせず、核酸の増幅反応から検出まで
を閉鎖系（同一反応チューブ内）で行うことが可能で、従来のレジオネラ属菌検査法 6）と
比較して短時間にレジオネラ属菌を検出することができます 7）, 8）。
【キット内容】
（1）
（2）
＊＊ （3）
（4）
（5）
48 テスト分
Extraction Solution for Legionella（EX Leg）※1
1M Tris－ HCl：pH7.0（Tris）※1
Reaction Mix. Leg（RM Leg）※1
Bst DNA Polymerase（Bst DNA Polymerase）※1
Positive Control Leg（PC Leg）※1
【使用目的】
※1：
（
1.8 mL × 2 tubes
1.0 mL × 1 tube
1.0 mL × 1 tube
60 μL × 1 tube
0.1 mL × 1 tube
）内は試薬チューブに記載されている表示です。
（3）また、コントロール反応用には、サンプル溶液の代わりに Positive Control Leg
（PC Leg）5μL を添加した陽性コントロールと Extraction Solution for Legionella
（EX Leg）5μL を添加した陰性コントロールを作製します。
2）リアルタイム濁度検出による増幅反応及び判定
（1） Loopamp リアルタイム濁度測定装置（適応機種 LA－320C，RT－160C，LA－200F）
の測定条件を本キット用にあわせます。設定は次のとおりです。
〔温度〕； 反応ブロック：65 ℃、 ホットボンネット：75 ℃
〔測定時間〕； 60 分
〔酵素失活処理〕； 80 ℃，2 分間
なお、操作方法の補足説明については Eiken GENOME SITE（URL；http://loopamp.
eiken.co.jp/）内の製品紹介ページをご参照ください。
（2）表示温度が 65℃に達していることを確認します。
（3）調製、分注済みの反応チューブをセットして速やかに測定を開始します。
（4）装置の表示画面上で陽性コントロールと陰性コントロールの濁度の上昇の有無を確認
します。陽性コントロール；Positive Control Leg（PC Leg）で濁度が上昇し、陰性
コントロール；Extraction Solution for Legionella（EX Leg）で濁度が上昇していな
ければ、LAMP 反応は正常に進行しています。それ以外の場合には、増幅反応が適切
に進行していない可能性があるため、試薬調製からの再検査を実施してください。
（図 1）
（5）次に、各検体の判定を行います。増幅反応時間内（60 分間）に濁度の上昇が認められ
た場合を「陽性」、濁度の上昇が認められない場合を「陰性」と判定します。（図 2）
環境水（温泉水、浴槽水、冷却塔水等）の検水をろ過濃縮法又は冷却遠心濃縮法で
処理した 100 倍濃縮検水を検体 6 ） としたレジオネラ属菌の検出。
【測定原理】
（6）なお、検体によって濁度上昇開始時間や濁度上昇値が陽性コントロール；Positive
Control Leg（PC Leg）と異なる場合があります。
（7）酵素失活処理（80℃，2 分間）（Loopamp リアルタイム濁度測定装置では自動処理
本キットは、LAMP 法を測定原理として利用しています。
されます。）が終了していることを確認した後、装置から使用済み反応チューブを取り
はじめに、濃縮処理した環境水（濃縮検水）中の DNA をアルカリ熱抽出後に中和処理し
出して、そのままキャップを開けずに廃棄してください。
た溶液をサンプル溶液とします。このサンプル溶液と Reaction Mix. Leg（RM Leg）、Bst
DNA Polymerase を混合してインキュベートすると、Bst DNA Polymerase の働きにより
■ 増幅曲線パターン
サンプル溶液中の DNA から増幅反応が進行します。核酸増幅の検出は、増幅反応の副産物
陽性コントロール
であるピロリン酸マグネシウム（白色沈殿物質）の濁度の変化によって行い 3）, 4）、レジオ
陽性検体1
陰性コントロール
0.4
陽性検体2
陰性検体
0.4
ネラ属菌の有無を判定します。
反応原理の詳細については、Eiken GENOME SITE（URL；http://loopamp.eiken.co.jp/）
をご参照ください。
なお、本キットは定性検出キットであり、定量測定目的に開発されたものではありません。
0.3
濁
0.2
0.2
度
度
【使用方法】
0.1
0.1
１．必要な器具・装置（キットに含まれていませんので、別途用意してください。）
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
0.3
濁
マスターミックス調製用滅菌チューブ（0.5 mL 又は 1.5 mL）
ピペット（0.5 ～ 10μL, 10 ～ 100μL, 100 ～ 1,000μL）
フィルター付きチップ
滅菌チューブ（2.0 mL）
Loopamp 反応チューブ
反応チューブ冷却用アルミ製ラック
氷（クラッシュアイス）
Loopamp リアルタイム濁度測定装置（適応機種 LA－320C，RT－160C，LA－200F）
小型冷却遠心機
微量簡易遠心機
ヒートブロック（95℃で使用）
ボルテックスミキサー
２．試薬の調製
0
0
10
20
30
40
50
60
0
0
10
20
時 間（分）
図 1．コントロールの増幅曲線パターン
30
40
50
60
時 間（分）
図 2．検体の増幅曲線パターン※2
※2：本キットは定性検出キットであり、
定量測定目的に開発されたものではありません。
したがって、濁度の立ち上がり時間で、コピー数を特定することはできません。
【操作上の留意事項】
１．サンプルの取扱い
1） 100 倍濃縮検水 2mL より 40μL 程度を残して上清（約 1,960μL）を除去する際は、
沈殿物を巻き込まないようピペッティング操作は慎重に行ってください。特に沈殿物が
1）－20℃で保存していた各試薬を室温で解凍し、解凍後は直ちに氷上で保存します。
多量に存在する場合は、沈殿物の巻き込みに十分注意して操作してください。
2）マスターミックスの調製（氷上で行ってください。）
2） サンプル溶液（DNA 抽出液）は原則として直ちに測定してください。また、長期に保存
（1）別途用意したマスターミックス調製用滅菌チューブに 1 テストあたり Reaction Mix.
Leg（RM Leg）20μL、Bst DNA Polymerase 1μL をそれぞれ必要なテスト数分
する場合は－80℃以下に保存し凍結融解の繰り返しは避けてください。
2． 試薬の取扱い
1） 本キットは必ず－20℃で保存してください。試薬の劣化を防止するために、使用時は
（陽性、陰性コントロール分も含む。）分注します。
（2）分注後、チューブを軽く数回叩いて混合する（以下、タッピングと呼ぶ。）か、又は
必要な試薬だけを箱から取り出してご使用ください。（凍結融解を 20 回繰り返した
転倒混和、あるいはボルテックスミキサーにて 1 秒間 × 3 回の撹拌により十分混合し
結果では、試薬の劣化はほとんど認められておりませんが､無用な凍結融解は品質維持
た後、微量簡易遠心機に数秒かけて（以下、スピンダウンと呼ぶ。）、これをマスター
ミックスとします。ボルテックスミキサーでの撹拌は過剰に行うと、酵素が失活する
可能性があります。したがって、1 秒間 × 3 回を厳守してください。
のために避けてください。）
2）試薬の解凍は室温で行い、調製と保存は氷上で行ってください。試薬を使用する際には、
一旦スピンダウンしてチューブの管壁やキャップに付着している試薬を落とした後、
十分混合し再度スピンダウンしてからご使用ください。なお、Bst DNA Polymerase は
なお、調製したマスターミックスはすぐに使用してください。
３．サンプル溶液の調製（氷上で行ってください。）
失活する恐れがありますので、激しく撹拌しないでください。
アルカリ熱抽出法 9）を用いて、検体から DNA 抽出液を得ます。
3） Positive Control Leg（PC Leg）は高コピー数です。Positive Control Leg（PC Leg）
＜アルカリ熱抽出法＞
から他のサンプル、試薬へのコンタミネーションを避けるため、取扱う際にはキャップ
（1）検体（100 倍濃縮検水 6））2 mL を別途用意した滅菌チューブ（2.0 mL）に入れ、
小型冷却遠心機で 4℃，13,000×g，10 分間遠心した後に 40μL 程度を残し、上清
（約 1,960μL）を除去します。
を開ける前に必ずチューブをスピンダウンし、キャップを開けている時間も必要最小限
となるようにしてください。また、反応チューブへの添加は、最後に行ってください。
このとき、反応チューブのキャップ（陽性コントロール用反応チューブ以外）はすべて
（2）スピンダウン後、Extraction Solution for Legionella（EX Leg）50μL を添加して、
閉まっていることを確認してください。さらに、検査環境へのコンタミネーションを
避けるため、Positive Control Leg（PC Leg）は本説明書に記載の操作方法以外での
ボルテックスミキサーで混合します。
（3）スピンダウン後、95℃，15 分間加熱処理して直ちに氷上で冷却します。
使用（希釈や検体などへの添加等）は、絶対に行わないでください。
（4）スピンダウン後、1M Tris－ HCl：pH7.0（Tris）8μL を添加して、ボルテックスミキ
4）陽性コントロール及び陽性と疑われる検体等は、他の試薬と離して取扱ってください。
5）試薬が余った場合、たとえ同一ロットであっても他キットへの使用はしないでください。
サーで混合します。
1／2
2）反応後のチューブはキャップを開けずに、焼却処理又は密閉できるビニール袋を二重に
■キット使用操作手順
施し、廃棄の基準に従って処理してください。増幅産物の飛散防止のため、廃棄の際に
＜検体の前処理；ＤＮＡ抽出液の調製＞（氷上操作）
オートクレーブ処理は行わないでください。
6）
検体（100 倍濃縮検水 ）2 mL を別途用意した滅菌チューブに入れる。
７．妨害物質
4℃，13,000 ×g，10 分間
反応液 25μL 中、鉄イオンは 3μmol／L 以上、マンガンイオンは 500μmol／L 以上で
LAMP 反応が阻害されます。多量の金属を含有する温泉水等を検体とする場合、金属
40μL 程度を残し、上清（約 1,960μL）を除去する。
〇 沈殿物を巻き込まないようピペッティング操作は慎重に行って
ください。
スピンダウン後、Extraction Solution for Legionella（EX Leg）50μL
を添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
イオンの影響により LAMP 反応が阻害される可能性がありますので注意してください。
【性能】
１．感度・特異性
Legionella pneumophila の 11 種の serogroup を含む 11 菌種 21 株のレジオネラ属菌
を特異的に検出することができました。非レジオネラ属菌では、市中肺炎の起因菌を含む
19 菌種 19 株で全く反応しませんでした 7）, 8）。
スピンダウン後、95℃，15 分間処理して、直ちに氷上で冷却する。
２．最低検出感度； 60 CF U（Colony Forming Unit）／test ※3
※3：最低検出感度は、Legionella pneumophila の保存菌株を用いた成績です。したがっ
スピンダウン後、1M Tris － HCl：pH 7.0（Tris）8μL を添加する。
て、実際の環境水を検体に用いた場合には、従来の培養法の性能及び感度と直接比較
ボルテックスミキサーで混合後、4℃，13,000×g，10 分間
することはできません。また、Legionella pneumophila に関しての最低検出感度で
あり､菌種によっては同様の感度が得られない場合があります。
上清をサンプル溶液とする。（氷上保冷）
３．培養法との相関
浴槽水 100 検体中、培養法でレジオネラ属菌が検出された 49 検体について LAMP 法
＜マスターミックスの調製＞ （氷上操作）
では全て陽性と判定され、陰性となる不一致は認められていません。また、培養法不検出
必要検体数分量（陽性、陰性コントロールも含む）を
調製し、よく混合する。
マスターミックスの調製（1 テストの分量）
Reaction Mix. Leg（RM Leg） 20μL
Bst DNA Polymerase
1μL
合
計
の 51 検体中 LAMP 法で陽性と判定された検体は 22 検体でした 11）。
【 使用上又は取扱い上の注意 】
１． LAMP反応は非常に鋭敏な反応であり、増幅産物等の DNA がごく微量でも混入すると
誤った結果をもたらす原因となる恐れがあります。このようなコンタミネーションを
回避するために、サンプル溶液と試薬の調製は別々のクリーンベンチ等を使用して行っ
21μL
スピンダウン後、マスターミックスとする。
（氷上保冷）
てください。なお、電気泳動等での増幅産物の取扱いは避けてください。
２．検体採取・取扱いについては必要なバイオハザード対策をとってください 6）,10）。
３．反応チューブ、マスターミックス調製用滅菌チューブには UV 照射しないでください。
UV 照射による変色等で誤った結果をもたらす場合があります。
＜操作法＞（氷上操作）
反応チューブ 1 本あたりマスターミックス 20μL を分注する。
４．本キットは、レジオネラ属菌検出を目的とした環境検査にのみご使用ください。ヒト、
動物由来検体の医療、臨床診断の目的では使用できません。
５．遺伝子検査の知識や経験をもたない場合、検査結果の判定を誤る危険性がありますので、
本キットの使用に当たっては遺伝子検査の知識、経験を有した技術者の指導の下で検査
サンプル溶液、又はコントロールをそれぞれ 5μL 添加する。
（LAMP 反応液として合計 25μL）
〇 陽性コントロールには Positive Control Leg（PC Leg）5μL を、
陰性コントロールには Extraction Solution for Legionella（EX Leg）
5μL を添加します。
ピペッティング又はタッピングにより混合後、スピンダウンする。
（気泡が立たないように注意する）
を実施してください。
６． 本キットは従来のレジオネラ属菌検査法の培養法とは異なり遺伝子検出法ですので、
レジオネラ属菌の生菌のみを検出するものではありません。したがって、本キットに
よる判定結果が培養法と異なる場合があります。自主検査の一環としてご使用ください。
７． 本キットの性能に由来しない事由（操作方法を誤った場合等）による誤った判定、また
その判定に由来して発生した事項に対して、当社は一切の責任を負いません。
８． 外箱に表示の使用期限（Exp.Date）内に使用してください。
９．本キットの保存温度は－20℃を厳守してください。－20℃より低い温度で保存・凍結
＜ＬＡＭＰ反応＞
融解を繰り返すことにより 1M Tris－HCl：pH7.0（Tris）チューブに亀裂が入る可能性
濁度測定装置の反応ブロックにセットして反応をスタートさせる。
65℃，60 分間
があります。
10．試薬チューブはＰＰ、キットケースは紙を主な材質としています。廃棄の際は医療廃
棄物等に関する規定及び、水質汚濁防止法等の各種規制に従い、各施設の責任において
酵素失活（80℃，2 分間）
（ Loopamp リアルタイム濁度測定装置では自動処理されます。）
処理してください。
【 包装単位・貯蔵方法・有効期間・製品コード 】
濁度測定 ・ 判 定
製
品
名
包装単位
®
Loopamp レジオネラ検出試薬キットＥ
３．反応チューブの取扱い方法
1）リアルタイム濁度検出の場合は、反応チューブは必ず専用の Loopamp 反応チューブを
ご使用ください。指定以外の反応チューブを使用した場合、光透過性の違いにより誤判
定を招く可能性があります。
2）反応チューブは破損しやすいので、取扱いには注意してください。
3）反応チューブは用いる前にキズ・ヒビ等が無いことを目視で確認してください。反応
チューブにキズ・ヒビ等があると正しく測定できないばかりか、チューブの破損により
装置を汚染する可能性があります。Loopamp リアルタイム濁度測定装置の反応ブロッ
ク内でチューブが破損した場合は、反応液が装置本体へ漏出し、除去不能な汚染や故障
の原因となります。
4）反応チューブにマスターミックス、サンプル溶液が添加されていることを、他のチュー
ブとの液量比較で確認してください。
４．増幅反応に際しての留意点
マスターミックスとサンプル溶液を混和後、反応液に気泡が残っていると濁度測定の
支障となり誤判定の原因となりますので、気泡が生じないよう注意してください。気泡が
貯蔵方法 有効期間 製品コード
48 テスト分 －20 ℃
1年間
LMP 661
【参考文献】
1）Notomi T. et al.: Nucleic Acids Research 28, No.12, e63（2000）
2）Nagamine K. et al.: Clin. Chem. 47, No.9, 1742－3（2001）
3）森 安義, 他 : 第 23 回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集（2000）
4）Mori Y. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 289, No.1, 150－154（2001）
5）富田 憲弘, 他 : 第 26 回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集（2003）
6）厚生省生活衛生局企画課監修: 新版レジオネラ症防止指針, 財団法人ビル管理教育セン
ター, 東京（2000）
7）安中 敏光, 他 : 日本臨床微生物学雑誌, 13, No.1, 19－25（2003）
8）安中 敏光 : JARMAM, 14, No.1, 25－30（2003）
9）Beige, J. et al.: J. Clin. Microbiol. 33 : 90－95（1995）
10）日本細菌学会バイオセイフティー委員会：日本細菌学雑誌, 54, No.3, 667－715（1999）
11）井上 浩章, 他 : 防菌防黴, 32, No.10, 481－ 487（2004）
＊【 問い合わせ先 】
残っている場合には、スピンダウンして気泡を取り除いてください。
栄研化学株式会社
５．検出、判定に際しての留意点
フリーダイヤル
1） 検出には必ず Loopamp リアルタイム濁度測定装置を用いてください。
お客様相談窓口
0120－308－421
2） Loopamp リアルタイム濁度測定装置は使用する約 20 分前までに立ち上げてください。
3）判定は、Positive Control Leg（PC Leg）の濁度上昇の有無（核酸の増幅反応が
適切に進行している場合、反応開始後 20 分前後から濁度上昇が開始します。）
により試薬の反応性を確認した上で行ってください。なお、検体によっては濁度
上昇開始時間が陽性コントロールよりも遅れる場合があります。
６．使用後の反応チューブの取扱い
1）反応後のチューブのキャップは決して開けないでください。特に反応チューブを装置か
ら取り出すときにチューブのキャップが開かないよう、慎重に取り出してください。
他検体の増幅産物によるコンタミネーションは誤判定の原因となるばかりでなく、検査
環境そのものを汚染し、汚染を除去しない限り、以後の検査で正しい結果が得られなく
＊ 製造販売元
栃 木 県 下 都 賀 郡 野 木町 野 木1 4 3 番 地
なる可能性があります。
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