Download Differentielle Gentranskription bei Hypobiose induzierten und nicht

Material und Methoden
69
dem die Testansätze drei weitere der unten aufgeführten PCR-Zyklen durchlaufen hatten,
wurden wiederum 15 μl abgenommen und dieses Vorgehen noch zweimal wiederholt. Von
den 15 μl-Aliquots der 15, 18, 21 und 24 durchlaufenen Zyklen wurden jeweils 5 μl auf ein
Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.
15 bzw. 3x
3.7.4
initiale Denaturierung
95 °C, 1 Minute
Denaturierung
95 °C, 15 Sekunden
Primerannealing
65 °C, 30 Sekunden
Primerextension
68 °C, 6 Minuten
Primerdesign
Um die gewünschte Amplifikation zu erzielen, sollten die Oligonukleotide, welche der Polymerase als Primer dienen, bestimmten Anforderungen genügen. Die Primerlänge beträgt im
Regelfall 18 bis 24 Nukleotide bei einem Guanosin (G)/Cytosin (C)-Gehalt von 40 % bis
60 %. Am 3´-Ende der Primer sollten ein oder zwei G bzw. C platziert sein, um eine bessere
Bindung zu gewährleisten. Befinden sich dort jedoch mehr als drei G oder C, werden fehlhybridisierende Primer stabilisiert. Um diese Fehlhybridisierungen zu vermeiden, sollten Primer auch nicht mehr als vier gleiche Basen hintereinander enthalten. Ferner ist darauf zu achten, dass Vorwärts- und Rückwärtsprimer keine komplementären Sequenzen, insbesondere
am 3´-Ende, aufweisen, da sonst Primerdimere entstehen. Auch sollte ein Primer nicht selbstkomplementär sein und somit interne Sekundärstrukturen ausbilden. Im Idealfall weisen Vorwärts- und Rückwärtsprimer den gleichen Schmelzpunkt auf, welcher nach folgender Formel
errechnet werden kann:
TM = N x [GC] x 4 + N x [AT] x 2
Abb. 6:
Formel zur Errechnung der Schmelztemperatur (TM) von Oligonukleotiden (N = Anzahl der Basenpaare) (THEIN u. WALLACE 1986)