Download MP Affymetrix

DIRECCIÓN DE INVESTIGACIÓN
Código:
Rev.
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
TÉCNICOS
Hoja: 21 de 56
III. PCR
1. Saque todos los reactivos necesarios para el procedimiento y asegúrese de que estén
descongelados. Mezcle y centrifugue antes de iniciar la preparación de la mezcla.
2. Alicuote 10µl de la muestra ligada diluida por triplicado. Mantenga las muestras en un bloque frío y
en hielo. Coloque un film sobre la placa para protegerla de la contaminación.
3. Prepare la siguiente Mezcla Maestra (Master Mix) de PCR en hielo. (3 reacciones de PCR por
muestra) Esta debe prepararse justo antes de utilizarse.
Reactivos
Agua
Titanium Taq PCR Buffer (10X)
GC Melt (5M)
dNTP (2.5mM each)
PCR Primer 002 (100µM)
Titanium Taq DNA Polymerase (50X)
Total
1 reacción (µL)
3 reacciones (µL)
39.5
10
20
14
4.5
2
90
118.5
30
60
42
13.5
6
270
Se recomienda añadir un control negativo para evaluar la presencia de contaminación
4. Añada 90µl del PCR Master Mix para obtener un volumen final de 100µl. Asegúrese de mezclar bien
la mezcla maestra antes de agregarla al DNA ligado.
5. Mezcle la reacción en un vortex durante 3 segundos y luego centrifugue a 2000 rpm. Durante 1 min.
6. Programe el termocilador según la marca de la siguiente forma:
GeneAmp® PCR System 9700
Temperatura
94ºC
94ºC
60ºC
68ºC
68ºC
4ºC
Tiempo
3 minutos
30 segundos
45 segundos
60 segundos
7 minutos
Ciclos
1X
30X
1X
∞
Si no va a procesar la
muestra inmediatamente guarde a -20ºC
7. Al finalizar la PCR, tome una alicuota de 3µl y agregue 3µl de buffer de muestra para gel de
electroforesis. Corra un gel de Agarosa/ TBE al 2% a 120V durante 50 minutos. Asegúrese que las
muestras estén en el rango de tamaña requerido (1500-200pb)
CONTROL DE EMISIÓN
Elaboró :
Nombre
Firma
Fecha
Revisó :
Autorizó: