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はじめに ノ ン ラ ジ オ ア ク テ ィ ブ な ラ ベ リ ン グ と 検 出 の 方 法 1. はじめに 本章では, DIGラベリングおよび検出にお いて最も一般的に使用されている方法を実 践するために必要な情報すべてがまとめら れています. この情報は, DIGシステムを 使用している当社研究室やお客様の研究室 での長年にわたる数多くの実験操作の中で 集積されたものです. これはまさしく「イ ンサイダーのためのマニュアル」として DIGシステムの多くの重要な部分を引き出 しています. ラベリングおよび検出の基本的なプロト コールに加え, 本章では以下の内容を紹介 しています. ● 2 ● ● ● それぞれのプロトコールに必要なロシュ ・ダイアグノスティックス社の製品および その他の資材全て DIGの最良の結果を得るためのヒント, トラブルシューティングガイドや追加 情報 DIGシステムを用いて得られた代表的 な実験結果 DIGシステムのための大容量スクリー ニング・アプリケーション ノート: 基本的な方法に親しむため, 本章を 読んでください. 基礎的な方法のいずれかに ついて, そのバリエーションの情報が必要で あれば, 本章に紹介されているDIG製品の 取扱説明書の内容が参考になります. DIGシステムを使用する際の追加情報につ いては, ロシュ・ダイアグノスティックス社 のウェブサイトを参照ください （http ://www.roche-applied-science.com/ DIG）. Tip：本章の操作方法の活用についての概 要は, 5 ページの 「DIGアプリケーションマ ニュアルの概要」を参照ください. 本章で解説される方法は次の通りです. トピックの情報 セクション ページ ハイブリダイゼーション用プローブのDIGラベリングに関するテクニック ランダムプライムド法によるDNAプローブのラベリング （高収量の方法） PCR法によるDNAプローブのラベリング トランスクリプションによるRNAプローブのラベリング オリゴヌクレオチドのDIGラベリング 直接検出法によりプローブの収量を概算する 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.6 41 43 51 62 73 75 DIGラベルされたプローブをブロットへハイブリダイズさせるテクニック DNAプローブのサザンブロットへのハイブリダイゼーション RNAプローブのノーザンブロットへのハイブリダイゼーション ブロットから最良の結果を得るために 3 3.1 3.2 3.3 84 84 94 103 ブロット上にハイブリダイズしたプローブを検出するテクニック 化学発光法によるブロット上にハイブリダイズしたプローブの検出 発色法によるブロット上にハイブリダイズしたプローブの検出 4 4.1 4.2 106 106 115 5 122 6 6.1 125 126 メンブレン上のプローブの剥離とリプロービングのテクニック DIGラベルされたプローブの大容量スクリーニング・アプリケーション DIGラベルされたプローブをコロニー/プラークハイブリダイゼーション に使用 40
