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L3 UE9 Agents Infectieux
4 Février 2013
Démarches diagnostiques
des infections virales
Dr Charlotte CHARPENTIER
MCU-PH
Laboratoire de Virologie – CHU Bichat-Claude Bernard
Université Paris 7
Démarches diagnostiques
des infections virales
DIAGNOSTIC DIRECT
Mise en évidence du virus ou
d’un de ses composants
(ADN, ARN, antigène)
DIAGNOSTIC INDIRECT
Détection des marqueurs
immunologiques spécifiques
produits par l’organisme en
réponse à l’infection virale :
Détection d’anticorps
Signe d’un contact avec le virus
DIAGNOSTIC DIRECT
Visualisation du
virus dans le
prélèvement
Détection
d’antigènes
viraux
Isolement du
virus sur
cultures
cellulaires
Détection du
génome viral
DIAGNOSTIC INDIRECT
Sérologies
Sérodiagnostic
PRELEVEMENT
Prélèvement
- Etape pré-analytique : La qualité des résultats dépend essentiellement
de la qualité du prélèvement.
- Echantillons cliniques doivent être :
 appropriés à l’examen demandé
 prélevés à un moment adapté à la chronologie de l’infection
 conservés dans des conditions favorables en attendant et durant leur
acheminement au laboratoire
- En cas de pathologie aiguë les prélèvements doivent être :
 réalisés le plus tôt possible après le début de l’infection, au moment
des symptômes cliniques (pour le diagnostic direct)
 avant la mise en route d’un traitement antiviral
 leur site dépend des symptômes cliniques et du mode de transmission
des virus suspectés
- En cas de diagnostic indirect : penser au délai d’apparition des Ac par rapport
au contage = fenêtre sérologique, réaliser un second prélèvement à distance
Prélèvement
- Types de recueil :
 tube sec
 tube contenant un anticoagulant (EDTA)
- Tube ou milieu de transport en fonction de la :
 nature du prélèvement
 technique à mettre en œuvre
Jamais de tube hépariné pour la biologie moléculaire (inhibiteur de
la Taq Polymérase : enzyme d’amplification de la PCR)
Technique
envisagée
Biologie
Moléculaire (charges
virales, PCR, séquençage)
Sérologies
virales
Tube
EDTA
sec
Délai pour
arriver au
laboratoire
<24h
<24h
Prélèvement
- Demande de mise en culture :
 Ecouvillon
 En présence OBLIGATOIRE de milieu de transport pour
décharger l’inoculum viral
Importance +++ de la
présence de CELLULES
dans le prélèvement (virus =
parasite intracellulaire strict)
Milieu de transport =
milieu de culture (milieu
nutritif permettant au
virus de rester
infectieux pendant le
délai prélèvement
prélè
=>
laboratoire)
- Prélèvements « précieux » :
 Prélèvements respiratoires : milieu de transport; arrivée le plus
rapidement possible au laboratoire ou conservation à +4°C
pendant 48h maximum
 LCR : tube sec stérile, arrivée dans les 24h, conservation à
Prélèvement : FEUILLE DE DEMANDE
- Nom, prénom, date de naissance du patient
- Date et heure du prélèvement
- Nature et site du prélèvement
NORME ISO15189
=> Accréditation
- Nom du prescripteur
- Nom du préleveur
- RENSEIGNEMENTS CLINIQUES sur le motif de la demande et chronologie
précise des événements => ESSENTIELS pour le choix de la technique et
pour l’interprétation des résultats (une feuille de demande mal renseignée
peut affecter le rendu des résultats).
Nécessité de l’ensemble de ces informations pour traiter
correctement l’analyse
 Non conformité => refusé et examen non réalisé
 Non informatif
DIAGNOSTIC DIRECT
Visualisation du
virus dans le
prélèvement
Détection
d’antigènes
viraux
Isolement du
virus sur
cultures
cellulaires
Détection du
génome viral
Visualisation de la particule virale en microscopie
électronique
• Coloration négative
 Simple et rapide ; grossissement : x 50 000-60 000
 Diagnostic de famille de virus (morphologie)
 Permettait :

Diagnostic des gastro-entérites : Rotavirus, Adénovirus, Norwalk like, Astrovirus,
Calicivirus
 Diagnostic à partir de liquide vésiculaire : HSV, VZV
 Diagnostic à partir de grattage cutané : Orf, molluscum contagiosum
Adénovirus
Rotavirus
VIH
Visualisation de la particule virale en microscopie
électronique
• Inconvénients :
 Nécessité d’un microscopiste entraîné
 Equipement coûteux, maintenance lourde (pas
présent dans tous les laboratoires de virologie)
 Sensibilité faible (Nécessite d’au moins 106
particules virales)
=> N’a plus d’indications en pratique courante
DIAGNOSTIC DIRECT
Visualisation du
virus dans le
prélèvement
Détection
d’antigènes
viraux
Isolement du
virus sur
cultures
cellulaires
Détection du
génome viral
Détection des antigènes dans le
prélèvement
• Détection d’antigènes intracellulaires
 Réaction d’immunofluorescence
 Immuno-enzymatique (immunoperoxydase)
 Immunodiffusion (savonnette, bandelette)
 Agglutination (latex)
•
Détection d’antigènes libres
 Immuno-enzymatique
Détection des antigènes dans le
prélèvement
• Détection d’antigènes intracellulaires
 Réaction d’immunofluorescence
Antigénémie pp65 (CMV)
Détection des antigènes dans le
prélèvement
• Détection d’antigènes intracellulaires
 Réaction d’immunoperoxydase
Antigénémie
pp65 (CMV)
Longtemps utilisée sur des cultures cellulaires => détection d’Ag précoces
=> rendu rapide en 48 heures
Détection des antigènes dans le
prélèvement
• Détection d’antigènes intracellulaires
 Réaction d’immunodiffusion, technique
immuno-chromatographie (savonnette,
bandelette)
VRS, Influenzavirus
Détection des antigènes dans le
prélèvement
• Détection d’antigènes intracellulaires
 Réaction d’agglutination (latex)
=> Seule indication en virologie clinique : Antigènes rotavirus
et adénovirus dans les selles
Diagnostic rapide par détection
d’antigènes viraux
Prélèvements respiratoires
VRS
Influenzavirus A et B
Parainfluenzavirus
Adénovirus
Selles
Rotavirus
Adenovirus
Peau
HSV
VZV
Sang
CMV
Diagnostic rapide par détection
d’antigènes viraux
• Avantages
 Résultats disponibles rapidement (de 10 min à 2 h)
• Inconvénients
 Faible sensibilité par rapport à la culture (jusqu’à 20%) et par
rapport à la biologie moléculaire (jusqu’à 50%)
 Spécificité dépendante de la qualité des anticorps
 Nécessité de prélèvements de bonne qualité
 Technique manuelle avec une lecture longue et subjective
(surtout pour immunofluorescence) nécessitant un technicien
expérimenté
Diagnostic des antigènes libres
 Antigène produit en excès et excrété dans le sérum
 Réaction immuno-enzymatique (ELISA)




Support solide (plaque, tube, bille)
Anticorps de capture monoclonal ou polyclonal
Anticorps de révélation couplés au système révélateur
Quantification possible
 Exemples

Détection de l’antigénémie HBs (VHB)

Détection de l’antigénémie p24 (VIH)
 Toute positivité doit toujours être suivie d’une neutralisation
pour s’assurer de la spécificité de l’Ag détecté (incubation avec
des Ac anti-p24 ou Ac anti-HBs puis dosage pour vérifier la négativation
en raison du complexe Ag/Ac formé)
DIAGNOSTIC DIRECT
Visualisation du
virus dans le
prélèvement
Détection
d’antigènes
viraux
Isolement du
virus sur
cultures
cellulaires
Détection du
génome viral
ISOLEMENT VIRAL
Réplication virale au sein de cellules vivantes :
3 modèles existants
-Animal entier (cobaye, souris, souriceau nouveau-né)
n’est plus utilisé en pratique (recherche)
- Œuf embryonné (Influenzavirus => fabrication du vaccin
antigrippal)
- Cultures cellulaires : Support de choix pour la
multiplication virale
ISOLEMENT VIRAL EN CULTURE
CELLULAIRE
METHODE DE REFERENCE EN VIROLOGIE
INTERETS :
 Diagnostiquer l’infection virale
 Apporter la preuve du caractère infectieux des
particules virales présentes dans le prélèvement
 Isolement et conservation de la souche
 Etudier la résistance du virus aux antiviraux
 Réaliser des enquêtes épidémiologiques
DIFFERENTS TYPES DE CELLULES UTILISES POUR LA
CULTURE CELLULAIRE
• Diploïdes (à durée de vie limitée)
- Pas de passage possible ou nombre de passages limité
- Inhibition de contact, nombre pair de chromosomes
 Cellules de primo-explantation : Rein de singe
- Susceptibles à de nombreux virus
- Chères
 Cellules embryonnaires : Fibroblaste humain embryonnaire (MRC5)
• Continues (immortelles)
- Cellules transformées
- Lignées cellulaires :
- HeLa (cellules cancer col utérus HPV)
- Vero (cellules épithéliales rein de singe)
- Hep2 (cellules issues carcinome pharyngé humain)
- LLC-MK2 (cellules épithéliales rein de singe)
- MDCK (cellules épithéliales rein de chien)
Peu onéreuses
Spectre de susceptibilité virale limité pour chaque lignée cellulaire
DIFFERENTS TYPES DE CELLULES
Sensibilité variable des types cellulaires aux différents
virus
 Nécessité de disposer de plusieurs types de cellules
 Au minimum fibroblastes embryonnaires humains
plus une ou deux lignées continues
Choix du type de cellules à inoculer dépendant du virus
recherché
ISOLEMENT VIRAL CLASSIQUE EN
CULTURE CELLULAIRE
Effet cytopathogène (ECP) : à l’observation à
l’état frais au microscope
= Ensemble des modifications induites dans la cellule
infectée
 Nature des cellules modifiées et délai d’apparition
 Arrondissement des cellules,
volume, formation de syncytia
augmentation
 Evolution de la progression des foyers
de
Culture cellulaire : effet cytopathogène CMV
Culture cellulaire : effet cytopathogène HSV
Culture cellulaire : effet cytopathogène VRS
ISOLEMENT VIRAL CLASSIQUE EN
CULTURE CELLULAIRE
• Effet cytopathogène (ECP) : à l’observation à l’état frais
au microscope
• Confirmation
 Par immunofluorescence (ex : HSV-1, HSV-2, CMV, …)
 Par hémadsorption (virus de la rubéole)
 Par neutralisation
(picornavirus)
avec
anticorps
spécifiques
• Conservation des souches (études ultérieures possibles :
sensibilité aux antiviraux, épidémiologie)
Problèmes associés à la culture cellulaire
• Souvent longue (jusqu’à 4 semaines)
• Souvent faible sensibilité, qui dépend en grande partie de
la qualité du prélèvement (quantité d’inoculum viral), mais
aussi du milieu de culture utilisé
• Sensible à la contamination bactérienne
• Sensible à diverses substances toxiques présentes dans
le prélèvement
• De nombreux virus ne sont pas cultivables, exemples :
– VHB
– Parvovirus
– Papillomavirus
Virus faciles à isoler en culture cellulaire
Herpes simplex
Cytomégalovirus
Adénovirus
Virus Coxsackie B
Echovirus
Influenza
Parainfluenza
Rhiniovirus
Virus des oreillons
Virus respiratoire syncytial
Virus de la varicelle et du zona
Virus moins fréquemment isolés
Virus de la rougeole
Virus de la rubéole
Virus Coxsackie A
CAS PARTICULIER DU VIH
Culture sur lymphocytes de donneurs séronégatifs
REGLES DE SECURITE POUR LA CULTURE DE VIRUS :
Laboratoire de haute sécurité microbiologique L3 (microorganisme de classe 3) : ayant un pouvoir pathogène important
chez l'homme mais présentant un risque mineur pour la
collectivité et contre lesquels une prophylaxie ou des
traitements efficaces sont connus.
DIAGNOSTIC DIRECT
Visualisation du
virus dans le
prélèvement
Détection
d’antigènes
viraux
Isolement du
virus sur
cultures
cellulaires
Détection du
génome viral
DÉTECTION / QUANTIFICATION DES ACIDES NUCLÉIQUES
• Génomes viraux :
- ADN
- ARN (étape de reverse transcription supplémentaire après
extraction => ADN)
• Prélèvements :
- sang total (plasma, sérum, leucocytes)
- autres (urines, LCR, expectorations, écouvillonnages,
ponctions, sperme, biopsies, cultures)
• Conditions de prélèvement :
- tube sec => sérum (rare)
- tube EDTA ou ACD => plasma (+ fréquent), sang total
- urines, LCR, LBA, plasma séminal : riches en inhibiteurs de PCR
(présence de contrôle interne pour vérifier absence de ces inhibiteurs)
héparine inhibiteur de la Taq polymérase, même si les techniques actuelles
d’extraction y sont moins sensibles
Détection des acides nucléiques :
EXTRACTION
 Lyse de la cellule et dénaturation des complexes
nucléo-protéiques (détergent)
 Séparation des protéines (solvant)
 Précipitation des acides nucléiques (alcool)
Extraction
manuelle
Phénol/
chloroforme
=> méduse
d’ADN
Extraction automatisée
Détection des acides nucléiques par
AMPLIFICATION DE LA CIBLE
Polymerase Chain Reaction : PCR
1 : Dénaturation
95°C
3 : Elongation
72°C
2 : Hybridation des
amorces
Autour de 50°C
Augmentation
exponentielle
du matériel
d’ADN à
chaque cycle
d’amplification
AMPLIFICATION PAR PCR
Courbes de PCR
PCR QUALITATIVE
• Détection => Présence ou non du génome viral
• Etude en phase plateau
Patients
PCR :
thermocycleur
Migration
électrophorétique
des amplicons sur
gel d'agarose
1 2
3
4 5 6 + -
La révélation de l'ADN sur le
gel d'agarose est réalisée par
le bromure d'éthidium (BET)
BET : intercalant de
l’ADN=> risque
mutagène et
cancérigène
PCR QUANTITATIVE : PCR EN TEMPS REEL
Reporter (émission de
fluorescence)
Quencher (capteur de
la fluorescence)
PCR QUANTITATIVE
• Quantification du génome viral => Charge virale => Nombre de
copies de virus/mL
• Etude en phase exponentielle de la PCR
1 courbe = 1 prélèvement
Ligne seuil
Cycle seuil (Ct)
La courbe standard permet de
déterminer la quantité pour un cycle seuil
donné
PCR QUALITATIVE
APPLICATIONS EN VIROLOGIE MEDICALE :
• Recherche de virus dans le LCR
HSV, VZV, Entérovirus
• Recherche de virus dans les prélèvements respiratoires (LBA,
aspirations naso-pharyngées, …)
CMV, Infuenzavirus
• Recherche de virus dans les prélèvements de biopsie
cutanéo-muqueuses
• Recherche de l’ADN proviral du VIH
Diagnostic de l’infection VIH chez les nouveaux-nés
PCR QUANTITATIVE
APPLICATIONS EN VIROLOGIE MEDICALE :
• Charges virales CMV, EBV (suivi post-greffe, patients immunodéprimés)
• Charges virales VIH, VHB, VHC (suivi efficacité traitement)
PCR QUALITATIVE « MULTIPLEX »
Multiplex : Recherche de plusieurs génomes viraux dans la même
réaction de PCR (plusieurs couples d’amorces dans le mélange
réactionnel)
Dans le même test :
- 16 virus ARN
- 2 virus ADN
- 4 bactéries
Selon le matériel utilisé résultats en moins de 6 heures
Résultats
PCR suivie d’une lecture sur un séquenceur
Les pics correspondent à une taille d’amplicons
PCR QUALITATIVE « TECHNOLOGIE CLE EN MAIN »
 Intégration des étapes d’extraction,
amplification, nested-PCR, et analyse en un
seul et même instrument
 Résultats en 1 heure
 Le panel de détection proposé vous permet
d'identifier simultanément plus de 15 virus
respiratoires différents et 4 bactéries
(3) PCR
(2) extraction
(1) échantillon
(4)
nestedPCR
AUTRES TECHNIQUES DE BIOLOGIE
MOLECULAIRE
 Hybridation inverse avec sondes spécifiques
 Séquençage du génome viral
 Analyses phylogénétiques
AUTRES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Hybridation avec sondes spécifiques :
Détection à l’aide d’oligonucléotides spécifiques d’un
génotype donné, incubation avec l’amplicon
=> Identification des génotypes VHC et Papillomavirus
VHC
HPV
1
Génotype 2
2
Génotype 1b
3
Génotype 3
4
5
Génotype 1a
6
Génotype 4
7
AUTRES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Séquençage du génome viral :
Détection des mutations de résistance aux antiviraux
(VIH, VHB, VHC, CMV, HSV)
AUTRES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Analyses phylogénétiques : évaluation de la proximité de
différentes séquences (liens épidémiologiques ?)
Diagnostic rapide par détection du
génome viral : Biologie Moléculaire
• Avantages
 Rapidité
 Sensibilité +++
 Applicable à l’analyse de l’ensemble des virus
• Inconvénients
 Impact de la variabilité génétique +++ => non hybridation (+++ avec
les virus à ARN)
 Pas d’information sur le caractère infectieux des virus détectés (virus
entier ? défectif ?)
 Présence possible d’inhibiteurs
 Risque de contamination (séparation des zones pré- et post-PCR)
DIAGNOSTIC INDIRECT
Sérologies
Sérodiagnostic
DIAGNOSTIC INDIRECT : SÉRODIAGNOSTIC
 Mise en évidence des anticorps spécifiques
synthétisés par l’hôte en réponse à l’infection virale
• Nature du prélèvement
 Sérum
 Autres : plasma, LCR, humeur aqueuse, liquide articulaire...
• Qualité
 Décantation du sang dans un délai de 24 heures
 Vérification de l’aspect (lipides, bilirubine)
• Sérothèque
 Conservation 1 an à -20°C (sérothèque légale)
 3 ans pour le diagnostic anténatal
PROFIL SÉROLOGIQUE TYPIQUE APRÈS UNE
INFECTION VIRALE AIGUË
Titre Ac
Réponse II
Réponse I
IgM
IgG + IgM
IgM
Seuil de détection
Séroconversion
Contage
Fenêtre
sérologique
Ré-activation/Ré-infection
Au cours de la ré-activation ou de la ré-infection, les IgM
peuvent être absentes ou présentes à de très faibles
titres et de façon transitoire.
Réaction Immuno-Enzymatique ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
Lecture
Révélation
Substrat de l’enzyme
Deuxième Ac marqué par une Enzyme
Sérum du patient
Antigène viral
Support
Traité de virologie médicale, Huraux, Agut, Nicolas, Peigue-Lafeuille
DIAGNOSTIC INDIRECT : SÉRODIAGNOSTIC
• Nature de l’antigène de capture des anticorps
 Virus entier purifié (historique, 1ère génération)
 Protéines virales natives ou recombinantes (2ème génération)
 Peptides de synthèse (3ème génération)
• Détection des anticorps
 Totaux (IgG + IgM)
 IgG ou IgM
• Expression des résultats
 Qualitatif (positif, négatif, douteux)
 Quantitatif (titre)
Test ELISA (Dépistage VIH)
Les puits colorés correspondent à un signal positif : présence d’Ac
DÉPISTAGE COMBINÉ : Ac + Ag
=> ELISA 4ème génération
VIH, VHC
Diagnostic de l’infection 15 à 17 jours après le contage =>
Réduction de la durée de la fenêtre sérologique
SÉRODIAGNOSTIC : INDICATIONS
• Détermination du statut immunitaire d’un individu vis-àvis d’un virus
• Dépistage ; avant vaccination ; bilan de greffe ; études
épidémiologiques
• Examen d’un seul sérum
• Résultat qualitatif
• Exemples : VIH, VHC, VHB (Ag HBs), HTLV, CMV, EBV, …
• Evaluation de l’immunité résiduelle après une infection
ou une vaccination
• Examen d’un seul sérum
• Résultat quantitatif
• Exemple : VHB (Ac anti-HBs)
SÉRODIAGNOSTIC : INDICATIONS
• Diagnostic d’une infection aiguë en cours ou récente :
 Examen de deux sérums successifs à 15-21 jours
d’intervalle
- Séroconversion (apparition d’Ac)
- Elévation significative du titre des anticorps : x 4
 Examen d’un seul échantillon
- Recherche d’IgM
- Index d’avidité des anticorps IgG (capacité d’un Ac à se
fixer à l’Ag) permet de dater l’infection
Avidité faible => infection < 3 mois
Avidité forte => infection >3 mois
SÉRODIAGNOSTIC : INTERPRETATIONS
• Absence d’IgG
 Prélèvement très précoce  Faire un deuxième prélèvement
 Patient immunodéprimé  Pratiquer une recherche directe (ex : PCR VHC,
PCR CMV)
• Résultat quantitatif (titre) isolé
 Ne permet pas de dater une infection
• Résultats séquentiels
 Ne comparer que les résultats obtenus dans un même laboratoire, au
cours de la même manipulation
• Détection d’IgM
 Possibilité de faux négatifs : Réponse inconstante, de courte durée ou retardée
 Possibilité de faux positifs :
 Manque de spécificité des préparations antigéniques
 Présence de facteur rhumatoïde
 Réactions antigéniques croisées
 Activations polyclonales non spécifiques
SÉRODIAGNOSTIC : INTERPRETATIONS
• Critères pour le diagnostic de primo-infection
• Augmentation par un facteur de 4 ou plus du titre des IgG
ou des anticorps totaux, entre un sérum “aigu” et un
sérum “convalescent”
• Présence d’IgM
• Séroconversion
• Critères pour le diagnostic de ré-infection
• Augmentation par un facteur de 4 ou plus du titre des IgG
ou des anticorps totaux, entre un sérum “aigu” et un
sérum “convalescent”
• Absence ou faible titre d’IgM
Intérêt de confronter les résultats de la sérologie
avec ceux du diagnostic direct
AUTRES TECHNIQUES DU SERODIAGNOSTIC
Western-Blot de confirmation (Infection par le VIH)
•
•
•
•
•
Bandelette 1 : Contrôle
positif
Bandelette 2 : Contrôle
négatif
Sérum A: Negatif
Sérum B: Indeterminé
Sérum C: Positif
AUTRES TECHNIQUES DU SERODIAGNOSTIC
Tests Rapides à Orientation Diagnostique (TROD)
• Ne nécessitent pas « d’équipements » de laboratoire
• 10-20 min
• Lecture visuelle
• Sensibilité « légèrement » inférieure aux nouvelles techniques
ELISA (séroconversion)
• Aide au diagnostic d’urgence et en situation de détresse
matérielle (Accidents d’exposition au sang ou sexuels)
• France : en association obligatoire avec le test ELISA
-
-
+
MODE D’EMPLOI DU TEST INSTI
RESULTATS EN MOINS DE 60 SECONDES
A Bichat disponible aux Urgences, CDAG, Gynécologie-Obstétrique
RESUME (EXEMPLES)
Diagnostic rapide par
recherche directe :
Microscopie
électronique (±)
. Calicivirus
. Virus de Norwalk
. HSV
Immunofluorescence
. Influenza
. Paramyxovirus
. HSV, VZV, CMV
. Adénovirus
. VRS
Antigènes viraux
(ELISA ou agglutination)
. VIH (Ag p24)
. VHB (Ag HBs)
. Adénovirus (selles)
Biologie moléculaire PCR
. A visée diagnostique :
- VHC, papillomavirus
- LCR : HSV, VZV, CMV, JC
. A visée thérapeutique :
- Quantification virale : VIH, VHC, VHB, CMV
- Mutations de résistance : VIH, HSV, CMV, VHB
. A visée épidémiologique
Virus non cultivables
ou de culture difficile
Sérodiagnostic
Méthode de choix pour :
. Virus d'Epstein-Barr
. Virus de la rubéole
. Virus des hépatites
(A, B, C, D et E)
. HTLV