Download WO 2011/024999 Al

(12) 特 許 協 力条 約 に基 づ
て 公 開 さ れた 国際 出願
(19) 世 界 知 的 所 有 権 機 関
国際 事 務 局
(10) 国 際 公 開番 号
(43) 国 際 公 開 日
2011 年 3 月 3 日(03.03.2011)
(51) 国際 特 許 分 類
GOlN 33/50 (2006.01)
A61B 1/00 (2006.01)
C12M 3/00 (2006.01)
(21)
(22)
(25)
(26)
(30)
(71)
PCT
Cl 2Q 1/02 (2006.01)
Cl 2Q 1/68 (2006.01)
WO 2011/024999 Al
道 札 幌 市 中央 区 南
Hokkaido (JP).
条 西 1 7 T 目2 9 1 番地
(72) 発 明者 お よ び
(75) 発 明 者 /t 願 人 ( 米 国 に つ 1 て の み ) : 豊 田 実
(TOYOTA Minoru) [JP/JP]; 〒0608556 北 海 道 札 幌
PCT/JP20 10/0647 15
国 際 出願 番 号
市 中央 区南 1 条 西 1 7 T 目 札 幌 医科 大 学 内
2010 年 8 月 30 日(30.08.2010)
国 際 出願 日
Hokkaido (JP). 山木 英 — (YAMAMOTO, Eiichiro)
[JP/JP]; 〒0608556 北 海 道 札 幌市 中 央 区 南 1 条 西
国 際 出願 の 言 語
日木
1 7 T 目 札 幌 医 科 大 学 内 Ho㏍ ido (JP) ・神 前
国際 公 開 の言 語
日木
正 幸 (KAMIMAE, Seiko) [JP/JP]; 〒0608556 北 海 道
札 幌市 中央 区南 1 条 西 1 7 T 目 札 幌 医科 大
優 先権 デ ー タ
学
内 Hokkaido (JP). 鈴 木 5 (SUZUKI, Hiromu)
61/238,106 2009 年 8
28 日(28.08.2009)
US
[JP/JP]; 〒0608556 北 海 道 札 幌市 中 央 区 南 1 条 西
出願 人 米 国 を 除 < 全 て の指 定 国 に つ 1 て ) : 北
1 7 T 目 札 幌 医 科 大 学 内 Ho㏍ ido (JP) ・ 山野
海 道 公 立 大 学 法 人 札 幌 医 科 大 学 (SAPPORO
泰 穂 (YAMANO, Hiroo) [JP/JP]; 〒0101495 秋 田 県
MEDICAL UNIVERSITY) [JP/JP]; 〒 0600061 北 海
続葉有
(54) Title: SPECIMEN FOR DETECTING INFILTRATIVE LARGE INTESTINE TUMORS
(54) 発 明 の名 称
: 浸潤
大 腸 腫 瘍 検 出 用 の検 体
(57) Abstract: Provided is a method for noninvasively obtaining an index for
diagnosing the infiltration or invasive depth of a large intestine tumor. The
method is characterized in that a specimen by which the infiltrative large intes
tine tumor can be detected is obtained by spraying a cleaning solvent onto the
target large intestine mucous layer to separate the mucous from said mucous
layer, and recovering the separated mucous along with the cleaning solvent.
(57) 要 約 : 本 発 明 は 、非 侵 襲 的 に 大 腸 腫 瘍 の 浸 潤 性 ま た は深 達
度 を 診 断 す る た めの 指 標 を 得 る 方 法 を 提 供 す る こ と を 目的 と す
る 。 本 発 明 は 、対 象 の 大 腸 粘 液 層 に 洗 浄 液 を 散 布 して 該 粘 液
層 か ら粘 液 を 剥 離 し、 剥 離 さ れ た 粘 液 を 洗 浄 液 と と も に 回 収 す
る こ と に よ り 、 浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 を検 出 し る 検 体 を得 る こ と を
特 徴 とす る 。
秋 田市 上 北 手猿 田 宇 苗 代 沢 2 2 2 赤 十 字 病 院 内 Akita (JP).
(84) 指 定 国 ( 表 示 の な 1 限 り 、全 て の種 類 の 広 域 保
護 が 可 能 ) : ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW,
MZ, NA, SD, SL,・ SZ, TZ, UG, ZM, ZW), --L ー ラ シ ア
(74) 代 理 人 : 葛 和 清 司 ， 外 (KUZUWA, Kiyoshi et 杣 .);
(AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ヨ ー ロ ッパ
〒 1620067 東 京 都 新 宿 区 富 久 町 8 番 2 1 号 丁
(AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR,
&. T ビ ル 葛 和 国 際 特 許 事 務 所 Tokyo (JP).
GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, 皿 ,
NL, NO, PL, PT, Rの, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BF,
(81) 指 定 国 ( 表 示 の な 1 限 り 、全 て の種 類 の 国 内保
BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE,
H が 可 ) : AE, AG, AL, AM, A の, AT, AU, AZ, BA,
SN, TD, TG).
BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, Cの,
CR, CU, CZ, DE, DK, DM, Dの, DZ, EC, EE, EG, ES, FI,
活 け公 開書 類
GB, GD, GE, GH, GM, GT, Hl , HR, HU, ID, IL, IN, IS,
国 際 調 査 報 告 条 約 第 2 1 条 (3))
JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR,
LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW,
明 細 書 の 別 個 の 部 分 と して 表 した 配 列 リ ス ト
MX, 1はY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PE, PG, PH,
規 則 5.2(a))
PL, PT, RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST,
SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ,
VC, VN, ZA, ZM, ZW.
1
秋田
明 細
書
発 明の名 称 : 浸 潤 性 大腸 腫 瘍 検 出用 の検 休
技 術 分野
０００
本 発 明 は 、大 腸 粘 液 層 を非 侵 襲 的 に剥 離 して 得 られ る 浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 検 出
用 の検 体 、大 腸 粘 液 層 を非 侵 襲 的 に剥 離 す る た めの キ ッ ト、大 腸 粘 液 層 を非
侵 襲 的 に剥 離 して 浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 を検 出す る 指 標 を得 る 方 法 、大 腸 粘 液 層 を
非 侵 襲 的 に剥 離 して 薬 剤 お よ び
ま た は治 療 方 法 の治 療 効 果 を評 価 す る た め
の指 標 を得 る 方 法 に 関す る 。 よ り 具 体 的 に は 、本 発 明 は 、 メ チ ル 化 D N A を
分 子 マ ー カ ー と す る 、前 記 の浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 検 出用 の検 体 、キ ッ ト、 受 H性
大 腸 腫 瘍 を検 出す る 指 標 を得 る 方 法 、治 療 効 果 を評 価 す る た めの指 標 を得 る
方 法 に 関す る 。
背景技 術
０００
欧 米 で は 、大 腸 癌 が 癌 死 亡 率 の上 位 を 占めて いる 。 大 腸 癌 は 、米 国の統 計
資料 の 2
００6 年 度 の 予 測 に よ れ ば 、男 女 共 に 3 番 目に 多 い癌 種 で あ り 、そ
の発 生 率 は 「 9 9 8 年 か ら 2 ００ 年 にか け て は毎 年
「・
8
づ つ増 加 して
いる 。 日木 で も 大 腸 癌 の患 者 数 は近 年 急 激 に増 加 して いる 。 これ は 日木 人 の
食 生 活 が 欧 米 型 の 肉食 が 中心 と な った こ と に原 因が あ る と考 え られ て いる 。
国 内 で は毎 年 約
「 ０万 人 が 罹 患 し、約
万 「千 人 が 死 亡 して いる と い う 報 告
が あ る 。 臓 器 別 の死 亡 数 で も 、 胃癌 、肺 癌 に続
く
3 番 目の 多 さ で あ り 、今 後
の さ ら な る 増 加 も 予 想 さ れ て いる 。 特 に 、女 性 に お け る 大 腸 癌 は 、罹 患 者 数
お よ び 死 亡 者 数 と も に全 悪 性 腫 瘍 の 中 で 第
「位 で あ る 。 男 性 で 肺 癌 、肝 癌 に
次 ぐ 3 位 に な る こ と が 推 定 さ れ て いる 。 大 腸 癌 は遺 伝 的素 因 よ り も 食 生 活 、
特 に動 物 性 脂 肪 お よ び 蛋 白質 の過 剰 摂 取 に起 因す る こ と が 疫 学 的 に推 察 さ れ
、大 腸 部位 と して は 、 S 状 結 腸 と 直 腸 に発 症 しやす い。
０００3
しか しな が ら 、大 腸 癌 は他 の癌 と異 な り 、早 期 癌 で あれ ば 手 術 に よ り 、 「
００
近
く 治 せる
こ と が 知 られ て いる 。 そ の た め、大 腸 癌 は早 期 癌 検 診 の 対
象 と な り 、数 多 く の検 査 法 が 開発 さ れ て きた 。
０００
ま た、早 期 癌 に つ いて は 、 内視 鏡 的粘 膜 切 除 術 や 内視 鏡 的粘 膜 下 層 剥 離 術
と い った 内視 鏡 を用 いた手 術 が 非 常 に有 効 で あ る 一 方 で 、浸 潤 腫 瘍 で は 、 開
腹 手 術 と 化 学 療 法 剤 や放 射 線 療 法 を併 用 す る 等 の治 療 法 が 一 般 に行 われ て い
る 。 した が って 、非 侵 襲 的 に癌 ま た は腫 瘍 の浸 潤 性 ま た は深 達 度 を事 前 に評
価 し う る 診 断 方 法 の 開発 が 待 たれ て いる 。
０００
大 腸 は 、 内腔 側 か ら順 に粘 膜 、粘 膜 下 層 、 固有 筋 層 、漿 膜 下 層 お よ び 漿 膜
層 構 造 を形 成 して お り 、下 部 直 腸 で は漿 膜 お よ び 漿 膜 下 層 を欠 いた 3 層
の
構 造 を形 成 して いる 。 大 腸 腫 瘍 は粘 膜 か ら発 生 し、腫 瘍 の進 行 と と も に深 層
へ 浸 潤 す る 。 こ の う ち 、腫 瘍 の浸 潤 が 粘 膜 下 層 ま で に と ど ま る も の を早 期 癌
と 呼ぶ 。
０００
一般 に 、消 化 器 癌 、特 に 、大 腸 癌 、直 腸 癌 等 の 一般 的 な 検 査 法 と して 、 (
) 便 潜 血 検 査 、 ( i i ) 直 腸 内触 診 、 ( i i i ) 血 液 検 査 、 ( i
検査 、 ( v )
三 丁 検査
V
) 注腸
( ポ ジ ト ロ ン 断 層 撮 影 法 ) 、 ( v i ) 内視 鏡 検 査 、
( v i i ) カ プ セ ル 内視 鏡 検 査 、 (
V
i i i ) 糞 便 ま た は生 検 組 織 を用 いる
遺 伝 子診 断 が あ る 。
０００
しか し、 これ ら の検 査 方 法 は 、早 期 癌 の発 見 、治 療 効 果 の測 定 、再 発 ・転
移 の判 断 材 料 の提 供 、 ま た は確 定 診 断 を 目的 と して お り 、 いずれの方 法 を用
いて も 、癌 ま た は腫 瘍 の浸 潤 度 を診 断 す る た めの指 標 を得 る こ と は で き な い
０００8
便 潜 血 検 査 は 、 ヒ トヘ モ グ ロ ビ ン の ぺ ル オ キ シ ダ 一ゼ活 性 ま た は ヒ トヘ モ
グ ロ ビ ン に反 応 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を利 用 して 、便 中への 出血 の有 無 及
び 出血 量 等 を検 査 し、間接 的 に大 腸 腫 瘍 の発 生 を予 測 す る 方 法 で あ り 、簡 便
・安 価 で 非 侵 襲 的検 査 で あ る 。 しか し、潜 血 反 応 検 査 の有 効 性 は 、大 腸 腫 瘍
か ら の 出血 が 間 欠 的 で あ る こ と に よ り損 な われ 、偽 陰 性 の判 定 の割 合 を高 め
て いる 。 例 え ば 、結 腸 直 腸 腫 瘍 と 診 断 さ れた患 者 の約
０
が便 潜 血検 査 で
陰 性 の判 定 を 受 け て いる 。 ま た、直 径 ０ 未 満 の小 さ な結 腸 直 腸 腫 瘍 か ら の
、 日当 た り の 出血 量 は
～
と 非 常 に小 さ いた め、潜 血 試 験 に よ って常 に検
出 さ れ る わ けで は な い。 さ ら に 、例 え ば 、歯 肉 炎 、痔 、潰 瘍 、 ア ス
ピ リ ンの
使 用 に よ る 腸 管 出血 な ど、 多 く の大 腸 腫 瘍 以 外 の原 因 に よ る 出血 に よ って も
陽 性 の判 定 を 引 き起 こ し得 る た め、便 潜 血 検 査 に よ る 陽 性 判 定 被 験 者 の 中 で
実 際 に大 腸 腫 瘍 で あ る の は 3
～
に過 ぎ ず 、便 潜 血 検 査 に よ る 陽 性 判 定 被
験 者 の 中 に は 多 く の偽 陽 性 を含 ま れ て いる 。 こ の よ う に 、便 潜 血 検 査 は 、大
腸 腫 瘍 等 の腫 瘍 の特 異 的検 出法 と は言 え ず 、大 腸 腫 瘍 等 の 予 備 診 断 方 法 と し
て も 必 ず し も 十 分 で は な い。 ま して 、便 潜 血 検 査 に よ って 、大 腸 腫 瘍 の浸 潤
度 を診 断 す る こ と は で き な い。
０００
直 腸 内触 診 に よ れ ば 、指 診 に よ り 大 腸
直 腸 の遠 端 に お け る 腫 瘍 を検 出す
る こ と が 可 能 で あ る が 、 よ り 内部 の腫 瘍 を発 見 す る こ と は で き な い。 ま た、
直 腸 内触 診 に よ って 、大 腸 腫 瘍 の浸 潤 度 を診 断 す る こ と は で き な い。
００ ０
血 液 検 査 は 、対 象 の血 液 試 料 中の腫 瘍 マ ー カ ー を測 定 して 、腫 瘍 マ ー カ ー
の量 ま た は濃 度 に よ って 大 腸 腫 瘍 を診 断 す る 診 断 方 法 で あ る 。
００
腫 瘍 マ ー カ ー と して は 、胎 児 性 蛋 白質 (
cA
、シ リア ル T
、c
三
A 等 ) 、糖 鎖 抗 原 (
等 ) 、異 所 産 生 物 質 ( ホ ル モ ン や腫 瘍 性 ア イ ソ
ザ イ ム 等 ) の よ う に 、 そ の物 質 を検 出す る こ と に よ って 大 腸 癌 と 診 断 す る 腫
瘍 マ ー カ ー と 、癌 遺 伝 子 (
) 、遺 伝 子 再 構 成 (
cR
a
等 ) 、癌 抑 制 遺 伝 子 (
3等
、e
b
」等 )
の よ う に遺 伝 子の 変 異 や組 換 え を検
出す る こ と に よ って情 報 が 得 られ る 腫 瘍 マ ー カ ー と が あ る 。
００
しか し、血 液 中の腫 瘍 マ ー カ ー は 、大 腸 癌 が な い場 合 に も 陽 性 と な る こ と
が あ り 、 ま た、 あ る 程 度 ま で 大 腸 癌 が 進 行 しな けれ ば 陽 性 と な ら な い こ と が
あ り 、逆 に進 行 大 腸 癌 で も 陽 性 に な ら な い こ と も あ る な どの 欠 点 が あ る 。 そ
の た め、大 腸 癌 の腫 瘍 マ ー カ ー は早 期 発 見 や確 定 診 断 に つ な が る ほ どの効 果
は な く 、現 状 と して は補 助 診 断 や治 療 の効 果 の測 定 、再 発 ・転 移 の発 見 の判
断 材 料 の つ と して 用 い られ て いる 。 ま た、血 液 中の腫 瘍 マ ー カ ー の濃 度 に よ
って 、大 腸 腫 瘍 の浸 潤 度 を診 断 す る こ と は で き な い。
００ 3
注 腸 検 査 と は 、バ リ ウ ム を大 腸 内 に注 入 し、大 腸 の粘 膜 面 に付 着 さ せ 、 そ
の表 面 の凹 凸 を X 線 に よ り 調 べ る 方 法 で あ る 。 しか しな が ら 、注 腸 検 査 は 、
コ ス トが 高 い上 に被 験 者 への 負 担 が 大 き く 、合 併 症 の リ ス ク を伴 う と い う 問
題 が あ る 。 例 え ば 、注 腸 検 査 で は 、検 査 の前 日に低 脂 肪 ・低 残 漬 よ り な る 注
( 塩 類 下 剤 及 び接 触 性
腸 検 査 食 を摂 取 さ せ た後 、
) の投 与 に よ り 大
腸 内容 物 を除 去 す る 前 処 置 が被 験 者 に施 さ れ る 。 ま た、注 腸 検 査 に は 、 X 線
被 爆 や腸 閉塞 の危 険 性 が あ る 。 ま た、注 腸 検 査 は腸 の 内腔 の凹 凸の 形 態 のみ
を調 べ る 検 査 で あ る た め、注 腸 検 査 に よ って 、大 腸 腫 瘍 の浸 潤 度 を診 断 す る
こ と は で き な い。
００
三 丁 検査
( ポ ジ ト ロ ン 断 層 撮 影 法 ) と は 、陽 電 子 放 出核 種 で 標 識 した薬
剤 を被 検 体 に投 与 して 、薬 剤 が どの部位 で 多 く 消 費 さ れ て いる か を調 べ る 方
法 で あ る 。 例 え ば 、糖 の 一種 で 腫 瘍 に集 積 す る 性 質 を持 つ 8
ル オ ロ デオ キ シ グ ル コ ー ス を
三 丁
で 標 識 した フ
用 薬 剤 と して被 検 者 に投 与 して 、 ガ ン マ
線 を体 外 か ら観 測 す る こ と に よ って 、 ラ ベ ル さ れた物 質 の体 内分 布 を映 像 化
し、 そ の体 内動 態 を確 認 し、病 巣 の位 置 や大 き さ 等 を検 査 す る も の で あ る 。
００
p
検 査 は一 般 にサ イ ク ロ ト ロ ン を必 要 と し， 設 備 に ０億 円 以 上 の高 額 な 費
用 が 必 要 で あ る 。 ま た、
た、
検 査 を行 な う と 放 射 線 被 ば く は避 け られ な い。 ま
検 査 に よ って 、 お よ そ の腫 瘍 の大 き さ は測 定 で き て も 、大 腸 腫 瘍 の浸
潤 度 を診 断 す る こ と は で き な い。
００
内視 鏡 検 査 は大 腸 の 中 を直 接 内視 鏡 で 調 べ る 方 法 で あ る 。 内視 鏡 検 査 は大
腸 腫 瘍 の発 見 に対 して 、高 い感 度 と 特 異 性 を有 して いる 。 加 え て 、 内視 鏡 検
査 で は早 期 癌 や前 癌 状 態 の ポ リー プ を切 除 で き る 利 点 も 有 して いる 。 さ ら に
、 内視 鏡 検 査 で はバ イ オ プ シ ー ( 組 織 生 検 ) に よ り 診 断 用 の組 織 を採 取 で き
る 利 点 も 有 して いる 。 しか し、 内視 鏡 検 査 は 、腸 の表 面 を 内腔 側 か ら観 察 す
る も の で あ る た め、 内視 鏡 検 査 に よ って 、大 腸 癌 の浸 潤 度 を診 断 す る こ と は
で き な い。 実 際 、大 腸 の 内視 鏡 検 査 で 発 見 さ れ る 腫 瘍 の 中 に は 、小 さ な 病 変
で あ って も 、大 腸 粘 膜 下 組 織 への浸 潤 を認 め る 腫 瘍 が 多 数 報 告 さ れ て いる 。
００
ま た、 内視 鏡 検 査 に よ る 組 織 生 検 で は 、組 織 を 「点 」 で 評 価 で き る にす ぎ
ず 、 これ を 「面 」 に広 げ て い く に は物 理 的 限界 が あ る 。 内視 鏡 検 査 に よ る 組
織 生 検 で は 、病 変 の 一 部 のみの評 価 で あ る た め、生 検 の採 取 部位 に よ って 、
ま た は 内視 鏡 的粘 膜 切 除 さ れた病 変 で あ って も 標 本 の切 り 出 し部位 に よ って
は 、大 腸 癌 で あ る こ と を確 定 診 断 す る こ と は で き な い。 ま して 、 内視 鏡 検 査
に よ る 組 織 生 検 を用 いて 、腫 瘍 の深 達 度 を正 確 に診 断 す る こ と で き な い。
００ 8
般 的 に 、大 腸 癌 の確 定 診 断 に は 、生 検 材 料 を用 いた病 理 組 織 診 断 が 行 な
われ て いる が 、大 腸 腫 瘍 を確 定 診 断 す る た めに は詳 細 な 内視 鏡 観 察 に も と づ
いた病 理 組 織 標 本 の作 製 が 必 須 で あ る 。 しか し、 そ の よ う な 病 理 組 織 標 本 の
作 製 に は 、極 めて 熟 練 した技 術 が 必 要 で あ る の で 、全 て の 内視 鏡 医 師 が 行 な
う こ と は 困難 で あ る 。
００
ま た、微 小 な 腫 瘍 や大 腸 粘 膜 切 除 前 の腫 瘍 に 関 して は 、生 検 す る こ と に よ
って 、手 術 後 の病 理 像 が 不 確 か に な る 、 な どの理 由か ら 、 内視 鏡 に よ る 大 き
さ 、形 態 観 察 や拡 大 内視 鏡 に よ る ピ ッ ト診 断 のみ に基 づ いて 、 内視 鏡 切 除 か
、 開腹 手 術 かの判 断 が な さ れ て きた 。
００ ０
カ プ セ ル 内視 鏡 検 査 と は 、超 小 型 カ メ ラ を 内蔵 した カ プ セ ル を 口か ら飲 み
込 み、消 化 管 を通 過 しな が ら カ プ セ ル が 自動 的 に撮 影 した画 像 情 報 を無 線 に
よ り体 外 に転 送 す る 、消 化 管 の検 査 方 法 で あ る 。 カ プ セ ル 内視 鏡 検 査 は 、通
常 の 内視 鏡 に比 べ て 画 像 の精 度 が 低
く 、 自動 撮 影 で あ る た め精 査
した い襄 の
奥 な ど を十 分 に観 察 で きず 、生 検 やポ リー プ 切 除 が で き な いな どの 欠 点 が あ
り 、現 状 で は 、 も っぱ ら 、通 常 の 内視 鏡 で 観 察 す る こ と の 困 難 な 小 腸 の検 査
に用 い られ て いる 。 ま た、 カ プ セ ル 内視 鏡 検 査 も 、腸 の表 面 を 内腔 側 か ら観
察 す る も の で あ る た め、 内視 鏡 検 査 に よ って 、大 腸 腫 瘍 の浸 潤 度 を診 断 す る
こ と は で き な い。
００
糞 便 ま た は生 検 組 織 を用 いる 遺 伝 子 診 断 は 、糞 便 中 に剥 離 した腫 瘍 細 胞 ま
た は生 検 組 織 中の腫 瘍 細 胞 の遺 伝 子 を調 べ る こ と に よ り 、大 腸 癌 の診 断 を行
な う 方 法 で あ る 。 一 旦 、腫 瘍 細 胞 に生 じ た遺 伝 子 変 異 や D N A の過 剰 メ チ ル
化 は 、正 常 な 状 態 に戻 り に く い と い う 意 味 で 固 定 的情 報 で あ る の で 、検 体 が
適 正 で あれ ば 、遺 伝 子 診 断 は信 頼 性 の高 い診 断 方 法 で あ る 。
００
しか し、糞 便 を用 いて遺 伝 子 診 断 を行 な った場 合 に は 、糞 便 中 に は様 々な
細 菌 や正 常 細 胞 由来 の核 酸 が 存 在 して いる た め、糞 便 か ら 回収 さ れ る 腫 瘍 細
胞 由来 の遺 伝 子の割 合 が相 対 的 に微 量 ( 約
０・ ０
) に な って しま い、正
確 な診 断 が 困 難 に な る こ と が 問 題 と な る 。 例 え ば 、非 特 許 文 献 「 お よ び 2 に
は 、糞 便 中の D N A を用 いて 大 腸 腫 瘍 を診 断 す る 方 法 が 一 定 の成 果 を示 した
こ と が 記 載 さ れ て いる 。 しか し、 これ ら の方 法 は 、診 断 可 能 性 や診 断 精 度 に
問題 が あ り 、実 用 化 に は ほ ど遠 い水 準 に と ど ま って いる 。
００ 3
方 、生 検 組 織 を用 いて遺 伝 子 診 断 を行 な った場 合 に は 、採 取 部位 に よ る
結 果 の ば ら つ きが 問 題 に な る 。 ま た、微 小 な 腫 瘍 や大 腸 粘 膜 切 除 前 の腫 瘍 に
関 して は 、生 検 す る こ と に よ り 線 維 化 、熱 凝 固 変 性 な どが 生 じ 、術 後 の病 理
像 が 不 確 か に な る と い う 問題 点 が あ る 。
００
大 腸 腫 瘍 の遺 伝 子 診 断 の 対 象 と な る 遺 伝 子の 変 化 は 、
3 等 の癌 抑 制 遺 伝 子の 変 異、
の発 癌 遺 伝 子の 変 異、
、e
a
等
b
」等 の
C R
遺 伝 子 再 構 成 を検 出す る も のの他 、癌 抑 制 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の C
G ア イ ラ ン ドの過 剰 メ チ ル 化 な どの エ ピ ジ ェネ テ ィ ック な 修 飾 が あ る 。
癌 抑 制 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に存 在 す る p ア イ ラ ン ドが メ チ ル 化 さ れ
００
る と 、 当 該 癌 抑 制 遺 伝 子の転 写 が 不 活 性 化 さ れ る た め、細 胞 増 殖 の制 御 が 効
かな く な り 、癌 な どの細 胞 増 殖 性 疾 患 が 進 行 す る 。 例 え ば 、癌 細 胞 に お いて
、
は
33
hs a
3
S g a
リ ガー ゼ
「、
0n
C ass
y
ある
「
、
p
日カ
ドヘ リ ン
フ ァ ミ リー 遺 伝 子の 一 つ で あ る
3
l 分 子の転 写 共 役 因子 で あ る Ⅲ
の 負 の制 御 遺 伝 子 「
「
る
3bc
、 「
S on
as
3
、ア ポ
h
L
、ユ ビ キ チ ン
、大 腸 癌 に お け
ト一 シ ス 関連 遺 伝 子 で
の制 御 遺 伝 子 で あ る
「等 の ゲ ノ
ム 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の p ア イ ラ ン ドの過 剰 メ チ ル 化 に よ り発 現 が 抑
制 さ れ て お り 、大 腸 腫 瘍 の診 断 に有 用 で あ る と報 告 さ れ て いる 。
００
過 剰 メ チ ル 化 は微 量 な
か ら検 出が 可 能 で あ り 、一旦 生
じ た過 剰 メ チ ル 化
は 自然 に は正 常 に戻 り に く い と い う 意 味 で 固 定 的情 報 で あ り 、遺 伝 子 診 断 の
た めの指 標 と して 有 用 で あ る と考 え られ て いる 。 しか し、糞 便 ま た は生 検 組
織 の遺 伝 子 診 断 で は腫 瘍 の存 在 診 断 は可 能 で あ る が 、腫 瘍 の浸 潤 度 の診 断 は
で き な い。
００
近 年 、 内視 鏡 技 術 の進 歩 に よ り 、手 術 せず に 内視 鏡 に よ り 大 腸 腫 瘍 が 治 療
さ れ る こ と が 多 く な って きた 。 しか し、事 前 に生 検 す る と 内視 鏡 治 療 が 困 難
に な った り 、切 除標 本 の 正 確 な 病 理 診 断 が 困 難 と な る な どの 問題 が あ る 。 一
部 の 内視 鏡 専 門施 設 で は 、生 検 をせず に極 めて 詳 細 な 拡 大 内視 鏡 観 察 、切 除
標 本 の顕 微 鏡 観 察 に よ り確 実 な診 断 が な さ れ て いる が 、限 られた施 設 で のみ
実 施 可 能 で あ る のが 現 状 で あ る 。
００ 8
こ の よ う に 、生 検 をせず に 、大 腸 腫 瘍 細 胞 の遺 伝 的性 質 を精 度 よ く 決 定 す
る 方 法 は 、 これ ま で 知 られ て いな い。 特 に 、大 腸 粘 液 層 剥 離 液 を用 いて 、大
腸 腫 瘍 細 胞 の D N A メ チ ル 化 を解 析 す る 方 法 は これ ま で に知 られ て いな い。
先行技術 文 献
ヨト
特許文献
００
h qu s
非特許文献
:
非特許文献
: sbo r n
e
e
as
a
a
as
ro n r
ro n ro
gy
gy
2０００ ov ;
2００ Ja n ;
( )
8(
) :
０
発 明が 解 決 しよ う とす る課 題
００3０
した が って 、本 発 明 は 、上 記 の ょぅな 欠 点 を有 しな い、大 腸 粘 液 層 を非 侵
襲 的 に剥 離 して 得 られ る 浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 検 出用 の検 体 、大 腸 粘 液 層 を非 侵 襲
的 に剥 離 す る た めの キ ッ ト、大 腸 粘 液 層 を非 侵 襲 的 に剥 離 して 浸 潤 性 大 腸 腫
瘍 を検 出す る 指 標 を得 る 方 法 、大 腸 粘 液 層 を非 侵 襲 的 に剥 離 して 薬 剤 お ょび
ま た は治 療 方 法 の治 療 効 果 を評 価 す る た めの指 標 を得 る 方 法 の提 供 を 目的
とす る 。
課 題 を解 決 す る た めの手 段
００3
本 発 明者 ら は 、上 記 課 題 を解 決 す る た めに鋭 意 研 究 を行 った と こ ろ 、意 外
に も 、対 象 の大 腸 粘 液 層 に洗 浄 液 を散 布 して 該 粘 液 層 か ら粘 液 を剥 離 し、剥
離 さ れた粘 液 を洗 浄 液 と と も に 回収 す る こ と に ょ り 、浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 を検 出
し ぅる 検 体 を得 られ る こ と を見 出 し、本 発 明 を完 成 す る に至 った 。
す な わ ち 、本 発 明 は 、 以 下 の検 体 、キ ッ ト、 ま た は方 法 に 関す る 。
浸 潤 性 大 腸 癌 検 出の た めの検 体 で あ って 、大 腸 粘 液 層 に洗 浄 液 を散 布 し
「
て 大 腸 粘 液 を剥 離 し、剥 離 した大 腸 粘 液 と と も に 回収 して 得 られ る 前 記 洗 浄
液 を含 む 、前 記 検 体 。
2
大 腸 粘 液 層 が 、腫 瘍 部位 を含 む大 腸 粘 液 層 で あ る 、
3
洗 浄 液 が 、生 理 的 な 等 張 液 で あ る 、
または 2
生 理 的 な 等 張 液 が 、生 理 食 塩 水 で あ る 、 3
散 布 が 、毎 秒 2
I
～「
に記 載 の検 体 。
に記 載 の検 体 。
に記 載 の検 体 。
の 速 度 で 行 な われ る 、
「
～
の いず
れか一項 に記 載 の検 体 。
検 出が 、腫 瘍 マ ー カ ー の検 出 で あ る 、 「
6
～
の いずれか一項 に記 載
の検 体 。
腫 瘍 マ ー カ ー の検 出が 、 メ チ ル 化 D N A の検 出 で あ る 、 「
7
～6
のい
ずれか一項 に記 載 の検 体 。
メ チ ル化 D
8
日カ
N A の検 出が
ドヘ リ ン
h
、
33
、
０ 、
3
on
S
3bc
hs a
3
a
「
p
l
U
「か ら な る 群 よ り選 択 され
「
る 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D N A の検 出 で あ る 、 「
～7
の
いずれか一項 に記 載 の検 体 。
9
メ チ ル化 D
N A の検 出が 、 「 、 「
hs a
r
3 b cか ら な
る 群 よ り選 択 さ れ る 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D N A の検 出 で あ
る、 8
「０
に記 載 の検 体 。
洗 浄 液 が 、前 洗 浄 な しで散 布 さ れ る 、 「
～9
の いずれか一項 に記
載 の検 体 。
「「
腫 瘍 部位 が 、腫 瘍 の浸 潤 が 疑 われ る 腫 瘍 部位 で あ る 、 2
に記 載 の検
体。
1 2
検体 が、 「
以上の
を含 む 、
「
～「「
の いずれか一項 に
記 載 の検 体 。
「
浸 潤 性 大 腸 癌 検 出の た めの キ ッ トで あ って 、大 腸 粘 液 層 に洗 浄 液 を散
布 して 大 腸 粘 液 を剥 離 す る た めの洗 浄 液 散 布用 器 具 お よ び 洗 浄 液 を含 む 、前
記 キ ッ ト。
浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 を検 出す る 指 標 を得 る 方 法 で あ って 、
「
大 腸 粘 液 層 に洗 浄 液 を散 布 して 大 腸 粘 液 を剥 離 す る エ 程 、
剥 離 した大 腸 粘 液 と と も に洗 浄 液 を 回収 す る エ 程 、
回収 した洗 浄 液 中の腫 瘍 マ ー カ ー の量 を決 定 す る エ 程 、 お よ び 、
腫 瘍 マ ー カ ー の量 に基 づ いて 浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る と 決 定 す る た めの指
標 を得 る エ 程 、
を含 む 、前 記 方 法 。
大 腸 粘 液 層 が 、腫 瘍 部位 を含 む大 腸 粘 液 層 で あ る 、
「
に記 載 の方
，
法０
「6
洗 浄 液 が 生 理 的な 等 張 液 で あ る 、 「
「7
生 理 的 な 等 張 液 が 、生 理 食 塩 水 で あ る 、 「 6
「8
散 布 が 、毎 秒 2
I
～「
または 「
に記 載 の方 法 。
に記 載 の方 法 。
の 速 度 で 行 な われ る 、
～ 「7
「
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
「9
腫 瘍 マー カ ーが 、メ チ ル 化
で ある 、 「
～ 「8
の いずれか一
項 に記 載 の方 法 。
、
マー カ ーが
日カ
ドヘ リ ン
h
、
33
S
3
a
「
l
U
～ 「9
で ある 、 「
子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
p
S on
「か ら な る 群 よ り選 択 され る 遺 伝
、 「
3
3bc
hs a
の いずれか
一項 に記 載 の方 法 。
2 「
腫 瘍 マー カ ーが 、
「 、 「
hs a
り選 択 さ れ る 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
r
3 b cか ら な る 群 よ
で ある 、 2 ０ に
記 載 の方 法 。
2 2
指標 が 、 「
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
を越 え て いる 場 合 で あ る 、
2
指標 が 、 「
「
～2
「
が
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
が
「
を越 え て いる 場 合 で あ る 、
指標 が 、 「
2
指標 が 、 「
指標 が 、
～2
「
～2
「
指標 が 、
～
指標 が 、
指標 が 、
3
r
r
「
「
～2
「
D
NAが
「
～2
「
～2
「
０
「
D
NAが
「
「
以 上 で あ り、
「
を越 え
以 上 で あ り、
を越 え て い
「０
「
以 上 で あ り、
を越 え て いて 、か
「０
を越 え て いる
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
指 標 が 、薬 剤 お よ び
「
「
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
つ 、 「 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D N A が
～2
を
以 下 で あ り、
「
指 標 が 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の 直 径 が ０
いる 指 標 で あ る 、
「「
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
～2
を
の いずれか一項 に記 載 の方 法
指 標 が 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の 直 径 が ０
場 合 で ある 、 「
「０
の いずれか一項 に記 載 の方 法
「 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
3 3
NAが
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
る場 合 で ある 、 「
3 2
D
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
かつ 、
NAが 3 3
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
r
て いる 場 合 で あ る 、 「
3 「
D
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
０ 指 標 が 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の 直 径 が
かつ 、
「０
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
r
を越 え て いる 場 合 で あ る 、
8
NAが
の いずれか一項 に記 載 の 方 法 。
～2
を越 え て いる 場 合 で あ る 、
2 9
「
D
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
越 え て いる 場 合 で あ る 、 「
2 8
「
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
越 え て いる 場 合 で あ る 、
2 7
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
を越 え て いる 場 合 で あ る 、
2 6
「
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
を越 え て いる 場 合 で あ る 、
2
～2
「
～3
ま た は治 療 方 法 の治 療 効 果 を評 価 す る た めに用
2
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
発 明の効 果
００33
本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 は 、対 象 の大 腸 の病 変 部 の粘 膜 に付 着
して いる 大 腸 粘 液 層 を洗 浄 す る こ と に よ り 得 られ る 大 腸 粘 液 層 剥 離 液 を用 い
る も の で あ り 、大 腸 粘 膜 生 検 組 織 を用 いる これ ま で の方 法 と は根 木 的 に異 な
る も ので ある 。
００3
大 腸 粘 液 層 剥 離 液 を用 いる 木 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に よ れ ば 、
大 腸 粘 膜 生 検 組 織 を用 いる これ ま で の方 法 と は異 な り 、癌 ま た は腫 瘍 の浸 潤
度 が 高 く な る 程 、 多 く の腫 瘍 細 胞 を大 腸 粘 液 層 か ら 回収 す る こ と が で き る 。
ま た、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に よ れ ば 、癌 ま た は腫 瘍 の浸 潤 度
が 高 く な る 程 、 多 く の腫 瘍 細 胞 由来 の メ チ ル 化 D N A を大 腸 粘 液 層 か ら 回収
す る こ と が で き る 。 した が って 、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び方 法 は 、癌
ま た は腫 瘍 の浸 潤 度 を診 断 す る 指 標 を得 る た めの検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法
と して 、有 用 で あ り 、 これ ま で の方 法 で は達 成 で き な か った、種 々の有 益 な
効 果 が 得 られ る 。
００3
す な わ ち 、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び方 法 は 、今 ま で 廃 棄 して きた洗
浄 液 を材 料 と す る た めに 、 内視 鏡 を利 用 した他 の検 査 方 法 に よ って 生 じ 得 る
様 々な リ ス ク ( 出血 の危 険 性 ( 生 検 法 ) 、 ア レル ギ ー 、検 査 時 間の 延 長 ( 拡
大 内視 鏡 ) 、高 価 な 設 備 ( 拡 大 内視 鏡 、 N
)
が 新 た に発 生 す る こ と も
な く 、検 体 の採 取 が 簡 便 な た め、 内視 鏡 施 行 医 、介 助 看 護 師 に ほ と ん ど負 担
をか け る こ と が な い。 さ ら に 、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に お いて
は 、市 販 の 内視 鏡 装 置 が そ の ま ま 利 用 で き る た め、新 た な 設 備 投 資 が 不 要 で
ある 。
００3
ま た、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に よ り 、病 変 部 の粘 膜 面 全 体 を
洗 浄 す る だ けで 「面 」 で の評 価 が 可 能 と な り 、 しか も 生 検 の よ う に組 織 に傷
を作 ら な いた め、止 血 機 能 や創 傷 治 癒 能 力 な どが 減 退 して いる 対 象 に お いて
も 、 ま た、抗 血 小 板 薬 、抗 凝 固 薬 等 の止 血 や創 傷 治 癒 に影 響 す る 薬 剤 を 内服
した ま ま で も 検 査 を行 う こ と が で き る 。 内視 鏡 検 査 を必 要 と す る 対 象 に高 齢
者 が 比 較 的 多 く 、 した が って かか る 薬 剤 を常 用 す る 者 の割 合 も 多 いた め、か
か る 利 点 の意 義 は極 めて 大 き い。
００3
本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に よ れ ば 、手 術 前 に腫 瘍 を傷 つ け る こ
と な く 、細 胞 診 、 D
N A 診 断 を行 な う こ と が 可 能 で あ る 。 した が って 、本 発
明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に よ り 、腫 瘍 の性 質 、浸 潤 度 予 測 の精 度 が 飛
躍 的 に 向上 す る 。 ま た、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に よ り 、手 術 前
に大 腸 腫 瘍 の遺 伝 的 プ ロ フ ァイ ル を診 断 す る こ と が 可 能 と な る 。
００3
ま た、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に よ り 、 ゲ ノ ム D N A の ジ ェネ
テ ィ ック ま た は エ ピ ジ ェネ テ ィ ック な 異 常 の検 出 をす る こ と が 可 能 で あ る 。
さ ら に 、本 発 明 に よ る 方 法 で 採 取 した検 体 を用 い、抗 癌 剤 を包 含 す る 様 々な
薬 剤 の感 受 性 を検 討 す る こ と も で き る 。 さ ら に ま た、本 発 明 の検 体 や方 法 に
よ り 、薬 剤 お よ び
ま た は治 療 方 法 の治 療 効 果 を評 価 す る こ と が 可 能 と な る
。 本 発 明 の検 体 や方 法 に よ り 、再 発 の 予 測 をす る た めの指 標 を得 る こ と が 可
能 とな る 。
００3
本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 を用 いた大 腸 粘 液 層 剥 離 液 を用 いた過
剰 メ チ ル 化 の解 析 に よ れ ば 、非 侵 襲 的 な 方 法 で どの施 設 で も 簡 便 に浸 潤 性 大
腸 腫 瘍 の 正 確 な診 断 が 可 能 に な る 。 した が って 、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お
よ び 方 法 は極 めて 有 用 で あ る 。
００ ０
図
洗 浄 液 を大 腸 粘 膜 に散 布 して 該 粘 液 層 か ら粘 液 を剥 離 す る 過 程 を示 す写
真 で あ る 。 A は洗 浄 液 を散 布 す る 前 の腫 瘍 部 分 を 、 日は洗 浄 液 を腫 瘍 部 分 に
散 布 して いる 様 子 を 、 c は洗 浄 液 を散 布 した後 の腫 瘍 部 分 を 、 それ ぞれ 、示
す。
図
洗 浄 液 を大 腸 粘 液 層 に散 布 して 該 粘 液 層 か ら粘 液 を剥 離 す る こ と に よ り
得 られた細 胞 の写 真 で あ る 。 「方 法 「」 は水 を大 腸 粘 液 層 に散 布 して 該 粘 液
層 か ら粘 液 を剥 離 す る こ と に よ り 得 られた細 胞 の写 真 を 、 「方 法
2 」 は生 理
食 塩 水 を大 腸 粘 液 層 に散 布 して 該 粘 液 層 か ら粘 液 を剥 離 す る こ と に よ り 得 ら
れた細 胞 の写 真 を 、 それずれ示 す 。 細 胞 の 染 色 は 、ヘ マ
ン 染 色 に よ り 行 な った 。
トキ シ リ ン
・エ オ ジ
図3 浸 潤 腫 瘍 、非 浸 潤 腫 瘍 、 ま た は非 癌 患 者 の大 腸 に お け る メ チ ル 化 さ れた
D N A の割 合 を 、生 検 組 織 と 大 腸 粘 液 層 剥 離 液 の それ ぞれ に つ いて 比 較 した
3 b c、 「 、 「
図 で あ る 。 図 中 、各 点 は各 症 例 を示 す 。 縦 軸 は 、
の各 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に お け る
の 割 合 を示 す 。 「
s」
Sa p
opsy
p アイラ ン
ドの メ チ ル 化 さ れた
は生 検 組 織 を 、 「 ash
g
I
ds 」
は
大 腸 粘 液 層 剥 離 液 を示 す 。 「旧」 は浸 潤 腫 瘍 を 、 「 」 は非 浸 潤 腫 瘍 を 、 「
０r a I」 は非 癌 患 者 を そ れ ぞれ示 す 。 「 二 」 の後 に記 した数 値 は症 例 数 を示 す
。 「 」 は有 意 差 が な い こ と を 、 「 く」 と 記 した後 の数 値 は有 意 差 の水 準 を
示 す 。 例 え ば 、 「 く ・０００ 」 と 記 さ れ て いれ ば 、0 ・０
の有 意 水 準 で 統 計 的
な 有 意 差 が あ る こ と を示 す 。 な お 、 図 中 の 水 平 線 は 平 均 値 を示 す 。
曲線
図
( 受 信 操 作 特 性 曲線 ま た は
㎝ r v と も い う ) を示 す 図 で あ る 。
r
c
p ra
h a r ac
ng
曲線 を作 成 して べ ス
トカ
r
ッ トオ フ値 を
決 定 す る こ と に よ り 、洗 浄 液 と して 生 理 食 塩 水 を散 布 して 回収 した検 体 ( 方
の割 合 に よ って 、浸 潤 腫 瘍 と 非 浸 潤 腫 瘍 を 区
法 2 ) の各 遺 伝 子の メ チ ル 化
別 す る た めに最 も 適 した 閾値 を決 定 す る こ と が で き る 。
r
、 は 、 それ ぞれ 、遺 伝 子 名 を示 す 。 縦 軸 の 「s
「
sp c
感 度 」 を示 し、横 軸 の 「
曲線 の 下 側 の 面 積 を示 す 。
c
「 s
y」
y」
ns
は 「 特 異 度 」 を示 す 。 「
o
Gu
3bc 、 「 、
」
は 「
」
は
は 、浸 潤 腫 瘍 と 非 浸 潤 腫 瘍 を
区 別 す る た めに最 も 適 した 閾値 で あ る 「ベ ス トカ ッ トオ フ値 」 を示 す 。 図 中
に お いて 、 「s n s
お け る 感 度 を 、 「s p c
」
y 」 の右 側 に示 した数 値 は 「ベ ス トカ
c
y 」 の右 側 に示 した数 値 は 「ベ ス トカ
ッ トオ フ値
に お け る 特 異 度 を そ れ ぞれ 示 す 。
図
腫 瘍 の 大 き さ を 、直 径 ０
未 満 の 場 合 ( 左 側 の 図 ) と 、直 径 ０
上 の場 合 ( 右 側 の 図 ) に分 けた場 合 の メ チ ル 化
で あ る 。 左 側 の 図 は 、腫 瘍 の大 き さ が 直 径 ０
r
ッ トオ フ値 」 に
3bc
と
「 の各 遺 伝 子の メ チ ル 化
図 は 、腫 瘍 の大 き さ が 直 径 ０
の各 遺 伝 子の メ チ ル 化
の割 合 の
曲線 を示 す 図
未 満 で あ る 場 合 に お いて 、
の割 合 の
曲線 を示 し、右 側 の
以 上 で あ る 場 合 に お いて 、
の割 合 の
以
曲線 を示 す 。 縦 軸 の
r
3bc
「s n s
と
y」
は 「感 度 」 を示 し、横 軸 の 「
図
複 数 の遺 伝 子の メ チ ル 化
sp c
ic
y」
の割 合 を指 標 と して 浸 潤 腫 瘍 の有 無 を診 断
す る 場 合 の 判 断 過 程 を示 す 図 で あ る 。 図 中 、
c 遺 伝 子の メ チ ル 化 さ れた
く」
5
。 「「
3 b
０
く」
s」
間 に位 置 す る 「
く」
c
は
の割 合 が
は
3
超であ
遺 伝 子の メ チ ル 化 さ れた
く」
の 割 合 が ０ 超 で あ る と い う 判 断 基 準 を示 す 。 「 「
子の メ チ ル 化 さ れた
は腫 瘍 の
超 で あ る と い う 判 断 基 準 を示 す
の割 合 が
は 「 遺 伝 子の メ チ ル 化 さ れた
る と い う 判 断 基 準 を示 す 。 「
く」
2０
「u o r s
以 上 で あ る と い う 判 断 基 準 を示 す 。 「
直径 が ０
b
は 「 特 異 度 」 を示 す 。
は 「 遺伝
の 割 合 が ０ 超 で あ る と い う 判 断 基 準 を示 す 。 棒 線 の
は そ の 左 側 の判 断 基 準 を満 たす場 合 を示 す 。 同様 に 、棒
線 の間 に位 置 す る 「 o 」 は そ の 左 側 の判 断 基 準 を満 た さ な い場 合 を示 す 。 「
vas
v
a nc
r 」 は浸 潤 腫 瘍 で あ る と い う 診 断 結 果 を 示 す 。 「 o
nva
u o r 」 は非 浸 潤 腫 瘍 で あ る と い う 診 断 結 果 を示 す 。 枠 内 の 「 s 」 の右 側 の
数 値 の分母 は枠 内 の判 断 基 準 を満 たす症 例 数 を 、分 子 は枠 内 の判 断 基 準 を満
たす症 例 の う ち で 浸 潤 腫 瘍 で あ る 症 例 数 を 、 それずれ示 す 。 枠 内 の 「 o 」 の
右 側 の数 値 の分母 は枠 内 の判 断 基 準 を満 た さ な い症 例 数 を 、枠 内 の 「 o 」 の
右 側 の数 値 の分 子 は枠 内 の判 断 基 準 を満 た さ な い症 例 の う ち で 浸 潤 腫 瘍 で あ
る 症 例 数 を 、 それずれ示 す 。 「 く」 と 記 した後 の数 値 は有 意 差 の水 準 を示 す
。 例 え ば、 「 く
００ 」 と 記 さ れ て いれ ば 、0 ・
・
の有 意 水 準 で 統 計 的 な 有 意
差 が あ る こ と を示 す 。
図
洗 浄 液 と して 生 理 食 塩 水 を散 布 して 回収 した検 体 ( 方 法 2 ) の各 遺 伝 子
の メ チ ル化
の割 合 と 生 検 組 織 中の各 遺 伝 子の メ チ ル 化
検 討 した 図 で あ る 。 図 中 、各 点 は各 症 例 を示 す 。
r
の割 合 の相 関 を
3bc 、 「 、 「
、 は 、 それ ぞれ 、遺 伝 子 名 を示 す 。 縦 軸 の 「 ash 」 は 「生 理 食 塩 水 を
の割 合 」 を示 し、横 軸
腫 瘍 に散 布 して 得 た大 腸 粘 液 層 剥 離 液 中の メ チ ル 化
の 「
psy 」
は 「生 検 組 織 中の メ チ ル 化
の 割 合 」 を示 す 。 図 中 の 実 線 は 共
分 散 分 析 法 に よ る 回帰 直 線 を しめ し、 当 該 実 線 の上 下 に位 置 す る 点 線 は信 頼
性
で の信 頼 限界 を示 す 。 「 = 」 の右 側 の数 値 は
a
rson の相 関係 数 を 、 「
二
」 の右 側 の数 値 は危 険 率 を示 す 。
発 明 を実 施 す る た めの形 態
００
以 下 、本 発 明 の 好 適 な 態 様 に つ いて 詳 細 に説 明す る 。
本 発 明 は 、大 腸 粘 液 層 を非 侵 襲 的 に剥 離 して 得 られ る 浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 検 出
用 の検 体 、大 腸 粘 液 層 を非 侵 襲 的 に剥 離 す る た めの キ ッ ト、大 腸 粘 液 層 を非
侵 襲 的 に剥 離 して 浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 を検 出す る 指 標 を得 る 方 法 、大 腸 粘 液 層 を
非 侵 襲 的 に剥 離 して 薬 剤 お よ び
ま た は治 療 方 法 の治 療 効 果 を評 価 す る た め
の指 標 を得 る 方 法 に 関す る 。
００
本 発 明 に用 いる 洗 浄 液 は 、大 腸 の粘 膜 を傷 つ け る こ と な く 大 腸 粘 液 層 を剥
離 し う る 液 体 が 好 ま し く 、 よ り 好 ま し く は等 張 液 で あ り 、 さ ら に 好 ま し く は
生 理 食 塩 水 で あ る 。 ま た、本 発 明 に用 いる 洗 浄 液 は 、大 腸 の粘 膜 を傷 つ け る
こ と な く 大 腸 粘 液 層 を剥 離 し う る 液 体 で あ る か ぎ り 、色 素 、抗 生 物 質 、 中性
の緩 衝 性 組 成 物 、キ レー
ト剤 、保 存 用 の 添 加 物 等 の任 意 の 添 加 物 を含 ん で い
て も よ い。
００ 3
本 発 明 に お いて 、洗 浄 液 は 、大 腸 の粘 膜 を傷 つ け る こ と な く 大 腸 粘 液 層 を
剥 離 し う る 速 度 で 大 腸 粘 液 層 に散 布 さ れ 、好 ま し く は毎 秒 2
の 速 度 で 、 よ り 好 ま し く は毎 秒 3
毎秒
００
～6
～8
l
～「
l
l の速 度 で 、 さ ら に好 ま し く は
l の速 度 で 、大 腸 粘 液 層 に散 布 さ れ る 。
本 発 明 に お いて 洗 浄 液 の 回収 方 法 は特 に限 定 さ れ な いが 、 内視 鏡 装 置 を利
用 す る 場 合 は 、例 え ば 、吸 引管 路 中の操 作 部 、 コ ネ ク タ 部 、吸 引 タ ン ク 、吸
引器 ま た は これ ら の間の部 分 等 に 、少 な く と も
「個 の密 封 可 能 な 検 体 採 取 容
器 を接 続 す る 方 法 を挙 げ る こ と が で き る 。 洗 浄 ・滅 菌 の簡 便 性 、 コ ン タ
ミ
ネ
ー シ ョ ン の リ ス ク な ど を考 慮 す る と 、検 体 採 取 容 器 は コ ネ ク タ 部 と 吸 引 タ ン
ク と の間 に取 り 付 け る の が 好 ま しい。 ま た、操 作 性 や洗 浄 の簡 便 性 な どの観
点 か ら 、検 体 採 取 容 器 は脱 着 可 能 に取 り 付 け る こ と が 好 ま しい。 典 型 的 に は
、例 え ば 、 コ ネ ク タ と 吸 引 タ ン ク と を つ な ぐ吸 引 チ ュー ブ を 、吸 引 タ ン ク 側
で 取 り 外 し、 これ を検 体 採 取 容 器 に設 けた流 人 側 接 続 部 に接 続 し、検 体 採 取
容 器 に設 けた流 出側 接 続 部 を吸 引 タ ン ク に接 続 す る 。 内視 鏡 装 置 は 、検 体 採
取 容 器 を保 持 す る 部 材 を備 え て いる こ と が 好 ま しい。 上 記 検 体 採 取 容 器 は 、
「個 のみ を接 続 して も よ い し、複 数 個 を直 列 ま た は 並 列 に接 続 して も よ い。
本 発 明 に お いて 用 いる 腫 瘍 マ ー カ ー は 、大 腸 粘 液 層 剥 離 液 を用 いて 腫 瘍 細
００
胞 を検 出 し う る 腫 瘍 マ ー カ ー で あ る か ぎ り 、任 意 の腫 瘍 マ ー カ ー を用 いる こ
と が で き る 。 例 え ば 、ヘ マ トキ シ リ ン ・エ オ ジ ン 染 色 等 の マ ー カ ー に よ り 染
色 した細 胞 を組 織 学 的 に診 断 す る 方 法 を用 いる こ と が で き 、好 ま し く は 、胎
児 性 蛋 白質 (
、C
A 等 ) 、糖 鎖 抗 原 ( C A 「
三
、シ リア ル T
等 ) 、異 所 産 生 物 質 ( ホ ル モ ン や腫 瘍 性 ア イ ソザ イ ム 等 ) の よ う に 、 そ の物
質 を検 出す る こ と に よ って 大 腸 腫 瘍 と 診 断 し う る 腫 瘍 マ ー カ ー で あ り 、 よ り
好 ま し く は 、癌 遺 伝 子 ま た は癌 抑 制 遺 伝 子 で あ る 。 癌 遺 伝 子 ま た は癌 抑 制 遺
伝 子の例 と して は
「、
ミ
「フ ァ ミ
リー 、
er b
リー 、
「 ファミ
フ ァ ミ リー 、
リー 、
p
3
p
、
フ ァ ミ リー 、
ファ
フ ァ ミ リー な ど癌 関連 遺 伝 子 、日
およ びその
お よ び そ の 関連 遺 伝 子 等 が 挙 げ られ る が 、 これ ら に限 定 さ れ
関連 遺 伝 子 、
ず 、現 在 は知 られ て いな いが 、将 来 に お いて発 見 さ れ る 様 々な 癌 遺 伝 子 ま た
は癌 抑 制 遺 伝 子 を用 いる こ と が で き る 。 本 発 明 に お いて 用 いる 腫 瘍 マ ー カ ー
は 、 よ り さ ら に好 ま し く は 、腫 瘍 関連 遺 伝 子の メ チ ル 化
も 好 ま し く は、
ン
h
、
、
「 、 「
33
０ 、
3
a
S
r
「
ll
3bc
l
p
、日カ ドヘ リ
S on
3
「か ら な る 群 よ り選 択 され る 遺 伝 子の プ ロ
「
モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化
００
hs a
の検 出 で あ り 、最
の検 出 で あ る 。
本 発 明 は さ ら に 、本 発 明 の検 体 か ら核 酸 を抽 出す る エ 程 を含 む 、腫 瘍 マ ー
カ ー を検 出す る 方 法 に 関す る 。
００
本 発 明 の方 法 に お いて 、検 体 か ら の腫 瘍 マ ー カ ー の抽 出 に は公 知 の任 意 の
方 法 を用 いる こ と が で き る 。 典 型 的 に は検 体 を遠 心 分 離 し、得 られた ぺ レ ッ
トを適 切 な 媒 体 、例 え ば P
S や生 理 食 塩 水 な ど に再 懸 濁 して か ら 、 プ ロ テ
イ ナ ー ゼ K な どの タ ン パ ク 溶 解 剤 等 で 消 化 し、 フ ェ ノ ー ル 、 ク ロ ロ ホ ル ム 等
の有 機 溶 媒 で 除 蛋 白 し、 エ タ ノ ー ル 等 で 核 酸 を沈 殿 す る こ と に よ り 、核 酸 を
抽 出す る ことが で き る。具体 的 な プ ロ トコル に関 して は、遺 伝 子 エ学 に関す
る種 々 の 文献 ( 例 えば
ho c yns
: n
acc
ch
8 、村 松 正實 、 山木雅 編 、新遺 伝 子 エ学 ハ ン ドブ ック、改 訂 第
版 、羊 土社 、 ００ 年 ０月 、 ０～ 頁等 ) に記 載 され て い るの で 、 こ こに詳
細 は記 載 しな い。
００ 8
検 体 は採 取 後 直 ち に抽 出処 理 に供 す る ことが 好 ま しいが 、抽 出処 理 まで一
定 時間 、例 えば 「2 時間程 度 、 さ らに は 2
時間程 度 にわ た って保存 す る こ
とが で き る。好 ま しい保存 温 度 は、腫 瘍 マー カー 保 護 の観 点 か ら、好 ま し く
。
8
。
０C ～2 ０C 、 よ り好 ま し く は
は
。
。
。
０C ～「０ C 、特 に 好 ま し く は 一
8
。
０C ～ C で あ る。検 体 を保存 す る場 合 は、遠 心 分 離 後 、上 記 適 切 な媒体
中 に再 懸濁 した状 態 で保存 す る ことが 好 ま しい。
００
抽 出 され た核 酸 は、 その後 、標 的疾 患 マー カー に対応 した種 々 の検 出方 法
p
、例 えば
( uc
法
( ranscr
p
(
ac
n) 法
d a
d is o h r a
r
n
d
a p
ic a
ic a
on
on) 法
a p
n
l
on) 法
ic a
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(L a s
L
on) 法
法
ic a
p
( so h r a
c a c ds)
nuc
O
as d
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ic a
p
r a nd d s p a c
d a p
a
d a
c d
c
ha n
( Loop
L
a nd
r c pr
Ch
b ranched
の各種 核 酸 増 幅 法 、サ ザ ン ブ ロ ッ ト法 、 ノ ザ ン ブ ロ ッ ト法 、
法など
a s プ ロテ ク シ
ョンア ッセ イ 、 マ イ ク ロア レイ法 、 ドッ トブ ロ ッ トまた はス ロ ッ トブ ロ ッ ト
法 等 に よ り検 出す る ことが で き る。
特 に、 マー カー が エ ピジ ェネ テ ィ ックな メチル 化
００ ０
えばb
u
i
i
r s
S S C P
hy
００
シー ケ ンス法 、 メチル 化 特異 的 P C R (
u
d b
で あ る場 合 は、例
n a ssay
D
H (d
h 法 、 y r os qu n
また 、核 酸 の 定量 に は、 2 6
(C O
r n
a
RA)
h
C R)
S
SN
n hybr d
P
a
o b
三
b s
on) 法
9法 等 の手 法 で検 出す る ことが で き る。
前 後 の 吸収 極 大 波長 に お ける吸光 度 を
測 定す る分 光 光 度 法 や 、核 酸 を染色 す る種 々の試 薬 、例 えば、 エチ ジ ウム ブ
ロマ イ ド、 D A
6
ジア ミ ジ ン
フ ェニ ー ル イ ン ドー ル ) 、
ア ク リ ジ ン オ レン ジ 、 u
(登 録 商 標 )
、 ジ フ ェニ ル ア ミ ン試 薬 、ヘ キ ス
co
r
n ds
ag n
コ
ag n
( v
シ株 式 会 社 ) 、
ト3
32
8 (H 3 3 2
rog n)
( nv
uan
(登 録 商 標 )
a
n l または 、
r
8)
r
bo
i
l d ca or
rog n)
(株 式 会 社 ア ドバ ン ス )
ey
g
uan
n (登 録 商 標 )
o
on (フ ナ
(登 録 商 標 )
o d
d 等 を用 いた方 法 を含 む 、任 意 の既 知 の方 法 を利 用 す る こ と が で き る
００
本 発 明 に お いて 、大 腸 粘 液 層 剥 離 液 は 、前 洗 浄 な しで 洗 浄 液 を大 腸 粘 液 層
に散 布 して 得 る こ と が で き 、好 ま し く は 、癌 ま た は腫 瘍 の浸 潤 が 疑 われ る 部
位 に直 接 洗 浄 液 を散 布 して 得 る こ と が で き る 。
～００
００ 3
本 発 明 に用 いる 洗 浄 液 は 、 ０
く
は
～０
l 、 さ ら に好 ま し く は
l で あ る こ とが 好 ま し く 、 よ り好 ま し
～3 ０
で あ る 。 本 発 明 に よ れ ば 、少 な く と も 「
l 、 も っと も 好 ま し く は ０
以上の
瘍 検 出用 の検 体 を得 る こ と が で き 、好 ま し く は 「 2
を含 む浸 潤 性 大 腸 腫
以上の
を含 む浸 潤
性 大 腸 腫 瘍 検 出用 の検 体 を得 る こ と が で き 、 さ ら に好 ま し く は 「
の
００
l
以上
を含 む浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 検 出用 の検 体 を得 る こ と が で き る 。
本 発 明 の キ ッ トは 、前 記 の 好 ま しい洗 浄 液 と 、大 腸 の粘 膜 を傷 つ け る こ と
な く 大 腸 粘 液 層 を剥 離 し う る 洗 浄 液 散 布用 器 具 を含 む こ と が で き る 。
００
本 発 明 の浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 を検 出す る 指 標 を得 る 方 法 は 、洗 浄 液 を大 腸 粘 液
層 に散 布 して 該 粘 液 層 か ら粘 液 を剥 離 す る こ と に よ り 、剥 離 さ れた粘 液 を前
記 洗 浄 液 中 に含 む検 体 を採 取 す る エ 程 と 、前 記 検 体 中の核 酸 を抽 出す る エ 程
と 、前 記 核 酸 中の腫 瘍 マ ー カ ー の存 在 又 は不 在 を決 定 す る エ 程 を含 む こ と が
で きる。
００
本 発 明 に お いて 、
「 遺 伝 子の メ チ ル 化
を指 標 と して 浸 潤 性 大 腸 腫
瘍 が 存 在 す る と 判 断 す る た めの判 断 基 準 と して は 、好 ま し く は 、
の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化
が
を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性 大
腸 腫 瘍 が 存 在 す る と判 断 す る こ と が で き、 よ り 好 ま し く は、 「
ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化
が
「
「 遺伝子
遺 伝 子の プ
を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性 大 腸 腫
瘍 が 存 在 す る と判 断 す る こ と が で き る 。
００
本 発 明 に お いて 、
遺 伝 子の メ チ ル 化
「
D
N A を指 標 と して 浸 潤 性 大 腸
腫 瘍 が 存 在 す る と 判 断 す る た めの判 断 基 準 と して は 、好 ま し く は 、
伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
D
NAが
０ を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性
大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る と判 断 す る こ と が で き、 よ り 好 ま し く は、 「
の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が 3 3
遺
「
遺伝子
を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性 大 腸
腫 瘍 が 存 在 す る と判 断 す る こ と が で き る 。
００
本 発 明 に お いて 、
遺 伝 子の メ チ ル 化
D
N A を指 標 と して 浸 潤 性 大 腸 腫
瘍 が 存 在 す る と 判 断 す る た めの判 断 基 準 と して は 、好 ま し く は 、
遺伝子
の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D N A が ０ を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性 大 腸
腫 瘍 が 存 在 す る と判 断 す る こ と が で き、 よ り 好 ま し く は、
モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D
NAが
遺 伝 子の プ ロ
を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が
存 在 す る と判 断 す る こ と が で き る 。
００
本 発 明 に お いて 、
r
3 b c遺 伝 子の メ チ ル 化 D N A を指 標 と して 浸 潤 性 大
腸 腫 瘍 が 存 在 す る と 判 断 す る た めの判 断 基 準 と して は 、好 ま し く は 、
c 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D
NAが
「
NAが
「8
3 b
を越 え て いる 場 合 に
浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る と判 断 す る こ と が で き、 よ り 好 ま し く は、
c 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D
r
r
3 b
を越 え て いる 場 合 に
浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る と判 断 す る こ と が で き る 。
００ ０
本 発 明 に お いて は 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の大 き さ と 、複 数 の遺
伝 子の メ チ ル 化
D
N A を指 標 と して 、 よ り精 度 よ く 、浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 の存 在
を診 断 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、腫 瘍 の大 き さ と して は 、大 腸 の 内腔 側 か
ら観 察 した腫 瘍 の 直 径 が ０
以 上 で あ る 場 合 に 、浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す
る と 判 断 す る こ と が で き る 。 ま た、例 え ば 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍
以 上 で あ り、
の直 径 が ０
ル化
D
NAが
「
s a
r
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ
を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る と 判 断 す
る こ と が で き る 。 他 の態 様 と して は 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の 直 径
が ０
以 上 で あ り 、hsa
r
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D
NA が
以 下 で あ り 、か つ 、
「
DN A が 「０
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る と 判 断 す る こ
と が で き る 。 さ ら に 、他 の態 様 と して は 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の
直径 が ０
が
「
NA が
以 上 で あ り、
「 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A
を越 え て いて 、かつ 、 「 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
「０
D
を越 え て いる 場 合 に浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る と 判 断 す る こ と
が で きる。
００
ま た、本 発 明 の浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 を検 出す る 指 標 を得 る 方 法 は 、薬 剤 お よ び
ま た は治 療 方 法 の治 療 効 果 を評 価 す る 方 法 と して も 用 いる こ と が で き る 。
００
例 え ば 、治 療 前 の マ ー カ ー レベ ル と 治 療 後 の マ ー カ ー レベ ル と の比 較 、 ま
た は 、治 療 中の あ る 時 点 で の マ ー カ ー レベ ル と 、 そ の 時 点 よ り 後 の治 療 中の
別 の 時 点 で の マ ー カ ー レベ ル と の比 較 に よ り 、標 的疾 患 の進 行 が 減 速 も し く
は停 止 す る か、標 的疾 患 が 消 退 して いれ ば 、治 療 効 果 あ り と 、 あ る いは 、標
的疾 患 の進 行 に影 響 を与 え な い場 合 に は治 療 効 果 な し と 評 価 す る こ と が で き
る。
００ 3
本 発 明 の方 法 は ま た、治 療 終 了後 の疾 患 再 発 の有 無 を モ ニ タ ー す る こ と に
利 用 す る こ と が で き る 。 こ の場 合 、治 療 終 了後 に対 象 か ら 定 期 的 に検 体 を採
取 し、 マ ー カ ー レベ ル を も と に上 記 と 同様 の手 法 で 疾 患 の存 否 を検 査 す る 。
００
木 明細 書 中 に別 記 の な い限 り 、本 発 明 に 関 して 用 い られ る 科 学 的お よ び 技
術 的用 語 は 、 当 業 者 に通 常 理 解 さ れ て いる 意 味 を有 す る も の と す る 。 一 般 的
に 、木 明細 書 中 に記 載 さ れた細 胞 お よ び組 織 培 養 、分 子 生 物 学 、免 疫 学 、微
生 物 学 、遺 伝 子 お よ び タ ン パ ク 質 お よ び核 酸 化 学 に 関 して 用 い られ る 用 語 、
お よ び そ の技 術 は 、 当 該 技 術 分 野 に お いて よ く 知 られ 、通 常 用 い られ て いる
も の と す る 。 ま た、別 記 の な い限 り 、本 発 明 の方 法 お よ び 技 術 は 、 当 該 技 術
分 野 に お いて よ く 知 られた慣 用 の方 法 に従 って 、木 明細 書 中 で 引用 さ れ 、議
論 さ れ て いる 種 々の 一 般 的 な 、 お よ び よ り 専 門的 な 参 考 文 献 に記 載 さ れた と
お り に行 われ る 。 かか る 文 献 と して は 、例 え ば 、 a broo
u a r ０lon ng
Labo ra
ory
anua
2nd
ed
e
０o d
a
・
，
pr ng
o
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Laboratory
9
００ ) ;
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arbor
sso
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０o d
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Labora ory r ss (
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０
u
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n bod
Laboratory
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o cu ar
Laboratory
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arbor
p 「 ng
o ogy
Lan
a nd
arbor
o le c u la r
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お よび ０００ 補 遺 ) ;
(
p ro oco s
e
０o d
e
０U r r n
a
s h ng
hor
hods
3r d
anua
０
pub
n
a
００
p r ss ( 8 ) お よび ambrook
Laboratory
O
4
h
d
Laborato
０) ; お よび a r
０o d
pr n
) な どが挙 げ られ る。
木 明細 書 中 に記 載 され た分析 化 学 、合 成 有機 化 学 な らび に医薬 品化 学 お よ
び薬 化 学 に関 して用 い られ る用 語 、 な らび にその実験 手 順 お よび技 術 は、 当
該 技 術 分 野 に お いて よ く 知 られ 、通 常用 い られ て い る もの で あ る。標 準 的 な
技 術 を、化 学 合 成 、化 学 分析 、薬剤 の製 造 、製剤 お よび送 達 、 な らび に対象
の処 置 に用 い る もの とす る。
００
な お、本発 明 に お ける用 語 「
症例 」 は、 ヒ トの患者 で あ る対象 を い う。
００
木 明細 書 に お いて は、別 記 の な い限 り、 タ ンパ ク質 の 名称 は遺 伝 子 名 の ア
ル フ ァベ ッ ト ( も し く はアル フ ァベ ッ トと数 字 ) 等 の あ とに タ ンパ ク と付 し
て表 記 し、 その タ ンパ ク質 を コー ドす る遺 伝 子 は、前 記 の遺 伝 子 名 の アル フ
ァベ ッ ト ( も し く はアル フ ァベ ッ トと数 字 ) 等 のみ で表 記 す るか 、遺 伝 子 名
の アル フ ァベ ッ ト ( も し く はアル フ ァベ ッ トと数 字 ) 等 の役 に 「
遺伝子」 と
付 記 して表 記 す る もの とす る。前 記 の 「
遺 伝 子 」 は、 ゲ ノ ム遺 伝 子 、 メ ッセ
ンジ ャー
また はc
の いずれ か を意 味す る もの と し、 いずれ か を特 定す る
場 合 に は、特 定 して表 記 す る もの とす る。
００ 8
本発 明 に お いて 、 「対象 」 とは、大腸 を有 す る任 意 の 生物個 体 を意 味 し、
好 ま し く は動 物 、 さ らに好 ま し く は哺 乳 動 物 、例 えば、 ヒ ト、非 ヒ ト霊 長 類
、 イ ヌ 、 ネ コな どの コ ンパ ニオ ンア ニ マル 、 ウ シ、 ウマ 、ヤ ギ 、 ヒツ ジ、 ブ
タ な どの産 業動 物 な ど、 そ して特 に好 ま し く は ヒ トで あ る。本発 明 に お いて
、対 象 は健 常 で あ って も 、何 ら かの疾 患 に罹 患 して いて も 、 ま た疾 患 の治 療
中 も し く は治 療 後 で あ って も よ い も の と す る 。
００
本 発 明 に お いて 、 「腫 瘍 」 と は 、細 胞 が 異 常 な 増 殖 をす る 状 態 を いい、腫
瘍 の う ち で 悪 性 腫 瘍 を 「癌 」 と い う 。
００ ０
本 発 明 に お いて 、 「深 達 度 」 と は 、癌 が 大 腸 癌 が 内腔 側 か ら深 層 へ 浸 潤 し
た度 合 いを いい、 「浸 潤 度 」 と 同 義 で あ る 。
００
本 発 明 に お いて 「浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 検 出」 、 「浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 の検 出、」 ま
た は 「浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 の検 出方 法 」 と は 、浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る か否 か
を検 出す る た めの指 標 を得 る 方 法 を い う 。
００
木 明細 書 に お いて 、 「エ ピ ジ ェネ テ ィ ック 」 と は 、本 発 明 の属 す る 技 術 分
野 に お け る通 常 の意 味 を有 す る も の と し、例 え ば 、
配 列 の 変 化 を伴 う こ と
な く 、 ク ロ マ チ ン への後 天 的 な 修 飾 に よ り遺 伝 子発 現 が 制 御 さ れ る こ と を例
示 す る こ と が で き る 。 ク ロ マ チ ン への後 天 的 な 修 飾 の例 と して は 、
塩基 の
メ チ ル 化 の ほ か 、 ヒ ス ト ン の メ チ ル 化 、 ア セ チ ル 化 、 リ ン 酸 化 な どの化 学 修
飾 を例 示 す る こ と が で き る 。
００ 3
本 発 明 に お いて 、 「腫 瘍 マ ー カ ー の量 」 と は 、組 織 学 的 な 評 価 ス コ ア 、血
液 等 の体 液 中の胎 児 性 蛋 白質 、糖 鎖 抗 原 、 ま た は異 所 産 生 物 質 の濃 度 、検 体
中 に含 ま れ る変 異 した癌 遺 伝 子 ま た は癌 抑 制 遺 伝 子の量 、検 体 中 に含 ま れ る
の量 を い う 。
腫 瘍 関連 遺 伝 子の メ チ ル 化
００
本 発 明 に お いて 「
メ チ ル 化 」 と は 、任 意 の ゲ ノ ム 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー
領 域 の p ア イ ラ ン ドに お け る シ トシ ン が メ チ ル 化 さ れ る こ と を い う 。
００
本 発 明 に お いて 「
過 剰 メ チ ル 化 」 ま た は 「過 剰 メ チ ル 化 」 と は 、任
意 の ゲ ノ ム 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の p ア イ ラ ン ドが 、正 常 細 胞 に比 べ て
過 剰 に メ チ ル 化 さ れ た状 態 を い う 。
００
本 発 明 に お いて 「 p ア イ ラ ン ドの メ チ ル 化 」 と は 、任 意 の ゲ ノ ム 遺 伝 子の
プ ロ モ ー タ ー 領 域 に存 在 す る p ア イ ラ ン ドに お け る
００
本 発 明 に お いて 「メ チ ル 化
メ チ ル化 をいう 。
」 と は任 意 の ゲ ノ ム 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領
域 の p ア イ ラ ン ドに お け る メ チ ル 化 さ れた シ トシ ン を いい、 「メ チ ル 化
の割 合 」 と は 当 該 領 域 に お け る 全 て の
メ チ ル化
ア イ ラ ン ド中の シ トシ ン に 占め る 「
」 の割 合 を い う 。
の量 」 と は 、任 意 の ゲ ノ ム 遺 伝 子の プ ロ モ ー
本 発 明 に お いて 「メ チ ル 化
００ 8
p
タ ー 領 域 の p ア イ ラ ン ドに お け る メ チ ル 化 さ れた シ トシ ン の量 を い う 。 「メ
チ ル化
の量 」 は 、 「メ チ ル 化
の割 合 」 と して 表 示 す る こ と も で き る 。
本 発 明 に お いて 「浸 潤 腫 瘍 」 と は粘 膜 筋 板 を超 え 、粘 膜 下 層 以 深 に浸 潤 し
００
た癌 を い う 。
００8 ０
本 発 明 に お いて 「非 浸 潤 腫 瘍 」 と は粘 膜 内 に留 ま る 癌 を い う 。
００8
本 発 明 に お いて 「非 癌 」 と は大 腸 癌 に罹 患 して いな い対 象 、 ま た は大 腸 癌
に罹 患 して いな い対 象 か ら採 取 した検 体 を指 して 用 いる 。
本 発 明 に お いて 「浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 検 出用 検 体 」 と は 、洗 浄 液 を大 腸 粘 液 層
００8
に散 布 して 該 粘 液 層 か ら粘 液 を剥 離 す る こ と に よ り 得 られ る 、剥 離 さ れた粘
液 を前 記 洗 浄 液 中 に含 む 、浸 潤 性 大 腸 腫 瘍 が 存 在 す る か否 か を検 出す る た め
の指 標 を得 る た めの検 体 を い う 。
本 発 明 に お いて 「大 腸 粘 液 層 」 と は 、大 腸 内腔 の粘 膜 の表 層 に あ る 粘 液 層
００8
をいう 。
本 発 明 に お いて 「大 腸 粘 液 層 剥 離 液 」 と は 、洗 浄 液 を大 腸 粘 液 層 に散 布 し
００8
て 該 粘 液 層 か ら粘 液 を剥 離 す る こ と に よ り 得 られ る 液 体 を い う 。
本 発 明 に お いて 「生 理 的 な 等 張 液 」 と は 、大 腸 粘 膜 を刺 激 す る 成 分 を含 有
００8
で ある等 張 液 をいう 。
しな い、 中性 付 近 の
本 発 明 に お いて 「hsa
００8
b
およ び
て 「 r
c ro
3
r
c
3 b c」 と
「 r
3 b c」 は、 と も に
c ro
3
に共 通 す る ゲ ノ ム 遺 伝 子 を意 味 す る 。 通 常 の用 語 と し
3 b c」 と い った場 合 に は 、転 写 された
を指 す こ と が あ る
c ro
た め、 ゲ ノ ム 遺 伝 子 を指 す こ と を強 調 す る た めに 「hsa
r
3 b c 」 と の用 語
を用 いて いる 。
００8
本 発 明 に お いて メ チ ル 化
の検 出 に用 いる プ ラ イ マ ー の配 列 の標 記 に お い
て 、 「 」 で 表 記 さ れ る 塩 基 は 、 メ チ ル 化 さ れ て いな い
トシ ン を検 出す る 場 合 に は チ ミ ン ( )
p
ア イ ラ ン ド中の シ
を意 味 す る も の と し、 メ チ ル 化 さ れ て
いる
p アイラ ン
ド中の メ チ ル 化 シ トシ ン を検 出す る 場 合 に は シ トシ ン (㈹
を意 味 す る も の と す る 。
本 発 明 に お いて メ チ ル 化
の検 出 に用 いる プ ラ イ マ ー の配 列 の標 記 に お い
て 、 「R 」 で 表 記 さ れ る 塩 基 は 、 ア デ ニ ン ( A ) ま た は グ ア ニ ン ( G ) を意
味 し、 「R 」 が ア デ ニ ン ( A ) で あ る プ ラ イ マ ー と 「R 」 が グ ア ニ ン ( G )
で あ る プ ラ イ マ ー を混 合 して 用 い られ る 。
００88
本 発 明 に お いて 「
g ha rac r
００8
曲線 」 と は 、 受 信 操 作 特 性 曲線 ま た は c
U rv
r
p ra
をいう 。
曲線 は 、連 続 す る 数 値 で 表 さ れ る 検 査 結 果 に基 づ いて 、特 定 の疾 患 が 陽
性 で あ る か陰 性 で あ る か を判 断 す る 場 合 に 、陽 性 ま た は陰 性 と 判 断 す る 閾値
を決 定 す る た めに用 いる こ と が で き る 。
曲線 に お いて 、 「感 度 (s ns
００ ０
y) 」 と は陽 性 と 判 定 さ れ る べ き検
体 を正 し く 陽 性 と 判 定 す る 割 合 を示 し、 「特 異 度
(sp c
y) 」 と は陰 性
c
と 判 定 さ れ る べ き検 体 を正 し く 陰 性 と 判 定 す る 割 合 を示 す 。 通 常 、陽 性 と 判
定 さ れ る べ き検 体 を正 し く 陽 性 と 判 定 した場 合 を 「真 陽 性 」 と 定 義 さ れ 、陽
性 と 判 定 さ れ る べ き検 体 を誤 って 陰 性 と 判 定 した場 合 を 「偽 陰 性 」 と 定 義 さ
れ 、陰 性 と 判 定 さ れ る べ き検 体 を正 し く 陰 性 と 判 定 した場 合 を 「真 陰 性 」 と
定 義 さ れ 、陰 性 と 判 定 さ れ る べ き検 体 を誤 って陽 性 と 判 定 した場 合 を 「偽 陽
性 」 と 定 義 さ れ る 。 そ して 、 「感 度 」 は 、真 陽 性 の件 数 を真 陽 性 の件 数 と偽
陰 性 の件 数 の和 で 割 る こ と に よ る こ と に よ り 求 め る こ と が で き る 。 ま た、 「
特 異 度 」 は 、真 陰 性 の件 数 を偽 陽 性 の件 数 と 真 陰 性 の件 数 の和 で 割 る こ と に
よ り求 める こ と が で き る 。
００
「
」
は
曲線 の 下 側 の 面 積 を示 す 。
「
」
は0・
～
0の値 と な り 、
・
0 に近 づ く ほ ど優 れた検 査 方 法 で あ る こ と を示 す 。
００
浸 潤 腫 瘍 と 非 浸 潤 腫 瘍 を 区 別 す る た めに最 も 適 した 閾値 で あ る 「ベ ス トカ
ッ トオ フ値 」 は 、
曲線 中の 左 上 の ポ イ ン
特 異 度 」 が 0 で あ る 点 か ら の距 離 が 最 も 短 い
が で きる。
トで あ る 、 「感 度 」 が
で、 「
曲線 上 の 点 と して 求 め る こ と
・
００
００
００
００
実施例
００
以 下 、実 施例 に基 づ いて 木 発 明 を さ ら に具 体 的 に説 明す る が 、本 発 明 は 以 下
の実 施例 に限 定 さ れ る も の で は な い。
００ 8
く実 施例
「ノ
検 体 の採 取 方 法 の検 討
検 体 は 、 ００8 年
月 か ら ００ 年 月 ま で の間 に 、秋 田 赤 十 字 病 院
消化器 内
視 鏡 セ ン タ ー で 採 取 した 。 検 体 を採 取 した 対 象 は 、長 年 、大 腸 腺 腫 が あ り経
過 観 察 目的 に大 腸 内視 鏡 検 査 を 受 けた患 者 、大 腸 癌 の手 術 前 検 査 の た めに大
腸 内視 鏡 検 査 を 受 けた患 者 、 お よ び健 康 診 断 に お いて便 潜 血 反 応 が 陽 性 で あ
ったた めに精 密 検 査 を 目的 と して 大 腸 内視 鏡 検 査 を 受 けた被 験 者 と し、生 検
検 体 は浸 潤 腫 瘍
検 体 、非 浸 潤 腫 瘍 9
と した 。 粘 液 層 剥 離 液 は浸 潤 腫 瘍 3
8 検 体 、正 常 粘 膜
「8
7 検 体 を対 象
4 検 体 、非 浸 潤 腫 瘍 3 6 検 体 、正 常 粘 膜
6 検 体 を対 象 と した 。 検 体 を採 取 した 対 象 の特 性 を表
「 に示 す 。 「
過 形成性
ポ リー プ 」 、 「腺 腫 」 、 「早 期 癌 」 、 「進 行 癌 」 は 、 いずれ も 病 理 組 織 学 的
診 断 に よ り 判 定 さ れた 。 隆 起 型 、平 坦 型 、陥 凹型 、 o r ann
2 型、
or
a nn
3型、
or
a nn
「型 、 o r
a nn
型 の分 類 は大 腸 癌 取 扱 い規 約 に従 った 。 異
形 成 の程 度 の判 定 お よ び 分 化 の程 度 の判 定 は病 理 組 織 学 的診 断 に よ り 判 定 さ
れた 。 腫 瘍 の大 き さ は 、病 理 標 本 を測 定 した 。 臨 床 ス テ ー ジ の判 定 は大 腸 癌
取 扱 い規 約 、
００
分 類 に従 った 。
検 体 の 回収 方 法 を検 討 す る た め、大 腸 癌 症 例 「 3 例 で 大 腸 フ ァイ バ ー よ り
直接 ０
l サ イ ズ の注 射 筒 を用 いて 腫 瘍 部位 に 、毎 秒
l の水 を 回収 す る 方 法 ( 方 法
を散 布 し、剥 離 した粘 液 層 を含 む ０
る いは 、大 腸 癌 症 例
6 症 例 で ピ オ ク タ ニ ン 散 布用 の チ ュー ブ
リ ン パ ス 製 ) よ り 、腫 瘍 部位 に 、毎 秒
「)
、あ
ub 、オ
(
l の速 度 で 生 理 食 塩 7K ０
l を散
l の水 を 回収 す る 方 法 ( 方 法 2 ) の いずれ
布 し、剥 離 した粘 液 層 を含 む ０
か に よ って 、検 体 を採 取 した 。 方 法
例 、方 法
l の速 度 で 水 道 水
「 に よ って 検 体 を採 取 した 対 象 は 「 「症
2 に よ って検 体 を採 取 した対 象 は3
症 例 で あ った 。 ピ オ ク タ ニ ン 散
布用 の チ ュー ブ を用 いて 、腫 瘍 部位 に生 理 食 塩 水 を散 布 す る 前 の大 腸 内腔 の
写 真 ( 図 「 ) 、散 布 中の大 腸 内腔 の写 真 ( 図 「 ) 、 お よ び 散 布 中の大 腸 内
腔 の写 真 ( 図 「㈹ を 、 図 「 に示 す 。
０ ００
得 られた検 体 は 、
００rp の速 度 で 「 ０分 間遠 心 して 、細 胞 を沈 殿 さ せ 、上
清 を棄 て た の ち 、 そ の 一 部 をホ ル マ リ ン で 固 定 した後 にへ マ トキ シ リ ン ・エ
オ ジ ン で 染 色 して 、細 胞 の 形 態 を観 察 した 。 大 腸 大 腸 粘 液 層 剥 離 液 の細 胞 診 (
進行癌
症 例 、早 期 癌 症 例 、腺 腫
症 例 ) を行 い、大 腸 腫 瘍 の病 理 診 断 と 大
腸 粘 液 層 剥 離 液 の細 胞 診 を比 較 した 。 進 行 癌 ０症 例 (合 致 率
症 例 (合 致 率 ０肋 、腺 腫 症 例 (合 致 率
) 、早 期 癌 ０
) に お いて 生 検 と細 胞 診 の結 果 が
合 致 した 。 これ ら の結 果 よ り 、大 腸 粘 液 層 剥 離 液 に大 腸 癌 細 胞 が 浮 遊 して お
り 、特 に進 行 大 腸 癌 の粘 膜 剥 離 液 に顕 著 に腫 瘍 細 胞 が 含 ま れ る こ と が 示 唆 さ
れた 。 方 法
「 ま た は方 法
2 に よ り採 取 した検 体 中の細 胞 の写 真 を図 2 に示 す
hod で は細 胞 が 少 な く 、細 胞 の 変 性 が強 い。
な り 、細 胞 診 に よ りadenoca
r
hod 2 で は変 性 が 弱 く
o a と 診 断 で き る 症 例 を認 めた 。 ま た 一部 の
症 例 で 細 胞 診 を施 行 した と こ ろ 、方 法 「 で は細 胞 数 が 少 な く 、細 胞 に変 性 が
多 い、方 法
2 で は細 胞 数 が 多 く 、変 性 も 少 な い像 が 得 られた 。 以 上 よ り方 法
2 で粘 液 層 の腫 瘍 細 胞 を効 率 よ く 回収 で き 、腫 瘍 細 胞 の異 常 メ チ ル 化 を解 析
す る こ と が 可 能 で あ る と考 え られた 。
を抽 出 し、得 られた
さ ら に 、遠 心 分 離 した上 記 の検 体 よ り
００
の量 を比
較 した 。 表 2 に示 す よ う に 、方 法 「 を用 いて 得 られた検 体 と 方 法 2 を用 いて
られた検 体 の間の
含 有 量 に大 き な差 は認 め られ な か った 。 方 法 「 に よ り 採
取 した検 体 の
量 は 、大 腸 粘 液 層 剥 離 液 で は 「
、生 検 組 織 で は 2
「・
り採 取 した検 体 の D
2 8ｱ
・
０8 ｱ
2 の いずれ を用 いて も 得 られ る
離 液 か ら得 られ る
ｱ 「「
「3
・
「
で あ った 。 一 方 、方 法 2 に よ
2
・
０
3ｱ
量 は 、大 腸 粘 液 層 剥 離 液 で は
、生 検 組 織 で は 「 7
8
「
・
・
8
で あ った 。 方 法 「 と 方 法
・
量 に差 は認 め られず 、 ま た、大 腸 粘 液 層 剥
量 と組 織 か ら の得 られ る
量 に差 は認 め られ な か っ
た０
００
の抽 出 は次 の よ う に して 行 な った 。 検 体 の遠 心 分 離 後 に 、上 清 を
な お、
除 去 し、ペ レ ッ トを
のS D S を
l のS
・
三
D T A 中 に再 懸 濁 した 。 これ に 、 「 ０
バ イ オ株 式 会 社 、 o d
o
０33)
を
０
イ ン キ ュベ ー ト した 。 フ ェ ノ ー ル (
r og n I
v
。
、
Cで 「
の プ ロ テ イ ナ ーゼ K ( タ カ ラ
。
それ ぞれ加 え 、
C で 「時 間
I およ び 2
・
chn
s)
を
r a ur
ml
u
r
a ura d
ph n
7
え 、転 倒 混 和 後
、
「
分 遠 心 分 離 し、上 清 を新 しいチ ュー ブヘ 移 した 。 こ の操 作 を さ
～2 回繰 り返 し、溶 媒 を 同 量 の ク ロ ロ ホ ル ム ( 和 光 純 薬 エ 業 株 式 会 社
g
に変 え て さ ら に 「 ～2 回繰 り 返 した 。 グ リ コ ー ゲ ン
I (
n
a
らに 「
)
梓
０) お よ び 「
間 イ ン キ ュベ ー
０
エ タ ノ ール
ト した 。 そ の後 、検 体 を 2
分 離 して 上 清 を捨 て 、ペ レ ッ トを 7
００ 「
解 し、
０ ０3
D
、
l を加 え 、転 倒 混 和 後 、
０
7 ００ 「
エ タ ノ ール 「 O
。
。
C にて 「 2 時
。
、
Cで 「
分遠 心
I に懸 濁 後 、 2 7
C で 「 5 分 遠 心 分 離 し、上 清 を捨 て 、精 製 7K
００
l に溶
分 析 用 試 料 を得 た 。
量 は 、検 体 中 に含 ま れ る
した 。 分 光光 度 法 は 、 a n o rop
の 回収 量 を 、分 光光 度 法 に よ り 測 定
００分 光光 度 計 ( 旭 テ ウ ノ ヴ ラ ス 株 式 会
社 ) を用 い、製 造 者 の マ ニ ュア ル に従 って 行 った 。
同 じ 対 象 に つ いて 病 理 組 織 学 的検 査 を行 い、粘 膜 下 層 以 深 への浸 潤 を認 め
００
る 場 合 に浸 潤 腫 瘍 と 診 断 し、非 癌 ま た は粘 膜 内 に留 ま る 癌 で あ る 場 合 に非 浸
潤 腫 瘍 と 診 断 した 。 ま た、方 法 「 を用 いて 得 た検 体 を用 いて 、病 理 組 織 学 的
に よ り 浸 潤 腫 瘍 か非 浸 潤 腫 瘍 か を診 断 した 。 これ ら の結 果 を表 2 に ま と めた
と 非 浸 潤 腫 瘍 の33 ・3
。 方 法 「 を用 いて 採 取 した検 体 で は 、浸 潤 腫 瘍 の
しか正 し く 診 断 で き な か った 一 方 で 、方 法 を用 いて 採 取 した検 体 で は 、浸
潤 腫 瘍 の3
法
を正 し く 診 断 で きた 。 した が って 、方
と非 浸 潤 腫 瘍 の
2 を用 いて 採 取
した検 体 が 、浸 潤 性 大 腸 癌 検 出用 の検 体 と して 、方 法 「 を
用 いて 採 取 した検 体 よ り も 優 れ て いる こ と が わ か った 。
００
さ ら に 、生 検 組 織 と 方 法
2 に よ り採 取
した大 腸 粘 液 層 剥 離 液 と を対 比 す る
た め、 それ ぞれの 、検 体 を得 た症 例 の特 性 を表 3 に示 した 。 生 検 組 織 を得 た
症 例 と方 法
2 に よ り大 腸 粘 液 層 剥 離 液 を得 た症 例 の間 で 、平 均 年 齢 、男 女 数
に有 意 な差 は見 られ な か った 。 表 3 中 、浸 潤 腫 瘍 か非 浸 潤 腫 瘍 かの判 定 は 、
病 理 組 織 学 的検 査 に よ り 行 な った 。 これ ら の結 果 に よ り 、性 別 や年 齢 に よ る
有 意 差 は認 め られ な か った 。 方 法
の 生 検 よ り 得 られた
ｱ０
33
に十 分 な
００
g(
二
3
2 を用 いて 採 取
した大 腸 剥 離 液 と 大 腸 腫 瘍
の 量 の 平 均 は そ れ ぞれ 、
28
ｱ
g(
二
)
8
) で あ り 、大 腸 内視 鏡 で 得 られた大 腸 粘 液 層 剥 離 液 に は解 析
量 が 存 在 す る こ と が 明 ら か と な った 。
く実 施例 2 ノ
メ チ ル化
の測 定 お よ び
次 に 、全 症 例 に つ いて 、 メ チ ル 化
変 異 の測 定
の測 定 を行 な った 。
ま ず 、大 腸 内視 鏡 検 査 を行 い、全 大 腸 内視 鏡 検 査 で 腫 瘍 を認 めた場 合 に 、
ピ オ ク タ ニ ン 散 布用 の チ
ュー ブ
(
ub
、オ リ ン パ ス 製 ) を用 い腫 瘍 に近
接 した位 置 か ら洗 浄 液 を散 布 す る こ と に よ り 大 腸 内腔 側 の表 面 の粘 液 を剥 離
した 。 そ の際 、洗 浄 液 は 、 お よ そ 、毎 秒
l の速 度 で 大 腸 粘 液 層 に散 布 し
た０
００
そ の後 、拡 大 内視 鏡 ( 「
(
０
観 察 後 、腫 瘍 の癌 部 、腺 腫 部 、腫 瘍 周 辺
以 内 ) の背 景 正 常 粘 膜 を生 検 に て 採 取 して 、日
や マ ー キ ン グ 等 の処 置
を行 な った 。 採 取 さ れた検 体 は 、 エ ン ドフ レ ッシ ュに て 保 管 し、冷 凍 保 存 後
、 フ ェノ ー ル ク ロ ロ ホ ル ム 法 に よ り
抽 出 を行 った 。
採 取 さ れ た 生 検 と 大 腸 粘 液 層 剥 離 液 は 、 そ れ ぞれ
０ ０8
社 の日
日
b
c
p
c
(登 録 商 標 )
c
プ ロ ト コ ー ル と トラ ブル シ ュー テ ィン グ 」 お よ び 「日
sul
(登 録 商 標 )
を用 いて 、 そ の取 扱 説 明書 で あ る 「日
k
u
抽 出 を行 った後 、
andboo k 」
ul
に記 載 の プ ロ
ul
硫 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム 処 理 を行 い、 そ のb
ト コ ー ル に従
U 使 い、
って 亜
を行 っ
た０
r は 、大 腸 癌 で メ チ ル 化 が 報 告 さ れ て いる
全 て のp r
、
cro
cの メ チ ル 化
3 b
具 体 的 に は、
００
を検 出す る た めのp r
r 3 b c遺 伝 子 に つ いて は 、 フ オ ワ ー ドプ ラ イ マ ー と して配
，
ン 一 ク エ ン ス プ ラ イ マ ー と して は配 列 番 号
3の
を使 用 した 。
、 リバ ー ス プ ラ イ マ ー と して配 列 番 号 の
プ ラ イ マ ー と して は配 列 番 号 ま た は の
、パ イ ロ シ ー ク エ ン ス
を使 用 した 。
遺 伝 子 に つ いて は 、 フ オ ワ ー ドプ ラ イ マ ー と して配 列 番 号 8 の
ま た、 「
、 リバ ー ス プ ラ イ マ ー と して配 列 番 号 の
プ ラ イ マ ー と して は配 列 番 号 ０の
０
を使 用 した 。
、 リバ ー ス プ ラ イ マ ー と して配 列 番 号
ン ス プ ラ イ マ ー と して は配 列 番 号 3 ま た は
０ 3
全 ての
p
、パ イ ロ シ ー ク エ ン ス
遺 伝 子 に つ いて は 、 フ オ ワ ー ドプ ラ イ マ ー と して配 列 番 号
同様 に 、
の
、パ イ ロ
遺 伝 子 に つ いて は 、 フ オ ワ ー ドプ ラ イ マ ー と して配 列 番 号 の
ま た、 「
０
r を用 いた 。
、 リバ ー ス プ ラ イ マ ー と して配 列 番 号 2 の
列 番 号 「の
０ ０
「 、 「
a ssay で は
０C 3０秒 x
ns o n
d na ur a
S
p
q u nc r に よ り メ チ ル 化
の
、パ イ ロ シ ー ク エ
を使 用 した 。
の
p g C 3０秒 そ の後 a n n
n S
g S
C 3０秒 を ０サ イ ク ル い った 。 そ の後 、py 「o s
を定 量 的 に測 定 し、p r
r の上 流 の
p
S
それ ぞれの メ チ ル 化 の数 値 を平 均 した値 を採 用 した 。
０
遺 伝 子の 変 異 に 関 して も 、パ イ ロ シ ー ク エ ン ス 法 を用 いて 、 コ ドン
お よ び コ ドン 3 を測 定 した 。
遺 伝 子の 変 異 の測 定 は 、
日
社の
検 出キ ッ トで あ る y r o a r k
の
０(
V
X
０
2 ) (カ タ ロ グ番 号
「 y r o a r k (登 録 商 標 )
を用 いて 、 そ の取 扱 説 明書 で あ る
)
k 」 に記 載 の プ ロ ト コ ー ル に従
０ andboo
V
っ
て 測 定 した 。
０
生検組織 では
r 3 b c の メ チ ル 化 は 非 癌 部 と腺 腫 、
「 、 「
癌 部 で 徐 々に上 昇 す る 傾 向 を認 めた が 、有 意 差 を認 めな か った 。 一 方 、粘 膜
剥 離 液 を用 いた メ チ ル 化
で 有 意 差 が 認 め られた 。
c ro
3 b
3 3 冊 で あ り 、 = ０ ０００
・
く
・
cの メ チ ル 化
は 、癌 部 で
の メ チ ル化
は早 期 癌 で
０ で あ り 、 = ０ ００ 3 の有 意 水 準 で 優 位 さ を認 めた 。
は 、早 期 癌 で
3
、 非癌 部 で
3
33
・
3
めた 。
c ro
、 非癌 部 で
3 b
3
2
、非 癌 部
c ro
cの
3 b
で あ り 、 = ０ ０ ０の有 意
水 準 で 有 意 差 を認 めた 。 腺 腫 と 非 癌 部 で 比 較 す る と 、
、腺 腫 で
００ の有 意 水 準
・
・
メ チ ル化
の
の有 意 水 準 で 有 位 な差 を認 めた 。 同様 に 、早
期 癌 と非 癌 部 で比 較 す る と 、 「
で
０ で あ り、
5 、 非癌 部 で
は 、癌 部 で
メ チ ル化
非癌 部 で
の解 析 で は 、進 行 癌 と 非 癌 部 に お いて 、 「
「 の メ チ ル化
は
０ で あ り 、 = ０ ００ の有 意 水 準 で 優 位 さ を認
・
cの メ チ ル 化
は 、腺 腫 で
、 非癌 部 で
33冊で
・
あ り 、 = ０ ０3 ０ の有 意 水 準 で 有 意 差 を認 めた 。 ま た、癌 の深 達 度 と メ チ ル 化
と の 関係 で は 、深 達 度 が ま た は p 以 深 で 有 意 に差 が あ った の は 、
チ ル化
は 、深 達 度
で3 3 3
有 意 水 準 で 有 意 差 を認 めた 。
、 深達度 pで
3
、 深達度 p で
c ro
3 b
で あ り、 ( =０
cの メ チ ル 化
は 、深 達 度
のみで あ り 、有 意 水 準 は
く
3 ０の
で
の有 意 水 準 で 有 意 差 を認 めた 。
で あ り、 =０ ０
全 体 の 生 検 と 大 腸 粘 液 層 剥 離 液 の間 で 相 関が見 られた の は 、
の メ チ ル化
「 のメ
3 b
c ro
００ 、相 関係 数 は 値 ０・
・
c
ｱ０
・
０００で あ った 。
０
表 3 で 得 た 同 一 病 変 由来 の検 体 中の 一 部 の検 体 を用 いて 、
異 の有 無 を検 討 して 、 そ の結 果 を表
遺 伝 子の 変
に示 した 。 生 検 組 織 を用 いて も 、方 法
2 に よ り 採 取 した粘 液 剥 離 液 を用 いて も 、
の検 体 で 一致 して 浸 潤 腫 瘍
を検 出 で きた こ と が わ か る 。 尚 、検 体 の合 計 数 が 一致 しな いの は 、生 検 で
遺 伝 子の 変 異 を検 出 で き て も 、粘 液 剥 離 液 で は
遺 伝 子の 変 異 を検 出 で
き な い症 例 が あ る た めで あ る 。 こ の よ う な 症 例 は特 に非 浸 潤 腫 瘍 に 多 か った
０
く実 施例 3 ノ
内視 鏡 分 類
大 腸 内視 鏡 で の腫 瘍 の 形 態 をhyp rp a s
をp ro rud d
yp (
)
C) に分 類 し
a
yp (
川a
日a
r
G a nc
ad no a
p
c p
d p r ss d
L )
a
ea r
r は 、癌 浸 潤 が submucos
yp (
rま
la y
で に達 す る も の と した 。 静 脈 浸 潤 、 リ ン パ 管 浸 潤 は 問わ な い。 dvac d
r はbo r r
く実 施例
分 類 に従 い、臨 床 診 断 さ れ て いる 。
ノ
細胞 診
大 腸 粘 液 層 剥 離 液 の細 胞 診 に 関 して は 、秋 田 赤 十 字 病 院
o u
pr
a s (０
on
d
i
消化器 セ ンタ ー
社 の h n r p (登 録 商 標 ) pr
で 採 取 さ れ た大 腸 粘 液 層 剥 離 液 を 、
y
G a nc
ann 分 類 を適 応 した 。 全 て の大 腸 腫 瘍 の手 術 や日 標 本 は 、秋 田 赤 十
字病 院病 理 部 で
０ 8
r
G a nc
ox
5０ V a s
O
s rv
注 文番号 ０
０
０ ) に保 存 し、遠 心 後 ホ ル マ リ ン 固 定 を行 い、ヘ マ トキ シ リ ン ・エ オ ジ ン 染
色 後 、細 胞 診 を行 った 。
０
く実 施例
ノ
統計解析
全 て の統 計 、 グ ラ フ に つ いて は 、
V
r
ッ トで 行 った 。 メ チ ル 化 に 関 して は 、 それ ぞれの
or
5
On
p
do s 日木 語 版 セ
の メ チ ル 化 の平 均
S
を そ の検 体 の メ チ ル 化 と して 、臨 床 診 断 、深 達 度 に つ いて ま と めた 。 有 意 差
に 関 して は 、 それ ぞれの群 で 一 元 は位 置 分 散 分 析 に よ る 検 定 を行 った 。 相 関
関係 で は 、 検 定 を行 った 。
０ ０
く実 施例 6 ノ
c
r3 b
曲線
、 「
の各 遺 伝 子の メ チ ル 化 D N A を指 標 と して
、 「
、浸 潤 性 大 腸 癌 の検 出 を行 う 際 の 閾値 を決 定 す る た めに 、
(図
)
o
れ に順 に 、
０
r3 b
c
4
、 「
33
く実 施例 7 ノ 腫 瘍 の 直 径 が
線
、 「
、
０
、ベ ス
トカ
曲線 を作 成 した
ッ トオ フ値 は 、 それ ぞ
で あ った 。
未 満 または ０
以 上 で ある場 合 の
曲
腫 瘍 の直 径 が ０
曲線 を作 成 した
る 場 合 に分 け て
の直 径 が ０
未 満 で あ る 場 合 、 お よ び腫 瘍 の 直 径 が ０
未 満 で あ る 場 合 に は、
N A を指 標 と した
メ チ ル化 D
)
r
。 大 腸 の 内腔 側 か ら測 定 した腫 瘍
3 b c遺 伝 子 お よ び 「
曲線 を作 成 した
腔 側 か ら測 定 した腫 瘍 の 直 径 が ０
(図
。 これ ら の結 果 か ら 、腫 瘍 の 直 径 が 2 O
非 浸 潤 腫 瘍 の 区別 に は
3 b
3 b
r
3 b c遺 伝 子
曲線 を作 成 した
(図
右
以 下 で あ る 場 合 の浸 潤 腫 瘍 と
c ま た は 「 遺 伝 子の メ チ ル 化 D N A を指 標 と
す る 野 が 好 ま し く 、腫 瘍 の 直 径 が 2 ０
潤 腫 瘍 の 区別 に は
遺 伝 子の
左 ) 。 ま た、大 腸 の 内
以 上 で あ る 場 合 に は、
遺 伝 子の メ チ ル 化 D N A を指 標 と した
およ び
)
(図
以上で あ
c または
以 上 で あ る 場 合 の浸 潤 腫 瘍 と ョ 浸
遺 伝 子の メ チ ル 化 D N A を指 標 と す る
野 が 好 ま しい こ と が わ か る 。
０
く実 施例 8 ノ 腫 瘍 の大 き さ と メ チ ル 化 D N A を組 合 わせた診 断 フ ロ ー図
大 腸 の 内腔 側 か ら測 定 した腫 瘍 の 直 径 と メ チ ル 化 D N A の測 定 を組 合 わ せ
て 、 も っと も 精 度 よ く 浸 潤 腫 瘍 の有 無 を診 断 す る た めの 、 フ ロ ー図 を作 成 し
た
。 こ の フ ロ ー図 を用 いれ ば 、左 端 の枠 内 に記 載 した、腫 瘍 の 直 径
(図6 )
が ０
以 上 で ある場 合 (
s)
と腫 瘍 の直 径 が ０
以 上 で な い場 合 ( o )
の判 断 か ら 開始 して 、順 に右 側 の枠 内 の判 断 基 準 に した が って 次 の枠 に進 む
こ と に よ り 、浸 潤 腫 瘍 か非 浸 潤 腫 瘍 の いずれかの診 断 が な さ れ る 。
０ 3
く実 施例 9 ノ 大 腸 粘 液 層 剥 離 液 の メ チ ル 化 D N A と 生 検 組 織 の メ チ ル 化 D
N
A の相 関
浸 潤 腫 瘍 と 非 浸 潤 腫 瘍 の それ ぞれ に つ いて 、
の各 遺 伝 子の メ チ ル 化 さ れた
r3 b c 、
の割 合 が 、大 腸 粘 液 層 剥 離 液 と 生 検 組 織 と
で 相 関す る か検 討 した 。 そ の結 果 、浸 潤 腫 瘍 に お け る 、
「 の各 遺 伝 子の メ チ ル 化 された
と で 、3
「 、 「
r3 b c 、
「 、
の割 合 は 、大 腸 粘 液 層 剥 離 液 と 生 検 組 織
以 下 の危 険 率 で 有 意 に相 関 して いた 。 ま た、浸 潤 腫 瘍 と 非 浸 潤 腫 瘍
を合 わ せ た全 体 に お いて 、
r3 b c 、
ル 化 さ れた
以 下 の危 険 率 で 有 意 に相 関 して いた 。
の割 合 は 、
産 業 上 の利 用 可 能 性
「 、 「
の各 遺 伝 子の メ チ
本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 は 、対 象 の大 腸 粘 液 層 に洗 浄 液 を散 布
して 該 粘 液 層 か ら粘 液 を剥 離 し、剥 離 さ れた粘 液 を洗 浄 液 と と も に 回収 す る
こ と に よ り 、非 侵 襲 的 に大 腸 癌 ま た は大 腸 腫 瘍 の浸 潤 性 ま た は深 達 度 を診 断
す る た めの指 標 を得 る 方 法 を提 供 す る 画 期 的 な発 明 で あ る 。 本 発 明 の検 体 、
キ ッ ト、 お よ び 方 法 を利 用 す る こ と に よ り 、非 侵 襲 的 に 、 しか も 高 い精 度 で
、大 腸 癌 ま た は大 腸 腫 瘍 の浸 潤 性 ま た は深 達 度 を診 断 し う る の で 、大 腸 癌 の
治 療 方 法 の選 択 に際 して有 用 で あ る 。 ま た 、本 発 明の検 休 、キ ツ ト、お よ び
方 法 を利 用 す る こ と に よ り 、抗 癌 剤 を包 含 す る 様 々な 薬 剤 に対 す る 感 受 性 を
予 め検 討 す る こ と も で き る 。 さ ら に ま た、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方
法 に よ り 、薬 剤 お よ び
ま た は治 療 方 法 の治 療 効 果 を評 価 す る こ と が 可 能 と
な る 。 本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び 方 法 に よ り 、再 発 の 予 測 をす る た めの
指 標 を得 る こ と が 可 能 と な る 。 した が って 、本 発 明 の検 体 、キ ッ ト、 お よ び
方 法 は 、産 業 上 の利 用 可 能 性 を有 す る 。
請 求 の範 囲
請 求項
浸 潤 性 大 腸 癌 検 出の た めの検 体 で あ って 、大 腸 粘 液 層 に洗 浄 液 を散 布
して 大 腸 粘 液 を剥 離 し、剥 離 した大 腸 粘 液 と と も に 回収 して 得 られ る
前 記 洗 浄 液 を含 む 、前 記 検 体 。
請 求項
大 腸 粘 液 層 が 、腫 瘍 部位 を含 む大 腸 粘 液 層 で あ る 、請 求 項 に記 載 の
検体 。
請 求項3
洗 浄 液 が 、生 理 的 な 等 張 液 で あ る 、請 求 項 ま た は 2 に記 載 の検 体 。
請 求項
生 理 的 な 等 張 液 が 、生 理 食 塩 水 で あ る 、請 求 項 3 に記 載 の検 体 。
請 求項
散 布 が 、毎 秒
l ～「
の速 度 で 行 な われ る 、請 求 項
「
～
の
いずれか一項 に記 載 の検 体 。
請 求項
検 出が 、腫 瘍 マ ー カ ー の検 出 で あ る 、請 求 項 「
～
の いずれか一項 に
記 載 の検 体 。
請 求項
腫 瘍 マ ー カ ー の検 出が 、 メ チ ル 化 D N A の検 出 で あ る 、請 求 項 「
～6
の いずれか一項 に記 載 の検 体 。
請 求項
メ チ ル化 D
N A の検 出が 、 「 、 「
日カ
ドヘ リ ン
S on
h
L
、
33
hs a
S
r
3
a
3
3bc
「
p
U
か らな
「
る 群 よ り選 択 さ れ る 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D N A の検
出 で あ る 、請 求 項
請 求項
メ チ ル化 D
「
～7 の いずれか一項 に記 載 の検 体 。
N A の検 出が 、 「 、 「
hs a
r
3 b cか ら
な る 群 よ り選 択 さ れ る 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D N A の
検 出 で あ る 、請 求 項 8 に記 載 の検 体 。
請 求項 ０
洗 浄 液 が 、前 洗 浄 な しで散 布 さ れ る 、請 求 項 「
～9 の いずれか一項 に
記 載 の検 体 。
請 求項
腫 瘍 部位 が 、腫 瘍 の浸 潤 が 疑 われ る 腫 瘍 部位 で あ る 、請 求 項 2 に記 載
の検 体 。
請 求項
検体 が、 「 ０
に記 載 の検 体 。
以上の
を含 む 、請 求 項
「
～「 「の いずれか一項
を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
～2
「
「の いずれか一 項 に記 載 の
方法 。
請 求項
3
指標 が 、 「
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
～2
「
D
NAが
「
「の いずれか一 項 に記 載 の
方法 。
請 求項
指標 が 、 「
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
～2
「
D
NAが
「０
「の いずれか一 項 に記 載 の
方法 。
請 求項
指標 が 、 「
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
～2
「
D
NAが 3 3
「の いずれか一 項 に記 載 の
方法 。
請 求項
指標 が 、
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項 「
～2
D
NAが
「０
を
「の いずれか一 項 に記 載 の方
法。
請 求項
指標 が 、
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項 「
～2
D
NAが
「「
を
「の いずれか一 項 に記 載 の方
法。
標 が、
請 求項
r
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
「
～2
「
「の いずれか一 項 に記
載 の方 法 。
請 求項
指標 が 、
8
r
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
「
～2
「
「の いずれか一 項 に記
載 の方 法 。
請 求項3 ０
指 標 が 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の 直 径 が ０
かつ 、
r
以 上 で あ り、
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
「
～2
「
「の いずれか一 項 に記 載
の方 法 。
請 求項
標 が 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の 直 径 が ０
以 上 で あ り、
r
3 b c遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
で あ り 、か つ 、
遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化
０ を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
「
～2
以下
「
D
NAが
「
「の いずれか一 項 に記
載 の方 法 。
請 求項3
指 標 が 、大 腸 の 内腔 側 か ら観 察 した腫 瘍 の 直 径 が ０
「 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー領 域 の メ チ ル 化 D N A が
以 上 で あ り、
「
を越 え て
いて 、かつ 、 「 遺 伝 子の プ ロ モ ー タ ー 領 域 の メ チ ル 化 D N A が
０ を越 え て いる 場 合 で あ る 、請 求 項
「
～2
「
「の いずれか一 項 に記
載 の方 法 。
請 求項3 3
指 標 が 、薬 剤 お よ び
ま た は治 療 方 法 の治 療 効 果 を評 価 す る た めに用
いる 指 標 で あ る 、請 求 項
「
～3
の いずれか一項 に記 載 の方 法 。
International application No.
I TERNATIONAL SEARCH REPORT
PCT/JP2010/064715
A
CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER
G01N33/50 (2 006 . 01 ) ±, A 61B1 /00
(2006 . 01) i ,
C12 l /
(2 0 0 6 . 0 1 ) i ,
C1 2M3/0
0 (2 0 0 6 . 0 1 ) i
,
C1 2Q1 /02
(2006 . 01) i
According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
B . FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
G01N33/50
, A61B1/00
, C12M3/00,
C12Q1/02
, C12Q1/68
Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched
Jitsuyo
Shinan Koho
Kokai Jitsuyo
Shinan
Koho
1922-1996
1971-2010
J tsuyo Shinan
Toroku Jitsuyo
Toroku
Shinan
Koho
Koho
1996-2010
1994-2010
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)
EDLINE/BIOSIS
C.
X
*
"A"
"E"
"L"
"O"
"P"
JSTPlus/
J EDPlus/
JST758 0 (JDreamll
)
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Category*
I
(STN) ,
ISHIBASHI et a l ., "Determining the telomerase
activity of exfoliated cells in intestinal
lavage solution to detect colorectal carcinoma",
Japanese Journal of Clinical Medicine, 1998,
vol. 56, no. 5 , pages 117 to 121, page 118,
'2. method'
1-12
TOMIKI Y , et al., CANCER CELL EXFOLIATION BY
PREOPERATIVE COLONOSCOPIC EXAMINATION,
Digestive Endoscopy, 2000, Vol. 12, p .327-330,
'SUBJECTS AND METHODS', fig. 1 , RESULT
1-12
See patent 佑 tnily an ex
I Further documents are listed in the continuation of Box C
Special categories of cited documents:
document defi ing t e general state of the art which is not considered
to be of particular relevance
earlier application or patent but published on or after the international
filing date
document which may throw doubts on priority claim(s) or which is
cited to establish the publication date of another citation or other
special reason (as specified)
document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other means
document published prior to the international filing date but later than
the priority date claimed
Date of the actual completion of the international search
1 0 November,
2010
(10 . 1 1 . 10)
Name and mailing address of the ISA/
Japanese
Facsimile No.
Relevant to claim No.
Patent Office
"
later document published after the international filing date or pπ onty
date and not in conflict with the application but cited to understand
the principle or theory underlying the invention
"X"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered novel or cannot be considered to involve an inventive
step when the document is taken alone
γ"
" "
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered to involve an inventive step when the document is
combined with one or more other such documents, such combination
being obvious to a person skilled in t e art
document member of the same patent family
Date of mailing of the international search report
3 0 November,
Authorized o価 ce「
Telephone No
2010
(30 . 1 1 . 10)
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International application No
PCT/JP2010/064715
C (Contmua on).
Category*
X
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
JP 2007-534404 A
(UCL B omedica PLC.)
「
2 9 November 2007 (29.11.2007),
claims; drawings
& GB 409474 D
U S 2005/0261553 A l
& EP 1740085 A
& WO 2005/117685
& CN 1905832 A
& CA 2555180 A
Relevant to claim No
13
Al
A
SUZUKI et a l ., "Atarashii Da cho Gan Yokusei
Idenshi - S RP-", Japanese Journal of Clinical
Medicine, 2005, vol. 63, no .4 , pages 707 to 719
1-13
A
FUJII et a l ., "Kaiyosei Daichoen n i Okeru DNA
Methyl-ka wa Hatsugen no Bunshi Marker to
Narieru ka?", G .I .Research 「 0 1 August 2009
(01.08.2009), vol. 17, no. 4 「 pages 304 to 311
1-13
A
WO 2007/132844 A l (Sapporo Medical University),
2 2 November 2007 (22.11.2007),
& U S 2010/0068702 A
& EP 2022861 A l
& KR 10-2009-0020595 A
& CN 101443462 A
1-13
INTERNATIO
AL SEARCH REPORT
International application No
PCT/JP2010/064715
Box No. II
Observations where certain claims were found unsearchable (Continuation of item 2 of first sheet)
This international search report has not been established n respect of certain claims under Article 17(2)(a) for the following reasons
[
l Claims Nos.
14 -
33
because they relate to subject matter not required to be searc ed by this Authority, namely
Claims 1 4 - 33 involves
a step o f spraying a cleaning liquid onto the raucous
liquid layer o f a large intestine and removing the mucous liquid", and therefore
pertain t o "method for surgery o f the human body", (continued t o extra sheet)
2.
Claims Nos.
because they relate to parts of the international application that do not comply with the prescribed requirements to such an
extent that no meaningful international search can be carried out, specifically:
I
I Claims Nos.
because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences of Rule 6.4(a).
Box No. Ill
Observations where unity of in ention is lacking (Continuation of item 3 of first sheet)
This International Searching Authority found multiple inventions in this international application, as follows:
4.
I
I A s all required additional search fees were timely paid by the applicant, this international search report covers all searchable
claims
I
I As all searchable claims could be searched without effort justifying additional fees, this Authority did not invite payment of
additional fees
I
I A s only some of the required additional search fees were timely paid by the applicant, this international search report covers
only those claims for which fees were paid, specifically claims Nos :
No required additional search f㏄ s were timely paid by the apphcant. Consequently, this international search report is
res 廿icted to the invention first mentioned in the claims; it is covered by claims Nos.:
Remark on Protest
The additional search fees were accompanied by the applicant's protest and, where applicable, the
payment of a protest fee.
The additional search fees were accompanied by the applicant' s protest but the applicable protest
fee was not paid within the time limit specified in the invitation
No protest accompanied the payment of additional search fees
INTER ATIO AL SEARCH REPORT
Continuation
o f Box No.II-1 o f continuation
International application No
PCT/JP2010/064715
o f first sheet (2)
and thus relate to a subject matter on which th s International Searching
Authority is not required to carry out a search under the provisions
of PCT Article 17(2) (a) (i) and PCT Rule 39.1(iv).
国際 出願 番 号
国際 調 査 報 告
P C T ノ J P 2 O 1 0 ノ0 6 4 7 1 5
発 明 の 属 す る 分 野 の 分 類 ( 国際 特 許 分 類 ( I P C ) )
IntCl
G01N33/50 (2006. 01) i , A61B1/00 (2006. 01) i , C12M3/00 (2006. 01) , C12Q1/02 (2006. 01) i , C12Ql/68 (2006. 01) i
A ・
た分 野
た最小 限資 料 ( 国際 特 許 分 類 ( I P C ) )
調 査 を行
B・
調 査 を行
IntCl
G01N33/50,
C12M3/00, C12Q1/02, C12Q1/68
A61B1/00,
た分 野 に含 ま れ る も <D
最小限資 叫以 外 CO 資 片 て調 査 を行
日本 国実 用 新 案 公 報
日本 国公 開 実 用 新 案 公 報
日本 国実 用 新 案 登 録公 報
日本 国登 録 実 用 新 案 公 報
1
1
1
1
国際 調 査 て使 用 した電 子テ — タ
MEDLINE/BIOSIS (STN)
C ・ 関連 す る
引用 文 献 の
JSTP1US/
2
7
9
9
2
1 9
1- 2 0
6 - 2 0
4 - 2 0
(テ— タ
ス (D
9
1
1
1
6
0
0
0
午
年
年
年
名 称 、 調 査 に使 用 した用 語 )
( 皿 reamll)
TMEDP1US/TST7580
認 め られ る 文 献
引用 文 献 名
カテ
X
—ス
9
9
9
9
及 ひ一部 の 箇 所 か関連 す
き は 、 そ の 関連 す る 箇 所 の 表 示
石 橋 他 ，腸 管 洗 浄 液 中テ メ ラ ゼ活
み，
日木 臨床 , 1998 5 6 巻 5 号 ， 117-121
118
請 大 項 の番 号
測 定 に よ る 大腸 癌 診 断 の試
1-12
ジ、
2 ・ 方 法 J の欄
シ
1-12
X
TOMIKI Y e t a l
CANCER CELL EXFOLIATION
BY PREOPERATIVE
COLONOSCOPIC EXAMINATION,
Digestive
Endoscopy,
rSUBJECTS
旺
2000,
AND METHODS
C 欄 の続 き に も 文 献 か列 挙 さ れて
Vol. 12,
Fig.
p . 327-330
1 、 及 び , RESULT
汀
る。
引用 文 献 の カ テ
特 に 関連 (O あ る 文 献 て 泣 な < 、 一般 的技 術 水 準 を示 す
もの
E 国際 出願 日前 の 出願 ま た は特 許 て あ る か 、 国際 出順 日
以 後 に公 表 れた も の
L 優 先 権 張 に疑 義 を提 起 す る 文 献 又 は他 の 文 献 の発 行
日若 し< は他 の 特 別 な 理 由 を確 立 す る た め に 引用 す
る 文 献 ( 理 由 を付 す)
ΓO 口頭 に よ る 開 示 、 使 用 、 展 示 等 に言及 す る 文 献
r p j 国際 出願 日前 て 、 か 優 先 権 の 張 の 基 礎 と な る 出頗
ΓA
国際 調 査 を完 了 した 日
ΓT
テ
トフア
リ — に 関す る 別紙 を参
。
の 日の 後 に公 表 れた文 献
国際 出順 日又 は優 先 日後 に公 表 さ れた文 献 て あ て
出順 矛盾 す る も のて は な < 、 発 明 の原 理 又 は理 論
の 理 解 の た め に 引用 す る も の
特 に 関連 の あ る 文 献 て あ て 、 当該 文 献 の みて発 明
の 新 規 性 又 は進 歩 性 か な と 考 られ る も の
特 に 関連 の あ る 文 献 て あ て 、 当該 文 献 他 の 1 以
上 の 文 献 と の 、 当業 者 に と て 自 明 て あ る 組 合 に
よ
同一
て進 歩 性 か な
テ
トフ ア
リ
考 え られ る も の
文献
国際 調 査 報 告 の発 送 日
1 0.
1 1. 2 0 1 0
国際 調 査 機 関 の名 称 及 ひ あ て先
日本 国特 許 庁 ( I S A ノ J P )
郵便番 号 1 0 0
8 9 1 5
東 京 都 千代 田 区 霞 か関三丁 目 4 番 3 号
3 0.
1 1. 2 0
2 J
特許 庁 審 査 官 (権 限 の あ る職員 )
山付
電話 番 号
O
9 2 1 7
梓子
O3- 3 5 8 1- 1 1 0 1
内線
3 2 5 2
国際 出順番 号
国際 凋 査 報 告
C
(続 き )
関連 す る
用文献 の
テ
リ
J P 2 O 1 0/0
及 ひ一部 の 箇 所 か 関連 す る と き は 、 そ の 関連 す る 箇 所 の表 示
JP 2007-534404
A
イ オ メ デ ィカ 、
、
(
テ ッ ド、 カ
) 2007. 11.29,
US 2005/0261553
CA 2555180
Al
A
GB 409474 D
ツク、
関連 す
請 大 項 の番 号
13
特 許 請 求 の範 囲 、 図 面
EP 1740085 A
WO 2005/117685
CN 1905832 A
鈴 木 他 新 し 大腸 癌 抑制 遺 伝 子 -SFRP-,
日本 臨床 , 2005, 63 巻 4 号 ， 707-719
シ
藤 井他
6 4 7 1 5
認 め られ る 文 献
引用 文 献 名
Al
PCT
潰瘍性 大腸 炎 に お け る DNA
メチ
1-13
化 は発 現 の分 子
カ
1-13
と な り得 る
G ・I . Research,
2009. 08. 01,
WO 2007 れ 32844 A l (
2007. 11.22,
10-2009-0020595
Vol. 17, No. 4 , p . 304-311
侮 道 公 立大 学 怯 人
US 2010/0068702
A
A
CN 101443462
札 幌 医科 大 学 )
EP 2022861
A
Al
KR
1-13
国際 出順 番 号
国際 洞 査 報 告
第
欄
請 大 の範 囲の
部 の 桐査 か て き な U と き の 昔 見 (第 1
怯 第 8条 第 3項 ( P C T 17 条 (2) (a) ) の 規 定 に ょ り
成 しな か た 。
旺 清大I
1
o
1 4
3 3
は
の
PCT ノ JP201 0 064 7 1 5
の続 き
こ の 国際 洞 査 報 告 は 次 の 理 由 に ょ り 請 水 の 範 囲 の 一部 に
こ の 国 際 凋 査 機 関か 凋 査 をす
こ と を要 しな
て作
対 象 に係 る も のて ぁる
ま
請 求 項 1 4 - 3 は 大腸 粘 液 層 に洗 浄 腋 を散 布 して 大 腸 腋 を剥 離 す る X 程 J を有
す る た め r人 の 身体 の手術 方 怯 て あ り 、 PCT 第 17条 (2)(a)(i) 及 ひPCT 規 則 39.l(iv) の 規
定 に よ り 、 こ の 回際 調 査 期 間 か調 査 す る こ t を要 しな 対 象 に係 る も の て あ る 。
ヴ 晴大
は 有 青義 な 国際 凋 査 をす る こ
な U 国際 出僻 の 部 分 に伜 る も のて ぁる 。 O ま 、
r
第
m欄
吹 に述
i
r
晴求
従 て記 載 さ れ て
発 明の
は
従 属 晴 求 の範 囲 て あ
か て き る 程 度 ま て 所 定 の要 件 を満 た して
て P C T 規 刊 6 4 (a) の第 2 文 及 ひ第 文 の規 定 に
な
吐 か欠 如 して
る と き の 青見
(第 1
る よ ヮ に こ の 国 際 出肺 に二 以 上 の 発 明 か あ る
出府 人 か ゼ 要 な 追 加 洞 査 手 数 料 をす
て 作 成 した
の
の椀 き
こ の 国 際 蝸 査 機 関 は詔 め た
て期 間 内 に納 付 した のて 、 こ の 国際 洞 査報 告 は 、 す
ての 桐査 可 能 な 請 大
項に
3
ア
追 加 凋 査 手 数 料 を要 求 す る ま て も な
査 手 数 料 の納 け を求 め な
た。
す ての 桐 査 可能 な 晴 大 項 にO
r
出順 人 かゼ 要 な 追 加 桐 査 手 数 料 を一部 のみ し 期 間 内 に納 付 しな
付 の あ た次 の 晴 水 の み に
て作 成 した。
出府 人 か ゼ 要 な 追 加 洞 査 手 数 料 を期 間 内 に納 付 しな
さ れ て U る 発 明 に係 る 次 ( 請 大 項 に O
て作 成 した
追 加 洞査 手数 料 の
て 洞 査 す る こ と か て き たのて
たのて
こ の 国降 凋 査 報 告 は
追加凋
手 数 料 の納
- た のて 、 こ の 国際 洞 査報 告 は 、 請 末 の範 囲の 最 初 に記 載
蟻 の 申 立 て に 関す る 庄 青
追 加 洞 査 手 数 片及 ひ
該 当 す る 場 合 に は、
追 加 洞 査 手数 叫 (D 納 付 と 共 に 出噸 人
内 に支 払 われ な
議 申 立 手 数 料 の納 付
ら 異議 申 立 て か あ
た。
追 加 凋 査 手数 片 ( 納 付 は あ
たか
礒 申立て は な
た
ら 礒 申 立て か あ た。
と 共 に、 出府 人
た か 、 異 議 申 立 手 数 料 か納 付 命 令 書 に示 した期 間