1
Download Mercodia Insulin ELISA
Transcript
Mercodia Insulin ELISA Directions for Use Mode d’emploi Instruzioni per l’uso Bruksanvisning Gebrauchsinformation Instrucciones para el uso Brugsanvisning 10-1113-01 Reagents for 96 determinations 10-1113-10 Reagents for 10 x 96 determinations Manufactured by/Hersteller/Fabriqué par/ Fabricado por/Prodotto da/Fremstillet af/ Tillverkad av Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A, SE-754 50 Uppsala, Sweden, Schweden, Suède, Suecia, Svezia, Sverige EXPLANATION OF SYMBOLS USED ON LABELS/ERKLÄRUNG DER SYMBOLE AUF DEN ETIKETTEN/EXPLICATION DES SYMBOLES UTILISES SUR LES ETIQUETTES/EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS UTILIZADOS EN LAS ETIQUETAS/SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE/FORKLARING AF SYMBOLER ANVENDT PÅ ETIKETTER/FÖRKLARING AV SYMBOLERNA SOM ANVÄNDS PÅ ETIKETTERNA ∑ = 96 Reagents for 96 determinations Reagenzien für 96 Bestimmungen Réactifs pour 96 mesures Reactivos para 96 determinaciones Reagenti per 96 rilevazioni Reagens til 96 bestemmelser Reagenser för 96 bestämningar Expiry date Verfallsdatum A utiliser avant Fecha de caducidad Data di scadenza Udløbsdato Utgångsdatum Store between 2–8°C Lagerungstemperatur 2–8°C A conserver entre 2 et 8°C Conservar a entre 2–8°C Conservare tra i 2–8° C Opbevar ved 2–8°C Förvara vid 2–8°C LOT Lot No. Lot Nr. N° de lot Nº lote Lotto n. Partinr. Lotnr. IVD For in vitro diagnostic use Zum Gebrauch in der in vitro-Diagnose Ce kit est réservé à l'utilisation diagnostique in vitro Para uso diagnóstico in vitro Per l’uso diagnostico in vitro Til in vitro-diagnosticering För in vitro diagnostiskt bruk Directions for Use 5 Gebrauchsinformation 13 Mode d’emploi 21 Instrucciones para el uso 29 Instruzioni per l’uso 37 Brugsanvisning 45 Bruksanvisning 53 © Mercodia 2008, 2009 4 Mercodia Insulin ELISA provides a method for the quantitative determination of human insulin in serum or plasma. SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST Insulin is the principal hormone responsible for the control of glucose metabolism. It is synthesized in the ß-cells of the islets of Langerhans as the precursor, proinsulin, which is processed to form C-peptide and insulin. Both are secreted in equimolar amounts into the portal circulation. The mature insulin molecule comprises two polypeptide chains, the A chain and B chain (21 and 30 amino acids respectively). The two chains are linked together by two inter-chain disulphide bridges. There is also an intra-chain disulphide bridge in the A chain. Secretion of insulin is mainly controlled by plasma glucose concentration, and the hormone has a number of important metabolic actions. Its principal function is to control the uptake and utilization of glucose in peripheral tissues via the glucose transporter. This and other hypoglycaemic activities, such as the inhibition of hepatic gluconeogenesis and glycogenolysis are counteracted by the hyperglycaemic hormones including glucagon, epinephrine (adrenaline), growth hormone and cortisol. Insulin concentrations are severely reduced in insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) and some other conditions such as hypopituitarism. Insulin levels are raised in non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM), obesity, insulinoma and some endocrine dysfunctions such as Cushing’s syndrome and acromegaly. PRINCIPLE OF THE PROCEDURE Mercodia Insulin ELISA is a solid phase two-site enzyme immunoassay. It is based on the direct sandwich technique in which two monoclonal antibodies are directed against separate antigenic determinants on the insulin molecule. During incubation insulin in the sample reacts with peroxidase-conjugated anti-insulin antibodies and anti-insulin antibodies bound to microtitration well. A simple washing step removes unbound enzyme labelled antibody. The bound conjugate is detected by reaction with 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB). The reaction is stopped by adding acid to give a colorimetric endpoint that is read spectrophotometrically. WARNINGS AND PRECAUTIONS • For in vitro diagnostic use. • The contents of this kit and their residues must not be allowed to come into contact with ruminating animals or swine. • The Stop solution in this kit contains 0.5 M H2SO4. Follow routine precautions for handling hazardous chemicals. • All patient speciments should be handled as of capable of transmitting infections. 5 English English INTENDED USE MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED • Pipettes for 25, 50, 100, 200 and 1000 µl (repeat pipettes preferred for addition of enzyme conjugate solution, Substrate TMB and Stop Solution) • Beakers and cylinders for reagent preparation • Redistilled water • Microplate reader (450 nm filter) • Plate shaker (The recommended velocity is 700-900 cycles per minute, orbital movement) • Microplate washing device REAGENTS 1 X 96 Each Mercodia Insulin ELISA kit (10-1113-01) contains reagents for 96 wells, sufficient for 42 samples and one calibrator curve in duplicate. For larger series of assays, use pooled reagents from packages bearing identical lot numbers. The expiry date for the complete kit is stated on the outer label. The recommended storage temperature is 2–8°C. Coated Plate 1 plate 96 wells Ready for use (mouse monoclonal anti-insulin) 8-well strips. For unused microplate wells completely reseal the bag using adhesive tape and use within two months. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 vials Concentration indicated on vial label (recombinant human insulin) Color coded yellow 1000 µl Ready for use Calibrator 0 Color coded yellow 1 vial 5 ml Ready for use Enzyme Conjugate 11X (peroxidase conjugated mouse monoclonal anti-insulin) 1 vial 1.2 ml Preparation, see below Enzyme Conjugate Buffer Color coded blue 1 vial 12 ml Ready for use Wash Buffer 21X 1 bottle Dilute with 1000 ml redistilled water to make wash solution Storage after dilution: 2–8°C for 4 weeks. 50 ml Substrate TMB Colorless solution Note! Light sensitive! 1 vial 22 ml Ready for use Stop Solution 0.5 M H2SO4 1 vial 7 ml Ready for use 66 English English Preparation of enzyme conjugate solution Prepare the needed volume of enzyme conjugate solution by dilution of Enzyme Conjugate 11X, Preparation enzymeBuffer conjugate (1+10) in EnzymeofConjugate accordingsolution to the table below. When preparing enzyme conjugate solution the whole plate, conjugate pour all ofsolution the Enzyme Conjugate Buffer into the Enzyme Prepare the neededfor volume of enzyme by dilution of Enzyme Conjugate 11X, (1+10) Conjugate vial. Mix gently. Use within onetable day.below. Mix gently. Use within one day. in Enzyme 11X Conjugate Buffer according to the Number of strips Number of strips 4 strips 12 strips 6 strips 8 strips 8 strips 6 strips 10 strips 4 strips 12 strips Enzyme Enzyme Conjugate Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11XBuffer Buffer Conjugate 11X 400 µl 4.0 ml 1 vial 1 vial 600 µl 6.0 ml 700 µl 7.0 ml 700 µl 7.0 ml 500 µl 5.0 ml 900 µl 9.0 ml 350 µl 3.5 ml 1 vial 1 vial REAGENTS 10 X 96 Each Mercodia Insulin ELISA kit (10-1113-10) contains reagents for 10 × 96 wells, sufficient for 42 samples and one calibrator curve in duplicate on each plate. For larger series of assays, use pooled reagents from packages bearing identical lot numbers. The expiry date for the complete kit is stated on the outer label. The recommended storage temperature is 2–8°C. Coated Plate 10 plates 96 wells Ready for use (mouse monoclonal anti-insulin) 8-well strips For unused microplate wells completely reseal the bag using adhesive tape and use within two months. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 vials Concentration indicated on vial label (recombinant human insulin) Color coded yellow 1000 µl Ready for use Calibrator 0 Color coded yellow 1 vial 5 ml Ready for use Enzyme Conjugate 11X (Peroxidase conjugated mouse monoclonal anti-insulin) 1 vial 12 ml Preparation, see below Enzyme Conjugate Buffer Color coded blue 1 bottle 120 ml Ready for use Wash Buffer 21X 2 bottle 200 ml Preparation, see below Substrate TMB Colorless solution.Note! Light sensitive! 1 bottle 220 ml Ready for use Stop Solution 0.5 M H2SO4 1 bottle 70 ml Ready for use 7 7 Preparation of enzyme conjugate solution Prepare the conjugate solution dilutionConjugate of Enzyme11X, Conjugate Prepare the needed neededvolume volumeofofenzyme Conjugate by dilution of by Enzyme (1+10) in 11X, (1+10) in Enzyme to the below. gently. Use within Enzyme Conjugate BufferConjugate accordingBuffer to theaccording table below. Mixtable gently. Use Mix within one day. one day. Number Number of of strips/ plates plates 6 strips 10 plates 1 plate 5 plates 2 plates 3 plates 3 plates 2 plates 5 plates 1 plate 10 plates EnzymeEnzyme Conjugate Conjugate 11X 11X 0.5 ml 1 vial 1.0 ml 5.0 ml 2.0 ml 3.0 ml 3.0 ml 2.0 ml 5.0 ml 1.0 ml 1 vial Conjugate EnzymeEnzyme Conjugate Buffer Buffer 5 ml 1 bottle 10 ml 50 ml 20 ml 30 ml 30 ml 20 ml 50 ml 10 ml 1 bottle Preparation of wash wash solution solution Prepare the needed volume of wash solution Prepare solution by by diluion dilutionofofWash WashBuffer Buffer21X 21Xininredistilled redistilledwater water (1+20) according according to to the the table table below. below. Mix Mix properly. properly. (1+20) Number of of strips/ Number plates plates Wash Buffer Wash 21X Buffer 21X Redistilled Redistilled water water 6 strips 10 plates 1 plate 5 plates 2 plates 3 plates 3 plates 2 plates 5 plates 1 plate 10 plates 20 ml 2 bottles 35 ml 180 ml 110 ml 70 ml 70 ml110 ml 35 ml180 ml 1 bottle 400 ml 8000 ml 700 ml 3600 ml 1400 ml 2200 ml 2200 ml 1400 ml 3600 ml 700 ml 8000 ml Storage after dilution: 2–8°C for 4 weeks. SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING Serum Collect blood by venipuncture, allow to clot, and separate the serum by centrifugation. Samples can be stored at 2–8°C up to 24 hours. For longer periods, store samples at –20˚C. Avoid repeated freezing and thawing. Plasma Collect blood by venipuncture into tubes containing heparin or EDTA as anticoagulant, and separate the plasma fraction. Samples can be stored at 2–8°C up to 24 hours. For longer periods store samples at –20˚C. Avoid repeated freezing and thawing. 8 No dilution is normally required, however, samples containing >200 mU/l should be diluted Preparation of samples 1+9 v/v with Calibrator 0. Preparation of samples No dilution is normally required, however, samples containing >200 mU/l should be diluted 1+9 Application ofnormally this testrequired, to individuals already undergoing insulin therapy complicated by No dilution is however, samples containing >200 mU/l isshould be diluted v/v with Calibrator 0. formation of anti-insulin antibodies that are capable of interfering in the assay. 1+9 v/v with Calibrator 0. Grossly lipemic, icteric samples not interfere in thetherapy assay. is complicated by Application of this testortohemolysed individuals alreadydoundergoing insulin TEST PROCEDURE formation of anti-insulin antibodies that are capable of interfering in the assay. TEST PROCEDURE All Grossly reagents and samples be brought to room use. lipemic, icteric must or hemolysed samples do temperature not interfere before in the assay. All reagents and samples be brought to room temperature before use. Prepare a calibrator curvemust for each assay run. Prepare a calibrator curve for each assay run. TEST PROCEDURE reagentsenzyme and samples mustsolution be brought to room temperature before use. 1.AllPrepare conjugate and wash solution. a calibrator for each assay run. 2.Prepare Prepare sufficient curve microplate wells to accomodate Calibrators and samples in duplicate. 3.1. Pipette µl eachconjugate of Calibrators andand samples appropriate wells. Prepare25enzyme solution wash into solution. 4.2. Add 100 sufficient µl of enzyme conjugate solution to each well. Prepare microplate wells to accomodate Calibrators and samples in duplicate. 5.3. Incubate onµla each plate of shaker (700-900 for 1into hourappropriate at room temperature (18–25°C). Pipette 25 Calibrators andrpm) samples wells. 6.4. Wash withconjugate plate an washer 6plate times with 700 µlautomatic per wellsolution using Add 100 µl6oftimes enzyme toautomatic eachor:well.plate washer with overflow-wash Add in 350 µl wash each temperature well. Aspirate(18–25°C). volume. function. Do not include soak step washing 5. Aspirate Incubatethe on reaction a plate shaker (700-900 rpm) for procedure. 1buffer hour attoroom times. Or manually, 6. completely. Wash plateRepeat 6 times5with automatic plate washer or: After final wash, invert and tap the plate firmly against paper. Discard the reaction volume byAdd inverting microplate a sink. Add 350 µl wash 350 µlthe wash buffer absorbent toover each well. Aspirate Aspirate the reaction volume. 7. Add 200to µl each Substrate each wellsolution, tap firmly several times against absorbent solution well. Discard wash completely. Repeat 5 TMB times.intothe 8. Incubate forwash, 15 minutes at room temperature (18–25°C). paper to remove excess liquid. 5 times. Avoid prolonged soaking After final invert and tapRepeat the plate firmly against absorbent paper.during washing. 9.7. Add Solution to each well. well Add50 200µl µlStop Substrate TMB into each plateforon15a minutes shaker foratapproximately 5 seconds to ensure mixing. 8. Place Incubate room temperature (18–25°C). 10. Read50optical at 450 nm and 9. Add µl Stopdensity Solution to each well.calculate results. Read 30 aminutes. Placewithin plate on shaker for approximately 5 seconds to ensure mixing. 10. Read optical density at 450 nm and calculate results. Read within 30 minutes. INTERNAL QUALITY CONTROL Note! To prevent contamination betweenDiabetes the conjugate andcontrol substrate, separate Commercial controls such as Mercodia antigen (Code No. 10-1134-01/ pipettes are and/or recommended. 10-1164-01) internal CONTROL serum pools with low, intermediate and high insulin concentrations INTERNAL QUALITY should routinely be assayed resultsantigen chartedcontrol from day(Code to day. It is10-1134-01/ good laboCommercial controls such as as unknowns, Mercodia and Diabetes No. ratory practiceand/or to record the following data forlow, eachintermediate assay: kit lotand number; reconstitution dates 10-1164-01) internal serum pools with high insulin concentrations INTERNAL CONTROL ofshould kit components; values forunknowns, the blank, and Calibrators and controls. routinelyQUALITY beOD assayed as results charted from day to day. It is good laboCommersial controls such as Mercodia Diabetes antigen control (Code No. 10-1134-01 ratory practice to record the following data for each assay: kit lot number; reconstitution dates 10-1164-01) and/or internal serum pools with low, intermediate and high insulin concentration of kit components; OD values for the blank, Calibrators and controls. should routinely be assayed as unknowns, and results charted from day to day. It is good laboratory practice to record the following data for each assay: kit lot number; reconstitution date of components; OD values for the blank, Calibrators and controls. 9 9 9 English English English Preparation of samples CALCULATION OF RESULTS Computerized calculation The concentration of insulin is obtained by computerized data reduction of the absorbance for the Calibrators, except for Calibrator 0, versus the concentration using cubic spline regression. CALCULATION OF RESULTS Manual calculation Computerized calculation 1. Plot the absorbance values obtained for the Calibrators, except for Calibrator 0, against the The concentration of insulin is obtained by computerized data reduction of the absorbance for insulin concentration on a log-log paper and construct a calibrator curve. the Calibrators, except for Calibrator 0, versus the concentration using cubic spline regression. 2. Read the concentration of the unknown samples from the calibrator curve. Manual calculation Example of results 1. Plot the absorbance values obtained for the Calibrators, except for Calibrator 0, against the insulin concentration on a log-log paper and construct a calibrator curve. Wells Identity A450calibrator curve. 2. Read the concentration of the unknown samples from the 1 A–B Calibrator 0 Example of resultsCalibrator 1 * 1 C–D 1Wells E–F Calibrator 2 * Identity 1 G–H Calibrator 3 * 1 A–B Calibrator 0 21A–B Calibrator1 *4 * C–D Calibrator 21C–D Calibrator2 *5 * E–F Calibrator 21E–F Unknown3 1* G–H Calibrator A–B Calibrator 22G–H Unknown4 2* C–D Calibrator 32A–B Unknown5 3* 2 E–F 0.070/0.071 0.105/0.106 A4500.202/0.204 Mean conc. mU/l 0.434/0.470 0.070/0.071 1.348/1.351 0.105/0.106 2.451/2.476 0.202/0.204 0.222/0.214 11.1 0.434/0.470 1.348/1.351 0.546/0.538 35.6 2.451/2.476 1.941/1.978 153 Unknown 1 G–H Unknown 2 label. *2Concentration indicated oncurve vial Example of calibrator 3 A–B Mean conc. mU/l Unknown 3 0.222/0.214 0.546/0.538 1.941/1.978 11.1 35.6 153 A typical calibrator curve is shown here. Do not use this curve to determine actual assay results. Example of calibrator curve Example of calibrator curve A typical calibrator curve is shown here. Do not use this curve to determine actual assay A typical calibrator curve is shown here. Do not use this curve to determine actual assay results. results. O.D. 450 nm O.D. 450 nm 1,00 1,00 0,10 0,10 0,01 0,01 1 1 10 100 10 100 Insulin (mU/l) Insulin (mU/l) 10 1010 1000 1000 1 µg/l = 29 mU/l; 1 mU/l = 6.0 pmol/l LIMITATIONS OF THE PROCEDURE As with all diagnostic tests, a definitive clinical diagnosis should not be based on the results of a single test, but should be made by the physician after all clinical findings have been evaluated. Application of this test to individuals already undergoing insulin therapy is complicated by formation of anti-insulin antibodies that are capable of interfering in the assay. Grossly lipemic, icteric or hemolysed samples do not interfere in the assay. EXPECTED VALUES Good practice dictates that each laboratory establishes its own expected range of values. The following results may serve as a guide until the laboratory has gathered sufficient data of its own. Fasting levels for 137 tested, apparently healthy individuals, yielded a mean of 9.2 mU/l, a median of 6.9 mU/l and a range, corresponding to the central 95% of the observations, of 2–25 mU/l. PERFORMANCE CHARACTERISTICS Detection limit The detection limit is 1 mU/l calculated as two standard deviations above the Calibrator 0. Recovery Recovery upon addition is 94–113% (mean 104%). Hook effect Samples with a concentration of up to 30 000 mU/l can be measured without giving falsely low results. Precision Each sample was analyzed in 6 replicates on six different occasions. Sample 1 2 3 4 Mean value mU/l 11 36 80 154 Coefficient of variation within between total assay % assay % assay % 3.4 4.0 2.8 3.2 3.6 2.6 2.8 2.9 5.0 4.7 4.0 4.4 11 11 EnglishEnglish Conversion factor Specificity The following crossreactions have been found: C-peptide <<0.01% 0.01% Specificity 0.01% Proinsulin The following crossreactions have been found:<<0.01% Proinsulin des (31-32) <0.5% 0.5% Proinsulin C-peptide des (31–32) <<0.01% Proinsulin split split (32–33) (32-33) 0.5% Proinsulin << 0.5% Proinsulin < 0.01% Proinsulin des (64-65) 98% Proinsulin des (64–65) 98% Proinsulin des (31–32) < 0.5% Proinsulin split (65-66) 56% Proinsulin split (65–66) 56% Proinsulin split (32–33) < 0.5% Insulin lispro (Humalog®, Eli Lily) < 0.000003% ® , Eli Lilly) < 0.000003% Insulin lispro (Humalog Insulin aspart < 98% 3.2% Proinsulin des (64–65) Insulin 3.2% IGF-I aspart < 0.02% Proinsulin split (65–66) 56% IGF-I < 0.02% ® IGF-II lispro (Humalog , Eli Lilly) < 0.02% < 0.000003% Insulin Rat insulin 0.7% IGF-II < 0.02% Insulin aspart 3.2% Mouse insulin 0.3% Rat 0.7% IGF-Iinsulin < 0.02% Porcine insulin 374% IGF-II < 0.02% Sheep insulin 48% CALIBRATION Rat insulin 0.7% Bovine insulin 31% Mercodia Insulin ELISA kit is calibrated against 1st International Reference Preparation 66/304. CALIBRATION WARRANTY Mercodia Insulin ELISA kit is calibrated against 1st International Reference Preparation 66/304. The performance data presented here was obtained using the procedure indicated. Any change or modification in the procedure not recommended by Mercodia AB may affect the results, in WARRANTY which event Mercodia AB disclaims allwas warranties expressed, or statutory, the The performance data presented here obtained using theimplied procedure indicated.including Any change implied warrantyinofthe merchantability fitness for use. or modification procedure notand recommended by Mercodia AB may affect the results, in Mercodia AB and itsABauthorised such event,implied shall not be liable including for damages which event Mercodia disclaims distributors, all warrantiesinexpressed, or statutory, the indirect or consequential. implied warranty of merchantability and fitness for use. Mercodia AB and its authorised distributors, in such event, shall not be liable for damages indirect or consequential. REFERENCES Gaines-Das, R.E. and Bristow, A.F. (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16:179-186 Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-105454 Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B. (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019 Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF. (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-2365 Sjostrand M, Gudbjornsdottir S, Holmang A, Lonn L, Strindberg L, Lonnroth P. (2002) Delayed transcapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects. Diabetes 51:2742-2748 12 12 ZIELSETZUNG Mercodia Insulin ELISA bietet eine Methode zur quantitativen Bestimmung von Insulin in humanem Serum oder Plasma. ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG DES TESTES DAS TESTPRINZIP Mercodia Insulin ELISA ist ein enzymatischer, zweiseitiger Immunoassay mit einer Festphase. Der Test basiert auf der direkten Sandwich-technik, in welcher zwei monoklonale Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen im Insulinmolekül gerichtet sind. Während der Inkubation reagiert das Insulin in der Probe mit den Insulin-Antikörpern im Peroxidase-Konjugat und den Insulin-Antikörpern, welche auf der Mikrotitierplatte gebunden sind. Eine einfache Waschung entfernt die ungebundenen, enzymatisch gekennzeichneten Antikörper. Das gebundene Konjugat wird durch 3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine (TMB) sichtbar gemacht. Durch Zugabe von Säure wird die Reaktion gestoppt. Der dadurch erhaltene colometrische Endpunkt wird nun spektrophotometrisch abgelesen. WARNUNG UND VORSICHTSMASSNAHMEN • Zum Gebrauch in der in vitro Diagnostik. Nicht für innere oder äußere Anwendung bei Mensch und Tier. • Der Inhalt dieses Kits darf nicht in Kontakt mit Wiederkäuern oder Schweinen kommen. • Die Stop Solution in diesem Kit enthält 0.5 M H2SO4. Bitte Routinevorkehrungen für gefährliche Chemikalien beachten! • Für sämtliche Patientenproben sollten die Vorsichtsmaßnahmen für den Umgang mit Blutderivaten beachtet werden. 13 Deutsch Deutsch Insulin ist das bedeutendste Hormon, das für die Kontrolle des Glukosestoffwechsels verantwortlich ist. Es wird in den β-Zellen der langerhans´schen Inselzellen gebildet. Ebenso die Vorstufe Proinsulin, welche in C-Peptide und Insulin umgeformt wird. Sowohl Insulin als auch C-peptide werden in gleichmolaren Mengen in das Verdauungssystem sekretiert. Das ausgereifte Insulinmolekül besteht aus zwei Polypeptidketten, der A-Kette und der B-Kette (21 respektive 30 Aminosäuren). Die zwei Ketten sind durch zwei Interketten-Disulphidbrücken miteinander verbunden. In der A-Kette befindet sich ebenfalls eine Intraketten-Disulphidbrücke. Die Sekretion des Insulins wird hauptsächlich durch die Glukosekonzentration im Plasma kontrolliert. Dabei hat das Hormon eine Anzahl wichtiger Funktionen im Metabolismus. Seine hauptsächliche Funktion ist die Absorption und die Verwertung der Glukose im peripheren Gewebe via Glukosetransport. Hyperglykämische Hormone wie das Glukagon, Epinephrin (Adrenalin), Wachstumshormone und Kortisol wirken hypoglykämischen Aktivitäten entgegen, wie der Inhibition der Glukoneogenese und der Glykogenolyse. Die Insulinkonzentration im Blut ist in der insulinabhängigen Diabetes Mellitus (IDDM) und unter einigen anderen Bedingungen, wie der Hypopituitarism, beträchtlich reduziert. Insulin ist erhöht bei nicht-insulinabhängiger Diabetes Mellitus (NIDDM), Obesität, Insulinoma und einigen endokrinen Disfunktionen wie das Cushing´s Syndrom und Acromegaly. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL • 25, 50, 100, 200 und 1000 µl (vorzugsweise Mehrfachpipetten für die Zugabe der Enzym• 25, 50, 100, 200 und 1000 µl (vorzugsweise Mehrfachpipetten für die Zugabe der Enzymkonjugatlösung, des TMB Substrates und der Stop Solution) konjugatlösung, des TMB Substrates und der Stop Solution) • Becherglas und Messzylinder für die Aufbereitung der Reagenzien. • Becherglas und Messzylinder für die Aufbereitung der Reagenzien. • Doppelt destilliertes Wasser • Doppelt destilliertes Wasser • Mikroplattenleser (450 nm Filter) • Mikroplattenleser (450 nm Filter) • Plattenschüttler (Die empfohlene Geschwindigkeit liegt bei 700-900 Umdrehungen pro Minute, • Plattenschüttler (Die empfohlene Geschwindigkeit liegt bei 700-900 Umdrehungen pro Minute, • Waschvorrichtung für die Mikrotiterplatten • Orbitalbewegung) Waschvorrichtung für die Mikrotiterplatten REAGENZIEN 1 X 96 REAGENZIEN 1 X 96 Jedes Mercodia Insulin ELISA (10-1113-01) Kit enthält Reagenzien für 96 Brunnen. Dies Jedes Mercodia Insulin ELISA (10-1113-01) Kit enthält Reagenzien für 96 Brunnen. Dies reicht aus für 42 Proben und eine Kalibratorkurve im Duplikat. Für größere Assay-Serien ist reicht aus für 42 Proben und eine Kalibratorkurve im Duplikat. Für größere Assay-Serien ist es empfehlenswert Reagenzien, die miteinander vermischt werden sollen, aus Packungen mit der es empfehlenswert Reagenzien, die miteinander vermischt werden sollen, aus Packungen mit der selben Lot Nummer anzuwenden. Das Haltbarkeitsdatum für das komplette Kit ist auf dem selben Lot Nummer anzuwenden. Das Haltbarkeitsdatum für das komplette Kit ist auf dem Etikett der Packung vermerkt. Die empfohlene Lagerungstemperatur ist 2–8°C. Etikett der Packung vermerkt. Die empfohlene Lagerungstemperatur ist 2–8°C. Coated Plate 1 Platte 96 Brunnen gebrauchsfertig Coated Plate 1 Platte 96 Brunnen gebrauchsfertig (Maus Anti-Insulin monoklonal) 8 Brunnen-Strips (Maus Anti-Insulin monoklonal) 8 Brunnen-Strips Die unbenutzten Mikrotitierstreifen können in der mit Klebstreifen wiederverschlossenen Die unbenutzten Mikrotitierstreifen können in der mit Klebstreifen wiederverschlossenen Originalverpackung zwei Monate lang aufbewahrt werden. Originalverpackung zwei Monate lang aufbewahrt werden. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 Fläschchen 1000 ul gebrauchsfertig Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 Fläschchen 1000 ul gebrauchsfertig Konzentrationen ist auf dem Fläschchen angegeben Konzentrationen ist auf dem Fläschchen angegeben (rekombinantes Humaninsulin) Gelbfärbung (rekombinantes Humaninsulin) Gelbfärbung Calibrator 0 1 Fläschchen 5 ml gebrauchsfertig Calibrator 0 1 Fläschchen 5 ml gebrauchsfertig Gelbfärbung Gelbfärbung Enzyme Conjugate 11X 1 Fläschchen 1.2 ml Zubereitung s. unten Enzyme Conjugate 11X 1 Fläschchen 1.2 ml Zubereitung s. unten (Peroxidasekonjugiertes, monoklonales Anti-Insulin der Maus) (Peroxidasekonjugiertes, monoklonales Anti-Insulin der Maus) Enzyme Conjugate Buffer 1 Fläschchen 12 ml gebrauchsfertig Enzyme Conjugate Buffer 1 Fläschchen 12 ml gebrauchsfertig Blaufärbung Blaufärbung Wash Buffer 21X 1 Flasche 50 ml Wash Buffer 21X 1 Flasche 50 ml Waschlösung: Verdünnen mit 1000 ml dest. Wasser Waschlösung: Verdünnen mit 1000 ml dest. Wasser Lagerung nach der Verdünnung: 4 Wochen bei einer Temperatur von 2–8°C Lagerung nach der Verdünnung: 4 Wochen bei einer Temperatur von 2–8°C TMB Substrate 1 Fläschchen 22 ml gebrauchsfertig TMB Substrate 1 Fläschchen 22 ml gebrauchsfertig Farblose Lösung. Achtung: lichtempfindlich ! Farblose Lösung. Achtung: lichtempfindlich ! Stop Solution 1 Fläschchen 7 ml gebrauchsfertig Stop Solution 1 Fläschchen 7 ml gebrauchsfertig 0.5 M H2SO4 0.5 M H2SO4 14 14 Vorbereitung der Enzymkonjugatlösung Vorbereiten der benötigten Konjugatlösung durch mischen von Enzym Conjugate 11X Vorbereitung der Enzymkonjugatlösung (1+10) mit Enzym ConjugateEnzyme Buffer entsprechend der folgenden Tabelle. von Während die KonjuVorbereiten des benötigten Conjugate Volumens durch mischen EnzymeSieConjugate gatlösung fürmit die Enzyme ganze platte vorbereiten, Sie den Enzyme Conjugate BufferVorsichtig komplett in 11X (1+10) Conjugate Buffer schütten oder entsprechend der folgenden Tabelle. das Fläschchen Enzym Conjugate 11X. Vorsichtig mischen. Innerhalb eines Tages aufbrauchen. mischen. Innerhalb eines Tages aufbrauchen. 4 Streifen 6 Streifen 12 Streifen 8 Streifen 8 Streifen Streifen 610 Streifen Streifen 412 Streifen Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate 11X 400 µl 600 µl 1 Fläschen 700 µl 700 µl 900 µl 500 µl 1 Fläschchen 350 µl Enzyme Conjugate Enzyme Conjugate Buffer Buffer 4.0 ml 6.0 ml1 Fläschen 7.0 ml7.0 ml 9.0 ml5.0 ml 1 Fläschchen 3.5 ml Deutsch Deutsch Anzahl Streifen Anzahl Streifen REAGENZIEN 10 X 96 Jeder Mercodia Insulin ELISA Kit (10-1113-10) enthält Reagenzien für 10 x 96 Brunnen. Dies reicht aus für 42 Proben und eine Kalibratorkurve im Duplikat pro Platte. Für grössere TestSerien ist es empfehlenswert Reagenzien, die miteinander vermischt werden sollen, aus Packungen mit der selben Lot Nummer anzuwenden. Das Haltbarkeitsdatum für das komplette Kit ist auf dem Etikett der Packung vermerkt. Die empfohlene Lagerungstemperatur ist 2–8°C. Coated Plate 10 Platte 96 Brunnen gebrauchsfertig (Maus Anti-Insulin monoklonal) 8 Brunnen-Strips Die unbenutzten Mikrotitierstreifen können mit Klebstreifen in der wiederverschlossenen Originalverpackung zwei Monate lang aufbewahrt werden. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 Fläschchen 1000 µl gebrauchsfertig Konzentrationen s. Etiketten (rekombinantes Human Insulin) Gelbfärbung Calibrator 0 Gelbfärbung 1 Fläschchen 5 ml gebrauchsfertig Enzyme Conjugate 11X 1 Fläschchen 12 ml (Peroxidasekonjugiertes, monoklonalesAnti-Insulin der Maus) Zubereitung s. unten Enzyme Conjugate Buffer Blaufärbung 1 Flasche 120 ml gebrauchsfertig Wash Buffer 21X 2 Flaschen 200 ml Zubereitung s. unten Substrate TMB 1 Flasche Farblose Lösung. Achtung: lichtempfindlich ! 220 ml gebrauchsfertig Stop Solution 0.5 M H2SO4 70 ml gebrauchsfertig 1 Flasche 15 15 Vorbereitung der Enzymkonjugatlösung Vorbereiten der benötigten Enzymkonjugatlösung durch mischen von Enzym Conjugate 11X (1+10) mit Enzym der Conjugate Buffer entsprechend der folgende Tabelle. Vorsichtig mischen. Vorbereitung Enzymkonjugatlösung Innerhalb eines Tages aufgebrauchen. Vorbereiten der benötigten Enzymkonjugatelösung durch mischen von Enzyme Conjugate 11X (1+10) mit Enzyme Conjugate Buffer entsprechend der folgende Tabelle. Vorsichtig Anzahl Innerhalb Platten eines Tages Enzyme Enzyme Conjugate mischen. aufbrauchen. conjugate 11X buffer Anzahl Platten/Streifen Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X 10 Platten 1 Fläschen 1 FläschenBuffer 6 Streifen 0.5 ml 5 Platten 5.0 ml 1 Platte 1.0 ml 3 Platten 3.0 ml 2 Platten 2.0 ml 2 Platten 2.0 ml 3 Platten 3.0 ml 1 Platten 1.0 ml 5 Platten 5.0 ml 10 Platten 1 Fläschchen Vorbereitung den Waschlösung 50 ml 30 ml 20 ml 10 ml 5 ml 10 ml 20 ml 30 ml 50 ml 1 Flasche Vorbereiten des benötigten Waschlösung Volumens durch mischen des Wash Buffer 21X mit Vorbereitung den Waschlösung doppelt destilliertem Wasser (1+20) entsprechend der folgenden Tabelle. Gründliches mischen Vorbereiten den benötigten Waschlösung volumens durch mischen des Wash Buffers 21X mit doppelt erforderlich. destilliertem Wasser (1+20) entsprechend der folgenden Tabelle. Gründliches mischen erforderlich. Anzahl AnzahlPlatten Platten/Streifen Wash Wash Buffer 21X Buffer 21 X 6 Streifen 10 Platten 1 Platte 5 Platten 2 Platten 3 Platten 3 Platten 2 Platten 5 Platten 1 Platten 10 Platten 20 ml 2 Flaschen 35 ml 180 ml 70 ml 110 ml 110 ml 70 ml 180 ml 35 ml 1 Flasche doppelt dest. doppelt dest. Wasser Wasser 8000 ml 3600 ml 2200 ml 1400 ml 700 ml 400 ml 700 ml 1400 ml 2200 ml 3600 ml 8000 ml Lagerung nach Vermischung: 4 Wochen bei einer Temperatur von 2–8°C. PRÄPARATGEWINNUNG UND HANDHABUNG Serum Gewinnen von Blut durch Venenpunktion, gerinnen lassen und das Serums durch Zentrifugieren abtrennen. Die Proben können bis zu 24 Stunden bei 2–8°C aufbewahrt werden. Längere Lagerzeiten erfordern eine Temperatur von –20°C. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Plasma Gewinnen von Blut durch Venenpunktion. Verhinderung einer Koagulation des Venenblutes durch die Zugabe von Heparin oder EDTA. Anschließend Trennung der Plasmafraktion. Die Proben können bis zu 24 Stunden bei 2–8°C aufbewahrt werden. Längere Lagerzeiten erfordern eine Temperatur von –20°C. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. 16 16 Vorbereitung der Proben Normalerweise ist eine Verdünnung der Proben nicht notwendig. Liegt jedoch die Konzentration über 200 mU/l wird eine Verdünnung von 1/10 v/v mit Calibrator 0 empfohlen. Vorbereitung der Proben Vorbereitung derVerdünnung Proben Bei der Anwendung des Testes bei die notwendig. bereits in Behandlung können KomNormalerweise ist eine derPatienten, Proben nicht Liegt jedochsind, die Konzentration plikationen auftreten, da die Einnahme von Körper zur AntiNormalerweise istder eine Verdünnung der nicht Liegt jedochebenfalls die Konzentration Vorbereitung Proben über 200 mU/l wird eine Verdünnung vonProben 1/10Insulinsurrogaten v/v mitnotwendig. Calibratorden 0 empfohlen. TESTDURCHFÜHRUNG Alle Reagenziender müssen vor Beginn auf Raumtemperatur gebracht werden. Ebenso sollte für 1. Vorbereiten Enzymkonjugatlösung und der Waschlösung. Alle Reagenzien müssen vor Beginn aufwerden. Raumtemperatur gebracht werden. Ebenso sollte für jeden Test eine Kalibratorkurve gemacht 2. Vorbereiten genügender Mikrotiterplatten für die Calibrators und die Proben im Dublikat. jeden Test eine Kalibratorkurve gemacht werden. 3. Vorbereiten Pipettieren von 25 µl von jedem Calibrator undWaschlösung. der Proben in die dafür vorgesehenen 1. der Enzymkonjugatlösung und der Brunnen. Vorbereitengenügender der Enzymkonjugatlösung undfürderdieWaschlösung. 2.1. Vorbereiten Mikrotiterplatten Calibrators und die Proben im Dublikat. 4. Zugabe vonvon 10025µlµlEnzymkonjugatlösung die Brunnen. 2. Pipettieren Vorbereiten genügender für die Calibrators die Proben im Dublikat. 3. von Mikrotiterplatten jedem Calibrator in und der Proben in und die dafür vorgesehenen 5. Inkubation Schüttler Stunde beidafür Raumtemperatur 3. Brunnen. Pipettieren auf von einem 25 µl von jedem(700-900 Calibratorrpm) undfür dereine Proben in die vorgesehenen (18–25°C). Brunnen. 4. Zugabe von 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Brunnen. Die Platten werden 6 Schüttler malµl mit automatischen Plattenwascher gewaschen 4. Inkubation Zugabe vonauf 100 µl 700 Enzymkonjugatlösung in diefür Brunnen. 6. 6-mal waschen mit pro einem Vertiefung unter Verwendung Platten5. einem (700-900 rpm) eine Stundeeines bei Raumtemperatur oder: 5. (18–25°C). Inkubation auf einem Schüttler (700-900 rpm) für Stunde bei Raumtemperatur Waschautomaten mit Überlauf-Waschfunktion. Dieeine Waschprozedur sollte keine Einwirkzeit Die Brunnen leersaugen. Anschliessend 350 µl Waschpuffer in jede Brunne pipettieren, (18–25°C). beinhalten. 6. Die Platten werden 6 mal mit einem automatischen Plattenwascher gewaschen Leersaugen. 6. oder: Die Platten 6 mal bitte mit einem automatischen Plattenwascher gewaschen Wird manuellwerden gewaschen, folgendermaßen vorgehen Diesen Vorgang 5 mal wiederholen. oder: Reaktionsvolumen verwerfen, durch Umdrehen Mikrotiterplatte über einempipettieren, Die Brunnen leersaugen. Anschliessend 350 µlder Waschpuffer in jede Brunne Waschpuffer-Reste entfernen, indem Rahmen mitWaschlösung (Öffnung nach Die Brunnen leersaugen. Anschliessend 350 µlderWaschpuffer inden jedeStreifen Brunne pipettieren, Ausgussbecken. 350gründlich µl Waschlösung in jede Vertiefung geben. verwerfen Leersaugen. unten) mehrmals auf eine saugfähige Unterlage aufgeschlagen wird. Flüssigkeit Leersaugen. und mehrmals kräftig saugfähiges Papier schlagen, um überschüssige Diesen Vorgang 5 kräftig mal gegen wiederholen. 7. Waschpuffer-Reste Zugabe von 200 TMB Substrate in dieindem Brunnen. Diesen Vorgang 5µlmal wiederholen. zu entfernen. 5-mal wiederholen. Längere Einwirkzeiten während dieser Waschprozedur gründlich entfernen, der Rahmen mit den Streifen (Öffnung nach 8. unten) 15 Minuten Inkubation bei (18–25°C). Waschpuffer-Reste gründlich entfernen, indem der Rahmen mit den Streifen vermeiden. mehrmals kräftig aufRaumtemperatur eine saugfähige Unterlage aufgeschlagen wird. (Öffnung nach 9. Zugabe Zugabe von 200 50 µlµlkräftig Stop Brunnen. unten) mehrmals auf eineinsaugfähige Unterlage aufgeschlagen wird. 7. von TMBSolution Substrate injeden die Brunnen. Um einevon gute Mischung von Substrate und Stop Solution zu gewährleisten, wird empfohlen, Zugabe 200 µl TMBbei Substrate in die Brunnen. 8.7. 15 Minuten Inkubation Raumtemperatur (18–25°C). die Platte 5 µl Sekunden den Schüttler zu(18–25°C). stellen. 15 Minuten Inkubation beiauf Raumtemperatur 9.8. Zugabe vonfür50 Stop Solution in jeden Brunnen. 10 Messen der 50 Absorbance beiSubstrate 450innm und auswerten. 9. Um Zugabe µl Stop Solution jeden eine von gute Mischung von undBrunnen. Stop Solution zu gewährleisten, wird empfohlen, Das Resultat innerhalb von Minuten abgelesen UmPlatte eine gute Mischung von und zu Stop Solutionwerden. zu gewährleisten, wird empfohlen, die für 5sollte Sekunden auf Substrate den 30 Schüttler stellen. Platteder fürAbsorbance 5 Sekundenbei auf450 dennm Schüttler zu stellen. 10 die Messen und auswerten. 10 Das Messen der sollte Absorbance bei von 450 30 nmMinuten und auswerten. Resultat innerhalb abgelesen werden. Das Resultat innerhalb vonzwischen 30 Minuten werden. Beachten Sie! Umsollte Kontaminationen demabgelesen Konjugat und dem Substrat zu vermeiden, INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE emphehlen wir Ihnen separate Pipetten zu verwenden. Um die tägliche Gültigkeit der Resultate zu sichern ist die Verwendung von Kontrollen als UnbekannteQUALITÄTSKONTROLLE ratsam. Dafür wird Mercodia Diabetes antigen control (Code No. 10-1164-01) INTERNE INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE empfohlen oder pathologische mit zu tiefen, mittleren und hohen InsulinkonzentratioUm die tägliche Gültigkeit derProben Resultate sichern ist die Verwendung von Kontrollen als nen.die Destägliche weiteren sollten Daten zu für jeden Kit werden: Lot-Nummer des Um Gültigkeit der Resultate sichern istprotokolliert die control Verwendung Kontrollen als Unbekannte ratsam. Dafür folgende wird Mercodia Diabetes antigen (Codevon No. 10-1164-01) Kits, Rekonstruktion der Daten der Kitkomponenten; OD-Werte der InsulinkonzentratioBlanke,No. Calibrators und Unbekannte ratsam. Dafür wird Mercodia Diabetes antigen (Code 10-1164-01) empfohlen oder pathologische Proben mit tiefen, mittleren und control hohen Kontrollen. empfohlen oder pathologische Proben mit tiefen, mittleren und hohenwerden: Insulinkonzentrationen. Des weiteren sollten folgende Daten für jeden Kit protokolliert Lot-Nummer des nen.Rekonstruktion Des weiteren sollten folgende Daten für jeden KitOD-Werte protokolliert Lot-Nummerund des Kits, der Daten der Kitkomponenten; der werden: Blanke, Calibrators Kits, Rekonstruktion der Daten der Kitkomponenten; OD-Werte der Blanke, Calibrators und Kontrollen. Kontrollen. 17 Deutsch Deutsch Deutsch Deutsch Insulin Antikörper-Produktion veranlasst. Diese Antikörper können Test stören. über mU/l wird eine Verdünnung von 1/10 nicht v/v Calibrator 0den empfohlen. Normalerweise ist eine Verdünnung derPatienten, Proben notwendig. Liegt jedoch die können Konzentration Bei200 der Anwendung des Testes bei diemit bereits in Behandlung sind, Komüber 200 wirdoder eine Verdünnung von 1/10 v/vdie mitbereits Calibrator 0Versuch empfohlen. Lipemic, Icteric hämolysierte beeinträchtigen denBehandlung nicht. Bei dermU/l Anwendung des beiProben Patienten, in sind, können Komplikationen auftreten, da dieTestes Einnahme von Insulinsurrogaten den Körper ebenfalls zur Antiplikationen auftreten, da dieveranlasst. Einnahme Diese von Insulinsurrogaten ebenfalls zur AntiInsulin Antikörper-Produktion Antikörper könnenden denKörper Test stören. TESTDURCHFÜHRUNG Insulin Antikörper-Produktion veranlasst. Diese Antikörper können den Test stören. Lipemic, Icteric oder hämolysierte Proben beeinträchtigen den Versuch nicht. Ictericmüssen oder hämolysierte beeinträchtigengebracht den Versuch nicht. AlleLipemic, Reagenzien vor Beginn Proben auf Raumtemperatur werden. Ebenso sollte für jeden Test eine Kalibratorkurve gemacht werden. TESTDURCHFÜHRUNG BERECHNUNG DER RESULTATE Computergestützte Berechnung Es kann eine computergestützte Berechnung der Absorbanzwerte der Calibrators, ausser Calibrator 0, und deren Konzentration mit Hilfe einer cubic spline regression erfolgen. BERECHNUNG DER RESULTATE Manuelle Berechnung Computergestützte Berechnung 1. Einzeichnen der für die Calibrators, ausser Calibrator 0, erhaltenen Absorbanzwerte im Es kann eine computergestützte Berechnung der Absorbanzwerte der Calibrators, ausser Verhältnis zur Insulinkonzentration auf einem log-log Papier und erstellen Kalibratorkurve. Calibrator 0, und deren Konzentration mit Hilfe einer cubic spline regression erfolgen. 2. Die Konzentration der unbekannten Proben aus der Kalibratorkurve ablesen. Manuelle Berechnung Beispiel von der Resultaten 1. Einzeichnen für die Calibrators, ausser Calibrator 0, erhaltenen Absorbanzwerte im Verhältnis zur Insulinkonzentration auf einem log-log Papier und erstellen Kalibratorkurve. Identifikation A450 Mittelwert mU/l 2. Die Konzentration der unbekannten Proben aus der Kalibratorkurve ablesen. Brunnen 1 A–B Calibrator 0 Beispiel von Resultaten 1 C–D Calibrator 1 * 1 E–F Calibrator 2 * Brunnen Identifikation 1 G–H Calibrator 3 * 1 A–B Calibrator 0 2 A–B Calibrator 4 * 1 C–D Calibrator 1 * 2 C–D Calibrator 1 E–F Calibrator 25** 2 E–F Unbekannte 1 G–H Calibrator 3 * 1 2 G–F Unbekannte 2 A–B Calibrator 4 * 2 3 A–B Unbekannte 2 C–D Calibrator 5 * 3 2 E–F 0.070/0.071 0.105/0.106 0.202/0.204 A450 0.434/0.470 0.070/0.071 1.348/1.351 0.105/0.106 2.451/2.476 0.202/0.204 0.222/0.214 0.434/0.470 0.546/0.538 1.348/1.351 1.941/1.978 2.451/2.476 Unbekannte 1 Mittelwert mU/l 11.1 35.6 153 0.222/0.214 11.1 35.6 3 A–B Unbekannte 3 1.941/1.978 153 Hier wird eine typische Kalibratorkurve gezeigt. Diese soll nicht zur Berechnung aktueller * Konzentrationen ist Unbekannte auf dem Fläschechn angegeben. 2 G–F einer Kalibratorkurve 2 0.546/0.538 Beispiel Beispiel einer Kalibratorkurve Testergebnisse benutzt werden! Beispiel einer Kalibratorkurve Hier wird eine typische Kalibratorkurve gezeigt. Diese soll nicht zur Berechnubg aktueller Hier wird einebenutz typischewerden. Kalibratorkurve gezeigt. Diese soll nicht zur Berechnung aktueller Testergebnisse Testergebnisse benutzt werden! 1,00 O.D. 450 nm O.D. 450 nm 1,00 0,10 0,10 0,01 0,01 1 10 1 100 10 100 Insulin (mU/l) 18 18 Insulin (mU/l) 1000 1000 UMRECHNUNGSFAKTOR 1 µg/l = 29 mU/l; 1 mU/l = 6.0 pmol/l GRENZEN DES VERFAHRENS ERWARTETE WERTE Es wird empfohlen, dass jedes Labor eigene Referenzwerte etabliert. Die folgenden Resultate können als Richtlinie gelten, bis das Labor genügend eigene Daten gesammelt hat. Die Werte von 137 augenscheinlich gesunden und fastenden Personen erreichten einen Mittelwert von 9.2 mU/l und einen Medianwert von 6.9 mU/l. Die Spannweite betrug 2–25 mU/l bezogen auf die zentralen 95% der beobachteten Werte. TESTCHARAKTERISIERUNG Nachweisgrenze Die Nachweisgrenze liegt bei 1 mU/l, definiert durch zwei Standardabweichnungen über dem Calibrator 0. Wiederfindung Die Wiederfindung nach Zugabe beträgt 94–113% (Mittelwert 104%). Hookeffekt Bei Proben mit einer Konzentration bis zu 30´000 mU/l wurde kein Hook-Effekt festgestellt. Präzision Jede Probe wurde unter 6 verschiedenen Bedingungen 6 mal gemessen. Probe Mittelwert mU/l 1 2 3 4 11 36 80 154 Variationskoeffizienz intra-Assay% inter-Assay total Assay % 3.4 4.0 2.8 3.2 3.6 2.6 2.8 2.9 5.0 4.7 4.0 4.4 19 19 Deutsch Deutsch Wie bei allen diagnostischen Tests sollte auch hier eine endgültige klinische Beurteilung nicht auf den Resultaten eines Einzeltests beruhen, sondern erst nach Erhalt der Ergebnisse aller klinischen und der Laborbefunde abgegeben werden. Proben von Individuen, die einer Insulinbehandlung unterzogen wurden, können den Test stören, da in diesen Anti-Insulin Antikörper vorhanden sind. Lipemic, Icteric oder hämolysierte Proben beeinträchtigen den Versuch nicht. Spezifität Die folgenden Kreuzreaktionen konnten festgestellt werden: C-peptide < 0.01% C-peptide < 0.01% Proinsulin < 0.01% Proinsulin < 0.01% Spezifität Proinsulin des < 0.5% Spezifität Proinsulin des (31-32) (31–32) < 0.5% Die folgenden Kreuzreaktionen konnten festgestellt werden: Proinsulin split Kreuzreaktionen (32-33) < 0.5% Die folgenden konnten festgestellt Proinsulin split (32–33) < 0.5% werden: Proinsulin C-peptide des (64-65) < 0.01%98% C-peptide < 0.01% Proinsulin des (64–65) 98% Proinsulin Proinsulin split (65-66) < 0.01%56% Proinsulin <0.000003% 0.01% split (65–66) Insulin lispro <56% Proinsulin des(Humalog®, (31–32) ® Eli Lily) < 0.5% Proinsulin des(Humalog (31–32) , Eli, Lilly) < 0.5% < 0.006% Insulin lispro Insulin aspart < 3.2% Proinsulin split (32–33) < 0.5% Proinsulin split (32–33) 0.5% Insulin aspart < 0.006% IGF-I < 0.02% Proinsulin des (64–65) 98% IGF-II Proinsulin des (64–65) 98%< 0.02% Insulin der Ratte 0.7% Proinsulin split (65–66) 56% Ratteninsulin Proinsulin split (65–66)® 56% 0.7% < 0.006% Insulin lispro (Humalog , Eli, Lilly) Mausinsulin KALIBRIERUNG < 0.006% 0.3% Insulin lispro (Humalog®, Eli, Lilly) Insulin aspart < 0.006% Schweineinsulin 374% Insulin aspart 0.006% Mercodia Insulin ELISA Kit wurde gemäss< der 1st International Reference Preparation für Schafinsulin Insulin der Ratte 0.7% 48% Insulin der Ratte 0.7% menschliches Insulin 66/304 kalibriert. Rinderinsulin 31% KALIBRIERUNG KALIBRIERUNG HAFTUNG Mercodia Insulin ELISA Kit wurde gemäss der 1st International Reference Preparation für Mercodia Insulin ELISA Kit wurde gemässwurden der 1stmit International Reference Preparation für Die hier aufgeführten Durchführungsdaten dem indizierten Verfahren gewonnen. menschliches Insulin 66/304 kalibriert. menschliches InsulinAB66/304 kalibriert. Änderung oder Modifikation des Verfahrens kann die Jede von Mercodia nicht empfohlene Resultate beeinträchtigen. In diesem Fall lehnt Mercodia AB jede explizierte, implizierte oder HAFTUNG HAFTUNG gesetzliche Garantie ab, die implizierte Marktfähigkeit und Anwendbarkeit inbegriffen. Die hier aufgeführten Durchführungsdaten wurden mit dem indizierten Verfahren gewonnen. DieMercodia hier aufgeführten wurden mitweder dem indizierten Verfahren AB und Durchführungsdaten deren Vertreter können dann für direkte Schädengewonnen. noch für Jede von Mercodia AB nicht empfohlene Änderung oder Modifikation des Verfahrens kann die Jede von Mercodia ABgemacht nicht empfohlene Folgeschäden haftbar werden. Änderung oder Modifikation des Verfahrens kann die Resultate beeinträchtigen. In diesem Fall lehnt Mercodia AB jede explizierte, implizierte oder Resultate beeinträchtigen. In diesem Fall lehnt Mercodia AB jede explizierte, implizierte oder gesetzliche Garantie ab, die implizierte Marktfähigkeit und Anwendbarkeit inbegriffen. gesetzliche Garantie ab, die implizierte Marktfähigkeit und Anwendbarkeit inbegriffen. Mercodia AB und deren Vertreter können dann weder für direkte Schäden noch für Mercodia AB und deren Vertreter können dann weder für direkte Schäden noch für Folgeschäden haftbar gemacht werden. Folgeschäden haftbar gemacht werden. REFERENZEN Gaines-Das, R.E. and Bristow, A.F. (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16:179-186 Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054 Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B. (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019 Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF. (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-2365 Sjostrand M, Gudbjornsdottir S, Holmang A, Lonn L, Strindberg L, Lonnroth P. (2002) Delayed transcapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects. Diabetes 51:2742-2748 20 20 UTILISATION PREVUE Le test Mercodia Insulin ELISA fournit une méthode de détermination des quantités d’insuline humaine dans le sérum ou le plasma. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST PRINCIPE DE LA PROCÉDURE Une caractéristique du test Mercodia Insulin ELISA est le dosage immunologique enzymatique à double site, en phase solide. Il repose sur une technique de type "sandwich direct", dans laquelle deux anticorps monoclonaux sont dirigés contre deux déterminants antigéniques distincts de l´insuline. En phase d´incubation, les molécules d´insuline de l´échantillon réagissent avec les anticorps anti-insuline correspondants dans le peroxidase conjugué et les anticorps anti-insuline correspondants fixés aux puits de microtitration. Un rinçage simple élimine les anticorps marqués non liés. Le conjugué est détecté par réaction avec la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB). Pour arrêter la réaction, on ajoute de l'acide. Cette solution fournit un point d'évaluation colorimétrique, qui sera lu par spectrophotométrie. AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS • Ce kit est réservé à l'utilisation diagnostique in vitro. • Vous devez éviter tout contact entre le contenu ou les résidus de ce kit et les ruminants ou les suidés. • La Stop Solution fournie contient 0,5 M d'acide sulfurique (H2SO4). Respectez les précautions habituelles relatives à l'utilisation de produits chimiques dangereux. • Tous les spécimens patient doivent être traités comme des échantillons contagieux. 21 Français Français L'insuline est la principale hormone impliquée dans le contrôle du métabolisme du glucose. Son précurseur, la proinsuline, est sécrété par les cellules ß des îlots de Langerhans, puis transformé pour donner des peptides C et de l’insuline, sécrétés, en quantités équimolaires, dans la circulation portale. La molécule d’insuline elle-même comprend deux chaînes de polypeptides, la chaîne A et la chaîne B (composées, respectivement, de 21 et de 30 acides aminés). Ces deux chaînes sont rattachées par deux ponts disulfure interchaînes. La chaîne A comporte également un pont disulfure intrachaîne. L'insuline, dont la sécrétion est principalement contrôlée par la concentration de glucose plasmatique, produit plusieurs effets métaboliques importants. Sa principale fonction consiste à contrôler l'absorption et l'utilisation du glucose dans les tissus périphériques, via le transporteur du glucose. Cette activé hypoglycémiante (ainsi que d'autres: inhibition de la gluconéogenèse et de la glycogénolyse hépatiques) est contrebalancée par les hormones hyperglycémiantes, notamment le glucagon, l'adrénaline, l'hormone de croissance et le cortisol. Les concentrations en insuline sont fortement réduites dans le diabète insulinodépendant (insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM) et dans d'autres affections telles que l'insuffisance hypophysaire. Elles sont accrues dans le diabète non insulinodépendant (non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM), l'obésité, l'insulinome et quelques autres dysfonctionnements endocriniens tels que le syndrome de Cushing et l'acromégalie. MATÉRIELNÉCESSAIRE NÉCESSAIRENON NONFOURNI FOURNI MATÉRIEL Pipettesdede25, 25,50, 50,100, 100,200 200etet1000 1000µlµl(pipettes (pipettesààrépétition répétitionrecommandées recommandéespour pourl'ajout l'ajoutdu du •• Pipettes conjuguéenzymatique, enzymatique,dedeSubstrate Substrate[TMB] [TMB]etetdedeStop StopSolution) Solution) conjugué Béchersetetéprouvettes éprouvettescylindriques cylindriquespour pourlalapréparation préparationdes desréactifs réactifs •• Béchers Eauredistillée redistillée •• Eau Lecteurdedemicroplaques microplaques(filtre (filtredede450 450nm) nm) •• Lecteur Agitateursecoueur secoueurdedeplaques plaques(Le (Lerégime régimerecommandé recommandéest estdede700-900 700-900tours tourspar parminute, minute, •• Agitateur Dispositifdedeorbital) rinçagededemicroplaques microplaques •• mouvement Dispositif rinçage RÉACTIFS11XX96 96 RÉACTIFS Chaquekit kitMercodia MercodiaInsulin InsulinELISA ELISA(10-1113-01) (10-1113-01)contient contientsuffisamment suffisammentdederéactifs réactifspour pour96 96 Chaque puits,soit soitune unequantité quantitépermettant permettantdedetraiter traiter42 42échantillons échantillonsetetune unecourbe courbed'étalonnage d'étalonnageenen puits, double.Pour Pourdes desséries sériesdededosages dosagesplus plusimportantes, importantes,mélangez mélangezles lesréactifs réactifsdedekits kitsportant portantdes des double. numérosdedelot lotidentiques. identiques.LaLadate datededepéremption péremptiondu dukit kitfigure figuresur surl'étiquette l'étiquetteapposée apposéeàà numéros l'extérieur.LaLatempérature températurededestockage stockagerecommandée recommandéeest est22àà8°C. 8°C. l'extérieur. CoatedPlate Plate plaque 96puits puits Prêteààl'emploi l'emploi Coated 11plaque 96 Prête (Anticorpsmonoclonal monoclonalmurin murin Bandes Bandesdede88puits puits (Anticorps anti-insuline) anti-insuline) S'ilreste restedes despuits puitsinutilisés, inutilisés,replacez-les replacez-lesdans dansleur leuremballage emballagehermétiquement hermétiquementfermé. fermé.Utilisez Utilisezces ces S'il puitssous sousdeux deuxmois. mois. puits Calibrators1,1,2,2,3,3,4,4,55 fioles 1000µlµl Calibrators 55fioles 1000 Conc.indiquée indiquéesur surl'l'etiquette etiquette Conc. (recombinanthuman humaninsulin) insulin)Code Codecouleur: couleur:jaune jaune (recombinant Prêteààl´emploi l´emploi Prête Calibrator00 Calibrator Codecouleur: couleur:jaune jaune Code Prêteààl'emploi l'emploi Prête fiole 11fiole EnzymeConjugate Conjugate11X 11X Enzyme (peroxidaseconjugué conjuguémonoclonal monoclonal (peroxidase murinanti-insulin) anti-insulin) fiole murin 11fiole EnzymeConjugate ConjugateBuffer Buffer 11fiole fiole Enzyme Codecouleur: couleur:bleu bleu Code 55mlml 1.2mlml 1.2 12mlml 12 préparer AApréparer voirci-dessous ci-dessous voir Prêtààl'emploi l'emploi Prêt WashBuffer Buffer21X 21X flacon 50mlml Wash 11flacon 50 Diluezavec avec1000 1000mlmld'eau d'eaudistillée distilléepour pourpréparer préparerlalasolution solutiondedelavage. lavage. Diluez Stockageaprès aprèsdilution: dilution:ààtempérature températurecomprise compriseentre entre22etet8°C 8°Cpendant pendant44semaines. semaines. Stockage SubstrateTMB TMB fiole 22mlml Substrate 11fiole 22 Remarque:Cette Cettesolution solutionest estsensible sensibleààlalalumière lumière! ! Solutionincolore. incolore.Remarque: Solution Prêtààl'emploi l'emploi Prêt StopSolution Solution Stop à 0,5 M 2SO HH2SO 4 4à 0,5 M Prêteààl'emploi l'emploi Prête 22 22 fiole 11fiole 77mlml Préparation du conjugué enzymatique Préparez le volume du conjugué enzymatique nécessaire en diluant 11X l’Enzyme Conjugate (1+10) Préparation du conjugué dans l’Enzym Conjugate Buffer, en enzymatique suivant les indications du tableau ci-dessous. Lors de la prépara tion du conjugué enzymatique une plaque entière, tout le tampon du Enzyme Préparez le volume d´Enzyme pour Conjugate nécessaire en transférer diluant 11X l´Enzyme Conjugate (1+10) Conjugate BufferConjugate dans le flacon 11X.duMélangez sans agiter.Mélangez A uitlisersans dans la dans l´Enzyme Buffer,duenEnzyme suivantConjugate les indications tableau ci-dessous. journée préparation. agiter. Asuivant utiliserladans la journée suivant la préparation. Nombre de de bandes bandes Nombre Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate Buffer Buffer 4.0 ml 6.0 1mlfiole 7.0 7.0 ml ml 9.0 5.0 ml ml 3.5 ml 1 fiole RÉACTIFS 10 X 96 Chaque kit Mercodia Insulin ELISA (10-1113-10) contient suffisamment de réactifs pour 10 x 96 puits, soit une quantité permettant de traiter 42 échantillons et une courbe d'étalonnage en double sur chaque plaque. Pour des séries de dosages plus importantes, mélangez les réactifs de kits portant des numéros de lot identiques. La date de péremption du kit figure sur l'étiquette apposée à l'extérieur. La température de stockage recommandée est 2 à 8°C. Coated Plate 10 plaque 96 puits Prête à l'emploi (Anticorps monoclonal murin anti-insuline) Bandes de 8 puits S'il reste des puits inutilisés, replacez-les dans leur emballage hermétiquement fermé. Utilisez ces puits sous deux mois. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fioles 1000 µl Prête à l´emploi Conc. indiquée sur létiquette (recombinant human insulin) Code couleur: jaune Calibrator 0 Code couleur: jaune 1 fiole 5 ml Prête à l'emploi Enzyme Conjugate 11X 1 fiole (peroxidase conjugué monoclonal murin anti-insulin) 12 ml A préparer voir ci-dessous Enzyme Conjugate Buffer Code couleur: bleu 1 fiole 120 ml Prêt à l'emploi Wash Buffer 21X 2 flacon 200 ml A préparer Voir ci-dessous Substrate TMB 1 flacon 220 ml Solution incolore. Remarque: Cette solution est sensible à la lumière ! Prêt à l'emploi Stop Solution H2SO4 à 0,5 M Prête à l'emploi 1 flacon 70 ml 23 23 Français Français 4 bandes 12 bandes 6 bandes 8 bandes 8 bandes 610 bandes bandes 4 bandes 12 bandes Enzyme Enzyme Conjugate 11X11X Conjugate 400 µl 6001 µlfiole 700700 µl µl 900500 µl µl 350 µl 1 fiole Préparation Préparation du du conjugué conjugué enzymatique enzymatique Préparez le volume du conjugué enzymatique nécessaire en diluant 11X l’Enzyme Conjugate Préparez le volume d´Enzyme Conjugate nécessaire en diluant 11X l´Enzyme Conjugate (1+10) (1+10) dans l’Enzym Conjugate Buffer, en suivant les indications du tableau ci-dessous. dans l´Enzyme Buffer, dans en suivant les indications tableau ci-dessous. Mélangez sans Mélangez sansConjugate agiter. A uitliser la journée suivant ladupréparation. agiter. A utiliser dans la journée suivant la préparation. Nombresdedebandes/ plaques Nombre plaques Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X 11X Enzyme Conjugate Enzyme Conjugate BufferBuffer bandes 106plaques plaque 5 1plaques plaques 32plaques plaques 23plaques plaques 15plaque 10 plaques 0.5 ml1 fiole 1.0 ml5.0 ml 2.0 ml3.0 ml 3.0 ml2.0 ml 5.0 ml1.0 ml 1 fiole 51ml flacon 10 50 mlml 2030 mlml 3020 mlml 5010 mlml 1 flacon Préparation la solution de lavage Préparation denécessaire Wash Buffer Préparez le volume la solusion de lavage en diluant 21X Wash Buffer dans l’eau Préparez(1+20), le volume nécessaire de solutionduen diluantci-dessous.. 21X le Wash Buffer correctement. dans l'eau distillée distillée en suivant les indications tableau Mélangez (1+20), en suivant les indications du tableau ci-dessous. Mélangez correctement. Nombre de plaques Wash Eau Nombre de plaques/ Wash Buffer Eau redistillée Buffer 21X bandes 21X redistillée bandes 20 ml2 flacones 4008000 ml ml 10 6plaques 5 plaques 1 plaque 35 ml180 ml 7003600 ml ml 32plaques plaques 70 ml110 ml 1 4002200 ml ml 23plaques plaques 110 ml 70 ml 2 2001400 ml ml 15plaque 700 ml plaques 180 ml 35 ml 3 600 ml 10 plaques 1 flacon 8 000 ml Stockage après dilution: à temperature comprise entre 2-8ºC pendant 4 semaines. Stockage après dilution: à température comprise entre 2 et 8 °C pendant 4 semaines. COLLECTE ET MANIPULATION DES SPÉCIMENS Sérum Collectez le sang par ponction veineuse, attendez la coagulation, puis isolez le sérum par centrifugation. Les échantillons peuvent être stockés jusqu'à 24 heures à une température comprise entre 2 et 8°C. Pour les conserver plus longtemps, stockez-les à –20°C. Evitez de les congeler et de les décongeler plusieurs fois. Plasma Collectez le sang par ponction veineuse dans des tubes contenant de l'héparine ou de l'EDTA comme anticoagulant et isolez le plasma. Les échantillons peuvent être stockés jusqu'à 24 heures à une température comprise entre 2 et 8°C. Pour les conserver plus longtemps, stockezles à –20°C. Evitez de les congeler et de les décongeler plusieurs fois. 24 24 Préparation des échantillons En général, les échantillons n'ont pas besoin d'être dilués ; toutefois, ceux dont la concentration Préparation des échantillons est supérieure à 200 mU/l doivent être dilués à 1+9 v/v avec le Calibrator 0. En général, les échantillons n'ont pas besoin d'être dilués ; toutefois, ceux dont la concentration Préparation L'application des de ceéchantillons test à des patients recevant déjà une insulinothérapie se complique par la Préparation des échantillons est supérieure 200 mU/l doivent êtrebesoin diluésd’étre à 1+9dilués; v/v avec le Calibrator 0. la concentration En général, les àéchantillons n’ont pas toutfois, ceux dont Français Français 25 FrançaisFrançais formation d'anticorps anti-insuline, susceptibles d'interférer avec le dosage. EnL'application général, lesáéchantillons n'ont pas besoin dilués ;insulinothérapie toutefois,0.ceux dont la concentration de test àdoivent des patients recevant déjà une se complique par la est supérieure 200cemU/l 1+9 d'être v/v le Calibrator L'hémolyse, l'ictère ou la lipémiedilués n'affectent pasavec le dosage. est supérieure à 200 mU/l doivent être dilués à d'interférer 1+9 v/v avec le Calibrator formation d'anticorps anti-insuline, susceptibles avec le dosage.0. L'application de ceou testlaàlipémie des patients recevant une insulinothérapie se complique par la L'hémolyse, l'ictère n'affectent pasdéjà le dosage. PROCÉDURE DE TEST formation d'anticorps anti-insuline, susceptibles d'interférer avec le dosage. Tous les réactifs et échantillons doivent être mis à température ambiante avant utilisation. PROCÉDURE DE TEST L'hémolyse, l'ictère ou la lipémie n'affectent pas le dosage. Préparez une courbe de Calibrator pour chaque dosage. Tous les réactifs et échantillons doivent être mis à température ambiante avant utilisation. DEde TEST Préparez unelacourbe Calibrator chaque et dosage. 1PROCÉDURE Preparez solution de l'enzymepour conjuguée la solution de lavage. les réactifs et échantillons être mis à température ambiante avant utilisation. 2Tous Preparez un nombre suffisant dedoivent puits de microplaques pour y loger les calibrators et les 1 Preparez la solution de l'enzyme conjuguée et la solution de lavage. Préparez une courbe de Calibrator pour chaque dosage. échantillons en double. 2 Preparez un nombre suffisant de puits de microplaques pour y loger les calibrators et les 3 Pipetez 25 µl de Calibrator et d'échantillons dans les puits appropriés. 1 échantillons Preparez la en solution de l'enzyme conjuguée et la solution de lavage. double. 4 Ajoutez 100 µl la solution de l'enzyme conjuguée dans chaque puits. Preparez suffisant de puits de microplaques pour y loger les calibrators et les 32 Pipetez 25un µl nombre de Calibrator et d'échantillons dans les puits appropriés. 5 Laissez incuber sur un agitateur secoueur de plaques (700-900 rpm) pendant une échantillons 4 Ajoutez 100 µlenladouble. solution de l'enzyme conjuguée dans chaque puits. heure á température ambiante (entre 18 et 25°C). Pipetezincuber 25 µl desur Calibrator et d'échantillons les puits appropriés. 53 Laissez un agitateur secoueur dedans plaques (700-900 rpm) pendant une 6 Rincez Lavez 66 fois µl par puit avec un laveur fois avec avec 700 un dispositif automatique ou: de plaques automatique en utilisant la 4 heure Ajoutez 100 µl la solution deEvitez l'enzyme dans chaque puits. á température ambiante (entrel’étape 18conjuguée et de 25°C). fonction aspiration verticale. trempage dans la procédure lavage. Aspirez le volume de réaction. Ajoutez 350 µl le tampon de lavage dans de chaque puits. Laissez secoueur ou: de plaques (700-900 rpm) pendant une 65 Rincez 6 incuber fois avecsur un un dispositif automatique Ou lavez manuellement :agitateur Aspirez complètement. Répétez l'opération 5 fois. á température ambiante (entre 18 et 25°C). heure Aspirez le volume de réaction. Ajoutez 350 µl le tampon de lavage dans chaque puits. Jetez lelevolume en retournant la plaque évier. Ajoutez 350papier µl Après dernierréactionnel rinçage, retournez la plaque et au-dessus appuyez-lad’un fermement sur du 6 Aspirez Rincez 6complètement. foisdeavec un dispositif automatique Répétez l'opération 5 ou: fois. de solution lavage dans chaque puit. Jetez la solution de lavage, tapez fermement absorbant. Aspirezle ledernier volume depapier réaction. Ajoutez 350 µl le de lavage dans5chaque Après rinçage, retournez la plaque ettampon appuyez-la fermement sur papier plusieurs fois sur un absorbant pour ôter l’excès de liquide. Répétez fois.du puits. 7 Ajoutez 200 µl de Substrate TMB. Aspirezlescomplètement. Répétezpendant l'opération 5 fois. absorbant. Evitez trempages prolongés l’étape de lavage. 8 Laissez incuber pendant 15 minutes à température ambiante (18 et 25°C). Après le200 dernier rinçage, retournez la plaque et appuyez-la fermement sur du papier 7 Ajoutez µl de Substrate TMB. 9 Ajoutez 50 µl de Stop Solution dans chaque puits. absorbant. 8 Laissez incuber pendant 15 minutes à température ambiante (18 et 25°C). Placez la plaque sur un agitateur secoueur pendant environ 5 secondes, afin que le mélange Ajoutez50 200 Substrate 97 Ajoutez µl µl dede Stop SolutionTMB. dans chaque puits. s'effectue bien. 8 Placez Laissezlaincuber 15 minutes à température ambiante (18 et 25°C). plaque pendant sur un agitateur secoueur pendant environ 5 secondes, afin que le mélange 10 Lisez la densité optique à 450 nm et calculez les résultats. 9 s'effectue Ajoutez 50 µl de Stop Solution dans chaque puits. bien. La lecture doit être réalisée sous 30 minutes. Placez plaqueoptique sur un àagitateur environ 5 secondes, afin que le mélange 10 Lisez la la densité 450 nm secoueur et calculezpendant les résultats. s'effectue bien.être réalisée sous 30 minutes. La lecture doit 10 Lisez la densité optique à 450 nm et calculez les résultats. LaPour lecture doitlesêtre réalisée sous du 30 minutes. Note: éviter contaminations CONTRÔLE QUALITÉ INTERNEconjugué avec le substrat, il est recommandé d’utiliser des pipettes différentes. Les contrôles disponibles le commerce, tels que le Mercodia Diabetes antigen control CONTRÔLE QUALITÉdans INTERNE (référence 10-1134-01/10-1164-01), ou les mélanges de sérums internes dont la concentration Les contrôles disponibles dans le commerce, tels que le Mercodia Diabetes antigen control en insuline est faible, moyenne ou élevée, doivent systématiquement être soumis à un dosage, CONTRÔLE QUALITÉ INTERNE (référence 10-1134-01/10-1164-01), ou les mélanges de sérums internes dont la concentration comme des mélanges de concentration inconnue, et les résultats doivent être reportés sur un Lesinsuline contrôles disponibles dansouleélevée, commerce, telssystématiquement que le Mercodia être Diabetes control en est faible, moyenne doivent soumisantigen à un dosage, graphique journalier. C'est une bonne pratique pour un laboratoire d'enregistrer les données sui(référence les mélanges sérums internes la concentration comme des10-1134-01/10-1164-01), mélanges de concentrationouinconnue, et lesderésultats doivent dont être reportés sur un vantes pour chaque dosage: numéro de lot du kit, dates de reconstitution des composants, en insulinejournalier. est faible,C'est moyenne ou élevée, doivent systématiquement être soumis à un dosage, graphique une bonne pratique pour un laboratoire d'enregistrer les données suivaleurs OD du blanc, des calibrators et des contrôles. commepour des chaque mélanges de concentration les résultats doivent être sur un vantes dosage: numéro de inconnue, lot du kit,etdates de reconstitution desreportés composants, graphique C'est une bonne pour un laboratoire d'enregistrer les données suivaleurs OD journalier. du blanc, des calibrators etpratique des contrôles. vantes pour chaque dosage: numéro de lot du kit, dates de reconstitution des composants, valeurs OD du blanc, des calibrators et des contrôles. CALCUL DES RÉSULTATS Calcul par ordinateur Pour calculer la concentration en insuline, réduisez les données d´absorbance des Calibrators, à l'exception du Calibrator 0, comparées à la concentration, en appliquant une équation de régression de la spline cubique. CALCUL DES RÉSULTATS Calcul par ordinateur Calcul manuel Pour calculer la concentration en insuline, réduisez les données d´absorbance des Calibrators, 1.à l'exception Placez les dupoints correspondant aux d'absorbance obtenues pour les deCalibrators, Calibrator 0, comparées à lavaleurs concentration, en appliquant une équation à l'exception du Calibrator régression de la spline cubique. 0, en fonction de la concentration d´insulin sur du papier pour graphiques logarithmiques et tracez la courbe d'étalonnage. manuel 2.Calcul Lisez la concentration des nouveaux échantillons à partir de cette courbe. 1. Placez les points correspondant aux valeurs d'absorbance obtenues pour les Calibrators, à l'exception du Calibrator 0, en fonction de la concentration d´insulin sur du papier pour Exemple de résultats graphiques logarithmiques et tracez la courbe d'étalonnage. Puits Conc. Identité A450à partir de cette courbe.moy. (mU/L) 2. Lisez la concentration des nouveaux échantillons 1 A–B Calibrator 0 de résultats 1Exemple C–D Calibrator 1 * 2* 1Puits E–F Calibrator Conc. Identité 11G–H Calibrator0 3 * A–B Calibrator 21A–B Calibrator1 4* * C–D Calibrator E–F Calibrator 21C–D Calibrator2 5* * G–H Calibrator 21E–F Nouveau31* A–B Calibrator 22G–H Nouveau42* C–D Calibrator 32A–B Nouveau53* 2 E–F 0.070/0.071 0.105/0.106 A4500.202/0.204 0.434/0.470 0.070/0.071 1.348/1.351 0.105/0.106 0.202/0.204 2.451/2.476 0.434/0.470 0.222/0.214 1.348/1.351 0.546/0.538 2.451/2.476 1.941/1.978 Nouveau 1 0.222/0.214 2Conc. G–H indiquéeNouveau 2 0.546/0.538 *Exemple sur létiquette. de courbe d´étalonnage 3 A–B Nouveau 3 1.941/1.978 moy. (mU/L) 11.1 35.6 153 11.1 35.6 153 La courbe présentée est une courbe d´étalonnage type. Ne l'utilisez pas pour déterminer les Exemple courbe d’étalonnage résultats desde dosages réels. Exemple de courbe d´étalonnage La courbe présentée est une courbe d’étalonnage type. Ne l’utilisez pas pour détermine les La courbe présentée est une courbe d´étalonnage type. Ne l'utilisez pas pour déterminer les résultats de dosages réels. résultats des dosages réels. O.D. 450 nm O.D. 450 nm 1,00 1,00 0,10 0,10 0,01 0,01 1 1 10 100 10 100 Insulin (mU/l) Insulin (mU/l) 26 26 1000 1000 FACTEUR DE CONVERSION 1 µg/l = 29 mU/l; 1 mU/l = 6.0 pmol/l LIMITES DE LA PROCÉDURE Comme pour tous les tests de diagnostic, le diagnostic clinique définitif ne doit pas reposer sur les conclusions d'un seul test: il doit être effectué par le médecin après évaluation de tous les résultats cliniques. L'application de ce test à des patients recevant déjà une insulinothérapie se complique par la formation d'anticorps anti-insuline, susceptibles d'interférer avec le dosage. L'hémolyse, l'ictère ou la lipémie n'affectent pas le dosage. VALEURS MOYENNES CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCES Limites de détection La limite de la détection est inférieure à 1 mU/l (deux écarts-type au-dessus du Calibrator 0). Récupération Le dosage en retour donne une valeur comprise entre 94 et 113% (moyenne 104%). Effet crochet Le kit permet d'effectuer des mesures sur des échantillons d'une concentration maximale de 30 000 mU/l sans donner de faux résultats bas. Précision Chaque échantillon a été analysé en 6 exemplaires à six occasions différentes. Echantillon Valeur moyenne mU/l 1 2 3 4 11 36 80 154 Coefficient de variation % pendant % entre % total du dosage le dosage les dosages 3.4 4.0 2.8 3.2 3.6 2.6 2.8 2.9 5.0 4.7 4.0 4.4 27 27 Français Français La déontologie incite chaque laboratoire à établir sa propre gamme de valeurs. Les résultats suivants peuvent servir de guide jusqu'à ce que le laboratoire ait rassemblé suffisamment de données provenant de ses propres sources. Un test de glycémie à jeun sur 137 individus apparemment sains donne une moyenne de 9,2 mU/l, une valeur médiane de 6,9 mU/l et une étendue de 2 mU/l à 25 mU/l (95% des observations, valeurs extrêmes exclues). Spécificité Les réactions croisées ci-dessous ont été identifiées: Peptide <<0,01% Peptide CC 0.01% Proinsuline <<0,01% Proinsuline 0.01% Spécificité Des (31-32) proinsuline proinsulin 0.5% Des <<0,5% Spécificité Les(31,32) réactions croisées ci-dessous ont été identifiées: Split (32-33 )proinsulin 0.5% Split (32,33) proinsuline <<0,01% 0.5% Les réactions croisées ci-dessous ont été identifiées: Peptide C < Des (64,65) (64-65) proinsuline proinsulin 98% Des 98% Peptide C < Proinsuline < 0,01% 0,01% Split (65-66) proinsulin split (65-66) 56% Split (65,66) proinsuline 56% Proinsuline < 0,01% Des (31,32) < 0,5% Insulin lispro proinsuline (Humalog®, Eli Lily) < 0.000003% ® , Eli Lilly) < 0.006% Insulin lispro (Humolog Des < Split(31,32) (32,33) proinsuline < 0,5% 0.5% Insulin aspartproinsuline 3.2% Insulin aspartproinsuline < 0.006% Split (32,33) proinsuline 0.5% IGF-I <<0.02% Des (64,65) 98% Rat 0.7% Des (64,65) 98% IGF-II < 0.02% SplitInsulin (65,66)proinsuline proinsuline 56% Insuline du ratproinsuline 0.7% Split (65,66) 56% < 0.006% Insulin lispro (Humolog®, Eli Lilly) ® ETALONNAGE Insuline du souris 0.3% < Insulin Insulin lispro aspart(Humolog , Eli Lilly) < 0.006% 0.006% Insuline du porcine 374% Le kit spécial Mercodia Insulin ELISA est étalonné à l'aide du réactif de 1st International Insulin aspart < 0.006% Rat Insulin 0.7% Insulin du mouton 48% Reference Rat InsulinPreparation 66/304. 0.7% Insulin du boeuf 31% ETALONNAGE GARANTIE ETALONNAGE Le kit spécial Mercodia Insulin ELISA est étalonné à l'aide du réactif de 1st International Les données deMercodia performances présentées ce document été obtenues de tests Le kit spécial Insulin ELISA estdans étalonné à l'aide ont du réactif de 1st lors International Reference Preparation 66/304. respectant la procédure66/304. indiquée. Tout changement ou modification dans la procédure, non Reference Preparation recommandé par Mercodia AB, est susceptible d'affecter les résultats. Si la procédure n'est pas GARANTIE respectée, Mercodia AB décline toute responsabilité exprimées, légales GARANTIE Les données de performances présentées dans ceconcernant document les ontgaranties été obtenues lors de tests ou implicites, compris la indiquée. garantie implicite relative la marchande etlaàprocédure, lalors conformité Les donnéeslayde performances présentées dans ce àdocument ont été dans obtenues de tests respectant procédure Tout changement ouqualité modification non d'usage de ce kit. respectant la par procédure indiquée. changement ou les modification la procédure, recommandé Mercodia AB, est Tout susceptible d'affecter résultats. Sidans la procédure n'est non pas MercodiaMercodia ABpar et Mercodia sesAB distributeurs agréés ne sauront êtrelestenus pour passibles de dommages recommandé AB, est susceptible d'affecter résultats. Si la procédure n'est pas respectée, décline toute responsabilité concernant les garanties exprimées, légales indirects ouMercodia immatériels procédure décriterelative n'est pas respectée, AB sidécline touteimplicite responsabilité concernant garanties exprimées, légales ou implicites, y compris lalagarantie à larespectée. qualitélesmarchande et à la conformité ou implicites, compris la garantie implicite relative à la qualité marchande et à la conformité d'usage de ceykit. d'usage de ceABkit.et ses distributeurs agréés ne sauront être tenus pour passibles de dommages Mercodia Mercodia AB et ses distributeurs agréés ne sauront être tenus pour passibles de dommages indirects ou immatériels si la procédure décrite n'est pas respectée. indirects ou immatériels si la procédure décrite n'est pas respectée. RÉFÉRENCES Gaines-Das, R.E. and Bristow, A.F.(1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16:179-186 Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054 Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B. (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019 Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF. (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-2365 Sjostrand M, Gudbjornsdottir S, Holmang A, Lonn L, Strindberg L, Lonnroth P. (2002) Delayed transcapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects. Diabetes 51:2742-2748 28 28 28 UTILIZACIÓN PREVISTA Mercodia Insulin ELISA es un método para la determinación cuantitativa de insulina humana en suero o plasma. RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO Mercodia Insulin ELISA es un inmunoensayo de fase sólida de dos puntos. Se basa en la técnica de sandwich directo según la que dos anticuerpos monoclonales se dirigen contra determinantes antigénicos separados de la molécula de insulina. Durante la incubación, la insulina de la muestra reacciona con los anticuerpos anti-insulina conjugados en peroxidasa y anticuerpos anti-insulina ligados con pocillo de microtitración. El anticuerpo marcado con enzima no unido se elimina con un simple lavado. El Enzyme Conjugate unido se detecta por reacción con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). La reacción se para añadiendo ácido para dar un punto final colorimétrico que se lee por espectrofotometría. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES • Para uso diagnóstico in vitro. • El contenido de este kit y sus residuos no deben dejarse entrar en contacto con animales rumiantes o cerdos. • Stop Solution de este kit contiene H2SO4 0,5 M. Seguir las precauciones rutinarias para el manejo de productos químicos peligrosos. • Las muestras de los pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infecciones. 29 29 Espanol ˜ Español La insulina es la principal hormona encargada del control del metabolismo de la glucosa. Es sintetizada por las células ß de los islotes de Langerhans como el precursor proinsulina que se procesa para formar péptido C e insulina. Ambos se secretan en cantidades equimolares a la circulación portal. La molécula de insulina madura consta de dos cadenas polipeptídicas, la cadena A y la cadena B (21 y 30 aminoácidos, respectivamente). Las dos cadenas están unidas por dos puentes disulfuro intercatenarios. En la cadena A también hay un puente disulfuro intracatenario. La secreción de insulina se controla principalmente mediante la concentración plasmática de glucosa, y la hormona tiene diversas e importantes acciones metabólicas. Su función principal es controlar la captación y utilización de glucosa en los tejidos periféricos por medio de la glucosa. Esta y otras acciones hipoglucémicas, como la inhibición de la neoglucogenesis y la glucogenolisis hepática, están contrarrestadas por las hormonas hiperglucémicas, como glucagon, adrenalina, hormona del crecimiento y cortisol. Las concentraciones de insulina están reducidas de forma importante en la diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) y en otras patologías como el hipopituitarismo. Los niveles de insulina están aumentados en la diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID), obesidad, insulinoma y algunas disfunciones endocrinas como el síndrome de Cushing y la acromegalia. MATERIAL REQUERIDO REQUERIDO PERO PERO NO NO SUMINISTRADO SUMINISTRADO MATERIAL Pipetasde de25, 25,50, 50,100, 100,200 200yy1000 1000µlµl(para (paralalaadición adiciónde delaladisolución disoluciónconjugado conjugadoenzimático enzimático,, •• Pipetas SubstrateTMB TMByyStop StopSolution Solutionse seprefieren prefierenlas laspipetas pipetasde derepetición) repetición) Substrate Cubetasyyprobetas probetaspara parapreparar prepararlos losreactivos reactivos •• Cubetas Aguabidestilada bidestilada •• Agua Lectorde demicroplacas microplacas(filtro (filtrode de450 450nm) nm) •• Lector Agitadorde deplacas placas(La (Lavelocidad velocidadrecommendable recommendablees esde de700-900 700-900vueltas vueltaspor porminuto, minuto, •• Agitador Lavadorde demicroplacas microplacas movimiento orbital) •• Lavador REACTIVOS 11 XX 96 96 REACTIVOS Cadakit kitde deMercodia MercodiaInsulin InsulinELISA ELISA(10-1113-01) (10-1113-01)contiene contienereactivos reactivospara para96 96pocillos, pocillos,suficiensuficienCada tes para para 42 42 muestra muestra yy una una curva curva de de calibración calibración por por duplicado. duplicado. Para Para series series de de ensayos ensayos más más tes amplias,mezclar mezclarreactivos reactivosde depaquetes paquetesde denúmero númerode delote loteidéntico. idéntico.La Lafecha fechade decaducidad caducidaddel del amplias, kit completo completo está está en en elel exterior exterior identificada identificada en en una una etiqueta. etiqueta.La La temperatura temperatura de de conservación conservación kit recomendadaes es2–8 2–8ºC. ºC. recomendada Coatedplate plate placa 96pocillos pocillos Listopara parausar usar Coated 11placa 96 Listo (anticuerpomonoclonal monoclonal tirasde depocillos pocillos (anticuerpo 88tiras deratón ratónanti-insulina) anti-insulina) de Paralos lospocillos pocillosde demicroplacas microplacasno noutilizados utilizadosvolver volveraasellar sellarlalabolsa bolsayyutilizarlos utilizarlosen enlos losdos dosmeses meses Para siguientes. siguientes. Calibrators1, 1,2, 2,3, 3,4, 4,55 viales 1000µlµl Calibrators 55viales 1000 Concentraciónindicada indicadaen enlalaetiqueta etiquetadel delvial vial Concentración (recombinanthuman humaninsulin) insulin) Codificado Codificadoen enamarillo amarillo (recombinant Listopara parausar usar Listo Calibrator00 Calibrator Codificadoen enamarillo amarillo Codificado ml 55ml Listopara parausar usar Listo EnzymeConjugate Conjugate11X 11X vial Enzyme 11vial (Monoclonalde deratón ratónEnzyme EnzymeConjugate Conjugate (Monoclonal conperoxidasa peroxidasaanti-insulina) anti-insulina) con 1,2ml ml 1,2 Preparación, Preparación, véaseaacontinuación. continuación. véase EnzymeConjugate ConjugateBuffer Buffer 11vial vial Enzyme Codificadoen enazul azul Codificado 12ml ml 12 Listopara parausar usar Listo vial 11vial WashBuffer Buffer21X 21X botella 50ml ml Wash 11botella 50 Diluircon con1000 1000ml mlde deagua aguabidestilada bidestiladapara parahacer hacerde desolución soluciónde delavado. lavado. Diluir Conservacióndespués despuésde delaladilución: dilución:2–8 2–8°C °Cdurante durante44semanas. semanas. Conservación SubstrateTMB TMB vial 22ml ml Substrate 11vial 22 Soluciónincolora. incolora. Atención Atención Essensible sensibleaalalaluz luz!! Solución .. Es Listopara parausar usar Listo StopSolution Solution Stop 0,5MMHH22SO SO44 0,5 Listopara parausar usar Listo 30 30 30 vial 11vial ml 77ml Preparación de la disolutión conjugado enzimático Preparar el volumen necessario disolución de conjugado enzimático por dilución del Enzyme Preparación de laendisolución conjugado enzimático Conjugate 11X (1+10) Enzyme Conjugate Buffer según la siguiente tabla. Si se usa toda la placa, verter completamente Conjugate Buffer al vial Enzyme Conjugate 11X. Preparar el volumen necesarioeldetampón EnzymeEmzyme Conjugate por dilución del Enzyme Conjugate 11 X (1+10) Mezclar suavemente. en unladia. en Enzyme Conjugate Utilizar Buffer según siguiente tabla. Mezclar suavemente. Utilizar en un día. Número Númerodedetiras tiras Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate 11X 4 tiras 126tiras tiras 88tiras tiras 6 tiras 10 tiras 4 tiras 12 tiras 400 µl 600 µl 700 µl 900 µl 1 vial 1 vial 700 µl 500 µl 350 µl Enzyme Conjugate Enzyme Conjugate Buffer Buffer 4.0 ml vial 6.01 ml 7.07.0 mlml 9.05.0 mlml 3.5 ml 1 vial REACTIVOS 10 X 96 Coated plate 10 placa 96 pocillos Listo para usar (anticuerpo monoclonal de ratón anti-insulina) 8 tiras de pocillos Para los pocillos de microplacas no utilizados volver a sellar la bolsa y utilizarlos en los dos meses siguientes. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 viales 1000 µl Listo para usar Conc. indicada en la etiqueta del vial (recombinant human insulin) Codificado en amarillo Calibrator 0 Codificado en amarillo 1 vial 5 ml Listo para usar Enzyme Conjugate 11X 1 vial (Monoclonal de ratón Enzyme Conjugate con peroxidasa anti-insulina) 12 ml Preparación, véase a continuación. Enzyme Conjugate Buffer Codificado en azul 1 botella 120 ml Listo para usar Wash Buffer 21X 2 botella 200 ml Preparación, véase a continuación Substrate TMB 1 vial Solución incolora. Atención Es sensible a la luz ! 220 ml Listo para usar Stop Solution 0,5 M H2SO4 70 ml Listo para usar 1 vial 31 31 Espanol Español ˜ Cada kit de Mercodia Insulin ELISA (10-1113-10) contiene reactivos para 10x96 pocillos, suficientes para 42 muestra y una curva de calibración por duplicado. Para series de ensayos más amplias, mezclar reactivos de paquetes de número de lote idéntico. La fecha de caducidad del kit completo está en el exterior identificada en una etiqueta. La temperatura de conservación recomendada es 2–8 ºC. Preparación de la disolución conjugado enzimático Preparación denecessario la disolución conjugado enzimático Preparar el volumen disolución conjugado enzimático por dilución del Enzyme Conjugate 11X (1+10) necesario en EnzymedeConjugate Buffer según siguiente Mezclar suave 11X Preparar el volumen Enzyme Conjugate porladilución deltabla. Enzyme Conjugate mente. en unConjugate dia. (1+10)Utilizar en Enzyme Buffer o según la siguiente tabla. Mezclar suavemente. Utilizar en un día. Número de placas Enzyme Enzyme Conjugate Número de tiras Enzyme Conjugate Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 11X Buffer 10 placas 1 vial 1 botella 6 tiras 0.5 ml 5 ml 5 placas 5.0 ml 50 ml 1 placa 1.0 ml 10 ml 3 placas 3.0 ml 30 ml 2 placas 2.0 ml 20 ml 2 placas 2.0 ml 20 ml 3 placas 3.0 ml 30 ml 1 placa 1.0 ml 10 ml 5 placas 5.0 ml 50 ml 10 placas 1 vial 1 botella Preparation de solución de lavado Preparación delnecessario Wash Buffer Preparar el volumen solusión de lavado diluyendo el Wash Buffer 21X en agua bidestilada según la siguiente tabla. Mezclar adecuadamente. Preparar el(1+20) volumen necesario de Wash Buffer diluyendo el Wash Buffer 21X en agua bidestilada (1+20) según la siguiente tabla. Mezclar adecuadamente. Nombre de placas Wash Agua Número de placas/ Buffer 21X Wash Buffer 21XbidestiladaAgua tiras bidestilada 10 placas 2 botellas 20 ml 8000 ml 6 tiras 400 ml 5 placas 180 ml 35 ml 3600 ml 1 placa 700 ml 3 placas 110 ml 70 ml 2200 ml 1.400 ml 2 placas 2 placas 70 ml 110 ml 1400 ml 2.200 ml 3 placas 1 placa 35 ml 180 ml 700 ml 3.600 ml 5 placas 10 placas 1 botella 8.000 ml Conservación después de la dilución: 2–8°C durante 4 semanas. OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE MUESTRAS Suero Recoger la sangre por venipunción, dejar coagular y separar el suero por centrifugación. Las muestras pueden conservarse a 2–8°C hasta 24 horas. Para periodos más largos, conservar las muestras a –20°C. Evitar la congelación y descongelación de forma repetida. Plasma Recoger la sangre por venipunción en tubos que contienen heparina o EDTA como anticoagulante y separar la fracción de plasma. Las muestras pueden conservarse a 2–8°C hasta 24 horas. Para periodos más largos, conservar las muestras a –20°C. Evitar la congelación y descongelación de forma repetida. 32 32 Preparación de de las las muestras muestras Preparación Normalmente no no es es necesario necesario diluirlas; diluirlas; sin sin embargo, embargo, las las muestras muestras que que contienen contienen >200 >200 mU/l mU/l Normalmente Preparación de las muestras deben diluirse diluirse 1+9 1+9 v/v con Calibrator 0. 0. deben Calibrator Preparación dev/v lascon muestras Normalmente no realizar es necesario diluirlas; sin embargo,que lasestán muestras que contienen >200 mU/l Es complicado complicado realizar estadiluirlas; prueba en individuos están sometidos insulinoterapia, por Es esta prueba en sometidos aa insulinoterapia, Normalmente no es necesario sinindividuos embargo,que las muestras que contienen >200 mU/lpor deben diluirse 1+9 v/v con Calibrator 0. que formación de anticuerpos anti-insulina que pueden pueden interferir interferir en en elel ensayo. ensayo. lala formación de anticuerpos anti-insulina deben diluirse 1+9 v/v Calibrator 0. Es complicado realizar esta prueba en individuos están sometidos a insulinoterapia, por Las muestras lipémicas, lipémicas, ictéricas hemolizadas noque interfieren en elel ensayo. ensayo. Las muestras ictéricas oo hemolizadas no interfieren en la formación de anticuerpos anti-insulina que pueden interferir en el ensayo. Las muestras lipémicas, o hemolizadas no interfieren en el ensayo. PROCEDIMIENTO DE ictéricas EVALUACIÓN PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓN Aviso: Usar pipetas distintas para prevenir contaminación entre conjugado y substrato. CONTROL DE DE CALIDAD CALIDAD INTERNA INTERNA CONTROL Loscontroles controlescomerciales comercialescomo comoMercodia MercodiaDiabetes Diabetesantigen antigencontrol control(N.º (N.ºde decódigo: código:10-1164-01) 10-1164-01) Los CONTROL DE CALIDAD INTERNA y/o mezclas mezclas de de sueros sueros internas internas con con concentraciones concentraciones de de insulina insulina bajas, bajas, medias medias yy altas, altas, se se anaanay/o Los controles comerciales como Diabetes antigen control (N.º de 10-1164-01) lizarán de forma forma rutinaria como como Mercodia muestras desconocidas desconocidas los resultados secódigo: representarán día aa lizarán de rutinaria muestras yy los resultados se representarán día y/o Es mezclas de sueros internas con concentraciones insulinadatos bajas,en medias y altas,número se anadía. Es una una buena buena práctica de laboratorio laboratorio registrar los losde siguientes datos en cada ensayo: ensayo: número día. práctica de registrar siguientes cada lizarán de rutinaria como muestrasde y los del resultados se representarán día a de lote del delforma kit; fechas fechas de reconstitución reconstitución dedesconocidas los componentes componentes del kit, kit, valores valores de DO DO de de blanco, blanco, de lote kit; de los de día. Es unayybuena práctica de laboratorio registrar los siguientes datos en cada ensayo: número Calibrators controles. Calibrators controles. de lote del kit; fechas de reconstitución de los componentes del kit, valores de DO de blanco, Calibrators y controles. 33 Español Espanol Espanol ˜ ˜ Todos los los reactivos reactivos yy muestras muestras deben deben estar estar aa temperatura temperatura ambiente ambiente antes antes de de su su uso. uso. Preparar Preparar Todos PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓN una curva curva de de calibración calibración para para cada cada ensayo. ensayo. una Todos los reactivos y muestras deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. Preparar 1. Preparar disolución depara conjugado enzimático yy de de solución solución de de lavado. lavado. 1. de conjugado enzimático unaPreparar curva dedisolución calibración cada ensayo. 2. Preparar Preparar suficientes suficientes pocillos pocillos de de microplaca microplaca para para los los Calibrators Calibrators yy muestras muestras por por duplicado. duplicado. 2. 1. Pipetear Preparar25 disolución de Calibrator conjugado de pocillos solución de lavado. 3. Pipetear 25 de cada cada Calibrator yyenzimático muestra en eny los los pocillos correspondientes. correspondientes. 3. µlµl de muestra 2. Preparar suficientes pocillos de microplaca para los Calibrators y muestras por duplicado. 4. Añadir Añadir 100 100 µlµl disolución disolución de de conjugado conjugado enzimático enzimático aa cada cada pocillo. pocillo. 4. 3. Incubar Pipetearen 25un µlagitador de cada de Calibrator y muestrarpm) en los pocillos correspondientes. 5. Incubar en un agitador de placas placas (700-900 (700-900 rpm) durante hora aa temperatura temperatura 5. durante 11 hora 4. ambiente Añadir 100 µl disolución de conjugado enzimático a cada pocillo. ambiente (18-25°C). (18-25°C). 5. Lavar Incubar en uncon agitador de placas (700-900 rpm) durante 1 hora a temperatura 6.6. 666veces 700 µl/pocillo mediante Lavador de placas automático con función de Lavar veces con un lavador lavador automático o: Lavar veces con un automático o: ambiente sobre-flujo de lavado.de Noreacción. usar el paso de remojo el proceso. Aspirar volumen de reacción. Añadir 350 µlµldurante de tampon tampon de lavado lavado aa cada cada pocillo. pocillo. Aspirar elel(18-25°C). volumen Añadir 350 de de 6. O Lavar 6completamente. veces con un lavador automático manualmente: Aspirar completamente. Repetir veces. o: Aspirar Repetir 55 veces. Aspirar el de reacción. µlpila. deAñadir tampon aabsorbente. cada Verter el líquido invirtiendo la microplaca en350 una 350deen µl de solución de pocillo. Después delvolumen último lavado, invertir y golpear golpear firmemente placa enlavado papel Después del último lavado, invertir yAñadir firmemente lala placa papel absorbente. Aspirar200 completamente. Repetir veces.contra papel absorbente para eliminar todo el golpeando firmemente la5placa 7. lavado, Añadir 200 de Substrate Substrate TMB. 7. Añadir µlµl de TMB. líquido endel exceso. Repetir 5 veces. Evitar remojo prolongado durante proceso. Después último lavado, y golpear firmemente la placa en el papel absorbente. 8. Incubar Incubar durante 15 minutos minutosinvertir temperatura ambiente (18–25°C). 8. durante 15 aa temperatura ambiente (18–25°C). 7. Añadir 200 µl de Substrate TMB. 9. Añadir 50 µl de Stop Solution a cada pocillo. 9. Añadir 50 µl de Stop Solution a cada pocillo. 8. Colocar Incubar la durante a temperatura ambiente (18–25°C). Colocar la placa placa15 enminutos un agitador agitador durante aproximadamente aproximadamente segundos para para en un durante 55 segundos 9. aseguar Añadir 50 µl de Stop Solution a cada pocillo. aseguar mezclado. elel mezclado. Colocar la placa en un agitador durante aproximadamente 5 segundos para 10. Leer Leer lala densidad densidad óptica óptica aa 450 450 nm nm yy calcular calcular los los resultados. resultados. 10. aseguar el mezclado. Leer en 30 minutos. Leer en 30 minutos. 10. Leer la densidad óptica a 450 nm y calcular los resultados. Leer en 30 minutos. CÁLCULO DE RESULTADOS CÁLCULO DE RESULTADOS Cálculo computarizado Cálculo computarizado Para obtener la concentración de insulina puede realizarse la reducción de datos computarizados obtener para la concentración de insulina puede0,realizarse reducción de datos computarizados de la Para absorbancia los Calibrators, sin Calibrator frente a lalaconcentración utilizando una de laspline absorbancia regresión cúbica. para los Calibrators, sin Calibrator 0, frente a la concentración utilizando una regresión spline cúbica. Cálculo manual Cálculo manual 1. Representar gráficamente los valores de absorbancia obtenidos para los Calibrators, Representar gráficamente los valores de absorbancia obtenidos para los sin1.Calibrator 0, frente a la concentración de insulina en papel log-log y construir una Calibrators, curva sin Calibrator 0, frente a la concentración de insulina en papel log-log y construir una curva de calibración. calibración. de las muestras desconocidas a partir de la curva de calibración. 2. Leer ladeconcentración 2. Leer la concentración de las muestras desconocidas a partir de la curva de calibración. Ejemplo de resultados Ejemplo de resultados Pocillos Identidad Identidad 1 A–BPocillos Calibrator 0 Calibrator 1 C–D1 A–B Calibrator 1* 0 Calibrator 2* 1* 1 E–F1 C–D Calibrator Calibrator 1 G–H1 E–F Calibrator 3* 2* Calibrator 4* 3* 2 A–B1 G–H Calibrator Calibrator 2 C–D2 A–B Calibrator 5* 4* Calibrator 2 E–F2 C–D Desconocida 1 5* Desconocida 1 2 G–H2 E–F Desconocida 2 Desconocida 2 3 A–B2 G–H Desconocida 3 3 A–B Desconocida 3 * Concentración indicada la etiqueta del vial. Ejemplo de curva deencalibración A450 A450 0.070/0.071 0.070/0.071 1.105/0.106 1.105/0.106 0.202/0.204 0.202/0.204 0.434/0.470 0.434/0.470 1.348/1.351 1.348/1.351 2.451/2.476 2.451/2.476 0.222/0.214 0.222/0.214 0.546/0.538 0.546/0.538 1.941/1.978 1.941/1.978 Conc. media mU/l Conc. media mU/l 11.1 35.6 11.1 153 35.6 153 Ejemplo calibración Aquí se presentade unacurva curva de de calibración típica. Esta curva no debe utilizarse para verificar Ejemplo de curva de calibración Aquí de se un presenta resultados ensayo.una curva de calibración típica. Esta curva no debe utilizarse para verificar Aqui se presenta una curva de calibración típica. Esta curva no debe utilizarse para verificar resultados de un ensayo. resultados de un ensayo. 1,00 O.D. 450 nm O.D. 450 nm 1,00 0,10 0,10 0,01 1 10 0,01 1 100 10 34 34 Insulin (mU/l) 34 1000 100 Insulin (mU/l) 1000 FACTOR DE CONVERSIÓN 1 µg/l = 29 mU/l; 1 mU/l = 6.0 pmol/l LÍMITES DEL PROCEDIMIENTO Igual que todas las pruebas diagnósticas, un diagnóstico clínico definitivo no debe estar basado únicamente en los resultados de una sola prueba, sino que el médico debe hacerlo sólo después de haber evaluado todos los datos clínicos. Es complicado realizar esta prueba en individuos que están sometidos a insulinoterapia, por la formación de anticuerpos anti-insulina que pueden interferir en el ensayo. Las muestras lipémicas, ictéricas o hemolizadas no interfieren en el ensayo. VALORES ESPERADOS Una buena práctica de laboratorio dicta que cada laboratorio establezca su propio rango de valores. Los siguientes resultados pueden servir de guía hasta que el laboratorio haya reunido suficientes datos por su cuenta. Los niveles en ayunas de 137 individuos estudiados, aparentemente sanos, dieron una media de 9,2 mU/l, una mediana de 6,9 mU/l y un rango – correspondiente al 95% central de las observaciones – de 2–25 mU/l. El límite de detección es 1 mU/l calculado como dos desviaciones estándar por encima del Calibrator 0. Recuperación La recuperación a la adición es del 94%–113% (media 104%). Efecto gancho Las muestras con una concentración superior a 30.000 mU/l pueden medirse sin obtener resultados falsamente bajos. Precisión: Cada muestra se analizó en 6 replicados en seis ocasiones diferentes. Muestra Valor medio mU/l 1 2 3 4 11 36 80 154 Coeficiente de variación intraintertotal ensayo % ensayo % ensayo % 3.4 4.0 2.8 3.2 3.6 2.6 2.8 2.9 5.0 4.7 4.0 4.4 35 35 Espanol ˜ Español CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO Límite de detección Especificidad Se han hallado las siguientes reacciones cruzadas: Péptido C < 0,01%< 0.01% Proinsulina < 0,01%< 0.01% Especificidad Proinsulina des (31–32) (31-32) Especificidad Proinsulina des 0,5%< 0.5% Se han hallado las siguientes reacciones <cruzadas: Proinsulina splitlas (32-33) Se han hallado siguientes reacciones cruzadas: Proinsulina split (32–33) < 0.5%< 0.5% Péptido C des (64-65) < 0,01% Proinsulina 98% Péptido C < 0,01% Proinsulina des (64–65) 98% Proinsulina split (65-66) < 0,01% Proinsulina 56% Proinsulina < 0,01% Proinsulina split (65–66) Eli Lily) 56% Proinsulina des(Humalog®, (31–32) <<0,5% Insulina lispro 0.000003% ® Proinsulina des (31–32) < < 0.006% Insulin lispro (Humalog Proinsulina split (32–33), Eli Lilly) < 0,5% 0.5%< 3.2% Insulina aspart Proinsulina split (32–33) < 0.5% Insulin aspart < 0.006% IGF-I < 0.02% Proinsulina des (64–65) 98% Proinsulina 98% IGF-II < 0.02% Rat Insulin des 0.7% Proinsulina split(64–65) (65–66) 56% Insulina de rata ® Proinsulina split (65–66) 56% 0.7% , Eli Lilly) < 0.006% Insulin lispro (Humalog Insulina de ratón < 0.006% 0.006% 0.3% Insulin aspart lispro (Humalog®, Eli Lilly) CALIBRACIÓN Insulin < Insulina porcino 374% Insulin aspart < 0.006% El Mercodia Insulin ELISA se calibra contra el0.7% reactivo de 1st International Reference Preparation Rat Insulin Insulina de oveja 48% Rat Insulin 0.7% 66/304. Insulina bovino 31% CALIBRACIÓN CALIBRACIÓN GARANTÍA El Mercodia Insulin ELISA se calibra contra el reactivo de 1st International Reference Preparation El Mercodia ELISA sepresentados calibra contra el reactivo de 1st usando International Reference Preparation Los datos deInsulin rendimiento aquí se obtuvieron el procedimiento indicado. 66/304. 66/304. cambio o modificación en el procedimiento, no recomendado por Mercodia AB, puede Cualquier afectar los resultados, en cuyo caso Mercodia AB declina cualquier responsabilidad y garantía GARANTÍA GARANTÍA acordada, o explícita, incluso la aquí garantía implícita sobre la comerciabilidad e idoneidad Los datos implícita de rendimiento presentados se obtuvieron usando el procedimiento indicado. Los datos de rendimiento presentados aquí se obtuvieron usando el procedimiento indicado. para su uso. Cualquier cambio o modificación en el procedimiento, no recomendado por Mercodia AB, puede Cualquier cambio o modificación en el procedimiento, no recomendado por Mercodia AB, puede Mercodia AB y sus distribuidores endeclina tal caso,cualquier no asumirán responsabilidades por afectar los resultados, en cuyo casoautorizados, Mercodia AB responsabilidad y garantía afectary los resultados, en cuyo caso Mercodia ABimplícita declina cualquier responsabilidade yidoneidad garantía daños perjuicios indirectos o consiguientes. acordada, implícita o explícita, incluso la garantía sobre la comerciabilidad acordada, implícita o explícita, incluso la garantía implícita sobre la comerciabilidad e idoneidad para su uso. para su uso. AB y sus distribuidores autorizados, en tal caso, no asumirán responsabilidades por Mercodia Mercodia AB y sus distribuidores autorizados, en tal caso, no asumirán responsabilidades por daños y perjuicios indirectos o consiguientes. daños y perjuicios indirectos o consiguientes. REFERENCIAS Gaines-Das, R.E. and Bristow, A.F. (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16:179-186 Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054 Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B. (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019 Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF. (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-2365 Sjostrand M, Gudbjornsdottir S, Holmang A, Lonn L, Strindberg L, Lonnroth P. (2002) Delayed transcapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects. Diabetes 51:2742-2748 36 36 36 USO PROPOSTO Mercodia Insulin ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa dell’insulina umana nel siero o nel plasma. RELAZIONE E SPIEGAZIONE DEL TEST L'insulina è il principale ormone responsabile del controllo di glucosio nel metabolismo. E’ sintetizzata nelle cellule delle isolette di Langerhans come il precursore, proinsulina, che è elaborato per formare la peptide C e l’insulina. Entrambi sono secreti in una somma equimolare nel portale della circolazione. La molecola matura dell’insulina comprende due catene di polipeptide, la catena A e la catena B (rispettivamente 21 e 30). Le due catene sono legate insieme da due ponti concatenati disulfidici. C’è anche un ponte disulfidico intercatenato nella catena A. La secrezione dell’insulina è principalmente controllata dalla concentrazione di glucosio nel plasma, e l’ormone ha un significante numero di azioni metaboliche. La sua funzione principale è di controllare il condotto e l’utilizzazione del glucosio nei tessuti periferici tramite il vettore di glucosio. Questa e le altre attività ipoglicemiche, per esempio l’inibizione di glicogenesi e glicogenolisi sono mitigate dagli ormoni iperglicemici inclusi il glucagone, l’epinefrina (adrenalina), la crescita degli ormoni e cortisolo. Le concentrazioni di insulina sono ridotte drasticamente nei pazienti di diabete melito insulina dipendenti (IDDM) e in altre condizioni come l'ipopituitarismo. I livelli di insulina sono aumentati nei pazienti di diabete melito non insulina dipendenti (NIDDM), di obesità, insulinoma e alcune disfunzioni endocrine come la sindrome di Cushing e l'acromegalia. PRINCIPIO DI PROCEDURA PREACAUZIONI E AVVISI • Per l’uso diagnostico in vitro • I contenuti di questo kit e i suoi residui non devono essere ammessi al contatto con animali ruminanti o suini. • La Stop Solution in questo kit contiene 0.5 M H2SO4. Seguire le precauzioni quotidiane di routine per maneggiare sostanze chimiche pericolose. • Tutti i pazienti presi come campione potrebbero essere trattati come capaci di trasmettere infezioni. 37 Italiano Italiano Mercodia Insulin ELISA, è una fase concreta dell’immunoanalisi enzima due-sito.E’ basata sulla tecnica diretta sandwich nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro determinanti antigenici separati sulla molecola insulina. Durante l’incubazione la insulina presente nel campione reagisce con gli anticorpi antiiinsulina coniugati a perossidasi e gli anticorpi anti-insulina legati al pozetto per microtitolazione. Un leggero lavaggio rimuovi indirettamente l’anticorpo Enzyme marcato. Il Conjugate diretto è scoperto dalla reazione con 3,3’,5,5’ – tetrametibenzidine (TMB). La reazione è fermata aggiungendo acido per dare una posizione estrema colorimetrica che è letta spettrometricamente. MATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI • Pipette for 25, 50, 100, 200, e 1000 µl (riutilizza le pipette in dotazione per l’aggiunta della soluzione enzima coniugato, Substrate TMB e Stop Solution). • Beakers e cilindri per la preparazione di reagenti • Acqua ridistillata • Lettore micro piastra (450nm filtro) • Piastra dello shaker (La velocità raccomandata é di 700-900 giri/minuto, movimento orbitale) • Micro piastra piano di lavaggio REAGENTI 1 X 96 Ogni kit Mercodia Insulin ELISA (10-1113-01) contiene reagenti per 96 prove, sufficienti per 42 campioni e una calibratura curva in duplicato. Per diverse serie di analisi, usare reagenti provenienti da scatole portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è stabilita sull’etichetta all’esterno. Si raccomanda di conservare ad una temperatura di 2–8° C. Coated plate 1 piastra 96 pozzetti Pronti per l’uso (Topo monoclonale anti insulina) 8 strips per pozzetti I pozzetti delle micro piastre inutilizzati, devono essere risigillati e adoperati entro due mesi. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fiale Concentrazione indicata sull'etichetta della fiala (recombinant human insulin) Giallo colore codificato 1000 µl Pronto all´uso Calibrator 0 Giallo colore codificato 1 fiala 5 ml Pronto all’uso Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 1.2 ml Per la preparazione vedi sotto: 12 ml Pronto all´uso (Peroxidase Conjugate topo monoclonale Anti insulina) Enzyme Conjugate Buffer Blu colore codificato 1 fiala Wash Buffer 21 X 1 bottiglia 50 ml Diluire con 1000 ml d’acqua ridistillata per fare di soluzione di lavaggio. Conservare dopo la diluizione: 2–8° C per 4 settimane. Substrate TMB Soluzione incolore Nota! Sensibile alla luce! 1 fiala 22 ml Pronto all’uso Stop Solution 0.5 M H2SO4 1 fiala 7 ml Pronto all’uso 38 Preparazione della soluzione enzima coniugato Preparare la quantitá necessaria della soluzione coniugato con la diluizione dell’Enzyme Preparazione della soluzione enzimaenzima coniugato Conjugate 11X (1+10)necessaria nel Enzyme ConjugateConjugate Buffer in base alladiluizione tabella sottostante. Preparare la quantità dell’Enzyme con la dell’EnzymeQuando Conjugate si11prepara la soluzione enzimaConjugate coniugatoBuffer per tutta la base piastra, versare tutto il tamponeMescolare Enzyme X, (1+10) nel Enzyme o in alla tabella sottostante. Conjugate Buffer nella fiala dell’Enzyme Conjugate 11X. Mescolare lievemente. Usare entro un lievemente. Usare entro un giorno. giorno. Numero di strisce Enzyme Enzyme Conjugate Numero di strisce Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer Conjugate 11X Buffer 4 strisce 400 µl 4.0 ml strisce 6.0 ml 126strisce 1 fiala 600 µl 1 fiala strisce 7.0 ml 88strisce 700 µl 700 µl 7.0 ml strisce 9.0 ml 610strisce 500 µl 900 µl 5.0 ml 412strisce 350 µl 1 fiala 3.5 ml strisce 1 fiala REAGENTI 10 X 96 Ogni kit Mercodia Insulin ELISA (10-1113-10) contiene reagenti per 10 x 96 prove, sufficienti per 42 campioni e una calibratura curva in duplicato. Per diverse serie di analisi, usare reagenti provenienti da scatole portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è stabilita sull’etichetta all’esterno. Si raccomanda di conservare ad una temperatura di 2–8° C. Coated plate 10 piastra 96 pozzetti Pronti per l’uso (Topo monoclonale anti insulina) 8 strips per pozzetti I pozzetti delle micro piastre inutilizzati, devono essere risigillati e adoperati entro due mesi. Calibrator 0 Giallo colore codificato 1 fiala 5 ml Italiano Italiano Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fiale 1000µl Pronto all´uso Conc. indicata sull'etichetta della fiala (recombinant human insulin) Giallo colore codificato Pronto all’uso Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 12 ml (Peroxidase Conjugate topo monoclinale Anti insulina) Enzyme Conjugate Buffer Blu colore codificato 1 fiala 120 ml Pronto all´uso Wash Buffer 21 X 2 bottiglia 200 ml Per la preparazione vedi sotto Substrate TMB 1 fiala Soluzione incolore. Nota! Sensibile alla luce! 220 ml Pronto all’uso Stop Solution 0.5 M H2SO4 70 ml Pronto all’uso 1 fiala 39 39 Preparazione Preparazionedella dellasoluzione soluzioneenzima enzimaconiugato coniugato Preparare soluzione enzima coniugato con la diluizione dell’Enzyme Prepararelalaquantitá quantitànecessaria necessariadella dell’Enzyme Conjugate con la diluizione dell’Enzyme Conjugate Conjugate 11X (1+10) nel Enzyme Conugate Buffer base alla alla tabella tabella sottostante. 11 X, (1+10) nel Enzyme Conjugate Buffer o ininbase sottostante.Mescolare Mescolare lievemente. lievemente.Usare Usareentro entrounungiorno. giorno. Numero di piastra Numero di strisce EnzymeEnzyme Conjugate 11X 11X Conjugate Enzyme Conjugate Enzyme Conjugate Buffer Buffer 6 strisce 10 piastra 1 piastra 5 piastra 2 piastra 3 piastra 3 piastra 2 piastra 5 piastra 1 piastra 10 piastra 0.5 ml 1 fiala 1.0 ml 5.0 ml 2.0 ml 3.0 ml 3.0 ml 2.0 ml 5.0 ml 1.0 ml 1 fiala 5 ml 1 bottiglia 10 ml 50 ml 20 ml 30 ml 30 ml 20 ml 50 ml 10 ml 1 bottiglia Preparazione il tampone di lavaggio Preparazione di soluzione di lavaggio Prepararelalaquantitá quantitànecessaria necessariail iltampone tamponedidilavaggio lavaggiocon conlaladiluizione diluizionedel delWash WashBuffer Buffer21X 21Xinin Preparare acquaridistillata ridistillata(1+20) (1+20)ininbase basealla allatabella tabellasottostante. sottostante.Mescolare Mescolareicompletamente. completamente. acqua Numero di piastre / Numero di piastra Strips Wash Buffer 21 X Wash Buffer 21X Acqua ridistillata Acqua ridistillata 6 strisce 10 piastra 1 piastra 5 piastra 2 piastra 3 piastra 3 piastra 2 piastra 5 piastra 1 piastra 10 piastra 20 ml 2 bottiglia 35 ml 180 ml 70 ml 110 ml 110 ml 70 ml 180 ml 35 ml 1 bottiglia 8000 ml 3600 ml 2200 ml 1400 ml 700 ml 400 ml 700 ml 1400 ml 2200 ml 3600 ml 8000 ml Dopo la diluizione conservare a: 2–8°C per 4 settimane. LA RACCOLTA E IL TRATTAMENTO DEL MODELLO Il siero Il prelievo in vena di sangue, permette di coagulare, e separare il siero con la centrifugazione. I campioni possono essere conservati a 2–8°C fino a 24 ore. Per periodo più lunghi, conservare i campioni a – 20°C. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento. Plasma Prelevare il sangue direttamente in vena in provette contenenti eparina o EDTA come anticoagulante , e separare la frazione del plasma. I campioni possono essere conservati a 2–8°C fino a 24 ore. Per periodi più lunghi conservare i campioni a –20°C. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento. 4040 Preparazione dei campioni Nota! Per evitare qualsiasi contaminazione tra coniugato e substrato devono essere usate CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO pipette distinte. I controlli commerciali tale come il Mercodia Diabetes antigen control (codifica No. 10-1164-01) CONTROLLO QUALITA’ INTERNO e/o il siero internoDI proveniente da diversi donatori con basse, intermedie e alte concentrazioni di CONTROLLO DI essere QUALITA’ INTERNO insulina analizzate periodicamente comecontrol se fossero esterne, e i risultati I controllidovrebbero commerciali tale come il Mercodia Diabetes antigen (codifica No. 10-1164-01) Ie/o controlli tale come il diversi Mercodia Diabetes control (codifica No. 10-1164-01) tracciati dicommerciali giorno proveniente in giorno. E’dabuona norma di un laboratorio registrare i seguenti dati per il siero interno donatori conantigen basse, intermedie e alte concentrazioni di e/o il sierodovrebbero internounproveniente da diversi donatori con basse, intermedie concentrazioni ciascuna analisi: certo numero di kit;periodicamente una ricostituzione dei datifossero e deie alte componenti kit;dii insulina essere analizzate come se esterne, e i del risultati insulina dovrebbero analizzate come se registrare fossero esterne, e i dati risultati valori di OD per il modulo, Calibrators controlli. tracciati di giorno in essere giorno. E’ buonae periodicamente norma di un laboratorio i seguenti per tracciati giornounincerto giorno. E’ buona di un laboratorio registrare i seguenti dati peri ciascunadianalisi: numero di kit;norma una ricostituzione dei dati e dei componenti del kit; ciascuna analisi: certo numero di kit; una ricostituzione dei dati e dei componenti del kit; i valori di OD per ilunmodulo, Calibrators e controlli. valori di OD per il modulo, Calibrators e controlli. 41 Italiano Italiano Italiano Italiano La diluizione non è normalmente richiesta , comunque, i campioni contenenti >200 mU/I Preparazione dovrebbero essere dei diluiticampioni 1+9 v/v con Calibratore 0. Preparazione campioni test su individui già,sottoposti a terapie di insulina è complicato La L’applicazione diluizione nondidei èquesto normalmente richiesta comunque, i campioni contenenti >200 dalla mU/I La diluizione non èdiluiti normalmente richiesta comunque, i campioni formazione diessere anticorpi anti-insulina capaci di,interferire nelle analisi. contenenti >200 mU/I dovrebbero 1+9 v/v con Calibratore 0. dovrebbero 1+9 con Calibratore IL’applicazione campioniessere grossolanamente lipoideici, itterici o0.hemolysed non interferiscono nell’analisi.dalla didiluiti questo testv/v su individui già sottoposti a terapie di insulina è complicato L’applicazione di questo test su individui sottoposti nelle a terapie di insulina è complicato dalla formazione di anticorpi anti-insulina capacigià di interferire analisi. PROCEDURA DEL TEST formazione di grossolanamente anticorpi anti-insulina capaciitterici di interferire nelle non analisi. I campioni lipoideici, o hemolysed interferiscono nell’analisi. I campioni grossolanamente lipoideici, itterici o hemolysed non interferiscono nell’analisi. Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso. PROCEDURA DEL TEST Preparare una calibratura curva per ciascuna serie di analisi PROCEDURA TEST devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso. Tutti i reagenti eDEL i campioni 1. Preparare la soluzione enzima coniugato e di soluzione de lavaggio. Tutti i reagenti e i campioni essere serie portati a temperatura ambiente prima dell’uso. Preparare una calibratura curvadevono per ciascuna di analisi 2. Preparare sufficiente pozzetti nelle micropiastre a comporre Calibrators e campione in duplice Preparare una calibratura curva per ciascuna serie di analisi 1. copia. Preparare la soluzione enzima coniugato e di soluzione de lavaggio. 1. Preparare enzima nelle coniugato e di soluzione de lavaggio. 3. 25la µlsoluzione per ognipozzetti Calibrators e micropiastre campioni in appropriati pozzetti. 2. Pipette Preparare sufficiente a comporre Calibrators e campione in duplice 2. Preparare pozzetti nelle enzima micropiastre a comporre Calibrators 4. Aggiungere 100 µl della soluzione coniugato per ogni pozzetto.e campione in duplice copia. sufficiente 5. Mettere in incubatrice una piastra shaker (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura 3. copia. Pipette 25 µl per ogni in Calibrators e campioni in appropriati pozzetti. 3. Pipette 25(18-25°C). µl100 per µl ogni Calibrators campioni in appropriati pozzetti. 4. ambiente Aggiungere della soluzionee enzima coniugato per ogni pozzetto. 4. Aggiungere 100 della enzima coniugato per ogni 6. volte conµl la lavatrice automatica o: 6. 700 per piastra pozzetto usando un lavatore automatico piastre 5. Lavare Mettere6 in incubatrice inµlsoluzione una shaker (700-900 rpm) perpozzetto. 1 ora a per temperatura 5. Aspirare Mettere in incubatrice in una piastra shaker (700-900 rpm) pernon 1 ora a temperatura Aggiungere 350 µl di di lavaggio tampone de lavaggio adlaogni pozzetto. la(18-25°C). quantità di reazione. con la funzione traboccare-lavare. Nella procedura utilizzare funzione ambiente (18-25°C). Aspirare Ripetere 5 volte. Dopo immersione. 6. ambiente Lavare 6completamente. volte con la lavatrice automatica o: l’ultimo lavaggio, capovolgere e incapsulare 6. Osaldamente Lavare 6 la volte con ladi lavatrice automatica o: 350 µl di tampone de lavaggio ad ogni pozzetto. il piatto contro la carta assorbente. manualmente, Aggiungere Aspirare quantità reazione. Aggiungere 350 µl di tampone lavaggio ad ogni pozzetto. Aspirare direazione reazione. il quantità volume capovolgendo la micropiastra su de uncapovolgere lavabo. Aggiungere 7. Eliminare Aggiungere 200 µl di Substrate TMB per ogniDopo pozzetto. Aspirare la completamente. Ripetere 5 volte. l’ultimo lavaggio, e incapsulare Aspirare completamente. volte. Dopo l’ultimo lavaggio, capovolgere e incapsulare 350 µl diin soluzione lavaggio ad 5ogni pozzetto. Eliminare la (18–25°C). soluzione di lavaggio, 8. Mettere incubatrice perRipetere 15la minuti a temperatura ambiente saldamente il piattodicontro carta assorbente. saldamente piatto contro la TMB carta assorbente. con il50 forza diverse volte contro cartapozzetto. assorbente per rimuovere il liquido in 9. Aggiungere µlµldi Stop Solution ad ogni 7. sbattere Aggiungere 200 Substrate per ogni pozzetto. 7. Aggiungere 200 µl Substrate TMB pozzetto. 5 volte. prolungate pause diambiente immersione procedura Mettere la piastra in uno shaker peraogni approssimativamente per 5durante secondilaper garantire la 8. eccesso. MettereRipetere in incubatrice perEvitare 15 minuti temperatura (18–25°C). 8. Mettere in incubatrice per Solution 15 minutiadaogni temperatura lavaggio. 9. dimiscelazione. Aggiungere 50 µl di Stop pozzetto.ambiente (18–25°C). 9. 50 µlµldiSubstrate Solution ad ogni pozzetto. 7. Aggiungere 200 TMB. 10. Leggerelal’assorbività a 450 mn e per calcolare i risultati. Mettere piastra inStop uno shaker approssimativamente per 5 secondi per garantire la la incubatrice piastra in uno shaker pera approssimativamente 5 secondi 8. Leggere Mettere in per 15 minuti temperatura ambienteper (18-25 C). per garantire la entro 30 minuti. miscelazione. miscelazione. 9. 50 µl Stop aSolution ogni pozzetto. Mettere la piastra in uno shaker per 10.Aggiungere Leggere l’assorbività 450 mnade calcolare i risultati. 10.approssimativamente Leggereentro l’assorbività a 450 mn e calcolare i risultati. per 5 secondi per garantire la miscelazione. Leggere 30 minuti. 30 minuti. 10. Leggere Leggereentro l’assorbività a 450 nm e calcolare i risultati. Leggere entro 30 minuti. IL CALCOLO DEI RISULTATI IL CALCOLO DEI RISULTATI Calcolo computerizzato Calcolodei computerizzato La riduzione dati computerizzati dell´assorbenza per le Calibrators, eccetto il Calibrator 0, verso la concentrazione usando un regressione cubicaper flessibile potrebbe essereil errettuata per La riduzione dei dati computerizzati dell´assorbenza le Calibrators, eccetto Calibrator 0, ottenere insulina. verso la concentrazione di usando un regressione cubica flessibile potrebbe essere errettuata per ottenere la concentrazione di insulina. Calcolo manuale 1. Calcolo Tracciare i manuale valori di assorbenza ottenuti per le Calibrators, eccetto il Calibrator 0, contro la concentrazione di insulina in un registro e formula una calibratura curva. 1. Tracciare i valori di assorbenza ottenuti per le Calibrators, eccetto il Calibrator 0, contro la 2. Leggere la concentrazione deiincampioni sconosciuti concentrazione di insulina un registro e formuladalla una calibratura calibratura curva. curva. 2. Leggere la concentrazione dei campioni sconosciuti dalla calibratura curva. Risultati ottenuti Risultati ottenuti pozzetti Identità A450 pozzetti Identità0 A450 1 A–B Calibrator 0.070/0.071 1 *0 0.105/0.106 1 C–D Calibrator 1 A–B Calibrator 0.070/0.071 1 E–F Calibrator 2 *1 * 0.202/0.204 0.105/0.106 1 C–D Calibrator 3 *2 * 0.434/0.470 1 G–H Calibrator 1 E–F Calibrator 0.202/0.204 2 A–B Calibrator 4 *3 * 1.348/1.351 0.434/0.470 1 G–H Calibrator 5 *4 * 2.451/2.476 2 C–D Calibrator 2 A–B Calibrator 1.348/1.351 2 E–F Incognita 1 5* 0.222/0.214 2.451/2.476 2 C–D Calibrator 2 G–H Incognita 2 1 0.546/0.538 2 E–F Incognita 0.222/0.214 3 A–B Incognita 3 2 0.546/0.538 2 G–H Incognita 0.546/0.538 3 A–B Incognita 3 0.546/0.538 * Concentrazione indicata sull`etichetta della fiala. Esempio di una calibratura curva Conc. princ.. mU/l. Conc. princ.. mU/l. 11.1 35.6 11.1 15335.6 153 una calibratura curvaqui. Non usare questa curva per determinare i UnaEsempio calibraturadirappresentativa è mostrata Esempio di delle unarappresentativa calibratura curva risultati attuali analisi. Una calibratura è mostrata qui. Non usare questa curva per determinare i Unarisultati calibratura rappresentativa attuali delle analisi. è mostrata qui. Non usare questa curva per determinare i risultati attuali delle analisi. 1,00 O.D. 450 nm O.D. 450 nm 1,00 0,10 0,10 0,01 1 0,01 10 1 42 42 100 10 Insulin (mU/l) Insulin (mU/l) 42 1000 100 1000 IL FATTORE DI CONVERSIONE 1 µg/l = 29 mU/l; 1 mU/l = 6.0 pmol/l LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non dovrebbe essere basata sui risultati di un singolo test, ma dovrebbe essere fatto medico dopo averne valutate le conclusioni cliniche. L’applicazione di questo test su individui già sottoposti a terapie di insulina è ostacolato dalla formazione di anticorpi anti-insulina, in grado di interferire nell’analisi. Grossolanamente campioni lipemic, itterico o hemolysed non interferiscono nell’analisi. VALORI PREVISTI E’ buona norma e pratica di ogni laboratorio stabilire una serie del tutto sua di presunti valori. I seguenti risultati potrebbero servire come guida fino a che il laboratorio abbia raccolto dati sufficienti del tutto suoi. I livelli di digiuno per 137 esaminati, individui apparentemente sani, hanno reso un media di 9.2 mU/l, una mediana di 6.9 mU/l e una serie corrispondente al centrale 95% delle osservazioni dei 2–25 mU/l. CARATTERISTICHE E ESECUZIONE Il limite della scoperta Il limite della scoperta è 1mU/l calcolato come due deviazioni standard sopra della Calibrator 0. Riacquisto Il riacquisto sull’aggiunta è 94–113% (significa 104%). I campioni con una concentrazione sopra i 30000 mU/l può essere analizzata senza dare falsamente bassi risultati . Precisione Ogni campione è stato analizzato su 6 riprodotti in 6 diversi momenti. Campioni Valore principale MU/l 1 2 3 4 11 36 80 154 Coefficiente di variazione Nell’ analisi % Fra analisi % Totale analisi % 3.4 4.0 2.8 3.2 3.6 2.6 2.8 2.9 5.0 4.7 4.0 4.4 43 43 ItalianoItaliano Hook effect Specificità Sono state trovate le seguenti reazioni trasversali: C-peptide C-peptide < 0.01% < 0.01 < 0.01% < 0.01% < 0.5% Sono state trovate le seguenti reazioni trasversali: Proinsulina des (31–32) < 0.05% Sono state trovate le seguenti reazioni trasversali: Proinsulina split (32-33) < 0.5% Proinsulina split (32–33) < 0.5% C-peptide < 0.01 98% Proinsulina des (64-65) C-peptide des (64–65) < 0.01 98%56% Proinsulina split (65-66) < 0.01% Proinsulina 0.01% split(Humalog®, (65–66) Eli Lily) 56% Insulina lispro << Proinsulina des (31–32) <0.000003% 0.05% Proinsulina des (31–32) < 0.05% ® Insulinalispro aspart < 3.2% < 0.006% Insulin (Humalog Proinsulina split (32–33), Eli Lilly) < 0.5% Proinsulina split (32–33) < 0.5% IGF-I aspart < 0.02% Insulin < 0.006% Proinsulina des (64–65) 98% Proinsulina (64–65) 98% IGF-II < 0.02% Rat Insulin des 0.7% Proinsulina split (65–66) 56% Insulina di ratta Proinsulina split (65–66) 56%0.7% ® , Eli Lilly) < 0.006% Insulin lispro (Humalog Insulinalispro di topo < 0.006%0.3% Insulin (Humalog®, Eli Lilly) CALIBRATURA Insulin aspart < 0.006% Insulinaaspart porcino 374% Insulin < 0.006% IlRat kit specifico Mercodia Insulin ELISA è calibrato contro Insulin 0.7% Insulina di pecora 48%i Riferimenti 1st International Reference Rat Insulin 0.7% Preparation 66/304. Insulina bovino 31% Specificità Proinsulina Proinsulina Specificità Proinsulina des (31-32) CALIBRATURA CALIBRATURA IlGARANZIA kit specifico Mercodia Insulin ELISA è calibrato contro i Riferimenti 1st International Reference Il kit specifico Mercodia Insulin ELISA è calibrato contro i Riferimenti 1st International Reference I dati dei rendimenti Preparation 66/304. presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi Preparation 66/304. cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB possono avere effetti su i risultati, nel caso in cui Mercodia rinuncia al diritto tutte le garanzie espresse, implicite GARANZIA GARANZIA fissate, la garanzia implicita per stati l’uso ottenuti commerciale e appropriato. Iodati dei inclusa rendimenti presentati qui sono usando le procedure indicate. Qualsiasi I dati dei rendimenti presentati qui autorizzati, sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasio Mercodia ABo emodifica i suoi distributori tal caso, non da sarà soggettoAB a danni indiretti cambiamento nella procedura non in raccomandata Mercodia possono avere cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB possono avere consequenziali. effetti su i risultati, nel caso in cui Mercodia rinuncia al diritto tutte le garanzie espresse, implicite effetti su i risultati, nel caso in cui Mercodia rinuncia al diritto tutte le garanzie espresse, implicite o fissate, inclusa la garanzia implicita per l’uso commerciale e appropriato. o fissate, inclusa la garanzia implicita per l’uso commerciale e appropriato. Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non sarà soggetto a danni indiretti o Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non sarà soggetto a danni indiretti o consequenziali. consequenziali. RIFERIMENTI Gaines-Das, R.E. and Bristow, A.F. (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16:179-186 Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054 Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B. (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019 Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF. (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-2365 Sjostrand M, Gudbjornsdottir S, Holmang A, Lonn L, Strindberg L, Lonnroth P. (2002) Delayed transcapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects. Diabetes 51:2742-2748 44 44 44 TILSIGTET ANVENDELSE Mercodia Insulin ELISA er en metode til kvantitativ bestemmelse af humant insulin i serum eller plasma. OVERSIGT OG FORKLARING AF ANALYSEN Insulin er det vigtigste hormon i forbindelse med styring af glukosemetabolismen. Det syntetiseres i ß-cellerne i de langerhanske øer ligesom forløberen, proinsulin, der behandles for at danne C-peptid og insulin. De udskilles begge i ækvimolære mængder i portal cirkulation. Det modne insulinmolekyle består af to polypeptid-kæder, A-kæden og B-kæden (med henholdsvis 21 og 30 aminosyrer). De to kæder kædes sammen af to disulfid-broer mellem kæderne. Der er også en kædeintern disulfid-bro i A-kæden. Insulinudskillelsen styres primært af glukosekoncentrationen i plasma, og hormonet har en række vigtige stofskiftefunktioner. Den primære funktion er at styre optagelsen og udnyttelsen af glukose i perifert væv via glukosetransporteren. Denne og andre hypoglykæmiske aktiviteter som f.eks. hæmningen af hepatisk glukoneogenese og glycogenolyse modvirkes af de hyperglykæmiske hormoner, herunder glukagon, epinephrin (adrenalin), væksthormon og cortisol. Insulinkoncentrationer er kraftigt reduceret ved insulinafhængig diabetes mellitus (IDDM) og visse andre tilstande som f.eks. hypopituitarisme. Insulinkoncentrationen er forhøjet ved insulinuafhængig diabetes mellitus (NIDDM), fedme, insulinoma og visse endokrine dysfunktioner som f.eks. Cushings syndrom og akromegali. PRINCIP FOR PROCEDUREN Mercodia Insulin ELISA er en tosidet solid phase-enzymimmunanalyse. Den er baseret på den direkte sandwich-teknik, hvor to monoklonale antistoffer rettes mod separate antigene determinanter på insulin-molekylet. Under inkubation reagerer insulin i prøven med peroxydasekonjugeret anti-insulin-antistoffer og anti-insulin-antistoffer bundet til mikrotitreringsbrønden. En enkel skylning fjerner ubundet enzym-mærket antistof. Det bundne konjugat registreres ved reaktion med 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB). Reaktionen stoppes ved at tilsætte syre for at give et kolorimetrisk endepunkt, der aflæses spektrofotometrisk. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER 45 Dansk Dansk • Til in vitro-diagnosticering. • Indholdet af dette sæt samt rester deraf må ikke komme i kontakt med drøvtyggende dyr eller svin. • Stop Solution i dette sæt indeholder 0,5 M H2SO4. Overhold almindelige forholdsregler for håndtering af farlige kemikalier. • Alle patientprøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER • Pipetter til 25, 50, 100, 200 og 1000 µl (repetitionspipetter foretrækkes til tilsætning af enzymkonjugatopløsning, Substrate-TMB og Stop Solution) • Bægerglas og målebægre til klargøring af reagenser • Redestilleret vand • Mikropladeaflæser (450 nm-filter) • Rystebord (Anbefalet hastighed er 700-900 omdrejninger per minut, orbital bevægelse) • Skylleanordning til mikroplader REAGENSER 1X96 Hvert Mercodia Insulin ELISA (10-1113-01) sæt indeholder reagenser til 96 brønde, nok til 42 prøver og en kalibratorkurve i dublet. Til større analyseserier skal der bruges puljereagenser fra pakker med samme partinummer. Udløbsdatoen for hele sættet er angivet på den yderste etiket. Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2–8°C. Coated plate 1 plade 96 brønde Klar til brug (Monoklonalt anti-insulin fra mus) Strimler med 8 brønde Ved ubrugte mikropladebrønde skal posen genforsegles og brøndene bruges inden for 2 måneder. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 hætteglas Koncentration angivet på hætteglassets etikett (rekombineret humant insulin) Farvekodet gul 1000 µl Klar til brug Calibrator 0 Farvekodet gul 1 hætteglas 5 ml Klar til brug Enzyme Conjugate 11X (Peroxidase-konjugeret fra mus monoklonalt Anti-insulin) 1 hætteglas 1,2 ml Klargøring, se nedenfor Enzyme Conjugate Buffer Farvekodet blå 1 hætteglas 12 ml Klar til brug Wash Buffer 21X 1 flaske 50 ml Fortynd med 1000 ml redestilleret vand for at lave vaske opløsning. Opbevaring efter fortynding: 2–8°C i 4 uger. Substrate TMB Farveløs opløsning Bemærk! Lysfølsom! 1 hætteglas 22 ml Klar til brug Stop Solution 0,5 M H2SO4 1 hætteglas 7 ml Klar til brug 46 46 Forberedelse af enzymkonjugatopløsning Klargøring af enzymkonjugatopløsning Forbered den påkrævede mængde enzymkonjugatopløsning ved at fortynde Enzyme Conjugate Klargør deni Enzym påkrævede mængde enzymkonjugatopløsning ved at fortynde Conjugate 11X, 11X, (1+10) Conjugate Buffer i henhold til tabellen nedenfor. Hvis der Enzyme forberedes (1+10) i Enzyme Conjugate i henhold tabellen nedenfor. Bland Conjugate forsigtigt. Bruges enzymkonjugatopløsning til enBuffer hel plade, hæld til hele indeholdet af Enzyme Buffer over i Enzyme inden 24Conjugate timer. 11X røret. Bland forsigtigt. Bruges inden 24 timer. Antalstrimler strimler Antal 4 strimler strimler 612strimler strimler 8 8strimler strimler 10 6strimler strimler 12 4strimler EnzymeEnzyme Conjugate 11X 11X Conjugate Enzyme Conjugate Enzyme Conjugate Buffer Buffer 400 µl 600 µl 1 hætteglas 700 µl 700 µl 900 µl 500 µl 350 µl 1 hætteglas 4.0 ml hætteglas 6.01 ml 7.07.0 mlml 9.05.0 mlml 3.5 ml 1 hætteglas REAGENSER 10 X 96 Hvert Mercodia Insulin ELISA (10-1113-10) sæt indeholder reagenser til 10 x 96 brønde, nok til 42 prøver og en kalibreringskurve i dublet. Til større analyseserier skal der bruges puljereagenser fra pakker med samme partinummer. Udløbsdatoen for hele sættet er angivet på den yderste etiket. Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2–8°C. Coated plate 10 plade 96 brønde Klar til brug (Monoklonalt anti-insulin fra mus) Strimler med 8 brønde Ved ubrugte mikropladebrønde skal posen genforsegles og brøndene bruges inden for 2 måneder. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 hætteglas 1000 µl Klar til brug Konc. angivet på hætteglassets etikett (rekombineret humant insulin) Farvekodet gul 5 ml Klar til brug Enzyme Conjugate 11X (Peroxidase-konjugeret fra mus monoklonalt Anti-insulin) 1 hætteglas 12 ml Klargøring, se nedenfor Enzyme Conjugate Buffer Farvekodet blå 1 flaske 120 ml Klar til brug Wash Buffer 21X 2 flaske 200 ml Klargøring, se nedenfor Opbevaring efter fortynding: 2–8°C i 4 uger. Substrate TMB 1 flaske Farveløs opløsning Bemærk! Lysfølsom! 220 ml Klar til brug Stop Solution 0,5 M H2SO4 70 ml Klar til brug 1 flaske 47 47 Dansk 1 hætteglas Dansk Calibrator 0 Farvekodet gul Forberedelse af enzymkonjugatopløsning Klargøring af enzymkonjugatopløsning Forbered den påkrævede mængde enzymkonjugatopløsning ved at fortynde Enzyme Conjugate Klargør deni påkrævede mængde enzymkonjugatopløsning ved at fortynde Enzyme Conjugate 11X, (1+10) Enzym Conjugate Buffer i henhold til tabellen nedenfor. Bland forsigtigt. Bruges 11X, (1+10) Enzyme Conjugate Buffer i henhold til tabellen nedenfor. Bland forsigtigt. Bruges inden 24i timer. inden 24 timer. Antal plader Enzyme Enzyme Conjugate Antal strimler/ Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer plader Conjugate 11X Buffer 6 strimler 10 plader 5 plader 1 plade 3 plader 2 plader 2 plader 3 plader 1 plade 5 plader 10 plader 1hætteglas0.5 ml 5.0 ml 1.0 ml 3.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 3.0 ml 1.0 ml 5.0 ml 1 hætteglas 1 flaske 50 ml 30 ml 20 ml 10 ml 5 ml 10 ml 20 ml 30 ml 50 ml 1 flaske Forberedelse vaskebuffer opløsning Klargøring afafvaske Forbered den påkrævede mængde vaske vaske buffer opløsning fortynding af Wash Buffer i redestilKlargør den ved ved fortynding af Wash Buffer 21X 21X i redestilleret leret (1+20) i henhod til tabellen nedenfor. Bland grundigt. vandvand (1+20) i henhold til tabellen nedenfor. Bland grundigt. Antal plader/ Antal plader strimler WashWash BufferBuffer 21X 21X Redestilleret Redestilleret vand vand 6 strimler 10 plader 1 plade 5 plader 2 plader 3 plader 3 plader 2 plader 5 plader 1 plade 10 plader 20 ml 2 flasker 35 ml 180 ml 70 ml 110 ml 110 ml 70 ml 180 ml 35 ml 1 flaske 400 ml 8000 ml 3600 ml 700 ml 2200 ml 1.400 ml 1400 ml 2.200 ml 700 ml 3.600 ml 8.000 ml Opbevaring efter fortynding: 2–8°C i 4 uger. UDTAGNING OG HÅNDTERING AF PRØVER Serum Tag blod ved venepunktur, lad det koagulere, og adskil serummet ved centrifugering. Prøver kan opbevares ved 2–8°C i op til 24 timer. Længere opbevaring skal ske ved –20°C. Undgå at nedfryse og optø af flere omgange. Plasma Tag blod ved venepunktur i rør med heparin eller EDTA som antikoagulant, og adskil plasmafraktionen. Prøver kan opbevares ved 2–8°C i op til 24 timer. Længere opbevaring skal ske ved –20°C. Undgå at nedfryse og optø af flere omgange. 48 48 Klargøring af prøver Fortynding er normalt ikke nødvendigt, men prøver, der indeholder >200 mU/l, skal fortyndes Klargøring af prøver Forberedelse af prover 1+9 v/v med Calibrator 0. Fortynding er normalt ikke nødvendigt, men prøver, der indeholder >200 skal Klargøring af prøver Fortynding er normalt ikketest nœdvendigt, mender prœver, derer indeholder >200 mU/l, mU/l,kompliceres skal fortyndes fortyndes Anvendelsen af denne på individer, allerede i insulinbehandling, af 1+9 v/v med Calibrator 0. nødvendigt, men prøver, der indeholder >200 mU/l, skal fortyndes Fortynding er anti-insulin-antistoffer, normalt ikke dannelsen af der kan forstyrre analysen. 1+9 v/v med Calibrator 0. Anvendelsen af denne test på individer, der allerede er i insulinbehandling, kompliceres af 1+9Stærkt v/v med Calibrator 0. lipæmiske, ikteriske eller hæmolyserede prøver forstyrrer ikke analysen. dannelsen af anti-insulin-antistoffer, der kander forstyrre analysen. Anvendelsen af denne test på individer, allerede er i insulinbehandling, kompliceres af Stærkt lipæmiske, ikteriske eller hæmolyserede prøver forstyrrer ikke analysen. dannelsen af anti-insulin-antistoffer, der kan forstyrre analysen. TESTPROCEDURE Stærkt lipæmiske, ikteriske hæmolyserede prøver forstyrrer Alle reagenser og prøver skaleller bringes til stuetemperatur før brug. ikke Lav analysen. en kalibratorkurve for TESTPROCEDURE hver analysekørsel. Alle reagenser og prøver skal bringes til stuetemperatur før brug. Lav en kalibratorkurve for TESTPROCEDURE 1. enzymkonjugatopløsning opløsning. før brug. Lav en kalibratorkurve for hverKlargør analysekørsel. Alle reagenser og prøver skal bringesogtilvaske stuetemperatur 2. Klargør tilstrækkeligt med mikropladebrønde til Calibrators og prøver i dublet. hver analysekørsel. 1. Klargør enzymkonjugatopløsning og vaske opløsning. 3. Pipetter 25 µl af både Calibrators og prøver i de relevante brønde. 2. Klargør enzymkonjugatopløsning tilstrækkeligt med mikropladebrønde til Calibrators og prøver i dublet. 1. og vaske opløsning. 4. Klargør Tilsæt 100 µl enzymkonjugatopløsning i hver brønd. 3. Pipettertilstrækkeligt 25 µl af bådemed Calibrators og prøver i tildeCalibrators relevante brønde. 2. mikropladebrønde og prøver(18–25°C). i dublet. 5. Klargør Inkuber på et rystebord (700-900 rpm) i 1 time ved stuetemperatur 4. Tilsæt 100 i hver de brønd. 3. 25 µl µl enzymkonjugatopløsning af både Calibrators og prøver brønde. 6. med 700 µl per brønd, anvendi eller: en relevante automatisk pladevasker med overflow 6. Pipetter Vask 6 gange automatisk skylleapparat 5. funktion. Inkuber på rystebord rpm) 1proceduren. time ved stuetemperatur (18–25°C). 4. Tilsæt µletenzymkonjugatopløsning iµlihver brønd. Benyt ikke soak(700-900 funktion i vaske Aspirer100 reaktionsvolumen. Tilsæt 350 vaske buffer i hver brønd. Aspirer fuldstændigt. 6. Eller Vaskmanuelt: 6 gange med automatisk skylleapparat eller: 5. Inkuber på et rystebord (700-900 rpm) i 1 time ved stuetemperatur (18–25°C). Gentag 5 gange. Aspirer reaktionsvolumen. Tilsæt 350 den µl vaske buffer over i hverenbrønd. Aspirer fuldstændigt. 6. Bortkast Vask 6 gange med automatisk skylleapparat eller: væsken i pladen ved at vende på hovedet vask. Tilsæt 350 µl Efter sidste vaskning vendes og bankes pladen mod absorberende papir. Gentag reaktionsvolumen. 5 gange.til hver brønd. Bortkast bank pladen flere fuldstændigt. gange mod Aspirer Tilsæt 350 µlvaske vaskeopløsningen, buffer i hver brønd. Aspirer 7. vaske Tilsætopløsning 200 µl Substrate TMB. Efter sidste vaskning og overskydende bankes pladenvæske. mod absorberende papir. papir forvendes at fjerne Gentag gange. 8. absorberende Inkuber 5i 15 minutter ved stuetemperatur (18–25°C). Gentag 5 gange. Undgå at forlænge 7. perioden Tilsætsidste 200 µl Substrate TMB. hvor brøndene står og medbankes væskepladen i løbetmod af vaskeperioden. Efter vaskning vendes absorberende papir. 9. Tilsæt 50 µl Stop Solution hver brønd. 8. Tilsæt Inkuber i 15 ved stuetemperatur (18–25°C). 7. µl minutter Substrate TMB. Placer 200 pladen på et rystebord i cirka 5 sekunder for at sikre blandingen. 9. Tilsæt 50 µl minutter Stop Solution hver brønd. (18–25°C). 8. i 15 10.Inkuber Aflæs optisk densitetved vedstuetemperatur 450 nm, og beregn resultaterne. Placer50 pladen på Solution et rystebord i cirka 5 sekunder for at sikre blandingen. 9. Tilsæt µl Stop hver Aflæs inden for 30 minutter. brønd. 10.Placer Aflæspladen optiskpå densitet ved 450 nm, 5ogsekunder beregn resultaterne. et rystebord i cirka for at sikre blandingen. 30 minutter. 10. Aflæs Aflæsinden optiskfor densitet ved 450 nm, og beregn resultaterne. Aflæs inden for 30 minutter. Obs! For att forhindre kontermination mellem konjugatet og substratet, anbefales det at anvende særskilte pipetter. INTERN KVALITETSKONTROL 49 Dansk Dansk Dansk Dansk Kommercielle Kontroller som f.eks. Mercodia Diabetes antigen control (Kodenr. 10-1164-01) INTERN KVALITETSKONTROL og/eller interne serumpuljer med lave, mellem og høje insulin-koncentrationer skal regelmæssigt Kommercielle Kontroller som f.eks. Mercodia Diabetes antigen control (Kodenr. 10-1164-01) INTERN KVALITETSKONTROL analyseres som ukendte, og resultaterne afbildes fra dag til dag. Det er god laboratoriepraksis at og/eller interneKontroller serumpuljer lave, mellem og høje insulin-koncentrationer skal 10-1164-01) regelmæssigt Kommercielle sommed f.eks. Mercodia Diabetes antigen rekonstitueringsdatoer control (Kodenr. registrere følgende data for hver analyse: sættets partinummer; for sætanalyseres somserumpuljer ukendte, og med resultaterne afbildes fra dag til dag. Det er god laboratoriepraksis at og/eller interne mellem ogCalibrators høje insulin-koncentrationer tets komponenter; OD-værdier forlave, blindprøver, og kontrolprøver. skal regelmæssigt registrere følgende data for hver analyse: sættets partinummer; rekonstitueringsdatoer for sætanalyseres som ukendte, og resultaterne afbildes fra dag til dag. Det er god laboratoriepraksis at tets komponenter; blindprøver, Calibrators og kontrolprøver. registrere følgende OD-værdier data for hverforanalyse: sættets partinummer; rekonstitueringsdatoer for sættets komponenter; OD-værdier for blindprøver, Calibrators og kontrolprøver. BEREGNING AF RESULTATER BEREGNING AF RESULTATER Computerberegning Computerberegning Computersturet datareduktion af absorbansen for Calibrators, bortset fra Calibrator 0, i forhold til koncentration ved datareduktion hjælp af cubic af spline-regression udføres for at opnå af insulin. Computersturet absorbansen forkan Calibrators, bortset fra koncentrationen Calibrator 0, i forhold til koncentration ved hjælp af cubic spline-regression kan udføres for at opnå koncentrationen af insulin. Manuel beregning beregning der er opnået for Calibrators, bortset fra Calibrator 0, mod insulin1.Manuel Plot de absorbansværdier, på dobbeltlogaritmisk papir, tegn en kalibratorkurve. 1.koncentrationen Plot de absorbansværdier, der er opnået for og Calibrators, bortset fra Calibrator 0, mod insulin2. Aflæs koncentrationen for de ukendte prøver fraog kalibratorkurven. koncentrationen på dobbeltlogaritmisk papir, tegn en kalibratorkurve. 2. Aflæs koncentrationen for de ukendte prøver fra kalibratorkurven. Eksempel på resultater Eksempel på resultater Brønde Identitet Brønde Identitet 0 1 A–B Calibrator 1 C–D Calibrator 1 *0 1 A–B Calibrator 2 *1 * 1 E–F Calibrator 1 C–D Calibrator 1 G–H Calibrator 3 *2 * 1 E–F Calibrator 4 *3 * 2 A–B Calibrator 1 G–H Calibrator 2 C–D Calibrator 5 *4 * 2 A–B Calibrator 2 E–F Ukendt 1 5* 2 C–D Calibrator 2 G–H Ukendt 21 2 E–F Ukendt 3 A–B Ukendt 32 2 G–H Ukendt 3 A–B Ukendt 3 * Eksempel Koncentrationpå angivet på hætteglassets etiket. kalibratorkurve A450 A450 0.070/0.071 0.105/0.106 0.070/0.071 0.202/0.204 0.105/0.106 0.434/0.470 0.202/0.204 1.348/1.351 0.434/0.470 2.451/2.476 1.348/1.351 0.222/0.214 2.451/2.476 0.546/0.538 0.222/0.214 1.941/1.978 0.546/0.538 1.941/1.978 Gennemsnit konc.mU/l Gennemsnit konc.mU/l 11.1 35.6 11.1 153 35.6 153 Eksempel på kalibratorkurve Der vises en typisk kalibratorkurve. Brug ikke denne kurve til at bestemme faktiske analyseExempel på kalibratorkurve resultater. Der vises en typisk kalibratorkurve. Brug ikke denne kurve til at bestemme faktiske analyseDer vises en typisk kalibratorkurve. Brug ikke denne kurve til at bestemme faktiske analyseresultater. resultater. 1,00 O.D. 450 nm O.D. 450 nm 1,00 0,10 0,10 0,01 1 0,01 10 1 100 10 100 Insulin (mU/l) 5050 50 Insulin (mU/l) 1000 1000 KONVERTERINGSFAKTOR 1 µg/l = 29 mU/l; 1 mU/l = 6.0 pmol/l PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Som ved alle diagnosticeringsanalyser må en definitiv klinisk diagnose ikke baseres på resultatet af en enkelt analyse, men skal foretages af lægen, efter at alle kliniske resultater er blevet bedømt. Anvendelsen af denne test på individer, der allerede er i insulinbehandling, kompliceres af dannelse af anti-insulin-antistoffer, der kan forstyrre analysen. Stærkt lipæmiske, ikteriske eller hæmolyserede prøver forstyrrer ikke analysen. FORVENTEDE VÆRDIER God praksis foreskriver, at hvert laboratorium fastlægger sine egne intervaller for forventede værdier. Følgende resultater kan fungere som en vejledning, indtil laboratoriet selv har indsamlet tilstrækkelige data. Fasteniveauer for 137 testede, tilsyneladende sunde individer gav et gennemsnit på 9,2 mU/l, en medianværdi på 6,9 mU/l og et interval, der svarer til de midterste 95% af observationerne på 2–25 mU/l. YDEEVNE Registreringsgrænse Registreringsgrænsen er 1 mU/l, beregnet som to standardafvigelser over Calibrator 0. Genfinding Genfinding efter tilsætning er 94–113% (gennemsnit 104%). Hook-effekt Prøver med en koncentration på op til 30 000 mU/l kan måles uden at få falsk lave resultater. Nøjagtighed Hver prøve analyseres 6 gange ved 6 forskellige lejligheder. 1 2 3 4 Gennemsnit mU/l 11 36 80 154 inden for analyse % 3.4 4.0 2.8 3.2 Variationskoefficient mellem samlet analyse % analyse % 3.6 2.6 2.8 2.9 Dansk Dansk Prøve 5.0 4.7 4.0 4.4 51 51 Specificitet Der blev fundet følgende krydsreaktioner: C-peptid < 0,01%< 0.01% C-peptid Proinsulin Proinsulin < 0,01%< 0.01% Proinsulin des (31–32) (31-32) Specificitet Proinsulin des < 0,5% < 0.5% Specificitet Proinsulin split Der blev fundet følgende krydsreaktioner: Proinsuline split(32-33) (32–33) < 0.5% < 0.5% Der blev fundet følgende krydsreaktioner: Proinsulin des (64–65) (64-65) C-peptid des < 0,01% Proinsulin 98% 98% C-peptid split (65-66) < 0,01% 56% Proinsulin Proinsulin split (65–66) < 0,01% Proinsuline 56% Insulin lispro (Humalog®, Eli Lily) 0.000003% Proinsulin << 0,01% Proinsulin des (31–32)®, Eli Lilly) < 0,5%< 3.2% < 0.006% Insulin lispro (Humalog Insulin aspart Proinsulin des (31–32) < 0,5% Proinsuline split (32–33) < 0.5% Insulin aspart < 0.006% IGF-I < 0.02% Proinsuline split (32–33) < 0.5% Proinsulin 98% Rat Insulin des (64–65) 0.7% IGF-II < 0.02% Proinsulin des (64–65) 98% Rotteinsulin Proinsuline split (65–66) 56% 0.7% Proinsuline split (65–66) 56% ® Musinsulin KALIBRERING < 0.006% 0.3% Insulin lispro (Humalog ®, Eli Lilly) < 0.006% 374% Insulin lispro (Humalog , Eli Lilly) Svininsulin Insulin aspart < 0.006% Mercodia Insulin ELISA sættet er kalibreret mod den 1st International Reference Preparation Insulin aspart < 0.006% 48% Fårinsulin Rat Insulin 0.7% 66/304. Rat Insulin 0.7% Bovine insulin 31% KALIBRERING GARANTI KALIBRERING Mercodia ELISA sættet er kalibreret den 1st fremgangsmåde. International Reference Preparation De angivneInsulin ydeevnedata blev opnået ved af mod den angivne Alle ændringer af Mercodia Insulin ELISA sættet er kalibreret mod den 1st International Reference Preparation 66/304. fremgangsmåden, der ikke anbefales af Mercodia AB, kan påvirke resultaterne, og i dette tilfælde 66/304. ophæver Mercodia AB alle garantier, det være sig udtrykkelige, stiltiende eller lovbefalede, herGARANTI under den stiltiende garanti for salgbarhed og egnethed til et bestemt formål. GARANTI DeI et angivne opnåetABvedogafdennes den angivne fremgangsmåde. Alle ændringer sådantydeevnedata tilfælde kanblev Mercodia autoriserede distributører ikke drages tilaf De angivne ydeevnedata blev opnået ved af den angivne fremgangsmåde. Alle ændringer af fremgangsmåden, ikke eller anbefales af Mercodia AB, kan påvirke resultaterne, og i dette tilfælde ansvar for indirekte der skader følgeskader. fremgangsmåden, der ikke anbefales af Mercodia AB, kan påvirke resultaterne, og i dette tilfælde ophæver Mercodia AB alle garantier, det være sig udtrykkelige, stiltiende eller lovbefalede, herophæver Mercodia AB alle garantier, det være sig udtrykkelige, stiltiende eller lovbefalede, herunder den stiltiende garanti for salgbarhed og egnethed til et bestemt formål. under den stiltiende garanti for salgbarhed og egnethed til et bestemt formål. I et sådant tilfælde kan Mercodia AB og dennes autoriserede distributører ikke drages til I et sådant tilfælde kan Mercodia AB og dennes autoriserede distributører ikke drages til ansvar for indirekte skader eller følgeskader. ansvar for indirekte skader eller følgeskader. REFERENCER Gaines-Das, R.E. and Bristow, A.F. (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16: 179-186 Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054 Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B. (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019 Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF. (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-2365 Sjostrand M, Gudbjornsdottir S, Holmang A, Lonn L, Strindberg L, Lonnroth P. (2002) Delayed transcapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects. Diabetes 51:2742-2748 52 52 ANVÄNDNING Mercodia Insulin ELISA är ett in vitro-test för kvantitativ bestämning av humant insulin i serum och plasma. SAMMANFATTNING Insulin är det hormon som reglerar glukosmetabolismen i kroppen. Det syntetiseras av betacellerna i bukspottkörteln via ett förstadium, proinsulin, som omvandlas till insulin genom avspjälkning av C-peptiden. Båda utsöndras i ekvimolära mängder i portablodet. Den mogna insulinmolekylen innefattar två polypeptidkedjor, A-kedjan och B-kedjan (21 respektive 30 aminosyror). De två kedjorna är sammankopplade genom två disulfidbryggor inom kedjorna. Det finns även en disulfidbrygga inom A-kedjan. Utsöndring av insulin kontrolleras huvudsakligen av koncentrationen av plasmaglukos, och hormonet har ett antal viktiga metaboliska aktiviteter. Den viktigaste är att kontrollera upptagningen och användningen av glukos i perifera vävnader via glukostransportören. Denna och andra hypoglykemiska aktiviteter, såsom inhibering av hepatisk glukoneogenes och glykogenolys motverkas av de hyperglykemiska hormonerna som innefattar glukagon, epinefrin (adrenalin), tillväxthormon och cortisol. Vid typ I-diabetes (insulinberoende diabetes, IDDM) saknas i princip insulin. Insulinnivån i serum är mycket låg och ökar inte vid stimulering med glukos. Vid hypopituitarism är insulinnivåerna likaledes mycket låga. Däremot finner man vid typ II-diabetes (åldersdiabetes, NIDDM) ofta normala eller t o m ökade insulinnivåer. Förhöjda insulinnivåer föreligger ofta vid fetma, insulinom och vissa endokrina dysfunktioner såsom Cushings syndrom och akromegali. TESTPRINCIP Mercodia Insulin ELISA är en fast fas enzym immunoassay som baserar sig på ”sandwich” teknik med två monoklonala antikroppar som är riktade mot separata antigena determinanter på insulinmolekylen. Under inkubation reagerar insulinet i provet med peroxidaskonjugerade antiinsulinantikroppar och anti-insulinantikroppar bundna till en mikrotiterbrunn. En enkel tvätt avlägsnar obunden enzyminmärkt antikropp. Det bundna konjugatet detekteras genom reaktion med 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB). Enzymreaktionen avläses spektrofotometriskt efter att ha stoppats genom tillsats av syra. VARNINGAR OCH SÄKERHETSÅTGÄRDER • För in vitro diagnostiskt bruk. • Innehållet i detta kit eller rester av det får inte komma i kontakt med idisslande djur eller svin. • Stop Solution i detta kit innehåller 0,5 M H2SO4. Följ standardsäkerhetsåtgärder för hantering av farliga kemikalier. • Alla patientprover skall hanteras som om de vore smittbärande. Svenska Svenska 53 MATERIAL SOM KRÄVS MEN EJ TILLHANDAHÅLLS • Pipetter för 25, 50, 100, 200 och 1000 µl (repeterbara pipetter är att föredra för tillsats av enzymkonjugatlösning, Substrate TMB och Stop Solution) • Bägare och mätglas för iordningställande av reagens • Dubbeldestillerat vatten • Mikrotiterplattläsare (450 nm filter) • Plattskak (rekommenderad hastighet är 700-900 varv per minut, orbital rörelse) • Tvättutrustning för mikrotiterplattor REAGENSER 1X96 Varje Mercodia Insulin ELISA kit (10-1113-01) innehåller reagenser till 96 brunnar, tillräckligt många för 42 prov och en kalibratorkurva i duplikat. För större analysserier, använd sammanslagna reagenser från förpackningar med identiska lotnummer. Utgångsdatumet för hela kitet står på ytterettiketten. Rekommenderad förvaringstemperatur är 2–8°C. Coated Plate 1 platta 96 brunnar Färdig att användas (monoklonalt mus-anti-insulin) Strips med 8 brunnar För oanvända mikrotiterplattbrunnar, återförslut påsen med tejp och använd inom två månader. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 flaskor Koncentration angiven på flaskans etikett (rekombinant humant insulin) Gul färgmärkning 1000µl Färdig att användas Calibrator 0 Gul färgmärkning 1 flaska 5 ml Färdig att användas Enzyme Conjugate 11X (peroxidaskonjugerat monoklonalt mus-anti-insulin) 1 flaska 1,2 ml Späd enligt nedan Enzyme Conjugate Buffer Blå färgmärkning 1 flaska 12 ml Färdig att användas Wash Buffer 21X 1 flaska 50 ml Späd ut med 1000 ml destillerat vatten för att göra tvättlösning. Förvaring efter utspädning: 2–8°C i 4 veckor. Substrate TMB Färglös vätska Obs! Ljuskänslig! 1 flaska 22 ml Färdig att användas Stop Solution 0,5 M H2SO4 1 flaska 7 ml Färdig att användas 54 54 Beredning av enzymkonjugatlösning Beredning enzymkonjugatlösning Bered önskad av mängd enzymkonjugatlösning genom att späda Enzyme Conjugate 11X (1+10) i Bered mängd enzymkonjugatlösning genom att spädaav ut enzymkonjugatlösning Enzyme Conjugate 11Xtill hela Enzymeönskad Conjugate Buffer enligt tabellen nedan. Vid beredning plattan,i hälls helaConjugate innehålletBuffer av Enzyme BufferBlanda i flaskan med Enzyme (1+10) Enzyme enligtConjugate tabellen nedan. varsamt. AnvändConjugate inom en 11X. Blanda varsamt. Använd inom en dag. dag. Antal Antal strips strips 4 strips 12 strips 6 strips 8 strips 8 strips 6 strips 10 strips 4 strips 12 strips Enzyme Conjugate Enzyme 11X Conjugate 11X 400 µl 600 1µlflaska 700 700 µl µl 900 500 µl µl 350 µl 1 flaska Enzyme EnzymeConjugate Conjugate Buffer Buffer 4.0 ml 1 flaska 6.0 ml 7.0ml ml 7.0 5.0ml ml 9.0 13.5ml flaska REAGENSER 10 X 96 Varje Mercodia Insulin ELISA kit (10-1113-10) innehåller reagenser för 10 x 96 brunnar, tillräckligt många för 42 prov och en kalibratorkurva i duplikat på varje platta. För större analysserier använd sammanslagna reagenser från förpackningar med identiska lotnummer. Utgångsdatumet för hela kitet står på ytterettiketten. Rekommenderad förvaringstemperatur är 2–8°C. Coated Plate 10 plattor 96 brunnar Färdig att användas (monoklonalt mus-anti-insulin) Strips med 8 brunnar För oanvända mikrotiterplattbrunnar, återslut påsen med tejp och använd inom två månader. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 flaskor 1000 µl Färdig att användas Koncentration angiven på flaskans etikett (rekombinant humant insulin) Gul färgmärkning 1 flaska 5 ml Färdig att användas Enzyme Conjugate 11X (Peroxidas konjugerat monoklonalt mus-anti-insulin) 1 flaska 12 ml Späd enligt nedan Enzyme Conjugate Buffer Blå färgmärkning 1 flaska 120 ml Färdig att användas Wash Buffer 21X 2 flaskor 200 ml Framställs enligt nedan Substrate TMB 1 flaska Färglös vätska. Obs! Ljuskänslig! 220 ml Färdig att användas Stop Solution 0,5 M H2SO4 70 ml Färdig att användas 1 flaska 5555 Svenska Svenska Calibrator 0 Gul färgmärkning Beredningav avenzymkonjugatlösning enzymkonjugatlösning Beredning Beredönskad önskadvolym volymenzymkonjugatlösning enzymkonjugatlösninggenom genomattattspäda spädaEnzym Enzyme Conjugate Bered Conjugate 11X11X, (1+10)i iEnzym Enzyme Conjugate Buffer enligt tabellen nedan. Blanda varsamt. Använd inom (1+10) Conjugate Buffer enligt tabellen nedan. Blanda varsamt. Använd inom enen dag. dag. Antal plattor Antal strips/ plattor Enzyme Enzyme Conjugate 11X Conjugate 11X Enzyme Conjugate Enzyme Buffer Conjugate Buffer 6 strips 10 plattor 1 platta 5 plattor 2 plattor 3 plattor 3 plattor 2 plattor 5 plattor 1 platta 10 plattor 1 flaska0.5 ml 5.0 ml 1.0 ml 3.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 3.0 ml 1.0 ml 5.0 ml 1 flaska 1 flaska 50 ml 30 ml 20 ml 10 ml 5 ml 10 ml 20 ml 30 ml 50 ml 1 flaska Beredning av tvättlösning Beredning av tvättbuffert Bered önskad mängd tvättlösning genom utspädning av Wash Buffer 21X i destillerat vatten Bered önskad mängd nedan. tvättbuffert genom utspädning av Wash Buffer 21X i destillerat (1+20) enligt tabellen Blanda noggrannt. vatten (1+20) enligt tabellen nedan. Blanda noggrant. Antal plattor Antal plattor/ strips Wash Buffer Wash 21X Buffer 21X Destillerat Destillerat vatten vatten 10 plattor 6 strips 5 plattor 1 platta 3 plattor 2 plattor 2 plattor 3 plattor 1 platta 5 plattor 10 plattor 2 flaskor20 ml 180 ml 35 ml 110 ml 70 ml 70 ml 110 ml 35 ml 180 ml 1 flaska 8000 ml 3600 ml 2200 ml 1400 ml 700 ml 400 ml 700 ml 1400 ml 2200 ml 3600 ml 8000 ml Förvaring, efter utspädning: 2–8°C i upp till 4 veckor. PROVTAGNING OCH HANTERING Serum Ta blod genom venpunktion, låt det koagulera, och separera serumet genom centrifugering. Prover kan förvaras vid 2–8°C i upp till 24 timmar. För längre tidsperioder, förvara proverna vid –20˚C. Undvik upprepad frysning och upptining. Plasma Ta blod genom venpunktion och sätt till rör innehållande heparin eller EDTA som motverkar koagulation och separera plasmadelen. Prover kan förvaras vid 2–8°C i upp till 24 timmar. För längre tidsperioder, förvara proverna vid –20˚C. Undvik upprepad frysning och upptining. 56 56 Provbehandling Normalt sett behövs det ingen utspädning, men prover som innehåller >200 mU/l bör spädas ut Provbehandling 1+9 v/v med Calibrator 0. Provbehandling Provbehandling Normalt sett behövs det ingen utspädning, men prover som innehåller >200 mU/l bör spädas ut Det är svårare attdettillämpa testet påmen individer som redan genomgår insulinbehandling på Normalt sett behövs ingen spädning, Normalt sett behövs det ingen menprover proversom sominnehåller innehåller>200 >200mU/l mU/lbör börspädas spädas ut 1+9 v/v med Calibrator 0. utspädning, grund av bildning av anti-insulinantikroppar som kan påverka provresultatet. 1+9 v/v med Calibrator 0. 1+9 Det v/v medsvårare Calibrator 0. att tillämpa på individer sompåverkar redan genomgår insulinbehandling på Starktärlipemiska, ikteriska ellertestet hemolyserade prover inte testresultatet. Det äravsvårare testet på individer redan genomgår insulinbehandling på grund bildningattavtillämpa anti-insulinantikroppar somsom kan påverka provresultatet. grund av bildning av anti-insulinantikroppar som kan påverka provresultatet. TESTETS UTFÖRANDE Starkt lipemiska, ikteriska eller hemolyserade prover påverkar inte testresultatet. TESTETS FÖRFARANDE Alla reagenser och prover måste före användning. Starkt lipemiska, ikteriska ellerrumstempereras hemolyserade prover påverkar inte testresultatet. reagenser och rumstempereras före användning EnAlla kalibratorkurva skaprover ingå imåste varje analys. TESTETS FÖRFARANDE En kalibratorkurva ska ingå i varje analys. TESTETS FÖRFARANDE Alla reagenser och prover måste rumstempereras 1. Bered enzymkonjugatlösning och tvättlösning. före användning Alla reagenser och prover En kalibratorkurva skamåste ingå irumstempereras varje analys. före användning 2. Gör i ordning tillräckligt många mikrotiterplattbrunnar för att rymma duplikat av Calibrators kalibratorkurva ska ingå i varje analys. 1.Enoch Bered enzymkonjugatlösning och tvättlösning. prover. 1.2.Bered och tvättlösning. Gör ienzymkonjugatlösning ordning mikrotiterplattbrunnar för att rymma duplikat av Calibrators 3. Pipettera 25 µltillräckligt vardera avmånga Calibrators och prover i lämpliga brunnar. 2. Gör tillräckligt många mikrotiterplattbrunnar för att rymma duplikat av Calibrators ochi ordning prover. 4. Tillsätt 100 µl enzymkonjugatlösning till varje brunn. och prover. 25 µl vardera av Calibrators och prover i lämpliga brunnar. Pipettera 5.3. Inkubera på en plattskak (700-900 rpm) i 1 timme vid rumstemperatur (18–25°C). 3.4.Pipettera 25 µlµlvardera av Calibrators och prover i lämpliga brunnar. Tillsätt6plattan 100 varje brunn. 6. Tvätta gånger6enzymkonjugatlösning med 700med µl per brunn,tillanvänd en automatisk microtiterplatt-tvätt med gånger en automatisk mikrotiterplatt-tvättare eller: 4.5.Tillsätt 100 på µl enzymkonjugatlösning till varje brunn. Inkubera en plattskak (700-900 rpm) i 1 timme vidtillrumstemperatur (18–25°C). overflow-funktion. Använd Tillsätt inte soak-funktion vid tvättproceduren. varje brunn. Aspirera Aspirera reaktionsvolymen. 350 µl tvättbuffert 5.6.Inkubera på en plattskak (700-900 rpm) i 1 timme vid rumstemperatureller: (18–25°C). Tvätta plattan 6 gånger med en automatisk mikrotiterplatt-tvättare Eller manuellt, all vätska. Upprepa 5 gånger. 6. Tvätta plattan 6 gånger med engenom automatisk mikrotiterplatt-tvättare eller: till varjeden brunn. Aspirera Aspirera 350 tvättbuffert Avlägsna reaktionslösningen attpåµl vända microtiterplattan upp och ner över enmot ett Efter sistareaktionsvolymen. tvätten, vänd uppTillsätt och ned plattan och knacka med stadig hand till varje brunn. Aspirera Aspirera reaktionsvolymen. Tillsätttill 350 µl tvättbuffert all vätska. Upprepa 5 gånger. slask. Tillsätt 350 µl tvättlösning varje brunn. Avlägsna tvättlösningen, knacka absorberande papper. allplattan vätska. Upprepa 5vänd gånger. bestämt flera gånger absorberande papper att taden bortmed överfödig Efter sista tvätten, upppå ochvarje nedbrunn. på plattan och för knacka stadig vätska. hand mot ett 7. Tillsätt 200 µl Substrate TMB till Efter sista tvätten, vänd upplångvarig och ned soak på plattan knacka den med stadig hand mot ett Upprepa 5 gånger. Undvik under och tvättproceduren. absorberande papper. 8. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur (18–25°C). absorberande Tillsätt50 200µl µlpapper. Substrate till varje brunn. 9.7. Tillsätt Stop solutionTMB till varje brunn. 7.8.Tillsätt 200 iµl15Substrate TMB till varje brunn.(18–25°C). Inkubera vid rumstemperatur Placera plattanminuter på en plattskak i ca 5 sekunder för att se till att lösningen blandas. 8.9.Inkubera i 15µlminuter vid rumstemperatur (18–25°C). Tillsättoptisk 50 Stop solution tillnm varje densitet vid 450 ochbrunn. beräkna resultaten. 10. Avläs 9. Tillsätt 50 plattan µl Stop på solution till varjei ca brunn. Placera en plattskak 5 sekunder för att se till att lösningen blandas. Avläs inom 30 minuter. på en plattskak i ca och 5 sekunder att se till att lösningen blandas. 10.Placera Avläs plattan optisk densitet vid 450 nm beräknaför resultaten. vid 450 nm och beräkna resultaten. 10. Avläs Avläsoptisk inomdensitet 30 minuter. Avläs inom 30 minuter. Obs! För att undvika kontamination rekommenderas att separata pipetter används för konjugat och substrat.KVALITETSKONTROLL INTERN Kommersiella kontroller såsom Mercodia Diabetes antigen control (Kod nr. 10-1164-01) och/ INTERN KVALITETSKONTROLL eller interna kontrollprover med låga, mellan och höga insulinkoncentrationer bör regelmässigt INTERN KVALITETSKONTROLL Kommersiella kontroller såsom Mercodia Diabetes antigen control (Kod nr. 10-1164-01) och/ 57 57 57 Svenska Svenska Svenska Svenska analyseras som okända och resultaten bör kartläggas dag för dag. Det tillhör goda laboratorieKommersiella kontroller såsom Mercodia Diabetes antigen control (Kod nr. 10-1164-01) och/ eller interna kontrollprover låga, mellan höga insulinkoncentrationer bör regelmässigt rutiner att anteckna följandemed uppgifter för varjeoch test: kitets lotnummer; kitkomponenternas eller interna kontrollprover med låga, mellan och höga insulinkoncentrationer regelmässigt analyseras som okända och resultaten bör kartläggas dag föroch dag. Det tillhörbör goda laboratorierekonstitutionsdatum; OD-värden för blankvärde, Calibrators kontroller. analyseras okändaföljande och resultaten börförkartläggas förlotnummer; dag. Det tillhör goda laboratorierutiner attsom anteckna uppgifter varje test:dag kitets kitkomponenternas rutiner att anteckna följande uppgifter varje test:Calibrators kitets lotnummer; kitkomponenternas rekonstitutionsdatum; OD-värden för för blankvärde, och kontroller. rekonstitutionsdatum; OD-värden för blankvärde, Calibrators och kontroller. BERÄKNING AV RESULTATEN BERÄKNING AV RESULTATEN Datorberäkning Datorberäkning Kalibratorkurva kan konstrueras genom att använda "cubic spline regression" med Kalibratorkurva kan konstrueras genom att använda "cubic spline regression" med absorbansvärdena för Calibrators, förutom Calibrator 0, mot insulin koncentrationen. absorbansvärdena för Calibrators, förutom Calibrator 0, mot insulin koncentrationen. Manuell beräkning Manuell beräkning 1. Märk ut absorbansvärdena som erhålls för Calibrators, förutom Calibrator 0, mot insulin1. Märk ut absorbansvärdena som erhålls för Calibrators, förutom Calibrator 0, mot insulinkoncentrationen på ett logpapper och konstruera en kalibratorkurva. koncentrationen på ett logpapper och konstruera en kalibratorkurva. 2. Avläs de okända provernas koncentration från kalibratorkurvan. 2. Avläs de okända provernas koncentration från kalibratorkurvan. Exempel på resultat Exempel på resultat Brunnar Identitet Brunnar Identitet 1 A–B Calibrator 0 1 A–B Calibrator 0 1 C–D Calibrator 1 * 1 C–D Calibrator 1 * 1 E–F Calibrator 2 * 1 E–F Calibrator 2 * 1 G–H Calibrator 3 * 1 G–H Calibrator 3 * 2 A–B Calibrator 4 * 2 A–B Calibrator 4 * 2 C–D Calibrator 5 * 2 C–D Calibrator 5 * 2 E–F Okänd 1 2 E–F Okänd 1 2 G–H Okänd 2 2 G–H Okänd 2 3 A–B Okänd 3 3 A–B Okänd 3 * Koncentrationen anges på flaskans etikett. A450 A450 0.070/0.071 0.070/0.071 0.105/0.106 0.105/0.106 0.202/0.204 0.202/0.204 0.434/0.470 0.434/0.470 1.348/1.351 1.348/1.351 2.451/2.476 2.451/2.476 0.222/0.214 0.222/0.214 0.546/0.538 0.546/0.538 1.941/1.978 1.941/1.978 Medelkoncentration Medelkoncentration mU/l mU/l 11.1 11.1 35.6 35.6 153 153 Exampel på kalibratorkurva Exampel på kalibratorkurva En typisk kalibratorkurva visas här. Använd inte den här kurvan för att fastställa verkliga testExempel på kalibratorkurva kalibratorkurva En typisk visas här. Använd inte den här kurvan för att fastställa verkliga testresultat. En typisk kalibratorkurva visas här. Använd inte den här kurvan för att fastställa verkliga resultat. testresultat. 1,00 O.D. 450 nm O.D. 450 nm 1,00 0,10 0,10 0,01 1 0,01 1 10 10 100 Insulin (mU/l) Insulin (mU/l) 58 58 100 1000 1000 OMRÄKNINGSFAKTOR 1 µg/l = 29 mU/l; 1 mU/l = 6.0 pmol/l METODENS BEGRÄNSNINGAR Liksom för alla andra diagnostiska tester, bör man inte basera en definitiv klinisk diagnos på resultaten från ett enstaka test. Diagnosen bör ställas av en läkare efter att alla kliniska fynd har utvärderats. Det är svårare att tillämpa testet på individer som redan genomgår insulinbehandling på grund av bildning av anti-insulinantikroppar som kan påverka provresultatet. Starkt lipemiska, ikteriska eller hemolyserade prover påverkar inte testresultatet. FÖRVÄNTADE VÄRDEN Det tillhör goda rutiner (good practice) att varje laboratorium skall etablera sin egen skala med förväntade värden. Följande resultat kan tjäna som vägledning till dess att laboratoriet har samlat tillräckligt med egna uppgifter. Nivåer för 137 fastande, till synes friska testindivider, gav ett medelvärde på 9.2 mU/l, ett medianvärde på 6.9 mU/l och en spännvidd, som motsvarar de mittersta 95% av observationerna, på 2–25 mU/l. ANALYTISKA PRESTANDA EGENSKAPER Gräns för påvisbarhet Detektionsgränsen är 1 mU/l beräknad som två standardavvikelser ovanför Calibrator 0. ”Recovery” ”Recovery” vid tillsats är 94–113% (medel 104%). ”Hook-effekt” Prover med en koncentration på upp till 30 000 mU/l kan mätas upp utan att visa felaktiga låga resultat. Precision Varje prov analyserades sexfaldigt vid sex olika tillfällen. Prov 11 36 80 154 inom testet % 3.4 4.0 2.8 3.2 Variationskoefficient mellan totalt testet % testet % 3.6 2.6 2.8 2.9 5.0 4.7 4.0 4.4 59 59 Svenska Svenska 1 2 3 4 Medelvärde mU/l Specificitet Följande korsreaktioner har hittats: C-peptid < 0.01% C-peptide < 0,01% Proinsulin < 0.01% Specificitet Specificitet Proinsulin < 0,01% Proinsulin des (31-32) < 0.5% Följande korsreaktioner har hittats: Proinsulin des < 0,5% Följande korsreaktioner Proinsulin split(31–32) (32-33) har hittats: < 0.5% Proinsulin (32–33) 0,5% des (64-65) 98% C-peptide split <<0,01% C-peptide split (65-66) < 0,01% 56% Proinsulin 98% Proinsulin des (64–65) < 0,01% Proinsulin < 0,01% Insulin lispro < 0.000003 Proinsulin split (65–66) Eli Lily) 56% Proinsulin des(Humalog®, (31–32) < 0,5% Proinsulin des (31–32) < 0,5% Insulin lispro aspart(Humalog®, Eli Lilly) <<3.2% 0,006% Insulin Proinsulin split (32–33) < 0,5% Proinsulin split (32–33) < 0,5% IGF-I < 0.02% Insulin aspart < 0,006% Proinsulin des (64–65) 98% IGF-II < 0.02%98% Proinsulin des (64–65) Rat Insulin split (65–66) 0,7% Proinsulin 56% Råttinsulin 0.7%56% Proinsulin split (65–66)® < 0,006% Insulin lispro (Humalog , Eli Lilly) Musinsulin <0.3% 0,006% Insulin lispro (Humalog®, Eli Lilly) KALIBRERING Insulin aspart < 0,006% Grisinsulin 374% Insulin aspart < 0,006% Mercodia Reference Preparation 66/304. Fårinsulin 48%0,7% Rat InsulinInsulin ELISA kit kalibreras mot 1st International Rat Insulin Bovint insulin 31%0,7% GARANTI KALIBRERING KALIBRERING De presenterade från utförandet med användning påvisat förfarande. Mercodia Insulinuppgifterna ELISA kit kalibreras mot 1sterhölls International Referenceav Preparation 66/304. Mercodia Insulin ELISA kit kalibreras mot 1st International Reference Preparation 66/304. Förändringar eller modifieringar av förfarandet som inte rekommenderas av Mercodia AB kan påverka resultaten. I dessa fall frånsäger sig Mercodia AB allt ansvar, underförstått såväl GARANTI GARANTI som lagstadgat, inklusive underförstådd säljbarhetsoch användning användbarhetsgaranti. De presenterade uppgifterna från utförandet erhölls med av påvisat förfarande. De presenterade uppgifterna från utförandet erhölls med användning av påvisat förfarande. Mercodia AB ochmodifieringar deras auktoriserade distributörer skallrekommenderas i dessa fall inteavhållas ansvariga Förändringar eller av förfarandet som inte Mercodia AB Förändringar eller modifieringar av förfarandet som inte rekommenderas av Mercodia AB för som orsakats Iindirekt ellerfrånsäger som en konsekvens. kanskador påverka resultaten. dessa fall sig Mercodia AB allt ansvar, underförstått såväl kan påverka resultaten. I dessa fall frånsäger sig Mercodia AB allt ansvar, underförstått såväl som lagstadgat, inklusive underförstådd säljbarhets- och användbarhetsgaranti. som lagstadgat, inklusive underförstådd säljbarhets- och användbarhetsgaranti. Mercodia AB och deras auktoriserade distributörer skall i dessa fall inte hållas ansvariga Mercodia AB och deras auktoriserade distributörer skall i dessa fall inte hållas ansvariga för skador som orsakats indirekt eller som en konsekvens. för skador som orsakats indirekt eller som en konsekvens. REFERENSER Gaines-Das, R.E. and Bristow, A.F. (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16:179-186 Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. (2002) Use of a novel double-antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054 Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B. (2004) Supplementation with trans10 cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019 Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF. (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-2365 Sjostrand M, Gudbjornsdottir S, Holmang A, Lonn L, Strindberg L, Lonnroth P. (2002) Delayed transcapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects. Diabetes 51:2742-2748 60 60 61 62 63 Add Calibrators and samples 25 µl Calibrators und Proben beigeben Ajout de Calibrators et d'échantillons Añadir Calibrators y muestras Aggiungere Calibrators e campioni Tilsæt Calibrators og prøver Tillsätt Calibrators och prover Incubate Inkubieren Incubation Incubar Incubazione Inkuber Inkubera Add enzyme conjugate solution 100 µl Enzymkonjugatlösung beifügen Ajout du conjugué enzymatique Añadir la disolución de conjugado enzymático Aggiungere la soluzione enzima coniugato Tilsæt enzymekonjugatopløsning Tillsätt enzymekonjugatlösning Add Stop Solution Incubate Inkubieren Añadir Stop Solution 1 hour at 18–25°C on a shaker 1 Stunde auf einem Schüttler bei 18–25°C Incubation 1 heure à 18–25°C sur un agitateur secoueur de plaques Incubar 1 hora a 18–25°C en un agitador de placas Incubazione 1 ora a 18–25°C in una piastra shaker Inkuber 1 time ved 18–25°C på et rystebord Inkubera 1 timme vid 18–25°C på en plattskak Wash Waschen Rinçage Lavar Lavare Skyl Tvätta 6 times 6 mal 6 rinçages 6 veces 6 volte 6 gange 6 gånger Add Substrate TMB Substrate TMB beigeben Ajout de Substrate TMB Añadir Substrate TMB Aggiungere Substrate TMB Tilsæt Substrate-TMB Tillsätt Substrate TMB 200 µl 15 minutes (18–25°C) 15 Minuten (18–25°C) 15 minutes (18–25°C) 15 min (18–25°C) 15 minuti (18–25°C) 15 min (18–25°C) 15 minuter (18–25°C) Stop Solution beifügen Ajout de Stop Solution Aggiungere Stop Solution Tilsæt Stop Solution Tillsätt Stop Solution 50 µl Shake for 5 sec to ensure mixing 50 µl Sicherstellen von Durchmischung 5 Sek. schütteln 50 µl Secouer pendant 5 secondes pour bien mélanger 50 µl Agitar durante 5 segundos para asegurar el mezclado 50 µl Scuotere per 5 secondi per assi curarsi che sia tutto mescolato 50 µl Ryst i 5 sekunder for sikre blanding 50 µl Skaka i 5 sekunder för att se till att lösningen blandas Measure A450 Messung A450 Mesure de A450 Medir A450 Misura A 450 Aflæs A450 Mät vid A450 31-3107 31-3107 Revised 2005-12-11 Revised 2009-05-05 X-O Graf Tryckeri AB SUMMARY PROTOCOL SHEET/ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLBLATTES/ FEUILLE DE PROTOCOLE RESUMEE/HOJA DE RESUMEN DEL PROTOCOLO/PROTOCOLLO DI SINTESI/OVERSIGTSPROTOKOLARK/SAMMANFATTNINGSPROTOKOLL Mercodia Insulin ELISA
![LIAISON® Insulin ([REF] 310360) 1. FINALIDAD DEL ENSAYO El](http://vs1.manualzilla.com/store/data/006302394_1-3e681360bdd695fe33f9e103ae3bebf6-150x150.png)
