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les bandelettes.
3. Ajouter dans chaque puit 1 ml de Tampon d’Hybridation (HYB, vert) préchauffé et homogénéisé. Homogénéiser jusqu’à ce que le mélange devienne
une couleur homogène.
Eviter les éclaboussures vers les autres puits.
4. Déposer une bandelette dans chaque puit utilisé.
Les bandelettes doivent être entièrement recouvertes par le liquide, avec la face
sensibilisée (identifiable par la ligne de repère) tournée vers le haut. Les bandelettes mal orientées doivent être remises en position à l'aide de pincettes propres. Afin d'éviter toute contamination, bien nettoyer les pincettes après chaque
utilisation. Cella vaut aussi pour tous les étapes suivantes.
5. Placer la plaque dans bain-marie agitateur/TwinCubator® et incuber 30 minutes à 45°C.
Pour le bain-marie agitateur sélectionner une fréquence d'agitation suffisante
pour assurer un bon brassage de tampon. Ajuster le niveau de l’eau dans le bainmarie agitateur à mi-hauteur des puits de façon à assurer un bon transfert de
chaleur. Cela vaut aussi pour tous les étapes suivantes.
6. Aspirer le contenu des puits.
Utiliser par exemple une pipette pasteur reliée à une pompe à vide.
7. Ajouter à chaque puit 1 ml de Solution de Lavage Stringent (STR, rouge) et
incuber 15 minutes à 45°C dans bain-marie agitateur/TwinCubator®.
8. A partir de cette étape, travailler à température ambiante.
Eliminer la Solution de Lavage Stringent.
Vider la Solution de Lavage Stringent dans un container à déchets. Eliminer tout
le liquide résiduel en retournant les puits sur du papier absorbant (effectuer de
même pour les autres étapes de lavage).
9. Laver chaque puit avec 1 ml de Solution de Rinçage (RIN) et incuber pendant
une minute sous agitation. Vider la Solution de Rinçage.
10. Ajouter à chaque puit 1 ml de Conjugué dilué (voir ci-dessus) et incuber sous
agitation 30 minutes.
11. Vider le contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute à l’aide de 1 ml de
Solution de Rinçage (RIN). Vider RIN. Répéter ce rinçage une nouvelle fois,
puis rincer une fois avec environ 1 ml d'eau distillée à l'aide d'une pissette.
Bien éliminer toute trace d'eau dans les puits après cette dernière étape.
12. Ajouter 1 ml de Substrat dilué (voir ci-dessus) dans chaque puit et incuber sans
agitation à l’obscurité.
Le temps de révélation peut varier en fonction des conditions de déroulement du
test (de 3 à 20 minutes), notamment de la température de la pièce. Des temps de
révélation trop longs peuvent entrainer un bruit de fond qui peut géner l'interprétation des résultats.
13. Arrêter la réaction en rinçant brièvement deux fois à l'eau distillée.
14. A l'aide de pincettes, récupérer les bandelettes et les sécher entre deux couches de papier absorbant.
Solution de Lavage Stringent (STR) prêt à l'emploi
contient >25% d'un sel d'ammonium quaternaire,
<1% détergent anionique, colorant
20 ml
120 ml
Solution de Rinçage (RIN) prêt à l'emploi
Milieu tamponné, <1% NaCl, <1% de détergent
anionique
50 ml
360 ml
Conjugué Concentré (CON-C) concentré
contient de la phosphatase alcaline conjugué à la
streptavidine, colorant
0,2 ml
1,2 ml
Tampon Conjugué (CON-D)
Milieu tamponné, 1% agent bloquant, <1% NaCl
20 ml
120 ml
Substrat Concentré (SUB-C) concentré
contient Dimethyl Sulfoxide, composé
chromogénique
0,2 ml
1,2 ml
Tampon Substrat (SUB-D)
Milieu tamponné, <1% NaCl, <1% MgCl2
20 ml
120 ml
portoir, feuille de lecture
1 de chaque
4 de chaque
manuel d'utilisation, matrice
1 de chaque
1 de chaque
Matériel Requis mais Non Fourni
Bain-marie agitateur/TwinCubator®
Chronomètre
Eau distillée
Embouts de pipettes
(de préférence stériles avec filtre)
– Eprouvette
–
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–
–
Echantillon requis:
Prélèvement subgingivaux
Volume nécessaire:
20 µl de solution d'ADN amplifié par
échantillon
Durée du test:
approximativement 2 heures
Conservation:
2–8°C; pour conserver >4 semaines,
le mélange PN doivent être conservés
à −20°C
Classer et ranger les bandelettes à l'abri de la lumière. Une feuille de lecture est
fournie avec le kit, mais peut également être téléchargée à l'adresse suivante :
http://www.hain-lifescience.de/pdf/md_evaluation.pdf
La matrice fournie avec la trousse permet d'identifier chaque zone réactionnelle par
superposition. Chaque bandelette comprend 7 zones réactionnelles (voir figure).
Contrôle Amplification (AMP-C)
Le développement d'une ligne dans cette zone confirme le bon déroulement de
l'amplification (cf paragraphe Contrôle de Qualité).
Le seuil de détection pour chacune des cinq espèces bactériennes correspond à
leur seuil de pathogénicité.
Gants à usage unique
Papier absorbant
Pincettes
Pipettes réglables pour 10, 20, 200,
et 1000 µl
– Plateau agitateur
– Thermomètre calibré
Données Techniques
Lecture et Interprétation des Résultats
Contrôle Conjugué (CC)
Une ligne colorée doit se développer dans cette zone. Cette ligne témoigne de la
bonne fixation du conjugué et du bon déroulement de la révélation.
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Art. No.: 232
Art.-Nr.: 23296
12 tests
96 tests
Fabricant
Hain Lifescience GmbH, Hardwiesenstraße 1, 72147 Nehren, Allemagne
http://www.hain-lifescience.de