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CAMPOS-ÁLVAREZ et al.: EXPRESIÓN DE GENES ABUNDANTES EN EMBRIOGÉNESIS TARDÍA
en algunos casos, en respuesta a la aplicación de ácido
abscísico (Galau et al., 1986; Mundy y Chua, 1988;
Harada et al., 1989; Ingram y Bartels, 1996; Close, 1997).
Las proteínas LEA se han agrupado en al menos seis familias sobre la base de la similitud en secuencias (Ingram
y Bartels, 1996; Colmenero-Flores et al., 1997). Aunque
no se ha detectado una similitud significativa entre los
miembros de las diferentes familias, una característica
unificadora y sobresaliente de estas proteínas es su alta
hidrofilicidad y su alto porcentaje de residuos de glicina
(Baker et al., 1988; Dure, 1993). Las proteínas LEA se
han identificado en un amplio rango de especies vegetales, al grado que se han considerado ubicuas en el Reino
Vegetal (Ingram y Bartels, 1996; Close, 1997). Aunque
no se ha demostrado una función precisa para ninguna
de las proteínas LEA, evidencia circunstancial e indirecta apuntaría a que estas proteínas cumplen una función
como protectoras de estructuras y proteínas celulares
durante lapsos de estrés por sequía o congelamiento
(Ingram y Bartels, 1996; Xu et al., 1996; Imai et al., 1995;
Close, 1997; Swire-Clark y Marcotte, 1999).
Las semillas secas almacenan una considerable cantidad de proteínas LEA y de sus respectivos mensajes, la
mayoría de los cuales son degradados durante la germinación, lo que muy probablemente provee a la semilla de
precursores que serán usados para sintetizar la nueva información y las estructuras necesarias para el proceso de
desarrollo siguiente, la formación de una plántula (Bewley
y Black, 1994).
Dado que las semillas osmoacondicionadas son metabólicamente activas, pero no germinan, es necesario conocer los mecanismos involucrados en este proceso. Puesto que los transcritos y proteínas de genes tipo lea generalmente se acumulan durante la fase tardía del desarrollo de la semilla y se degradan al inicio del proceso
germinativo, como un acercamiento a la caracterización
del mismo, en este trabajo se determinó los patrones de
acumulación de los transcritos y de las proteínas de diferentes genes tipo lea en semillas de dos especies durante
el osmoacondicionamiento, una monocotiledónea y una
dicotiledónea. Como hipótesis se plantea que si el OSMA
representa un estado de germinación incipiente, se tendrá que ver la gradual degradación de las proteínas LEA
con el paso del tiempo de OSMA; por el contrario, si
durante el OSMA las semillas no han encendido el proceso germinativo, las proteínas LEA serán estables.
MATERIALES Y MÉTODOS
Semillas
Se usaron semillas de la variedad Chalqueño de maíz y semillas
de frijol, variedad Negro Jamapa. Las semillas mostraron una viabilidad de 90 a 95% después de la imbibición.
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has not been demonstrated for any Lea protein,
circumstantial and indirect evidence indicates that they
play a role as protectors of cellular structures and proteins
during drought and freezing stress (Ingram and Bartels,
1996; Xu et al., 1996; Imai et al., 1995; Close, 1997;
Swire-Clark and Marcotte, 1999).
Dry seeds contain a considerable store of Lea proteins
and their messages, most of which are degraded during
germination, very likely providing the seeds of precursors
that will be used to build the new information and
structures necessary for the following developmental
process (Bewley and Black, 1994).
Since osmoprimed seeds are metabolically active, but
do not germinate, it is important to know the mechanisms
involved in this process. As lea-type transcripts and
proteins generally accumulate during late seed
development and are degraded in the early germination
stages, the experimental approach taken to characterize
osmopriming consisted in determining the patterns of
transcript and protein accumulation of different lea-type
genes in two seeds species, a monocotiledoneous and a
dicotiledoneous. The hypothesis is that if osmopriming
represents an early germination stage, there will be a
gradual Lea transcripts degradation with osmopriming
time. On the contrary, if during osmopriming the
germination process is not triggered, Lea transcrips will
be stable.
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Seeds from maize (Zea mays L.) cv. Chalqueño and common beans
(Phaseolus vulgaris L.) cv. Negro Jamapa were used. They showed
90-95% germination after imbibition.
Chemicals
Polyethylene glycol 8000 (PEG) and Tris (tris hydroxymethyl
amino methane) were from Sigma-Aldrich Chemicals Co., Hybond-N
membranes, enhanced chemiluminescence (ECL) kit and [32P] dCTP
(3000 Ci/mmol) were from Amersham International; Random Primer
kit was from Gibco, BRL. Protease inhibitor cocktail was from
Boehringer. All other reagents were of analytical grade.
cDNA probes
Complementary DNA (cDNA) probes from common beans were:
group-4 Lea cDNA (Pvlea4-25), group-6 Lea (Pvlea18) and class I
heat shock protein cDNA (Pvhsp17-19). All encode for transcripts and
proteins highly accumulated during late embryogenesis in bean seeds
(Colmenero-Flores et al., 1997). Probes for maize seeds were: a partial
cDNA clone coding for a class I heat shock protein (Zmhsp 17.4, Shen
et al., 1996) and a cDNA coding for a group 2 Lea protein (also called
dehydrins) (rab 17; Goday et al., 1994).