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GE Healthcare Dharmacon 遺伝子発現調節 試薬カタログ shRNA 発現レンチウイルスベクター ● cDNA/ORF クローンコレクション ● ※これまでご 愛用いただいておりました Lentiviral RNAi や遺伝子過剰発現などの「Open Biosystems」製品は 「Dharmacon（ダーマコン）」にブランド名を変更するこ ととなりました。今後ともご愛顧のほどよろしくお願い申 し上げます。 取扱店 www.gelifesciences.co.jp shRNA発現レンチウイルスベクター 製品選択ガイド shRNA とは、RNA 干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型の RNA 配列です。shRNA はベクターによって細 胞に導入され、恒常的あるいは誘導的に発現します。通常このベクターは娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングの効果も受 け継がれます。shRNA のヘアピン構造は細胞内で siRNA へと切断され、RNA 誘導サイレンシング複合体（RISC ）と結合します。こ の複合体は siRNA と相補的な配列を持つ mRNA に結合し、切断します。 下表を参考にして研究目的に合った shRNA 発現レンチウイルスベクターをご選択ください。 発 現 レンチ ウ イルスベクター shRNA 生物種 SMARTvector Leniviral shRNA SMARTvector Inducible Leniviral shRNA GIPZ Lentiviral shRNA TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA ヒト・マウス・ラット ヒト・マウス・ラット ヒト・マウス ヒト microRNAベース＊1 shRNAの種類 TRC Lentiviral shRNA ヒト・マウス シンプルヘアピン型 プロモーター 7種類から選択 4種類から選択 ヒトcytomegalovirus プロモーター Tetracycline誘導性 蛍光マーカー TurboGFP/TurboRFP/無し TurboGFP/TurboRFP TurboGFP TurboRFP ー ー ● ー ● ー 高力価ウイルス粒子＊2 高力価ウイルス粒子＊2 大腸菌グリセロールストック＊3 高力価ウイルス粒子＊2 shRNA発現の誘導性 製品フォーマット ＊4 shRNA Starter Kit 掲載ページ P3 P4 プロモーター 大腸菌グリセロールストック＊3 shRNA Starter Kit＊4 P5 ヒトU6プロモーター 大腸菌グリセロールストック＊3 P6 P7 ＊1 microRNA ベースの shRNA は、Drosha/Dicer によるプロセシングを正確に受けるため特異的な遺伝子発現抑制が可能です。また、シンプルヘアピン型の shRNA に比 。 べて細胞毒性が低いことが示唆されています（McBride et al. , Beer et al. ） ＊ 2 高力価 レンチウイルス粒子として提供されます。 ＊3 レンチウイルスベクターを導入した大腸菌の培養液にグリセロールを加えたもので、チューブあるいは96ウェルマイクロタイタープレートで提供されます。 ＊ 4 shRNA 発現レンチウイルスベクターを用いた遺伝子発現抑制実験に必要な試薬をパッケージにしたキットです。 参考文献 1. McBride, J.L et al.（2008）Artificial microRNAs mitigate shRNA mediated toxicity in the brain: Implications for the therapeutic development of RNAi. PNAS 105（15）:5868-5873. 2. Beer, S. et al.（2010）Low-level shRNA cytotoxicity can contribute to MYC induced hepatocellular carcinoma in adult mice. Molecular Therapy 18（1）:161-170. SMARTvector Lentiviral shRNA および SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA のノックダウン機能保証について 同一遺伝子（タンパク質をコードする遺伝子に限る）をターゲットとする3 種類以上の shRNA クローンを用いて実験を行った場合、そのうち1つについて、 mRNAレベルで70% 以上の遺伝子発現抑制を保証します。この機能保証期限は納品後 6ヶ月間となります。 下記条件を満たしたうえで、mRNA の発現抑制が70% に満たない場合には、1 回に限り交換品（1クローン）を提供いたします。機能保証の適用にあたっ ては実験条件、結果等を詳細に確認させていただきますのであらかじめご了承願います。状況により交換品の提供ができない場合は、交換品（1クローン） と同額の製品への交換とさせていただきますのであらかじめご了承ください。なお、この機能保証は、製品コードが V3S*xxxx である製品のみに適用され、 また、long noncoding RNA をターゲットとする製品には適用されません。 機能保証の実験条件 この機能保証では、使用する細胞に最適なプロモーターを搭載したターゲットshRNA クローンとともに non-targeting コントロールおよび GAPD/PPIB ポジティ ブコントロール（いずれもターゲットshRNA クローンと同一のプロモーターおよび蛍光マーカーを搭載しているもの）を用いて同一条件下で同時に実験を行い、 ポジティブコントロールが十分に機能しているコントロール実験のデータが必須となります。 （1）SMARTvector Lentiviral shRNA の場合、使用する細胞に 最適なプロモーターは SMARTchoice promoter selection plate を用いて決定してください。ノックダウン効率は、ウイルス感染から72 時間以降に、non（2）SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA の場合、使用す targeting コントロールを導入した細胞に対して定量 RT-PCR 法を用いて評価してください。 る細胞に最適なプロモーターは SMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-pack を用いて決定してください。また、最適な doxycycline 濃度は SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA Technical Manual にしたがって検討してください。ノックダウン効率は、doxycycline による誘導から72 時間 以降に、non-targeting コントロールを導入した細胞に対して定量 RT-PCR 法を用いて評価してください。 GIPZ shRNA Starter Kit および TRIPZ shRNA Starter Kit のノックダウン機能保証について キット取扱説明書にしたがって Starter kit を使用した場合に適用されます。同一遺伝子をターゲットとする3 種類の shRNA クローンを用いて実験を行った場 合、そのうち1つについて、mRNAレベルで70% 以上の遺伝子発現抑制を保証します。この機能保証期限は納品後 6ヶ月間となります。 下記条件を満たしたうえで、mRNA の発現抑制が70% に満たない場合は1 回に限り交換品（1クローン）を提供いたします。なお、機能保証の適用にあたっ ては、実験条件、結果等を詳細に確認させていただきますのであらかじめご了承願います。状況により交換品の提供ができない場合は、交換品（1クローン） と同額の製品への交換とさせていただきますのであらかじめご了承ください。 機能保証の実験条件 この機能保証では、ターゲットshRNA クローンとともにキットに添付のポジティブコントロールを用いて同一条件下で同時に実験を行い、ポジティブコントロー ルが十分に機能しているコントロール実験のデータが必須となります。ノックダウン効率は、Non-silencing ネガティブコントロールを導入した細胞に対して定 量 RT-PCR 法を用いて評価してください。また、すべてのトランスフェクション実験は、キットに添付のトランスフェクション試薬を用いてください。 2 SMARTvector Lentiviral shRNA ターゲット遺伝子を効率的にノックダウンするようにデザインされた shRNA 配列を含む核酸配列をパッケージしたレンチウイルス粒子 です。本製品は、shRNA 専用のアルゴリズムによりデザインしたターゲット配列を、microRNA パスウェイにおいて効率よくプロセッ シングされる SMARTvector universal scaffold に組み込んでいます。この scaffold は、内在性の microRNA 転写産物を模倣する ようにデザインされており、Drosha/Dicer により正確にプロセッシングされるとともに、shRNA アンチセンス鎖の RISC への優先的 な取り込みを実現するため、より特異的な遺伝子ノックダウンが可能です。また、使用する細胞に最適なプロモーター（shRNA の発 現を駆動）を7 種類から選択可能です。さらに、2 種類の蛍光マーカーにより、導入効率を簡便にチェックできます（蛍光マーカー非 搭載タイプもあります）。本製品を用いることによって、より確実な shRNA の恒常的発現実験が可能です。 ※ 製品の購入に際しては、SMARTchoice Promoter Selection Plate（下図 ）を用いて、使用する細胞に最適なプロモーターを必ず事前に検討・選択してください。 ベクター中の要素 説明 ◦ ヒト・マウス・ラットの遺伝子に対応 5 ' LTR 5' long terminal repeat ◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA Ψ Psi パッケージングシグナル配列 RRE Rev response element（完全長ウイルスゲノム のパッケージング効率を向上） SMARTchoice promoters 7 種類のプロモーターから選択可能 の恒常的な発現を実現 ◦ 使用する細胞に最適なプロモーターを7 種類から選択可能 ◦ TurboGFP あるいは TurboRFP の同時発現によって shRNA の発現を確認可能 ◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を tGFP 遺伝子形質導入と発現の確認マーカー （TurboGFP 遺伝子） tRFP 遺伝子形質導入と発現の確認マーカー （TurboRFP 遺伝子） 薬剤選択可能 ◦ Ready-to-use の高力価レンチウイルス粒子フォーマット＊ SMARTchoice promoters hCMV 耐性遺伝子をコードする転写産物の翻訳を実現） hEF1α SMARTchoice shRNA mEF1α CAG PGK Ψ tGFP RRE or tRFP or IRES PuroR WPRE Puromycin 耐性遺伝子 （遺伝子形質導入細胞の選択マーカー） PuroR UBC 5' LTR Internal ribosome entry site（リボソームが結 合するサイト。TurboGFP/RFP および Puromycin IRES mCMV 発現レンチウイルスベクター shRNA 特長 3' SIN LTR SMARTvector universal scaffold None SMARTvector universal scaffold 内 在 性の microRNA 転 写 産 物を模 倣するよう にデザイン WPRE Woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element（導入遺伝子の発現を促進） 3 ' SIN LTR 3' 末端の自己不活性化（self inactivating ） long terminal repeat SMARTvector Lentiviral shRNA デザイン TU(×105)= 8.0 4.0 2.0 1.0 0.5 0.25 8.0 4.0 2.0 1.0 0.5 0.25 Promoter A Empty B hCMV:humancytomegalovirus C mCMV:mousecytomegalovirus D hEF1α:humanelongationfactor1alpha E mEF1α:mouseelongationfactor1alpha F CAG:chickenβactinhybridpromoter G PGK:mousephosphoglyceratekinase H UBC:humanubiquitinC SMARTchoice Promoter Selection Plate 製品概要 7 種類のプロモーターの制御下で TurboGFP 遺伝子、Puromycin 耐性遺伝子、 Non-targeting shRNA を共発現する SMARTvector Lentiviral shRNA ウイルス 粒子を、力価を変えて96ウェルプレートにアレイ化しています（各ウェル25 µL ） 。 各細胞におけるプロモーター活性を TurboGFP の蛍光強度から簡便に評価する ことができます。 Relative Expression（Normalized to NTC） SerialDilutions ■mCMV 1.4 ■ hCMV 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 MOI20 MOI10 MOI5 GAPDH MOI20 MOI10 MOI5 RHOA-1 マウス CMV プロモーターは、マウス NIH/3T3 細胞において、 ヒト CMV プロモーターより効率的な遺伝子発現抑制を実現 マウ ス NIH/3T3 細 胞を プ レートにまき、 マウ ス GAPDH 遺 伝 子あるいは RHOA-1 遺伝子をターゲットとする SMARTvector Lentiviral shRNA ウイルス 粒子（マウスあるいは、ヒトの CMV プロモーターを搭載）を MOI ＝ 20 、 10 、 5 にて形質導入しました。形質導入から72 時間後に各遺伝子の発現抑制レベ ルを評価しました。 ＊ 高力価（1 × 10 8 ±20 % TU/mL ）および超高力価（5 × 10 9 ±20 % TU/mL ）フォーマットの製品をラインナップしています。 3 SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA ターゲット遺伝子を効率的にノックダウンするようにデザインされた shRNA 配列を含む核酸配列をパッケージしたレンチウイルス粒子 です。本製品は、shRNA 専用のアルゴリズムによりデザインしたターゲット配列を、microRNA パスウェイにおいて効率よくプロセッ シングされる SMARTvector universal scaffold に組み込んでいます。この scaffold は、内在性の microRNA 転写産物を模倣する ようにデザインされており、Drosha/Dicer により正確にプロセッシングされるとともに、shRNA アンチセンス鎖の RISC への優先的 な取り込みを実現するため、より特異的な遺伝子ノックダウンが可能です。また、使用する細胞に最適なプロモーター（Tet-On 3G アクチベータータンパク質の発現を駆動）を4 種類から選択可能です。さらに、2 種類の蛍光マーカーにより、導入効率を簡便にチェッ クできます。最新のテトラサイクリン誘導系である Tet-on 3G システムを採用した本製品を用いることによって、より厳密に制御され た shRNA の誘導的発現実験が可能です。 発 現 レンチ ウ イルスベクター shRNA 製品の購入に際しては、SMARTchoice Inducible Non-targeting Control 4-Pack＊1を用いて、使用する細胞に最適なプロモーターを必ず事前に検討・選択して ください。 ※ 特長 ベクター中の要素 ◦ ヒト・マウス・ラットの遺伝子に対応 5 ' LTR ◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA Ψ の誘導的な発現を実現 Psi パッケージングシグナル配列 Rev response element（完全長ウイルスゲノムの RRE パッケージング効率を向上） ◦ 使用する細胞に最適なプロモーターを4 種類から選択可能 ◦ TurboGFP あるいは TurboRFP の同時発現によって shRNA Tetracycline 応答エレメントを持つ誘導性のプロ モーター（doxycycline の存 在 下で Tet-On 3G ア クチベータータンパク質によって活性化） PTRE3 G の発現を確認可能 ◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を 薬剤選択可能 ◦ Ready-to-use の高力価レンチウイルス粒子フォーマット＊2 mCMV PGK mEF1α hEF1α PTRE3G 5' LTR Ψ PuroR 2a Tet-On 3G tGFP RRE or tRFP SMARTchoice promoters SMARTchoice Inducible shRNA SMARTvector universal scaffold A U2 OS cells, SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA with mCMV 50ng/mLDox 遺伝子形質導入と発現の確認マーカー （TurboGFP 遺伝子） tRFP 遺伝子形質導入と発現の確認マーカー （TurboRFP 遺伝子） SMARTvector universal scaffold 内 在 性の microRNA 転 写 産 物を模 倣するように デザイン SMARTchoice promoters 4 種類のプロモーターから選択可能 Puromycin 耐性遺伝子 （遺伝子形質導入細胞の選択マーカー） 3' SIN LTR SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA デザイン NoDox tGFP PuroR WPRE 説明 5' long terminal repeat 2a 2a self-cleaving peptide（自己切断活性を持つ短い ペプチド。Puromycin 耐性遺伝子産物および Tet-On 3G アクチベータータンパク質の同時発現を実現） Tet-On 3 G Doxycycline によって制御されるアクチベータータ ンパク質（Doxycycline 存在下で PTRE3G に結合） WPRE Woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element（導入遺伝子の発現を促進） 3 ' SIN LTR 3' 末端の自己不活性化（self inactivating ） long terminal repeat B Terminal Cell Density（U2 OS, mCMV promoter ） 500ng/mLDox 900 ■NTC No Dox 800 ■ NTC 50 ng/mL Dox ■ NTC 500 ng/mL Dox NTC UBB CellsperField 700 ■ UBB No Dox 600 ■ UBB 50 ng/mL Dox ■ UBB 500 ng/mL Dox 500 400 300 200 100 0 NTC UBB SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA は、doxycycline 濃度依存的に必須遺伝子のノックダウンを実現 U2OS 細胞に、non-targeting control shRNA（NTC ）あるいは ubiquitin B（UBB ）遺伝子をターゲットとする shRNA を発現する SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA ウイルス粒子（マウスの CMV プロモーターを搭載）を MOI＝0.1にて形質導入しました。形質導入された細胞を1.5 µg/mL puromycin にて3 日間選択後、96ウェ ルプレートにウェルあたり2,000 個の細胞を播きました。 1 日後、doxycycline にて shRNA の発現を5 日間誘導しました。細胞を Hoescht 33342 にて染色し、核（青）お よび TurboGFP（緑）の発現をイメージアナライザーで解析しました（A ）。また、Cell Titer-Glo assay（Promega ）を用いて細胞の数をカウントし、フィールドあたりの細胞 密度を定量しました（18フィールドの平均） （B ）。 ＊1 4 種類の異なるプロモーター （mCMV、PGK、mEF1 α、hEF1 α）を搭載した SMARTvector Inducible Non-targeting Control（ TurboGFP 遺伝子発現タイプ）の各々 をチューブに分注し4 本セットとした製品です。各チューブに含まれるウイルス粒子の最小力価は 1 × 107 TU/mL、容量は25 µLです。 ＊ 2 高力価（1 × 107 ± 20% TU/mL ）フォーマットの製品をラインナップしています。 4 GIPZ Lentiviral shRNA＊1 ヒトおよびマウス全ゲノムを網羅する shRNA コンストラクトを pGIPZレンチウイルスベクターに組み込むことによって構築されました。 GIPZ Lentiviral shRNA を用いることにより、特異的、安定的、効率的な RNAi 実験が可能です。大腸菌グリセロールストックおよ び Ready-to-use の高力価レンチウイルス粒子フォーマット＊2の製品をご用意しています。GIPZ Lentiviral shRNA のお好みのクローン （最大 3 種類）にコントロールベクターなどをセットにした GIPZ shRNA Starter Kit もラインナップしています（下表参照）。 特長 ベクター中の要素 説明 5 ' LTR 5' long terminal repeat Ψ Psi パッケージングシグナル配列 RRE Rev response element（完全長ウイルスゲノムの パッケージング効率を向上） の恒常的な発現を実現 ◦ ヒトの CMV プロモーターを採用 ◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を 薬剤選択可能 tGFP Revised versions hCMV PuroR RRE WPRE Ψ IRES Ψ tGFP shRNA pUC ori 5ʹ LTR 5' LTR AmpR Ψ Ψ Kit 5ʹ LTR 5' LTR Viral Starter pUC ori particle SV40 ori ・GIPZ Lentiviral shRNA クローン（1 ∼ 3 種類）- 高力価レンチウイルス粒子（2 × 25 µL ） 高力価レンチウイルス粒子 （1 × 25 µL ） ・GIPZ GAPDH Lentiviral shRNA Positive AmpR Control pUC-ori SV40 ori ・GIPZ Non-silencing Lentiviral shRNA Control - 高力価レンチウイルス粒子（1 × 25 µL ） U6 hPGK RRE PuroR hPGK shRNA PuroR Ψ Ψ 117 % RSV/5ʹ LTR AmpR 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pLKO.1 RSV/5' LTR 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pLKO.1 pUC ori Amp GIPZ Lentiviral shRNA による効率的な遺伝子ノック R 50 ダウン SV40 ori TP53-3 Ψ 18 % 7% TP53-1 12 % TP53-2 5ʹ LTR 8% PTEN-2 PTEN-1 7% MAPKAPK2-2 MAPK1-3 pUC ori MAPK1-2 BUB1-3 BUB1-2 AmpR WPRE 15 % pSMART 2.0 MAPK1-1 11 % BUB1-1 BRCA1-3 BRCA1-2 9% microRNA 30 % 23 % hCMV shRNA を OVCAR-8 細胞に MOI＝0.4 ∼ 2にて GIPZ Lentiviral R 4 導入しました （導入実験を 回行いました） microRNA 2∼ RRE tGFP IRES Puro WPRE。導入から48 時 25 % 間後に puromycin（30 µg/mL ）で細胞の選択を開始しました。 導入から84 時間後の細胞から抽出した RNA を用いて定量 PCR pSMART 2.0 を3 連で行いました （18S rRNA を内部標準として使用）。 Nonsilencing ネガティブコントロールによるノックダウンとの比較で、 3つの GIPZ Lentiviral shRNA のうち平均 2つが70％以上のノック 3ʹ SIN LTR 5' LTR 32 %PuroR 3' SIN LTR 0 BRCA1-1 IRES 26 % PTEN-3 tGFP 26 % MAPKAPK2-3 RRE 40 % MAPKAPK2-1 36 % hCMV 39 % Ψ Remaining mRNA Expression（%） 5ʹ LTR ・GIPZ Lentiviral shRNA クローン（1 ∼ 3 種類）- 大腸菌グリセロールストック hCMV ・GIPZ GAPDH Lentiviral shRNA Positive Control - 大腸菌グリセロールストック RRE Positive cPPT/CTSControl tGFP- 大腸菌グリセロールス IRES PuroR shRNA WPRE tGFP IRES shRNA WPRE トック ・GIPZ EG5 Lentiviral shRNA Transduction Starter Kit ・GIPZ Non-silencing Lentiviral shRNA Control - 大腸菌グリセロールストック ・Calcium phosphate transfection reagent pSMART 2.0 pSMART 2.0 ・Trans-Lentiviral packaging mix（ 10 回分） 100 25 3ʹ SIN LTR pTRIPZ ・GIPZ Lentiviral shRNA クローン（1 ∼ 3 種類）- 大腸菌グリセロールストック ・GIPZ GAPDH Lentiviral shRNA Positive Control - 大腸菌グリセロールストック 大腸菌グリセロールストック ・GIPZ EG5 Lentiviral shRNA Positive Control -pUC AmpR ori SV40 ori ・GIPZ Non-silencing Lentiviral shRNA Control - 大腸菌グリセロールストック ・TurboFect transfection reagent PuroR shRNA pUC ori rtTA3 IRES PuroR WPRE hCMV U6 RRE UBC tRFP shRNA キッ ト内容 3' SIN LTR 製品名 Transfection Starter Kit SV40 ori Ready-to-use の高力価レン チウイルス粒 子をお求めの AmpR 場合 75 WPRE pUC ori トランスフェクションの困難 RRE な細胞用にレンチウイルス粒 子を自作したい場合 125 PuroR RRE Ψ IRES pTRIPZ 5' LTR Ψ rtTA3 shRNA トランスフェクションの容易 な細胞を用いる場合 AmpR 3' 末端の自己不活性化（self inactivating ） long terminal repeat TRE UBC 目的 Woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory pUC ori element SV40（ ori導入遺伝子の発現を促進） AmpR 3 ' SIN LTR pGIPZ ベクターの構造 tRFP RRE Starter GIPZ shRNA Kit shRNA WPRE SV40 ori TRE PuroR Internal ribosome entry site（リボソームが結合 するサイト。TurboGFP および Puromycin 耐性遺 hCMV 伝子をコードする転写産物の翻訳を実現） tGFP IRES PuroR WPRE Puromycin 耐性遺伝子 （遺伝子形質導入細胞の選択マーカー） shRNA 内在性の microRNA 転写産物を模倣するように pGIPZ デザイン 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pGIPZ 遺伝子形質導入と発現の確認マーカー （TurboGFP 遺伝子） From PowerPoint (R&D) IRES RRE ヒトcytomegalovirus プロモーター （ORF の発現を駆動） hCMV ◦ TurboGFP の同時発現によって shRNA の発現を確認可能 発現レンチウイルスベクター shRNA ◦ ヒト・マウスの遺伝子に対応 ◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA AmpR pUC ori ダウンを実現しました。 SV40 ori Ψ Multi Tag Cloning Site pLOC 3ʹ SIN LTR pLOC 5ʹ LTR Multi Tag Cloning Site 3' SIN LTR 5' LTR Ψ ＊1 第 3 世代のレンチウイルスパッケージングシステムに適合しません。レンチウイルス粒子へのパッケージングには Trans-Lentiviral shRNA Packaging System hCMV hCMV （10ページ）の使用をおすすめします。 7 8 ORF R RRE Control の力価は IRES BlastR WPRE -2aWPRE tGFPnuc1 × ORFクローンの力価は IRES nuc -2a± 20% ∼10tGFP です。 ＊ 2 GIPZ Lentiviral shRNA 108Blast TU/mL、GIPZ Lentiviral shRNA 1 × 10 TU/mL 5 TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA＊ ヒト全ゲノムを網羅する shRNA コンストラクトを pTRIPZレンチウイルスベクターに組み込むことによって構築されました。TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA を用いることにより、誘導的な RNAi 実験が可能です。pTRIPZ ベクターにはテトラサイクリン誘導系で ある Tet-On システムが 採 用されています。 大 腸 菌グリセロールストックの製 品をラインナップしています。TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA のお好みのクローン（最大 3 種類）にコントロールベクターなどをセットにした TRIPZ shRNA Starter Kit もラインナッ プしています（下表参照）。 Revised versions From PowerPoint (R&D) 特長 ベクター中の要素 hCMV PuroR WPRE Ψ shRNA 3' SIN LTR の誘導的な発現を実現 5' LTR pGIPZ ◦ TurboRFP の同時発現によって shRNA の発現を確認可能 ◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を AmpR 薬剤選択可能 pUC ori Ψ IRES ◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA 5ʹ LTR tGFP RRE 5 ' LTR SV40 ori RRE Ψ tGFP UBC rtTA3 IRES PuroR TRE 内在性の microRNA 転写産物を模倣するように デザイン UBC ヒトubiquitin rtTA3 IRES PuroR（rtTA3 WPREおよび PuroC プロモーター mycin 耐性遺伝子の発現を駆動） tRFP UBC 5ʹ LTR Ψ 5' LTR pUC ori SV40 ori shRNA Reverse tetracycline-transactivator 3（ doxycycline pTRIPZ存在下で TRE に結合し、TRE からの TurboRFP および shRNA の発現を活性化） 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR AmpR 遺伝子形質導入と発現の確認マーカー pUC ori SV40 ori （TurboRFP 遺伝子） TRE shRNA pTRIPZ rtTA3 Internal ribosome entry site（リボソームが結合 pUC ori SV40 ori するサイト。rtTA3および Puromycin 耐性遺伝子 をコードする転写産物の翻訳を実現） AmpR IRES pTRIPZ ベクターの構造 tGFP IRES PuroR RRE WPRE shRNA 5' LTR AmpR pUC ori AmpR PuroR Ψ RSV/5' LTR SV40 ori pUC ori PuroR microRNA WPRE 58 % 42 % 21 % WPRE 19 % pUC ori PRKAR2B SV40 ori DDR1 V2THS-92319 V2THS-92317 pLOC V2THS-202770 V2THS-170431 V2THS-170430 V2THS-135377 V2THS-135381 Blast R 14 % PTEN Multi Tag で shRNA の発現を誘導しました。導入から2 週間後の doxycycline（1 µg/mL ） Cloning Site 細胞から抽出した RNA を用いて定量 PCR を3 連で行い（ 18S rRNA を内部標準と pLOC 3ʹ SIN LTR V2THS-135378 Ψ -2a- 14 % 3' SIN LTR R Amp TNFRSF12A tGFPnuc IRES 14 % Multi Tag Cloning Site V2THS-263364 ORF 22 % V2THS-221377 25 4 種類の遺伝子をターゲットとする TRIPZ Inducible Lentiviral shRNAレンチウイ hCMV ルス粒子（遺伝子あたり3 種類）を HEK293T 細胞に MOI ＝ 0.3にて導入し、 48 時 ORF RRE IRES tGFPnuc -2a- BlastR WPRE 間後に puromycin（ 5 µg/mL ）で細胞の選択を開始しました。導入から 5 日後に 37 % 35 % 30 % V2THS-231722 hCMV V2THS-262746 50 pSMART 2.0 R pUC ori SV40 ori を用いた TRIPZ InducibleAmp Lentiviral shRNA 低 MOI での誘導的な遺伝子ノックダウン 65 % NS1 IRES Ψ AmpR 5ʹ LTR pSMART 2.0 75 5' LTR tGFP Ψ RRE 5ʹ LTR Ψ WPRE 100 % NS1 pLKO.1 3ʹ SIN LTR 5' LTR microRNA 3' SIN LTR Remaining mRNA Expression（%） PuroR hPGK ・TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA クローン（1 ∼ 3 種類）- 大腸菌グリセロールストック ・TRIPZ Human GAPDH Inducible Lentiviral shRNA Positive Control - 大腸菌グリセロールストック ・TRIPZ Inducible Lentiviral Non-silencing shRNA pUC ori AmpR Control - 大腸菌グリセロールストック ・Calcium phosphate transfection reagent ・Trans-Lentiviral packaging mix（10 回分） hCMV hCMV IRES SV40 ori 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pLKO.1 トランスフェクションの困難 pUC ori AmpR Packaging Starter Kit な細胞用にレンチウイルス粒 子を自作したい場合 0 pUC ori ・TRIPZ Inducible Lentiviral shRNA クローン（1 ∼ 3 種類）- 大腸菌グリセロールストック R shRNA shRNA Positive ControlPuro ・TRIPZ Human GAPDHRRE Inducible Lentiviral - 大腸菌グリセロールストック ・TRIPZ Inducible Lentiviral Non-silencing shRNA Control - 大腸菌グリセロールストック ・TurboFect transfection reagent Transfection Starter Kit tGFP WPRE キット内容 shRNA RRE shRNA U6 hPGK トランスフェクションの容易 な細胞を用いる場合 PuroR Ψ RRE IRES Woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element（導入遺伝子の発現を促進） 製品名 U6 100 tGFP RSV/5ʹ LTR 目的 cPPT/CTS 3' 末端の自己不活性化（self inactivating ） 3 ' SIN LTRpSMART 2.0 long terminal repeat SV40 ori TRIPZ shRNA Starter Kit 125 WPRE hCMV （遺伝子形質導入細胞の選択マーカー） 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pSMART 2.0 5ʹ LTR Ψ Ψ RRE Puromycin 耐性遺伝子 PuroR hCMV WPRE Tetracycline 誘導性プロモーター AmpR RRE WPRE Puro Psi パッケージングシグナル配列 Rev response shRNA element（完全長ウイルスゲノムの パッケージング効率を向上） pGIPZ tRFP Ψ TRE tRFP IRES RRE shRNA RRE 説明 5' long Rterminal repeat 3ʹ SIN LTR 発 現 レンチ ウ イルスベクター shRNA hCMV ◦ ヒトの遺伝子に対応 して使用）、各ターゲット遺伝子のノックダウンを評価しました。 TRIPZ Inducible Lentiviral Non-silencing shRNA Control（NS1）によるノックダウンと比較した結 果を示しました。ノAmp ックダウン実験は 2 回行いました。 R pUC ori SV40 ori ＊ 第 3 世代のレンチウイルスパッケージングシステムに適合しません。レンチウイルス粒子へのパッケージングには Trans-Lentiviral shRNA Packaging System （10ページ）の使用をおすすめします。 mCMV hEF1α mEF1α CAG SMARTchoice shRNA ARTchoice romoters SMARTchoice promoters hCMV 6 hCMV mCMV hEF1α mEF1α CAG hCMV hCMV WPRE Ψ IRES RRE shRNA 5ʹ LTR 5' LTR WPRE pGIPZ SV40 ori AmpR TRC Lentiviral shRNA pUC ori SV40 ori UBC TRE UBC TRE PuroR 3ʹ SIN LTR pUC ori IRES shRNA 3' SIN LTR pGIPZ AmpR tGFP Ψ tGFP RRE PuroR RRE tRFP コンストラクトを rtTA3 IRES レンチウイルスベクタ PuroR WPRE （TRC ）により、ヒ ー The RNAi RRE Consortium shRNA pLKO.1 IRES トおよびマウス全ゲノムを網羅する Puro tRFP rtTA3 WPRE Ψ R Ψ に組み込むことによって構築されました。大腸菌グリセロールス トックの製品をラインナップしています。 shRNA shRNA AmpR pUC ori ベクター中の要素 AmpR SV40 ori ◦ ヒト・マウスの遺伝子に対応 tGFP RRE IRES PuroR ンチウイルスを強力に転写） hCMV RRE Ψ WPRE shRNA Ψ Ψ 5ʹ LTR 5' LTR ◦ ヒトの U6プロモーターを採用 ◦ ピューロマイシン耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を AmpR 薬剤選択可能 pUC ori SV40 ori pSMART 2.0 ヒトU6プロモーター （RNA polymerase III、shRNA の発現を駆動） U6 AmpR shRNA hPGK shRNA RRE PuroR Ψ Ψ RRE RSV/5ʹ LTR RSV/5' LTR AmpR pUC ori ヒトphosphoglycerate kinase プロモーター （Puromycin 耐性遺伝子の発現を駆動） hPGK Puromycin 耐性遺伝子 PuroR （遺伝子形質導入細胞の選択マーカー） shRNA PuroR SV40 ori 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pLKO.1 pUC ori シンプルヘアピン型の shRNA U6 hPGK U6 Rev response element（完全長ウイルスゲノム のパッケージング効率を向上） 3ʹ SIN LTR RRE 3' SIN LTR pSMART 2.0 tGFPPsi IRES PuroR shRNA WPRE パッケージングシグナル配列 cPPT/CTS 発現レンチウイルスベクター shRNA ◦ in vitro および in vivo における安定期な遺伝子ノックダウン を実現 SV40 ori 説明 pUC ori RSV プ ロ モーター /5' long terminal repeat （パッケージング細胞において Tat 非依存的にレ RSV/5 ' LTR ◦ 初代培養細胞や非分裂細胞を含むさまざまな細胞で shRNA の恒常的な発現を実現hCMV pTRIPZ 5ʹ LTR 5' LTR 特長 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pTRIPZ 3' 末端の自己不活性化（self inactivating ） pLKO.1 long terminal repeat 3 ' SIN LTR pUC ori AmpR pTRIPZ ベクターの構造 hCMV hCMV tGFP microRNA PuroR WPRE RRE tGFP IRES PuroR microRNA WPRE Ψ IRES 100 AmpR pSMART 2.0 5ʹ LTR 125 2.0 ■ 実験 2 SV40 ori pUC ori 3ʹ SIN LTR pSMART ■ 実験 1 3' SIN LTR AmpR pUC ori SV40 ori 75 shJAK2 pUC ori shERBB3 shFGFR1 SV40 ori shFYN shIGF1R AmpR pUC ori SV40 ori HP5 HP4 HP3 HP2 HP1 HP5 HP4 pLOC tGFPnuc -2a- BlastR WPRE HP3 HP2 Multi Tag Cloning Site HP1 HP4 HP3 HP2 HP4 HP3 HP2 HP5 HP1 HP4 HP3 HP2 HP1 HP5 HP4 HP3 HP2 HP1 pLOC IRES 3ʹ SIN LTR AmpR ORF RRE WPRE Blast R HP5 -2a- Ψ tGFPnuc Multi Tag Cloning Site 0 5' LTR hCMV IRES HP1 25 ORF HP5 hCMV 5ʹ LTR 50 3' SIN LTR Remaining mRNA Expression Ψ 5'（ LTR%）Ψ RRE shMST1R TRC Lentiviral shRNA を用いた遺伝子ノックダウン A549 細胞で発現する6つのチロシンキナーゼ遺伝子を、 30 種類の shRNA を用いてノックダウンする実験を2 回行い（実験 1および2）、各遺伝子の発現量を定量 PCR で解析しました。 6つのどの遺伝子についても、少なくとも1 種類の shRNA が mRNAレベルを70％以上低減させました。 Moffat et al.（2006 ）の一部改変データ＊。 mCMV hEF1α mEF1α CAG PGK SMARTchoice promoters SMARTchoice promoters hCMV SMARTchoice shRNA UBC 5' LTR Ψ tGFP RRE or tRFP IRES PuroR WPRE SMARTvector universal scaffold 3' SIN LTR 5ʹ LTR Ψ RRE hCMV mCMV hEF1α mEF1α CAG PGK UBC tGFP or tRFP IRES PuroR WPRE 3ʹ SIN LTR SMARTvector2.0 universal scaffold SMARTchoice shRNA ＊ Moffat, J. et al.（2006）A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high content screen. Cell 124:1283-1298. 7 shRNA発現レンチウイルスベクターライブラリー 最新の研究報告やデータベースに由来する遺伝子情報やオントロジー情報を反映した shRNA 発現レンチウイルスベクターのライブラ リーをラインナップしています。本ライブラリーは、最先端のバイオインフォマティクスツールを利用して編成されています。 下表を参考にして研究目的に合ったヒトおよびマウス遺伝子をターゲットとするshRNA 発現レンチウイルスベクターライブラリー をご選択ください。 ヒトライブラリー製品 GIPZ TRIPZ TRC マウスライブラリー製品 GIPZ TRC 発 現 レンチ ウ イルスベクター shRNA Angiogenesis ー ー ● Angiogenesis ● ● Apotosis ー ー ● Apotosis ● ● Cell Cycle ー ー ● Cancer ー ● Druggable Genome ● ー ー Cell Cycle ● ● Drug Target ● ー ー Druggable Genome ー ● GPCR ● ー ● GPCR ー ● Ion Channel ● ー ー Protease ー ● Phosphatase ● ー ● Protein Kinase ● ● Protease ● ー ー Transcription Factor ● ● Protein Kinase ● ー ● Ubiquitin ● ● Transcription Factor ー ー ● Ubiquitin Ligase ● ● Ubiquitin ー ー ● Whole Genome ● ● Ubiquitin Conjugation Subset 1 ● ー ー Ubiquitin Conjugation Subset 2 ● ー ー Ubiquitin Conjugation Subset 3 ● ー ー Ubiquitin Ligase ー ー ● Whole Genome ● ● ● GPCRs Proteases Ion Channels Ubiquitin Conjugation （Subsets 1, 2, 3） Kinases Phosphatases Drug Targets Drug Target Subcategories 8 Anti-apoptosis Autophagy Enzymes Transcription Regulators Transporters Transmembrane Receptors GPCR Signaling DNA Repair Translation Regulators Druggable genome ライブラリーの内訳 Senescense Nuclear Receptors 創薬ターゲットとなりうる遺伝子を発現抑制する Apoptosis Signaling shRNA を含みます。創薬ターゲット遺伝子カテゴ Cell Cycle リーの内訳を左に示します。 Decode Pooled Lentiviral shRNA Libraries 本ライブラリーは、shRNA を発現する GIPZ Lentiviral shRNAレンチウイルス粒子（5ページ）を遺伝子ファミリーごと、あるいは全ゲ ノムレベルで混合してプールとした製品です。本製品を細胞に感染させてヒト遺伝子を網羅的に発現抑制し、目的の表現型（特定の 選択条件下で生存可能あるいは増殖速度が変化するなどを指標に用いる）を細胞に与える shRNA 配列をスクリーニングします。 illumina シークエンサーにのみ対応した製品です。 特長 ◦ ヒトの遺伝子に対応 ◦ 濃縮した高力価レンチウイルス粒子（≧1 × 108 TU/mL ） ◦ 小規模の遺伝子ファミリーからゲノムワイドな解析が 可能な製品まで充実のラインナップ（右表） ターゲット遺伝子数 プール数 × プールあたりの shRNA数 571 254 709 374 382 478 7 ,494 18 ,205 1 プール × 3 ,830 shRNA 1 プール × 1 ,561 shRNA 1 プール × 4 ,675 shRNA 1 プール × 1 ,884 shRNA 1 プール × 2 ,591 shRNA 1 プール × 2 ,559 shRNA 5 プール × 8 ,490 shRNA 10 プール × 9 ,570 shRNA 発現レンチウイルスベクター shRNA として提供 ライブラリー Ubiquitin Conjugation Phosphatase Protein Kinase Ion Channel GPCR Protease Druggable genome Human genome ※ 表中の数字は、参照データベースの変更等により変更になる場合があります。 Decode Pooled shRNA Screening Library を用いたスクリーニングワークフロー 感染条件の検討 スクリーニングパラメーターの検討 Step 1 アッセイ系の開発および至適化 選択圧 レンチウイルスの感染条件（感染に用いる培地、感染時間、細胞密 度等）やスクリーニングパラメーター（アッセイの時間、選択圧等）を 決定します。 shRNA を発現するレンチウイルスプールの感染 Step 2 一次スクリーニング レンチウイルス感染細胞の選抜 細 胞あたり1 種 類の shRNA 配 列を発 現させるために、レンチウイ ルスを低い MOI で細 胞に感 染させます。レンチウイルスの感 染し た細 胞を、 対 照 用 サンプルと選 択 圧をかける処 理 用 サンプルに 分けます。 処 理 用 サンプルに選 択 圧をかけた後、 対 照 用 サンプ ルおよび 処 理 用 サンプ ルのそれぞれからゲ ノム DNA を 抽 出しま 対照用サンプル 処理用サンプル 選択圧 す。 Illumina-adapted プライマーおよび Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase を用いて、ゲノム中に挿入され た shRNA 配列を PCR 増幅し、アダプター付加した PCR 増幅断片を illumina flow cell に固定化します。結果的に生じるアンプリコンを Illumina シークエンサーによりシークエンシングします。 表現型選抜 Log Experimental/Reference Log Experimental/Reference Log Experimental/Reference ゲノム DNA の調製および shRNA 配列のシーケンシング 増加した shRNA 配列 Step 3 減少した shRNA 配列 ヒットの同定 スクリーニング中に増減した shRNA 配列をヒットと見なし、それらヒッ トshRNA がターゲットとする遺伝子を同定します。 Log mean counts Log mean counts Log mean counts 参考文献 1. Gazin, C. et al.（2007）An elaborate pathway required for Ras mediated epigenetic silencing. Nature 449: 1073-1077. 2. Gobeil, S. et al.（2008）A genomewide shRNA screen identifies GAS1 as a novel melanoma metastasis suppressor gene. Genes and Development 22: 2932-2940. 3. Hurov, K.E. et al.（2010）A genetic screen identifies the triple T complex required for DNA damage signaling and ATM and ATR stability. Genes and Development 24: 1939-1950. 4. Schalbach, M.R. et al.（2008）Cancer proliferation gene discovery through functional genomics. Science 319: 620-624. 5. Silva, J.M. et al.（2008）Profiling essential genes in human mammary cells by multiplex RNAi screening. Science 319: 617-620. 6. Westbrook, T.F. et al.（2005）A genetic screen for candidate tumor suppressors identifies REST. Cell 121: 837-848. 9 Trans-Lentiviral shRNA Packaging Kit shRNA 発現レンチウイルスベクター用の安全・高効率パッケージングシステムです。Packaging mix とレンチウイルスベクターを HEK293T パッケージング細胞にコトランスフェクションすることによってパッケージングを行います。 Packaging Cell 特長 ◦ 多用途性：第 2または第 3 世代のレンチウイルスベクターの Viral Proteins Packaging Mix 効率的なパッケージングが可能です。 ◦ 卓越したバイオセーフティー：ウイルスゲノムのパッケージン 発 現 レンチ ウ イルスベクター shRNA グに必要なタンパク質をコードしている遺伝子を5つのプラス ウイルスの組み立て および出芽 RNA Transfection ミドに分け、自己複製能を持つ組み換えウイルスの生じるリ スクを低減しています。 ◦ 幅広い細胞指向性：非分 裂 細 胞 を 含 む 哺 乳 動 物 細 胞に in vitro および in vivo において効率的に形質導入するレン チウイルス粒子を作成します。 Transcription shRNAを含む レンチウイル スベクター ウイルス上清の 回収 6 力価 1∼5 × 10 TU/mL 自己複製能の ないウイルス ◦ 高力価：1 ∼ 5 × 10 6 TU/mL の力価が得られます。 Transduce Cells キット内容 Trans-Lentiviral shRNA packaging Kit による ウイルスパッケージング ◦ Trans-Lentiviral Packaging Mix ◦ HEK293T Packaging Cell ◦ CaCI 2 Reagent ◦ 2X HBSS reagent ◦ pGIPZ Non-silencing Control Vector DNA TurboFect Transfection Reagent TurboFect Transfection Reagent は、高効率・簡便・非免疫原性のトランスフェクション試薬です。本試薬は、カチオン性のポリマー を水に溶解した滅菌済みの製品です。このポリマーは、DNA とともにコンパクトで安定的・正に帯電した複合体を形成します。これ らの複合体は、DNA を分解から保護し、真核細胞への遺伝子導入を促進します。 特長 TurboFect Transfection Reagent を用いて DNA 導入に成功した細胞 ◦ さまざまな細胞へのトランスフェクションに最適 ◦ 血清の共在・非共在にかかわらずトランスフェクション可能 不死化した細胞株 B50, BHK21, Calu1, CHO, COLO, COS-7, HEK293, HeLa, HeLa S3, Hep2C, HepG2, Jurkat, L929, RAW264, MDCK, NIH/3T3, Sp2/Ag14, WEHI 初代培養細胞 ヒト肺線維芽細胞、ラット線維芽細胞、マウス骨 髄由来樹状細胞、マウス骨髄由来マクロファージ ◦ リピッドベースあるいはほかのポリマーベースのトランスフェク ション試薬と比較してより高いトランスフェクション効率と低 毒性を実現 ◦ 簡便なトランスフェクションプロトコール ■Transfection efficiency 1,250 1,000 50 750 500 25 250 UT TurboFect 競合A社 製品 競合B社 製品 0 1,500 1,250 40 1,000 30 750 20 500 10 0 250 UT TurboFect 競合A社 製品 競合B社 製品 0 GFP Positive Cells（%） 1,500 GFP Positive Cells（%） 1,750 75 0 50 2,000 Mean Fluorescence Intensity GFP Positive Cells（%） 100 HepG2 Cells ■ Mean fluorescence intensity 60 1,500 50 1,250 40 1,000 30 750 20 500 10 250 0 UT TurboFect 競合A社 製品 競合B社 製品 Mean Fluorescence Intensity WEHI Cells Mean Fluorescence Intensity HeLa Cells 0 TurboFect Transfection Reagent は、幅広い細胞株において、高いトランスフェクション効率およびプラスミドからの遺伝子発現を実現 3 種類の細胞に、上図に記載のトランスフェクション試薬を用いて、enhanced GFP（eGFP ）をコードするプラスミド DNA をトランスフェクションしました（UT: トランスフェ クションしないコントロール）。トランスフェクションは、各試薬の推奨プロトコールにしたがって行い、フローサイトメーターを用いて GFP の発現を解析しました。 10 cDNA/ORF クローンコレクション製品選択ガイド cDNAおよび ORFクローンの構造について cDNA および ORF クローンを用いることにより、RNA 転写産 物の構 造に関する最も確かな情 報が得られます。cDNA ク ローンは、タンパク質コード領 域（Open reading frame、 ORF ）や非翻訳領域（Untranslated region、UTR ）内の制 御配列などの実際の RNA 配列を正確に反映します。 弊社では、完全長 cDNA および ORF クローンを幅広くライン ORF 5' UTR 3' UTR 完全長 cDNA クローンの構造 attクローンは、全長 ORF のほかに、5' 末端と3' 末端に attUTR の一部 完全長 cDNA または全部を含みます。 5' UTR att ナップしています。ヒト・マウス・ラット・ウシの全ゲノムをほ ORF ORF 3' UTR att ORF 完全長 ORF クローンの構造 ぼ網羅する cDNA クローン、ご希望の発現ベクターに ORF を 完全長 ORF クローンは、完全長 cDNA クローンから UTR を取り除いた ORF で 容易に移し変えることのできる Gateway 対応の ORF クロー す。弊社の提供する ORF クローンは、Gateway 対応のデスティネーションベク ン、すぐに遺伝子過剰発現実験に使用できるレンチウイルス ターに ORF を容易に移し変えることのできるように、UTR が組み換え用クロー ニングサイト（att サイト）に置き換わっています。 ベースの ORF 発現ベクターなどがあります。 下表を参考にして研究目的に合った cDNA/ORF クローンをご選択ください。 cDNA 生物種 全塩基配列確認済＊1 Expression-ready （すぐに遺伝子発現実験に使用可能） Expression-to-transfer 蛍光マーカー Mammalian Gene Collection （MGC ） CCSB Human ORFeome Human ORFeome V8 .1 ORFeome Collaboration CCSB-Broad Lentiviral Expression ORF Library Precision LentiORF ヒト・マウス・ ラット・ウシ ヒト ヒト ヒト・マウス ヒト ヒト ー ● ● ● ● 一部の製品 ー ー ー ● ● ー ● ● ● ー ー ー ー ー ー ー TurboGFP ● ＊2 クローンコレクション cDNA/ORF （Gateway対応のエントリークローン） ORF 大腸菌グリセロール ストック＊3 製品フォーマット 大腸菌グリセロール 大腸菌グリセロール 大腸菌グリセロール 大腸菌グリセロール 大腸菌グリセロール ストック＊3 ストック＊3 ストック＊3 ストック＊3 ストック＊3 高力価 ウイルス粒子＊4 Precision LentiORF Starter Kit＊5 掲載ページ ＊1 ＊2 ＊3 ＊4 ＊5 P12 P12 P12 P12 P13 P13 公的研究機関で検証したものです。弊社では塩基配列を確認していません。 一部のヒトの MGC cDNA クローン（製品コード：MHS6278）については弊社で塩基配列を確認しています。 プラスミドベクターを導入した大腸菌の培養液にグリセロールを加えたもので、チューブあるいは96ウェルマイクロタイタープレートで提供されます。 高力価 レンチウイルス粒子として提供されます。 遺伝子過剰発現実験に必要な試薬をパッケージにしたキットです。 cDNA/ORF クローン製品（旧 Open Biosystems 製品）のご使用に際して cDNA/ORF クローン製品は、研究機関から供給を受けたクローンを提供している関係上、公開されている製品情報とは異なるクローンが含まれるなどの不 具合がみられる可能性があります。これらの製品については、クローンの妥当性をシークエンシングにより使用前に確認いただくようお願いいたします。不 具合が考えられた製品については、シークエンシングデータ（少なくとも3つの独立したコロニーから得たもの）を提供いただいたうえで、弊社にて不具合が 確認できた場合、可能な限り正しい配列をもつ同等クローンを交換品として提供いたします。この交換品の提供期限は納品後 6ヶ月間となります。状況に より同等クローンの提供ができない場合は、同額の製品への交換または契約金額の返金とさせていただきますのであらかじめご了承ください。 11 Mammalian Gene Collection（MGC ） 米国国立衛生研究所をはじめとする多くの研究機関の共同 プロジェクトにより作成された、ヒト・マウス・ラット・ウシの 完全長 cDNA クローンコレクションです １）、2 ）、3 ）。大腸菌グリ セロールストックフォーマットの製品をラインナップしています。 特長 ◦ ヒト・マウス・ラット・ウシの全ゲノムをほぼ網羅 MGCの cDNA クローン数 MGCの Non-redundant 遺伝子数 ヒト マウス ラット ウシ 29 ,818 27 ,285 6 ,763 9 ,104 17 ,592 17 ,701 6 ,486 8 ,724 ※ 表中の数字は、参照データベースの変更等により変更になる場合があります。 ◦ 各クローンの cDNA 塩基配列を確認済み＊1、2 ◦ 一部のクローンは、すぐに遺伝子発現実験に使用可能 エントリークローン att CCSB Human ORFeome Collection 本クローンコレクションは、Dana - Farber Cancer Institute の Center for Cancer System Biology（CCSB ）において作 成されました。これらのクローンは、MGC の完全長 cDNA を 鋳型とした PCR により得られた ORF を、Gateway 対応のエ ントリーベクターにクローニングすることによって作成されまし た4 ）。Fidelity の高い DNA Polymerase を用い、少ないサイ クル数（25サイクル）で各 ORF を増幅しているため、PCR に起 因する塩基配列の変異の発生が最小限に抑えられています。 大腸菌グリセロールストックフォーマットの製品をラインナップ しています。 特長 ◦ ヒトの全ゲノムをほぼ網羅 att ORF att att ccdB デスティネーションクローン att att ORF 発現クローン タンパク質精製 タンパク質の 細胞内局在性解析 遺伝子過剰発現 Gateway システムによる、発現ベクターへの ORF 配列の移動 Gateway システムによって、Gateway 対応のエントリークローンから、さまざ ◦ Gateway 対応のエントリークローン まな種類のデスティネーションクローンに容易に ORF を移し変えることができま ◦ ORF の終止コドンが除かれているため、 C 末端へのタグ す。そのため、発現クローンの構築に要する手間と時間を低減することができ、 ク ローンコレクション cDNA/ORF 等の付加が可能 さまざまな実験系の構築が容易になります。 Human ORFeome V8.1 本クローンコレクションは、Dana - Farber Cancer Institute の Center for Cancer System Biology（CCSB ）において作成された、 最新バージョンの Human ORFeome Collection です。以前のバージョンのコレクションより各クローンの ORF 塩基配列の確度が向上 しています。大腸菌グリセロールストックフォーマットの製品をラインナップしています。 特長 ◦ ヒトの全ゲノムをほぼ網羅 ◦ 各クローンの ORF 塩基配列を確認済み＊１ ◦ Gateway 対応のエントリークローン ◦ ORF の終止コドンが除かれているため、 C 末端へのタグ等の付加が可能 ORFeome Collaboration Collection ヒト・マウスの塩基配列確認済み ORF を Gateway 対応のエントリーベクターに挿入したクローンコレクションです。Dana - Farber Cancer Institute の Center for Cancer System Biology（CCSB ）をはじめとする世界中のゲノム研究組織の共同プロジェクトにより コレクションが整備されました。大腸菌グリセロールストックフォーマットの製品をラインナップしています。 特長 ◦ ヒトの全ゲノムをほぼ網羅 ◦ 各クローンの ORF 塩基配列を確認済み＊１ ◦ Gateway 対応のエントリークローン ◦ ORF の終止コドンのあるクローンと除かれているクローンの両方をラインナップ 1 ） MGC Program Team（2002）Generation and initial analysis of more than 15,000 Full-length Human and Mouse cDNA Sequences. PNAS 99（26） : 16899-16903. . Genome 2 ） MGC Project Team（2004）The status, quality, and expansion of the NIH Full-length cDNA Project: The Mammalian Gene Collection（MGC ） Res. 14: 2121-2127. . Genome Res. 19: 2324-2333. 3 ） MGC Project Team（2009）The completion of the Mammalian Gene Collection（MGC ） 4 ） Lamesch, P. et al.（2007）hORFeome v3.1: A resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics 89:307-315. ＊1 公的研究機関で検証したものです。弊社では塩基配列を確認していません。 ＊2 一部のヒトの MGC cDNA クローン （製品コード：MHS6278）については弊社で塩基配列を確認しています。 12 Revised versions From PowerPoint (R&D) hCMV hCMV tGFP RRE IRES PuroR RRE WPRE tGFP IRES PuroR WPRE Ψ Ψ CCSB-Broad Lentiviral Expression Library ＊1 pGIPZ shRNA 5ʹ LTR 5' LTR 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR shRNA pGIPZ 本製品は、Dana - Farber Cancer Institute および Broad Institute において作成されました。各クローンは、Gateway システムに ー pLX304-Blast-V5 に移し変えることにより作成されま より、Human ORFeome V8.1 AmpR pUC ori の ORF SV40 をレンチウイルスベースの発現ベクタ ori AmpR pUC ori SV40 ori した。レンチウイルスベースの発現ベクターを採用しているため、さまざまな細胞において遺伝子発現実験に使用可能です。大腸菌 グリセロールストックフォーマットの製品をラインナップしています。 RRE UBC tRFP rtTA3 ベクター中の要素 IRES PuroR WPRE Ψ ◦ ヒトの全ゲノムをほぼ網羅 Ψ RRE 5' LTR 説明 tRFP 3' SIN LTR 5' LTR pTRIPZ ◦ ヒトの CMV プロモーターを採用 ◦ V5タグとの融合タンパク質として ORF を発現 pTRIPZ RRE パッケージング効率を向上） PGK Amp pUC ori SV40 ori ◦ Blasticidin 耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を薬剤 R AmpR hCMV Blasticidin 耐性遺伝子 （遺伝子形質導入細胞の選択マーカー） tGFP RRE WPRE ORF V5 stop hCMV ORF RRE V5 ヒトcytomegalovirusプロモーター（ORF の発現を駆動） hCMV Open reading frame（タンパク質コード領域） tGFP IRES PuroR shRNA WPRE V5エピトープタグ IRES PuroR WPRE shRNA 5' LTR 5' LTR AmpR pUC ori AmpR WPRE F1 ori pUC ori 3' SIN LTR SV40 ori AmpR pLX304-Blast-V5 ベクターの構造 Precision LentiORF Collection ＊1 hPGK U6 shRNA RRE PuroR pUC ori SV40 ori U6 hPGK shRNA PuroR Ψ RRE Woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element（導入遺伝子の発現を促進） pSMART 2.0 3' 末端の自己不活性化（self inactivating ） long terminal repeat 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR 3' SIN LTR pLX304-Blast-V5 pSMART 2.0 cPPT/CTS Ψ R BsdhCMV 5ʹ LTR PGK RRE ヒトの phosphoglycerate kinase（PGK ）遺伝子プロ モータ ー（ori BsdR の発現を駆動） pUC SV40 ori Bsd R 選択可能 3ʹ SIN LTR rtTA3 IRES PuroR WPRE 5' long terminal repeat パッケージングシグナル配列 Psi shRNA Rev response element（完全長ウイルスゲノムの Ψ shRNA ◦ 各クローンの ORF 塩基配列を確認済み＊2 Ψ Ψ UBC TRE TRE 5ʹ LTR 特長 Ψ RSV/5ʹ LTR RSV/5' LTR 3' SIN LTR 3ʹ SIN LTR 本クローンコレクションは、ORFeome Collaboration Collection の ORF をレンチウイルスベースの発現ベクター pLOC に挿入すること pLKO.1 により作成されました。レンチウイルスベースの発現ベクターを採用しているため、さまざまな細胞において遺伝子発現実験に使用 pLKO.1 可能です。大腸菌グリセロールストックおよび Ready-to-use の高力価レンチウイルス粒子フォーマット＊3の製品をラインナップしてい トロールベクタ ーなどをセットにした Precision ます。Precision pUC oriLentiORF Collection のお好みの ORF クローン（最大 2 種類）にコン AmpR pUC ori AmpR LentiORF Starter Kit もラインナップしています（下表参照）。 ベクター中の要素 hCMV tGFP IRES microRNA PuroR WPRE Ψ RRE ◦ヒトの全ゲノムをほぼ網羅 Ψ ◦各クローンの ORF 塩基配列を確認済み＊2 5ʹ LTR 5' LTR ◦カスタムタグとの融合タンパク質として ORF を発現可能 SV40 の発現を確認可能 ori AmpR pUC ori ◦ TurboGFP の同時発現によって ORF IRES ◦ Blasticidin 耐性遺伝子を持つため、安定発現細胞を薬剤 tGFPnuc -2a- Blast R WPRE Ψ IRES Multi Tag Cloning Site 5' LTR pUC ori BlastR WPRE SV40 ori 3' SIN LTR pLOC ベクターの構造 R WPRE ORF IRES tGFPpeptide nuc -2a- Blast 2a self-cleaving （自己切断活性を持つ短いペプチド。 TurboGFP およ Multi Tag Cloning Site 耐性タンパク質の同時発現を実現） び Blasticidin Blasticidin pLOC 耐性遺伝子 RRE 2a （遺伝子形質導入細胞の選択マーカー） AmpR 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pLOC 5ʹ LTR ORF Internal ribosome entry site（リボソームが結合する pUC ori SV40 ori サイト。TurboGFP および Blasticidin 耐 性 遺 伝 子を 遺伝子形質導入と発現の確認マーカー hCMV （核移行シグナルを付加した TurboGFP 遺伝子） tGFPnuc hCMV Ψ AmpR タンパク質精製用または発現確認用タグ配列の追加 に便利なクローニングサイト コードする転写産物の翻訳を実現する） 選択可能 AmpR hCMV ORF pSMART 2.0 Multi Tag Cloning Site hCMV 5' long terminal repeat tGFP IRES PuroR microRNA WPRE Psi パッケージングシグナル配列 ヒトcytomegalovirusプロモーター（ORF の発現を駆動） Open reading frame（タンパク質コード領域） 3ʹ SIN LTR 3' SIN LTR pSMART 2.0 ◦ヒトの CMV プロモーターを採用 説明 5' LTR RRE Ψ クローンコレクション cDNA/ORF 特長 Woodchuck hepatitis posttranscriptional （導入遺伝子の発現を促進） regulatory pUC ori element SV40 ori 3' 末端の自己不活性化（self inactivating ） long terminal repeat Precision LentiORF Starter Kit hCMV mCMV hEF1α トランスフェクションの容易な mEF1α 細胞を用いる場合 CAG PGK 製品名 UBC トランスフェクションの困難な 細胞用にレンチウイルス粒子を Transduction Starter Kit PuroR IRES tGFP Ψ RRE 5' LTR 自作したい場合 or tRFP Ready-to-useの高力価レンチ ウイルス粒子をお求めの場合 キット内容 hCMV トック ・Precision LentiORF クローン（1 ∼ 2 種類）- 大腸菌グリセロールス mCMV hEF1α トック ・Precision LentiORF RFP Positive Control - 大腸菌グリセロールス Transfection StartershRNA Kit SMARTchoice mEF1α ・TurboFect transfection reagent SMARTchoice promoters SMARTchoice promoters 目的 SMARTvector universal scaffold ・Precision Viral particle Starter Kit CAG PGK トック ・Precision LentiORF クローン（1 ∼ 2 種類）- 大腸菌グリセロールス UBC トック ・Precision LentiORF RFP Positive Control - 大腸菌グリセロールス ・Calcium transfection reagent WPRE 3' SIN phosphate LTR 5ʹ LTR tGFP IRES PuroR Ψ RRE ・Trans-Lentiviral packaging mix（10 回分） or WPRE 3ʹ SIN LTR tRFP （2 × 25 µL ）universal scaffold LentiORF クローン（1 ∼ 2 種類）- 高力価レンチウイルス粒子 SMARTvector2.0 ・Precision LentiORF RFP Positive Control - 高力価レンチウイルス粒子（1 × 25 µL ） SMARTchoice shRNA ＊1 第 3 世代のレンチウイルスパッケージングシステムに適合しません。レンチウイルス粒子へのパッケージングには Trans-Lentiviral ORF Packaging System （14ページ）の使用をおすすめします。 ＊ 2 公的研究機関で検証したものです。弊社では塩基配列を確認していません。 （≧ 1 × 108 TU/mL ）フォーマットの製品をラインナップしています。 ＊3 高力価 13 cDNA/ORF クローンライブラリー 最新の研究報告やデータベースに由来する遺伝子情報やオントロジー情報を反映した cDNA/ORF クローンのライブラリーをラインナッ プしています。本ライブラリーは、最先端のバイオインフォマティクスツールを利用して編成されています。 下表を参考にして研究目的に合ったヒト cDNA/ORFクローンライブラリーをご選択ください。 製品 Fully-sequenced MGC cDNA Apoptosis Cell Cycle（Regulation ） Cytokine（Receptor ） Deubiquitinating Enzyme DNA Damage Response Druggable Genome Drug Target Epigenetics GPCR Growth factor Insulin Receptor Signaling Ion Channel Kinase Membrane Trafficking Nuclear Receptor Oxygen Binding Peptidase Phosphatase Plasma Membrane Protease Protein Kinase Serine Protease Transcription Factor Transporter Tyrosine Kinase Ubiquitin（Conjugation ） Whole genome Expression Ready MGC cDNA＊ CCSB Human ORFeome Collection ORFeome Collaboration Collection Human ORFeome V8 .1 CCSB-Broad Lentiviral Library Precision LentiORF ー ー ー ● ー ● ● ー ● ● ● ー ● ● ● ● ● ● ー ● ● ー ー ー ● ー ● ● ー ー ー ● ー ● ● ー ー ー ● ー ● ● ー ー ー ● ー ● ● ー ー ー ● ー ● ● ● ● ● ● ー ● ● ● ● ● ー ー ー ー ● ー ー ー ー ー ー ● ● ● ● ー ● ● ● ● ● ー ー ー ー ー ー ー ● ー ● ● ● ● ● ● ー ● ● ー ー ● ー ー ー ー ● ● ● ー ー ー ー ● ● ● ● ー ● ● ● ● ● ー ー ー ー ー ー ー ● ー ● ● ● ● ● ● ー ● ● ー ー ー ● ー ● ● ● ● ● ● ー ● ● ● ● ● ー ー ー ー ー ー ー ● ー ● ● ● ● ● ● ー ● ● ● ー ● ● ● ● ● ク ローンコレクション cDNA/ORF ＊ 哺乳動物用発現ベクターに cDNA が挿入されています。 Trans-Lentiviral ORF Packaging Kit ORF 発現レンチウイルスベクター用の安全・高効率パッケージ ングシステムです。 Packaging mix とレンチウイルスベクター を HEK293T パッケージング細胞にコトランスフェクションする Packaging mix ORF を含む レンチウイルスベクター ことによってパッケージングを行います。 特長 ◦ 多用途性：第 2または第 3 世代のレンチウイルスベクター の効率的なパッケージングが可能です。 ◦ 卓越したバイオセーフティー：ウイルスゲノムのパッケージ ングに必要なタンパク質をコードしている遺伝子を5つの プラスミドに分け、自己複製能を持つ組み換えウイルス の生じるリスクを低減しています。 ◦ 幅広い細胞指向性：非分裂細胞を含む哺乳動物細胞に Packaging mix および ORF を含む レンチウイルスベクターを HEK293T パッケージング細胞に導入 in vitro およびin vivo において効率的に形質導入するレ ンチウイルス粒子を作成します。 ◦ 高力価： 1 ∼ 5 × 10 6 TU/mL の力価が得られます。 キット内容 自己複製能のないウイルス ◦ Trans-Lentiviral Packaging Mix ◦ HEK293T Packaging Cell ◦ CaCI 2 Reagent ◦ 2X HBSS reagent ◦ Precision LentiORF RFP control DNA Trans-Lentiviral ORF packaging Kit による ウイルスパッケージング 14 製品検索方法のご案内 弊社 Dharmacon 専用 Web サイト dharmacon.gelifesciences.com へアクセスしてください。 Step 1 ターゲット遺伝子情報を入力してください。 ターゲット遺伝子の Genbank accession number、 gene symbol、gene ID のいずれかを、Web サイト の上部にある検索窓（赤枠）に入力して検索ボタンを クリックしてください。 ➡ Step 2 製品群ごとに検索結果をまとめてお知らせ します。 画面は「BRCA1」と入力して検索した結果が表示さ れた状態です。製品ならびに関連する学術情報が 「遺伝子」のフィールドに表示されます。cDNA/ORF あるいは shRNA のリンク（赤枠）から各製品リストの ページに移動してください。 ➡ Step 3 関心のある製品についてさらに詳細な製品 リストが表示されます。 画面は Step2で shRNA のリンクをクリックした結果 が表示された状態です。各種デザイン済み shRNA 発現ベクターの＋ （赤枠）をクリックすると、さらに詳 細な製品リストが表示されます。 Dharmacon日本語 Webサイトはこちら www.gelifesciences.co.jp/dharmacon 15 ■製品技術情報に関して FAQ（製品 Q&A） 弊社 Web サイト ▲ サポート ▲ FAQ（製品 FAQ または、 Q&A） 検索 製品マニュアル 弊社 Web サイト ▲ サポート ▲ 製品マニュアル バイオダイレクトライン （営業日の 9:00 ∼ 17:30） 応答メッセージが聞こえましたら、下記の番号を押してください。 クロマトグラフィー関連製品 ： 1 ：3 ビアコア関連製品 ：2 ワットマン製品、その他製品 ： 4 電気泳動関連製品 （常時受付） （常時受付） 基礎学習などに 研究者向けコミュニティ Life Sciences Academy ▲▲ lifesciences-ac.com ■機器アフターサービス ■納期／在庫お問合せ 注）お問合せに際してお客さまよりいただいた情報は、お客さまへの回答、弊社サービスの向上、弊社からのご連絡のために利用させて いただく場合があります。 注）アナログ回線等で番号選択ができない場合はそのままお待ちください。オペレーターにつながります。 掲載されている価格は 2015 年 7 月現在の希望小売価格です（消費税は含まれておりません）。希望小売価格は単なる参考価格であり、弊社販売代理店が自主的に設定する販売価格を何ら拘束するもの ではありません。掲載されている製品は試験研究用以外には使用しないでください。掲載されている内容は予告なく変更される場合がありますのであらかじめご了承ください。掲載されている社名や製 品名は、 各社の商標または登録商標です。お問合せに際してお客さまよりいただいた情報は、お客さまへの回答、弊社サービスの向上、弊社からのご連絡のために利用させていただく場合があります。 Life Sciences Academy はゼネラル・エレクトリック・カンパニイまたはその関連会社の商標です。 販売元・問合せ窓口 製造元 フナコシ株式会社 受託・特注品業務担当 TEL：03-5684-1645 Fax：03-5684-6539 E-mail：[email protected] 8 71-3770-02
