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市販ELISAキットを使用した作物残留農薬分析における妨害
とホウレンソウでの妨害回避法の検討
誌名
埼玉県農林総合研究センター研究報告 = Bulletin of the Saitama
Prefectural Agriculture and Forestry Research Center
ISSN
13467778
著者
小林, 由美
佐藤, 賢一
巻/号
7号
掲載ページ
p. 56-65
発行年月
2008年3月
農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波事務所
Tsukuba Office, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat
埼玉農総研研報 (
7
)56
・
6
5，2007
市販 ELISAキットを使用した作物残留農薬分析における妨害と
ホウレンソウでの妨害回避法の検討
小 林 由 美 へ 佐 藤 賢一料
V
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nMethodo
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YumiKOBA
YASH
，
I KenichSATO
要約
本県の主要農産物であるダイ コン，ニンジン，ネギ，ブロツ コ リーとホウレンソウの
市販 ELISAキ ッ ト7種類(ホリパ ・バイオテクノロジー (現在は堀場製作所)製の SmartAs
s
a
y
シリ ーズのアセタミプリド，イプロジオン，イミダクロプリド，クロルフェナピル，クロロタ
ロニル，フェニト ロチオン測定用キッ トと SDI 社製のダイアジノン測定用キット)による残
留農薬分析 について検討した .今回検討した作物のうちホウレンソウを除けば，従来から示さ
れている方法(磨砕均質化試料からメタノールで農薬を抽 出し ，水で適宜希釈後市販 ELISAキ
ッ トに供 し測定する)による分析で，機器分析 と同程度の分析結果が得られ，分析値への妨害
の程度は微小で、あった.ホウレンソウは，一部 ELISA キッ トで，吸光度が大きく低下し，分
析値に大きな誤差が生じた.ホウレンソ ウの ELISA キッ トによる妨害回避法として，限外ろ
過 を分析法に取 り入れることにより，機器分析と同程度の分析結果が得られる .
農作物の安全 ・安心確保の取り組みとして生産履
がその測定値に及ぼす妨害の程度を確認し，妨害の
歴の管理 ・公開が重要視されている .特に消費者の
大きいホウレンソウについては，限外ろ過の利用に
残留農薬への関心は高く，生産者はそれに応えるた
より，妨害を回避 できたのでここに報告する .
めに農薬使用暦や残留農薬分析結果の公表を始 めて
なお，本報告は先端技術を活用した農林水産研究
いる .残留農薬分析は分析機関に委託されることが
高度化事業 「
残留農薬評価 のための地域特産物の分
多いが ，時間と費用の点から生産者自らが生産現場
類法及び迅速検出法の開発 (
200
3.
.
.20
0
5)J による
で実行可能な迅速かっ簡便な残留農薬の分析法が求
成果の一部である。
められている .
迅速かっ簡便な残留農薬分析手法として ELISA
材料および方法
法は注目されるが， 作物体に含まれる央雑物により
擬陽性を示すマ トリクス効果があるなどの問題点が
1 試料
指摘されて い る(津村 ら
， 1
9
9
2)
. 特に，ネギとホウ
ダイコン，ニンジン，ネギ，ブロッコリーおよび
レンソウについては，作物成分の影響が大き い こと
ホウレンソウは農林総合研究センターで栽培され，
.
も報告されている(中揮， 2000)
農薬使用履歴の明らかなサンプルを用いた .
そこで，本県主要農産物であるダイコン，ニンジ
2 試薬
ン，ネギ，ブロッ コ リーおよびホウレンソウを対象
有機溶媒は残留農薬分析用，その他の試薬は残留
とし ，市販 ELISA キ ッ ト7種類に対し作物中成分
農薬分析用及び特級品，水は純水を用いた.標準品
1回大会 (
2
0
0
6年 3月)に発表した .
本研究の一部は，農薬学会第 3
本
農産物安全性担当 (
現水 田農業研 究所)，料農産物安全性担当
pHU
n
hv
小林ら:EL
lSAによる作物残留農薬分析の際の妨害と回避法の検討
(
1
) 既知の農薬濃度における，作物試験溶液と
は，農薬分析用を，有機溶媒に溶解し適宜希釈して
用いた.
1
0%メタノール含有水との比較
3 ELISAキット
先の調整法で得られた作物試験溶液，および対照
EL
lSA キ ッ トは，ホリパ・バイオテクノロジー
溶液としての 10%メタノール含有水(メタノール
製の SmartAssay シリーズを主に用いた.アセタミ
:水= 1
:
9，v
/
v
)に
， EL
lSAキ ッ トの測定範囲で農
プリド(測定範囲: (以下同じ) 0.
3.
.
.
.4ppb)，イプ
薬標準品を添加し，農薬標準溶液列を作成した.試
ロジオン(1.5.
.
.
. 30ppb)，イミダクロプリド (
2.
.
.
.
験溶液と対照の EL
lSAで得られた吸光度を比較し，
2.
.
.
.I
O
p
p
b
)，クロロ
1
0
0
p
p
b
)，クロルフェナピル (
作物由来の妨害の有無や程度を検討した.
0
.
1
5
.
.
.
.
.
.
.1
5
p
p
b
)，フェニトロチオン (
0
.
1
5
タロニル (
ダイアジノン試験用の作物試験溶液は，磨砕均質
.
.
.
. 2ppb (高感度タイプ))それぞれの測定用キット
化試料にメタノールを加え振とう抽出，ろ過後に試
である.キット内容は，抗体プレート (96ウェル， 8
料の 200倍および 1000倍に水で希釈し作成した.
x12列)，標準試薬 L，標準試薬 H，酵素標識物試
対照は
薬，発色試薬，反応停止試薬，プレートシール，取
1
:
9
9，v
/
v
) を{吏用した.
扱説明 書からなる.
1%メタノール含有水(メタノール:水=
(
2
) Blank試料で作成した作物試験溶液と標準
その他 SDI社製の EnviroGard シ リーズのダイア
試薬 L との比較
ジノンキ ッ ト(測定範囲:0
.
0
3.
.
.
.0
.
5
p
p
b
) を使用し
農薬添加試験により，吸光度が事離する場合は低
9
6ウェル， 1
2
た.キ ッ トの内容は，抗体プレート (
濃度域でその度合いが大きいことが明らかとなっ
x 8列)，農薬標準試薬，酵素標識物試薬，発色試
た.そこで，試験対象農薬が含まれていない作物試
薬，反応停止試薬，取扱説明書からなる.
料 (Blank試料)を抽出し、作成した作物試験溶液
lSA キットの定量下限濃度の吸光
と対照として EL
4 装置
EL
lSA 法 :吸 光 光 度 計 (SmartReader r
MPR
・0
1J
)
度を比較することにより作物が EL
lSA に及ぼす妨
機器分析法:高感度窒素燐検出器付きガスクロマト
害の程度を調べた . EL
lSA キ ッ トの定量下限濃度
グラ フ (GC17A，hp6890)，高速液体クロマトグラ
r
t
Assayν リーズの場合メーカーがキット
は
， Sma
フ (LP7000)
に付属した農薬標準液(標準試薬L)の濃度とした.
・
5 ELISAでの分析方法
ダイア ジノンキットの場合は 0.
03ppb とした.試験
B
/
B
O%)
結果は，数回の平均をとるため吸光度比 (
磨砕均質化試料 20gにメタノール 100mL加え， 30
で表した .B/
BO%の求め方は下記の式による.
分間振とう後，ろ紙 (
N
o
.5B) でろ過， ImL 分取し
水 7.5mL を加えて希釈したものを作物試験溶液と
作物試験協夜の
ELISAで鳴られた吸光度
した.
B/
BO %= .
.
_
_.
対照(I併もメタノーノレ)の ELISA
で得られた吸光度
測定用 EL
lSA キットの操作方法はメーカ一指定
x 100
の方法に従 った.
分析値の算出は，以下の方法で、
行った.①試験溶
(
3
) 妨害要因の推定(ホウレンソウと他の葉莱
ELlSAによって得た吸
lSA キ ッ トで操作し
液および標準試薬 L，H を EL
類の試験溶液における
発色させる.②その発色の濃淡を分光光度計で数値
光度の比較) (妨害要因物質のイミダクロプリ
化し吸光度を得る.③標準試薬の EL
lSA で得られ
ド精製操作における挙動)
た吸光度での検量線に試験溶液で得られた吸光度を
ホウレンソウにおけるイミダクロプリド分析で吸
あてはめ，分析値を算出する.以下，本報告で吸光
光度減少という妨害が明確に現れた.そこで，妨害
度は
ELlSA操作によって得られた波長
450nmの吸
要因となる物質が，葉緑素の多く含まれる葉菜類に
光度を示す.
共通の物質か，ホウレンソウに特有の物質かを明ら
なお，試験によっては，水もしくは 50%リン酸
かにするため，ホウレンソウおよび参考としてシュ
を磨砕均質化時に添加，あるいは試料とメタノール
ンギク，コマツナ，
の割合および希釈率の変更を行 った.
イミダクロプリドを添加し， EL
lSA で得られた吸
6 作物が ELISAによる分析値に及ぼす妨害の有無
光度を比較した.
ミツバ，ネギの作物試験溶液に
ワ
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FD
埼玉農総研研報 (
7
)
5
6・6
5，2007
さらに，妨害要因物質を推定するため， HPLC に
ターの効果はイミダクロプリド，抽出溶媒の変更お
よるホウレンソウのイミダクロプリド分析で用いら
よび活性炭粉末の効果はイミダクロプリドとダイア
れる精製操作の途中で分取した試料液から ELISA
ジノンそれぞれの測定用 ELISAキットを使用した.
測定に悪影響を及ぼす有機溶媒をエパポレーターで
(
3
) 限外ろ過の利用(イミダ クロプリ ド)
留去し，これを 10%メタノールに再溶解し ELISA
限外ろ過の有効性が玄米等で報告されている(畠
キ ッ トで測定し，妨害要因物質を推定した.精製操
山ら 2
0
0
4
) ことから，その効果について試験した.
作は以下の手順で、
行った.多孔性ケイソウ土カラム
試験には、 ADVANTEC 製限外ろ過膜フィルター
にホウレンソウの有機溶媒抽出液から有機溶媒を留
0，
0
0
0
) を使用し，
ユニット (USY-I，分画分子量 1
去したものを負荷し，ヘキサンを流下して央雑物を
イミダクロプリドを添加後に限外ろ過処理したホウ
分画除去する(画分1).次にヘキサン/酢酸エチ
レンソウ試験溶液とイミダ クロプリド添加 10%メ
ル混液を流下しイミダクロプリドが含まれる画分を
タノール含有水(対照)の吸光度を比較した.さら
).その溶出液の有機溶媒を留去
溶出する(画分 2
に数品種のホウレンソウ試験溶液の限外ろ過処理と
し，ヘキサンに再溶解後シリカゲノレミニカラムに負
無処理の ELISA によって得た吸光度を比較した.
荷する.ヘキサンを流下し爽雑物を分画除去する(画
また，限外ろ過によ って妨害物質を分離したこと
).さらにヘキサン/酢酸エチル混液を流下し
分 3
を確認するため，ろ過膜上に残った残濯をメタノー
)，酢酸エチノレを流下しイミダ クロプリド
(画分 4
ルに再溶解しつつ回収し，水で希釈後 ELISA で測
定した.
)
.
が含まれる画分を溶出する(画分 5
7 妨害回避法の検討(ホウレンソウ)
アセタミプリド，イプロジオン，クロルフェナピ
(
1
) 試験溶液の希釈による妨害回避効果
ル，フェニトロチオンとダイアジノン各々の測定用
ホウレンソウを試料とした ELISA で、
吸光度が小
ELISA キ ットについてもホウレンソウによる分析
さくなる(つまり分析値が大きくなる)測定妨害が
妨害の限外ろ過処理による回避効果を無処理と比較
おきる.そこで、ホウレンソウが原因となる妨害の
し確認した .
回避法を検討した.先の調整法で得られたホウレン
8 機器分析法との比較評価
ソウ試験溶液を 10%メタノーノレでさらに追加希釈，
ELISA キ ッ トを用い，ほ場で農薬製剤を散布し
ELISA キット(イミダクロプリド測定用)に供し
て栽培したサンプルについて ELISA 法と機器分析
妨害回避可能な希釈倍率とその時の測定範囲を調べ
法による測定値の比較評価を行った. ELISA 法に
た.試験は，イミダクロプリド測定用 ELISA キッ
よるホウレンソウのイミ ダク ロプリド分析には，限
トを使用した.
外ろ過，ダイアジノン分析は 50%メタノール含有
(
2
) メンブレンフィルターあるいは抽出溶媒の
水抽出法による妨害回避法を加えた. ELISA 法に
よるブロツコリーのダイアジノン分析は 300倍と
変更による妨害回避効果
500倍希釈溶液を用いた.
ホウレンソウからメタノールによって農薬と共に
抽出される妨害要因物質の除去法を検討した.水で
希釈したメタノールを抽出溶媒にすることによる妨
結 果
害要因物質溶出抑制の効果，メンブレンフィルター
による妨害要因物質除去効果，抽出時の活性炭粉末
1 作物が ELISAIこ及ぼす妨害の有無
添加処理による妨害要因物質吸着除去効果について
(
1
) 既知の農薬濃度における，作物試験溶液と
10%メタノーノレ含有水との比較
無処理の吸光度と比較した .メンブレンフィルター
4
5 μ mと 0.
2μ mを使用し数品種のホウ
は孔径 0.
作物から作成した試験溶液と対照の 10%メタノ
レンソウを試験した.活性炭粉末はイミダクロプリ
ール含有水にそれぞれ既知濃度の農薬を添加して得
ド試験は Envi・Carb粉末 (SPELCO社製)を試料重
'
"
'
'3
られた吸光度をプロットしたものの一部を図 1
に示した.
量の 1
0%， ダイアジノン試験はグラファイトカー
ボンブラック粉末 (GL サイエンス社製)を試料重
イミダクロプリドを添加したネギ試験溶液および
I・
同 量使用した .メ ンブレンフィル
量の 2割 ・5害J
イプロジオンを添加したニンジン試験溶液の吸光度
。
。
FHU
小林ら:ELISAによる作物残留農薬分析の際の妨害と回避法の検討
は
， 10%メタノール含有水に農薬添加した対照のそ
加濃度における吸光度はおおむね一致していた.
れと測定範囲内においておおむね一致していた.フ
0.
900
ェニトロチオンを添加したネギの試験溶液は，低濃
0
.
8
0
0
0.
700
度域で対照に比べて吸光度が小さくなったが，全体
大¥
1
0
%
メ9
1
ー
ル
ー~
ホウレンソウ
Q
0
.
6
0
0
的に吸光度は一致していた.クロロタロニノレを添加
票
日
したニンジンとダイコン(葉および根)試験溶液は，
i
!0.
400
500
0.
300
測定濃度全体で対照と比べて吸光度がわずかに小さ
0.
200
くなった(図 1
).イミダクロプリドを添加したホ
0.
1
0
0
ウレンソウ試験溶液は，対照に比べ吸光度が大きく
0
。一
0
.
¥よミ
D
-
∞o
1
0
イミダクロプリド温度(即b
)
).ダイアジノンを添加したネギと
減少した(図 2
1
0
0
ホウレンソウの試験溶液は，希釈倍率によって結果
図 2 イミダクロプリドを添加したホウレンソウ試
に違いがあった. 200 倍希釈で作成したネギとホウ
験 溶 液 と 対 照 (10 % メ タ ノ ー ル 含 有 水 ) の
レンソウ試験溶液の吸光度は対照の吸光度に比べて
ELISAで得られた吸光度
※ lプ ロッ トは 2サ ンプルの吸光度平均を表す
小さかった. しかし， 1000 倍希釈で作成した試験
溶液は，対照とほぼ同じ吸光度であった(図 3
)
.
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1
.
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1
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，
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ヲロ白骨ロニル温度(即b
)
ネギ 10
∞倍希釈液
0.
1
0
1
.
00
ダイアジノン濃庚 (
p
p
b
)
ゐ
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、
図 3 ダイアジノンを添加したホウレンソウとネギ
、
1
0 %メタノール含有水)
の試験溶液と対照 (
n
I-4-1日'"タゾール ‘
'
∞ ~ 0 ネギ
0
β∞ 」一一一一ー一日叫ん一一一一一-- - ~
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1
0.
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子、
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0 ネギ 200
倍希釈液
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回
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1
.
2
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I d.ホウレンソウ 1000倍希釈
0.
2
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1
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イミダヲロヲJ
ド温度(押b
)
イプロジオン濠度 (ppb)
1
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[ 01¥官
0.
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田
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8
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1
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2
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。
1
.
6
0
.
1
の ELISAで得られた吸光度
1
0
※ lプ ロッ トは 2サンプルの吸光度平均を表す
7:
x
.
ニトロチオン温度(押 b
)
図 l 農薬を添加した作物試験溶液と対照 (
1
0%メ
(
2
) 81ank試料で作成した試験溶液と標準試薬 L
タノール含有水)の ELISAで得られた吸光度
との比較
※ lプ ロッ トは 3サン プルの平均吸光度を表す
ELISA キットと作物の組み合わせで得られた吸
光度比 (BIBO%) を表 1に示した.ニンジン・ネギ
ダイコン(葉および根)はクロロタロニル以外に
とダイアジノンの組合せ以外はいずれの作物も
アセタミプリド・クロルフェナピルについて，ニン
8/BO%は 1
0
0 以下となり， 1
0 %メタノールより小
ジンはイプロジオンとクロロタロニル以外にアセタ
さかった.ネギとアセタミプリド，クロロフェナピ
ミプリド・クロルフェナヒ。
ル・ダイアジノンについ
ル，ブロ ッコリーとクロルフェナヒ。
ル・ダイアジノ
て，ネギはイミダクロプリド・ダイアジノン・フェ
ン，ホウレンソウとアセタミプリド・イプロジオン
ニトロチオン以外にアセタミプリド・クロルフェナ
・イミダクロプリド・クロルフェナヒ。
ル・高感度フ
ピルについて，ブロツコリーはアセタミプリド・ク
ェニトロチオン・ダイアジノン，ニンジンとクロル
ロルフェナヒ。
ル・フェニトロチオンについて試験し
フェナヒ。
ル・ダイコン葉とクロルフェナヒ。
ル・クロ
た.この組み合わせにおいて，いずれの作物の試験
ロタロニル，ダイコン根とクロルフェナヒ。
ルそれぞ、
溶液も対照の 10%メタノール含有水と同じ農薬添
れの ELISA において 81ank試料(試験対象農薬を
QU
FD
埼玉農総研研報 (
7
)56・6
5，
2007
表 1 8
1
a
n
k試料および標準試薬 Lの吸光度と 10%メタノールの比 (8/
80%1))
ホ
ぢー
レ
子
7
i
7
ヂイコ ン棄
ヂイコン寝
穣翠衰薬L
覧(
n=
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)
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覧:
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:
2
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n
=
6
)
92
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:
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%(
n
=
3
)
9
5
覧:
!
:
2
弛(
n=
3
)
92首 :
!
:
2
覧(
n
=
9
)
96
首:
!
:
2
%(
n
=
6
)
n=
6
)
88%土 鳩 (
覧:
!
:
2
弛(
n
=
6
)
97
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%:
!
:
2
首(
n
=
6
)
9
4% :
!
:
2
略(
n
=
6
)
覧:
!
:
3
事(
n
=
6
)
89
87
覧:
!
:
I弛(
n=
6
)
32%:
!
:
1弧(
n
=
6
)
首:
!
:
7
覧(
n
=
6
)
90
90
覧:
!
:
2
首(
n
=
6
)
87%:
!
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覧(
n
=
6
)
80
首:
!
:
1覧(
n
=
6
)
83%:
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%(
n
=
9
)
%:
!
:
4
覧(
n=6)
89
93
覧:
!
:
5
覧(
n=
6
)
88
弧:
!
:
3
覧(
n
=
6
)
95
覧:
!
:
4
覧(
n
=
5
)
97
首±持 (
n=
6
)
90
覧:
!
:
2
事(
n=
6
)
93%:
!
:
2
首(
n
=
6
)
93%:
!
:
2
覧(
n
=
6
)
87
略:
!
:
3
也(
n=
3
)
9
1覧 :
!
:
2
弛(
n
=
3)
斉家蔑薬て搾務
~
ブロツコす
アセタミプリド
88首 :
!
:
2
置い=自)
イプロ ジオ ン
イミダクロプリド
クロルフェナ ピル
90%土 浦 (
n
=
9
)
98%:
!
:
5
覧(
n=
2
)
89
覧:
!
:
5
'
H
n=
3
)
一
クロ ロタロニノレ 2
)
一
ーンジン
フェニトロチオン 3
)
79
首 ±符 (
n
=
6
)
7
8
覧 ±怖い=
3
)
69
同 士 拘(
n=
6
)
94
覧 ±柑 (
n
=
3
)
ダイアジノン 4)
0
1%:!:怖い=
2
86
覧:
!
:
2
買い=
8
)
100
覧:
!
:
7
耳(
n=
2
)
1
0
4
弛±時 (
n
=
2
)
作物平均
90
覧
88%
76
弧
95
覧
9
1覧
1)B
/
回世 l
立、 (
B
l
a
n
k試料の吸光度 /1
0
包メタノールの吸光度) の百分率土様準誤差 (
n
=サンプル数)
74
覧:
!
:
2
%
(
n
=
3
)
95%:
!
:
2
覧(
n
=l1)
9
1慣i
88
首
農薬標準品 Lとそれより吸光度が小さくなる組み合わせは太字で裂す
2)クロロタロニルの吸光度は 0
.
1
%リン隊合有の 1
0
%メタノールの吸光度を B
Oとしている
3) EL
lSAキ ットは高感度タイ プを使用した
4)ダイアジノンは 作物試験溶液の希釈率は下記の通 り
、 標準訳業 L
は0
.
0
3
p
p
bを作成した
ネ
キ '・1
0
0
0倍 、 γ。ツコト ・印刷吾、制レンゾウ・ l
∞o倍、 ニンンツ ・900倍
含まない試料)がキット付属の標準試薬 L より小
分析で用いられる精製操作の各段階の分取画分を
さい吸光度で、あった.ホウレンソウのイミダクロプ
E
L
I
S
Aキットで測定した結果は，表 2に示すとお
リド分析の場合に吸光度は大きく減少した.フェニ
りであった.多孔性ケイソウ土カラムで分画したホ
トロチオン分析でもホウレンソウの吸光度は他作物
ウレンソウのメタノール抽出物は，ヘキサン画分(1)
に比べ減少した.
ではイミダクロプリドが検出されず，ヘキサン/酢
(
3
) 妨害要因の推定(ホウレンソウと他の葉菜
酸エチル混液画分 (
2
)でイミダクロ プ リドが検出さ
E
L
I
S
Aによって得た吸
れた.その後の，シリカゲルミニカラムによる精製
光度の比較) (妨害要因物質のイミダクロプリ
ではイミダクロプリドはヘキサン画分(3)では検出
類の試験溶液における
.
5
6
されず，ヘキサン/酢酸エチル混液画分(4)で 3
ド精製操作における 挙動)
作物試験溶液の色はシュンギクがもっとも濃く，
ppm，その後の酢酸エチル画分 (
5
)で 1
.
1
2ppm検出
次にホウレンソウが濃かった.ネギはもっとも色が
された.供試サンプルにはイミダクロプリド剤は使
薄かった.
E
L
I
S
A によ って得た吸光度がもっとも
用されていない.
事離したのは，ホウレンソウだった.コマツナは低
表 2 ホウレンソウの精製過程で分取した成分
濃度域でやや吸光度が小さくなったもののほぼ対照
E
L
I
S
Aによるイミダクロプリド測定値
E
L
I
S
A
測定値(ppm)
分取画分
の
と同じであった.シュンギク・ネギ・ミツバの作物
試験溶液は，対照の
10%メタノールと E
L
I
S
Aによ
多孔性ケイソウ土カラム
ヘキサン
ヘキサン/酢酸エチル
シリカケツレミニカ
ラ
ム
ヘキサン
ヘキサン/酢酸エチル
酢酸エチル
って得た吸光度がほぼ同じで、あった(図 4
)
.
ホウレンソウの HPLC によるイミダクロプリド
一
・
-1
凹メ骨ノール
1
2
田
1
.
000
ロ
シ斗ンギヲ
。
A コマツナ
ネギ
ム
ミ
ッ J¥
。ホウレンソウ
D
0
.
8
∞
0
.
2
5
3
.
5
2
(
3
)
(
4
)
(
5
)
0
.
0
9
3
.
5
6
1
.
12
2 妨害回避法の検討(ホウレンソウ)
組
栄 0
.
6
回
g
0
.
4
∞
(
1
)
(
2
)
O
(
1
) 試験溶液の希釈による妨害回避効果
O
ホウレンソウ試験溶液を追加希釈していくと，得
O
0
2
叩
られた吸光度は 10%メタノールのそれに近づいた
0皿J
O L.ーー一一一一一一一←一一一一一一ー--~
1
0
イミダクロプリド温度(Pp
b
)
∞
図 4 イミダクロプリドを添加したホウレンソ
ウと他の葉菜類の吸光度
※ lプロットは 2サ ンプル の 吸 光 度 平 均
(
図 5
).通常の希釈倍率である 5
1 倍希釈より 5
1
x8倍，
5
1 x8倍より 5
1 x1
6倍とい うように希
釈 を 大 き く す る ほ ど 対 照 の 10%メタノールの吸光
度との事離は小さくなった.
(
2
) メンブレンフィルターあるいは抽出溶媒の
-60-
小林ら:ELISAによる作物残留農薬分析の際の妨害と回避法の検討
みの結果イミダクロプリド測定の場合，対照との吸
変更による妨害回避効果
光度~離の状況は無添加と同様大きかった.
作物試料から農薬を抽出するのに使う溶媒である
6
).ダイアジノン測定の場合は活性炭粉末(グラフ
メタノールに水を加えその含有割合を少なくし妨害
∞
0.
8
0.
700
0.
600
∞
ァイ トカ ーボンパウダー)の抽出時添加量が増すほ
。
0.
900
対照区 10ν'/，
I
J
白
5
1倍 希 釈
企 5
1x8倍希釈
G- 5
1x16倍 希 釈
Eb
lSA の結果得られた吸光度は対照に近づいた
ど EL
(
図8
).
0.
6
0
0
倒 0.
5
ボ
0.
5
5
0 r
g 【).400
0.
300 I
ミ¥
ロー
(同図
-.
8- '
-8-_
制 0.
4
5
0
r
O
}
I 0 月I-J~抽出
e
栄 0.
4
∞
醤
0
.
3
5
0
0.
100
0.
000
10
日
\~
!
ト
8
￨ ・対照 (
1
1
1
"'
1
ー
ル)
門
昌
X
M
U
ー
O0 0
0.
200
0
.
5
∞
0
.
3
0
0 I 0 50\.. ，/-J~ 抽出
。
問 ! 10''''1ール抽出
100
日
イミダクロプリド;a度 (
p
凶)
0200
図 5 ホウレンソウ試験溶液の希釈による妨害回避
効果(イミダクロプリド)
1000
100
10
Fイ7シ'
1
ン;
J
度(
p
同)
図 7 抽出方法の違いによるによる妨 害回避効果
(ホウレンソウ・ダイア ジノン)
※ lプ ロ ッ トは 2サン プルの吸光度平均を表す
物質の溶出抑制を試みた結果を図 6，8に示す.イ
※ lプ ロッ トは lサ ンプルの吸光度 を表す
ミダクロプリド測定の場合，どの抽出溶媒を用いて
100
%，
95%
90
也ト
85¥ I
水 /岬 J
ー刷 9
9
:
1
) 8
0
%￨
I
で調製した塵聾
帽"晶の唖先度 7
5% I
に封する鼠厳区 7
0
%•
も，得られたホウレンソワ抽出液の吸光度は対照の
1
0%メタノールと比べて小さくなった(図‘6
)
. メ
^
.
，
タノール抽出 < 50%メタノール含有水抽出 < 10%
メタノール含有水抽出 <水抽出の順に吸光度は大き
の唖光度(
，)
"" I
65% '
l 一一一一一ーー-- ~単Z汁 1
くなり，対照に近づいたが黍離は大きかった .ダイ
・本ウレン
con
t
11
ロホウレンGC820也
ロ本ウレン
GCB50
%
直主佐沼9
!
11
也!
t
アジノン測定の場合，結果にばらつきが大きいもの
のメタノール抽出 < 50%メタノール含有水抽出 <
0
0.
05
0.
2
0.
5
，
.
イルー
ル 温 度 帥}
・
細
.
.
.
.
，
.
.Iu'l'lのac
図 8 活性炭粉末の抽出 時処理による妨害回避効果
(ホウレンソウ ・ダイア ジノン)
10%メタノール含有水抽出の順に吸光 度が大きくな
). 10%メタノール含有
り，対照に近づいた(図 7
※ lプ ロッ トは 2サ ンプル の吸光度を表す
水による抽出は，ほぽ対照と閉じ吸光度であった .
抽出後の希釈液をメンブレンフィノレターによって
o 鼠料無し(Hl%;I?ノール)
ロ メ9ノール抽出
1
.
200
A
O
。ロ
8
AU
40%
恩
OA回
。
盟
国
山
。
蜘L
.
.
川W
0.
200
OXAり
0.
400
舎
8
0%
mg
M酉叫
∞
~ 0.
6
g
1
1訓
1
∞
司 ↓E
¥
0.
800
性6
制月
し抽出
1
0
唱
メヲノール抽出
純水抽出
同m
V
一
ヘ¥ 。
1
一
a
w似無
一
回 jotA一
∞o
ろ過し妨害物質の除去を試みた結果を図 9に示す.
A メヲノール +ENVI-C.巾摘出
A
~
20
情
~ \8
。
唱
0
1
0
∞
J
/~ .
A
.
.
4
j
;
'J
.
)"
n
1
- /;ll'l.l{.) ->S~ _'I2f
ず んb
ィ
'PJFJ
f 帳 、
t
l
'
i
' .
.
.
.
.
Y
吟
イミダクロプリド濃度(
p
p
b
)
ぐ
品種名
図 6 抽出方法の違いによる妨害回避効果(ホウレ
図 9 メンブレンフィルターによる妨害回避効果
ンソウ ・イミダクロ プリ ド ホ ウ レ ン ソ ウ ・イミ ダクロプリド)
※ lプ ロ ッ トは 2サ ンプル の平均吸光度を表す
※ lプ ロ ッ トは 2サ ンプルの平均吸光度を表す
抽出時の活性炭粉末添加による妨害物質吸着の試
イミダクロプリドの含まれていないホウレンソウか
唱EA
FO
埼玉農総研研報 (
7
)56・65，
2007
ら作成した作物試験溶液の
E
L
I
S
Aによって得た吸
涯の
光度は対照の 10%メタノールや定量限界濃度の農
E
L
I
S
Aによって得た吸光度は，限外ろ過無処
理の試験溶液と同様に小さく，対照と事離していた
(
図 1
2
)
.
薬標準品 L のそれと比べ小さくメンブレンフィル
ターでろ過しない場合と同様で、あった.
イミダクロプリド以外の測定キットについても限
(
3
) 限外ろ過の利用(イミダクロプリド)
外ろ過処理と無処理を比較した.試験した 6種類の
文献で限外ろ過膜フィルターユニットに妨害回避
80%は 1
0
0に
キットにおいても，無処理と比べ ，8/
効果があるとされていたので，市販の限外ろ過フイ
1
2
0
怯
酬[
。 。口 口 口 口
(ADVANTEC USY
・I)がホウレン
ノレターユニット
~ 6
0
鴨
醤
。<>
:[
EE
J
レンソウ試験溶液にイミダクロプリドを添加し，限
外ろ過した試験溶液と対照の吸光度は良く一致して
>
<
> <
> <
。
唱
。
いた(図 1
0
).
Y J U fr
PU J
1~匹、司P
4 ρ 爪 JFJ ゃ ん
n
u U
内 Aυ
U
内
u
︽ n u
u
内
︽ Aunu
υ
︽ nυ
υ
内
n
u U
守e
oroaaマ
nunwwmO '
UAUAUnununu
，
︽
，
4
吟
.
.
.
.
T~
t
品種名
V
図 1
1 限外ろ過による妨害回避効果(ホウレンソ
mg
刷世到
ウ・イミダクロプリド)
※ lプロットは 4サンプルの平均吸光度を表す
0
.
3
0
0
I
0.
200
0.
100 ト
0.
000
口
恒 8
0
弛
E
L
I
S
A分析に使用できるか試験した.ホウ
ソウの
ロ
1
1
D
O
:iロ
¥-
~ー 1 0%メ骨ノール
w
ロ ホウレンソウ
rl
O
倒
一
一一一一ー一一←一一一一一一一~
1
0
100
イミダクロプリド濃度 (
p
p
b
)
ロ
口
6
念
ロ
￨
扇 面一 一 一 1
@
ロ限外ろ過処理
∞
￨
C
;J
ィルトに残ったもの [
図 1
0 イミダクロプリド添加後限外ろ過処理したホ
玉、'::/l
.
.
:
十
~.)
ウレンソウ試験溶液と 1
0 %メタノールの吸光
FY4cγ
，~
"
，
'
i
i
‘
，
.
:
:
.
i
'
"
.
.
.
{
冒 干 '
度比較
※ lプロットは 2サンプルの平均吸光度を表す
J
少
図 1
2 限外ろ過による妨害回避効果(ホウレンソウ
・イミ ダクロプリド)
81ank試料による試験の結果，品種の異なるホウ
※ lプロットは 2サンプルの平均吸光度を表す
レンソウでも限外ろ過後の供試液は対照と同様の吸
)
.
近づいた(表 3
光度を示し，限外ろ過しない供試液の吸光度とは明
らかに異なった(図 11).限外ろ過膜上に残った残
表
3 ホウレンソウの E
L
I
S
Aにおける限外ろ過による妨害回避効果 (8/80%，
)
)
一
-
薬
い
ー
一
1) B/BO%は試験溶液の吸光度を 10%メタノーノレの吸光度で除した百分率 (
2点平均)
2) E
L
I
S
Aキットは高感度タイ プを使用した
--
肌酬州側側馴 一
一
一
端
1
一一一
一
一
一一一
JAl
一
一
一ン 一 一 一
m 印刷m一
同 訓 肌 川mmMm一
一オ 一
肌刊拘m
一 /
Aりノ 一
8 3 9 8 6一
9 m m 8 9 8一
一hV一 叩
一吠 一
%
川町苅%偽%
%一
%
% % % % 九せ一
qJqd'IFhdqJ 泊
AUηJqJqdA
吐凋せ
一小ノ 一
8 9 4l
0 8 7一
0
10
10
10
10
1 9一
一プ 一
一
一
一一一
一
凶
一哨 一
一
消
防
銚
潟
市
郊
郊m m 効 % 強 一
g 9 4川γ 広一
山川町引引制 一
一助 一
商
示
月
ン
加
ホ
一一一
一ラ 一
%%%%%偽一
%%%%%%
一
t 一nhunvηJqdηIT土 a4RUQdQJAA Q U
一川
一
7 9 4 9 5 5一
999899
アセタミプリド
イプロジオン
イミダクロプリド
無処理
クロルフェナヒ。
ル
)
フェニトロチオン 2
ダイアジノン
アセタミプリド
イプロジオン
イミダクロプリド
限外ろ過処理 クロルフェナヒ。
ル
フェニトロチオン 2)
ダイアジノン
一一 ノ
、
。
対象農薬
L
円
n
hu
小林ら :ELISAによる作物残留農薬分析の際の妨害と回避法の検討
ppm _
-.
.7'
ロヮヨ
).
ヲ
ロ
J
l
.7エ
ナピル
・ネキ・. ~日Jl. 7工ナピJI.
6
~
y: 1
.
11x-0.
01
r:
:0.
99
坦
(
サンプル敏 122)
.
.
ロ
ヰ
キ
.
・7
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世
ミ
プ
リ
ド
1
I
t
./
ロネキ.
・イ
ミ
ダ
ヲ
ロ7.
リ
ド
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Aホウレンソウ・イミダヲロ7.
)
ド1
)
'
Oノ
盆
・二ル.
ン・知ロ知ニJI.
o~.イコン領 ・ 知ロ知ニル
o~.イコン葉・ 9日ロ知ニJI.
xホウ
レンソ
ウ
・ fイ7
シソ
ン
xプ
ロッ
:
1
)
.
ず
イ7
シ
ソン
ω
問︿的コ
MHE
エ
ニト
ロ
チ
オ
ン
白科.・ 7
4
2
2
4
8 ppm
6
1) EUSA測定値は隈外ろ過処理を加
えた分析 j
去による
機器分析法測定値
図 1
4
EL
ISAキッ トによる 5作物の残留農薬測定値と機器分析法による測定値との相関性
3 機器分析法との比較評価
ウレンソウは妨害が大きい.ネギとブロツコリーは
3 に示す作物と農薬の組み合わせで，機器分
図 1
大きくないが妨害を示しやすいといえる.ニンジン
析法 (
GC， HPLC) と ELISA 法による分析値の相
やダイコンは妨害が少ない.しかし，ホウレンソウ
関性と傾きを調べた.相関係数 rは 0
.
9
9(
p 値 =2
.
6
を除いて今回試験したダイコン，ニンジン ，ネギ，
x1
0- ，傾きは 1
.
11(標準誤差:t0.
01
)，切片は一0.
0
1
ブロッコリーは ELISA による分析値に影響を及ぼ
(標準誤差 :
t0.
02
) を示し ，双方には高い相関関係
さないか，あったとしても極小 さい.先の既知濃度
があり，傾きから EL
ISA 分析の方がやや測定値が
の農薬添加試験の傾向からも， B
1ank試料の吸光度
高く なるものの，両分析法で閉じ値が得られること
が定量限界濃度の標準試薬 L より大きいならば，
が認め られた(図 1
4).
それ以上の濃度の測定では妨害はなく，一般的な使
1
01
)
用における測定には影響しないと考える.そして
考
ELISA キ ッ トは根菜類の一部の農薬を除いて基準
察
値を確認するのに十分高い感度を有している . した
作物が E
L
I
S
A
Iこ及ぼす妨害の確認
がって，測定範囲の低濃度域での誤差に注意する必
作物抽出液由来の妨害が起こることはイチゴ、やハ
要はあるものの，基準値の確認のための使用に問題
ーブ類や大阪しろななどで報告がある(渡辺ら
にはならないと考える .
2005
) (橋本 ・権田 2004) (矢吹ら 2004).同濃度の
そこで， EL
ISA に及ぼす妨害が大きいホウレン
コントロール(作物試料を含まない対照)より吸光
ソウで妨害要因を明らかにしようと試みた .イミダ
度 が小さくなる妨害は， ELISA測定値を実際の作
クロプリド分析に及ぼす妨害は，シュンギクやコマ
物残留濃度より多く誤り，測定対象農薬使用歴のな
ツナとの比較から葉菜類に共通の葉緑素ではなく，
い作物からも残留があるように誤認させる.既知濃
精製操作における挙動から イ ミダクロプリドに極性
度の農薬を添加した 作物 試 験 溶 液 と 対 照 の 比 較 か
などが近い物質であると推定する .また GC分析の
ら，妨害は低濃度域でより多く現れることがわかる.
際には妨害となるネギ類の臭気成分やアブラナ科の
低濃度域のみ吸光度が草離する作物と農薬の組み合
含有窒素成分、ミツバの香気成分などは ELIS
A分
わせもある.
析に大きな妨害は及ぼさないといえる .
分析対象農薬を含まない作物試料 (
Blank 試料)
2 妨害回避手法の検討
から作成した試験溶液と対照(作物試料無 しメタノ
妨害の大きいホウレンソウのイミダクロプリドお
ール 1
0%含有水)および定量限界濃度の農薬添加
よびダイアジノン分析について回避法を検討した .
した対照の比較から，供試したいずれの作物もわず
試験溶液の追加希釈によってリンゴなどの果実類
かな妨害を ELISA に及ぼした . さらに ，作物によ
は ELISA に及ぼす妨害が回避できるといわれてい
って ELISA に及ぼす妨害の程度に傾向がある. ホ
δ
円
広U
埼玉農総研研報 (
7
)5665，2007
・
る(渡辺ら 2005，2
0
0
6
)
. ホウレンソウのイミダク
いにかかわらず限外ろ過処理は妨害回避効果があっ
ロプリド分析の際にも試験溶液(通常は作物の 5
1
た.また，限外ろ過されずに残った物質が ELISA
倍液)の 1
6倍追加希釈によって ELISAにおよぼす
を妨害す石ことから，限外ろ過によって妨害物質が
妨害は小さくなったが，対照の¥0%メタノールと
除去できることも確認できた.イミダクロプリド分
閉じ吸光度で、はなかった.イミダクロプリド測定用
析での結果からメンブレンフィルターでは妨害を回
の ELISAキ ットは 2.
，
. 100ppbがその測定範囲であ
避できなかったので，妨害要因物質は容易にメンブ
るため， 1
6倍の追加希釈(作物試料の 816倍)に
レンフィルターを通過するほと刀、さい. しかし，
よってもホウレンソウの残留基準値 5ppmは測定範
セル生成の原因物質が限外ろ過されたことによるの
囲にある.しかし，今回の試験の際にホウレンソウ
か，妨害要因がミセルではないことを示すのかは明
試験溶液の及ぼす妨害の大きさは常に一定ではなく
らかにできなかった.供試された ELISA キットす
品種や作型によっても異なり，完全に妨害が回避で
べてにおいて妨害回避効果があったことから，ホウ
きていない場合に追加希釈によって妨害による測定
レンソウの ELISA には限外ろ過処理を取り入れた
誤差も拡大されるため，追加希釈は実用的ではない
方が良いといえる.
ミ
と考える.ダイアジノン測定用の ELISAキットは，
3 機器分析法との比較評価
試料の標準的な希釈方法がマニュアルとして添付さ
機器分析法と ELISA法による分析値を比較した.
れていない.作物の 200倍希釈溶液と¥0
00倍希釈
ELISA法でホウレンソウのイミダクロプリドおよ
溶液で試験した結果は， 200倍では妨害が大きく
びダイアジノンを分析する場合は，限外ろ過による
¥
000倍では妨害がなかった .ホウレ ンソウの他に
妨害回避法を加えた.相関性および傾きから ELISA
ニンジン，ネギとブロッコリーについても添加試験
法は，機器分析法と同程度の精度を有していると判
の結果などから希釈が十分に大きければ妨害は回避
断された.
できると考える.妨害を及ぼさない十分な希釈倍率
以上の結果から，野菜のほとんどは従来から示さ
は，妨害を示しやすい作物とそうではない作物によ
れている方法(磨砕均質化試料からメタノールで、農
って異なるが， 600倍
.
.
.
.
.
.
， ¥
000倍 であると推定する .
薬を抽出し，水で適宜希釈後市販 ELISA キットに
抽出溶媒に水を混合しメタノールの含有割合を小
供し測定する)で分析しても機器分析と同程度の分
さくすることで妨害要因物質の抽出を抑制する試み
析結果になる，つまり妨害の程度は微小であると筆
は，ダイアジノン分析には有効で，イミダクロプリ
者は考える. しかし，ホウレンソウではメタノール
ド分析にはその効果はほとんどない.抽出時の活性
で抽出されるホウレンソウ由来の成分が ELISA キ
炭粉末添加処理による妨害要因物質を吸着除去する
ットでの反応を妨害し，吸光度を小さくするので，
試みもまた，ダイアジノン分析には有効で，イミダ
分析値に誤差が生じる.妨害回避法として，限外ろ
クロプリド分析にはその効果はない.このことは，
過を分析法に取り入れることによって，他の野菜と
妨害要因物質が分析対象農薬によって異なることを
同様に機器分析と同じ分析結果になる 。
示唆する.つまり ELISA共通の発色反応に妨害が
働くのではなく，抗原抗体反応の際に妨害がおこる
引用文献
と筆者は推定する.ただし，ホウレンソウは多くの
ELISAに対し妨害を及ぼすので，妨害要因物質は l
種類ではなく多種類が複合していることも考えられ
天野昭子・矢野秀治 (
2
0
0
6
) :フェニトロチオンおよ
る.
びイミダクロプリド測定用 ELISA キットにおけ
作物が ELISA に及ぼす妨害はミセルの影響によ
るキュウリのマトリクス効果について，日本農薬
学会誌 v
o
1
3
1 N
o
.
4，425・4
3
0
.
るもので.
，限外ろ過膜によってそれを除外すること
ができるといわれている(畠山ら 2
0
0
4
).また，限
橋本良子・権回優子 (
2
0
0
4
) :アセタミプリドイムノ
外ろ過による妨害回避効果は，様々な作物で試験さ
アッセイキットのセリ科作物(ハーブP類)ベの適
れ確認されている(天野，矢野 2
0
0
6
) (E.Hatakey
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用 . 第 27回 残 留 農 薬 分 析 研 究 会 講 演 要 旨 集
2
0
0
6
).今回の試験結果で品種や ELISAキ ットの違
7
1
7
5
.
-64ー
小林ら :EL
lSAによる作物残留農薬分析の際の妨害と回避法の検討
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(2006):D
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坂真智子ら (
2005):市販 EL
lSA キ ッ トの作物残留
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分析 における活用 について .第 28 回残留農薬研
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究会講演要旨集 3
1・3
6
.
(
2)2
0
0
.
渡辺栄喜
畠山えり子 (
2004):市販 EL
lSA キットによる玄米
ら(
2005):ネオニコチノ イド 系殺 虫剤 ア
セタミプリド用 EL
lSA キ ッ トの性能評価及び農
，
中の残留農薬分析.岩手県環保研センタ一年報 4
作物 中残留分析への応用. 第 28 回残留農薬研 究
9
0
9
4
.
会講演要旨集
中津裕之 (
2000):残留農薬のイムノアッセイキッ ト
3741
.
・
渡辺栄喜 (
2006):イムノアッセ イ で農作物 中の残留
による分析 .食品中残留農薬検査の迅速化 に関す
農薬を簡易かっ迅速に検出する .
農業および園芸 .
2年度 ，7
3・1
1
7.
る調査研究研究報告書平成 1
1巻 第 9号 ，9
8
1・987.
第8
津村ゆかりら (
J9
9
2):市販分析 キッ トによる食品中
矢吹芳教ら (
2004):酵素免疫測定法による大阪特産
残留農薬の分析及びガスクロマ トグラフ法との 比
農産物 の残留農薬分析 .第 27 回残留農薬研 究会
較検討.食衛誌
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.
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3
3，
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.
5，458466.
講演要旨集
・
7
67
7
.
・
F
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0