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BIOLOGIE VEGETALE
BIOCH I. 1, a
BIOCHIMIE
TRAVAUX PRATIQUES
(BIOCH. I. 1, a)
Techniques de chromatographie en
phase liquide.
• Chromatographie de partage
d’un extrait total de pigments
végétaux.
• Expérience Assistée par
Ordinateur (EXAO)
Expériences réalisables en T.P. de Biologie
avec des élèves du 3ème degré.
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BIOCH I. 1, a
• Chromatographie de partage d’un extrait total de pigments
végétaux.
• Expérience Assistée par Ordinateur (EXAO)
AVERTISSEMENT
La chromatographie des pigments
végétaux nécessite impérativement d’être
réalisée sous hotte aspirante vu la toxicité
des solvants organiques.
Sécurité
Les consignes de sécurité d’usage en
laboratoire de chimie doivent être
appliquées à la lettre.
Le port de gants et de lunettes de
protection ainsi que d’une blouse de
laboratoire est indispensable.
Protection de l’environnement :
Les solvants organiques doivent
impérativement être jetés avec les déchets
de laboratoire et déposés dans une
collecte de produits chimiques.
√
√
√
√
1 erlenmeyer
1 cristallisoir
1 entonnoir + filtres en papier
1 spatule ou 1 cuillère en plastique
Pour la filtration sous vide (rapide) :
√ Büchner et fiole à vide reliée à une trompe à
eau
Pour la chromatographie de partage :
√ Cuve de développement : une éprouvette graduée
de 1000 ml équipée d’un bouchon muni d’un crochet.
Un cache en papier noir pour recouvrir l’éprouvette.
√ Bandes de papier Whatman de 30 cm x 3 cm
√ 1 petite éprouvette graduée
√ 3 pipettes graduées 10 ml
√ 3 poires propipettes
√ 1 petit capillaire pour effectuer les dépôts
√ Règle en plastique transparent
√ Crayon à papier ou porte-mine
√ Papier absorbant
Connaissances
PRODUITS CHIMIQUES POUR LA
CHROMATOGRAPHIE :
BIOLOGIE : La structure chimique des
pigments végétaux (voir page 2).
CHIMIE : techniques de chromatographie en
phase liquide (voir pages 3 - 5).
√ Ether de pétrole
(essence G)
R11-45-65 et
S 9-16- 29-53-45
Matériel
√ Acétone
(Propanone)
(C3H6O)
R11-36-66-67
S9-16-26
Pour l’extraction des pigments :
√ Du matériel biologique au choix : feuilles
d’épinard, feuilles de carotte, feuilles d’arbre,
algues, …. Dans cet exemple, nous avons
choisi des feuilles (fanes) de carotte
√ Mortier + pilon
√ Un peu de sable fin propre
PRODUIT CHIMIQUE POUR
L’EXTRACTION :
√ Ethanol dénaturé à 95°
(C2H6O)
R 11 et S 7-16
√ Cyclohexane
(C6H12)
R11-38-50/53-65-67
S9-16-33-60-61-62
Pour l’EXAO :
√ un appareil photo numérique ou un scanner à plat
compatible TWAIN (ou les deux)
√ un ordinateur
√ le logiciel Mesurim
Pour la filtration simple (lent):
√ 1 petite passoire
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Un document utile : la structure chimique des pigments végétaux :
La famille des
chlorophylles
La famille des
caroténoïdes
•
Les carotènes
•
Les
xanthophylles
Forme oxydée du β-Carotène
La famille des
flavonoïdes
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Ce qu’il faut savoir faire:
Choisir le type de chromatographie en fonction des composés à séparer.
Composés à séparer
PM > 2000
Chromatographie
d’exclusion
PM < 2000
Apolaires : solubles
dans les solvants
organiques
Chromatographie
d’affinité
Chromatographie
pour la séparation
d’énantiomères
Polaires : solubles
dans l’eau
Non ionisés
Ionisés
Chromatographie
d’adsorption
Chromatographie
d’affinité
Chromatographie
de partage en
phase inverse
Chromatographie
d’affinité
Chromatographie de
partage en phase
directe
Infographie inspirée de :
www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/chromato/A62.html
Chromatographie
de partage en
phase inverse
Chromatographie
de partage en
phase directe
Chromatographie
d’échange d’ions,
de paires d’ions
Chromatographie
pour la séparation
d’énantiomères
Facteurs intervenant dans le partage des molécules en fonction des mécanismes de séparation :
-
la solubilité dans un solvant liquide : chromatographie de partage
-
la taille, la forme des molécules : chromatographie d’exclusion
-
la polarité : chromatographie d’adsorption, chromatographie d’adsorption en phase inversée
-
la charge électrique : chromatographie par échange d’ions
-
la présence de groupe d’atomes formant des sites particuliers : chromatographie d’affinité
La classification des différents types de chromatographie repose sur le fait que l’on a privilégié l’effet
de l’un des facteurs ci-dessus, cependant aucune méthode ne repose exclusivement sur un seul de
ces facteurs.
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Ce qu’il faut comprendre :
La chromatographie de partage, sur papier Whatman ou sur colonne (CLC), fait partie des différents
modes de chromatographie en phase liquide.
1. La méthode :
- chromatographie liquide/liquide.
- La phase mobile, l’éluant, est liquide.
- La phase stationnaire est liquide.
- Le facteur intervenant dans le
mécanisme de séparation : la
différence de solubilité des espèces
dans les 2 solvants.
(Revoir en chimie les chapitres sur
l’équilibre chimique, le déplacement de
l’équilibre chimique, la solubilité)
Le mécanisme mis en jeu dans ce type de
chromatographie est le partage des solutés
du mélange entre les 2 solvants non
miscibles qui constituent d’une part la
phase stationnaire et d’autre part la phase
mobile.
La phase stationnaire peut être
constituée par :
- un film liquide imprégné sur un
support rigide (silice, cellulose,..)
Figure C. Schématisation du partage d’un soluté entre
2 phases liquides non miscibles.
-
Source : G. Coutouly & al., Travaux dirigés de biochimie, biologie
moléculaire et bioinformatique, éd. doin, 2006, 254.
un film liquide fixé par liaison
covalente (phases greffées sur silice),
le greffage est réalisé par des ponts
siloxane :
Si – OH + X – Si(CH3)2 – R Æ Si – O – Si(CH3)2 – R + HX
2. La chromatographie sur papier
La chromatographie sur papier est une chromatographie de partage
-
La phase fixe est formée par l’eau adsorbée par la cellulose du papier qui constitue le support rigide.
Les molécules d’eau liées à la cellulose représentent le premier solvant.
La phase mobile est constituée par l’éluant qui représente le second solvant (ou mélange de
solvants).
Les facteurs qui interviennent dans cette méthode et qui influencent la vitesse et donc la hauteur
de migration des espèces sont multiples :
-
La solubilité des espèces dans chacun des 2 solvants : une espèce plus soluble dans la phase
mobile (l’éluant) se déplace plus rapidement qu’une espèce qui l’est moins.
Le coefficient de partage K d’une espèce X entre 2 solvants S1 et S2 :
K = [X]S1 / [X]S2
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-
La teneur en eau du papier dépend directement du degré hygrométrique ambiant. La quantité
de solvant de la phase fixe et la concentration de l’espèce à partager entre les 2 phases (fixe et
mobile) influencent la vitesse de séparation.
-
La polarité de la phase fixe (eau) et celle de la phase mobile (l’éluant).
Voir : « fiche technique pour la chromatographie : échelle de polarité des solvants organiques ».
-
Le pH, la température.
-
La taille des molécules : la chromatographie sur papier implique l’imprégnation du mélange à
séparer dans le support rigide (le papier) lors du dépôt. La migration de l’éluant, entraîne le
mélange, par capillarité. Il ne s’agit pas d’un phénomène de surface mais d’un phénomène de
diffusion.
Comme en électrophorèse sur support (papier, gel d’acétate de cellulose modifié, gel
d’agarose), il s’agit d’une migration dans un support poreux imbibé.
Le support minimise la diffusion des substances lors de la migration suite à une migration
selon la taille (tamisage moléculaire) des molécules.
Ce qu’il faut retenir !
La chromatographie de partage est une chromatographie liquide – liquide basée sur le partage des
solutés dans le solvant de la phase stationnaire liquide et dans l’éluant qui constitue la phase mobile
liquide.
Chaque soluté est soumis à une série de facteurs qui influencent sa migration.
Fiche technique :
Table de miscibilité des solvants
Source : www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/chromato/A62.html
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Source : www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/chromato/A62.html
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Protocole
A. Extraction d’une solution
totale de pigments :
1. Rincer à l’eau déminéralisée quelques
feuilles du végétal choisi : ici, des feuilles
de carotte (Daucus carota)
2. Sécher convenablement avec du papier.
absorbant, sans trop malmener les
feuilles.
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5. Récupérer le dépôt accumulé dans la
passoire avec une spatule ou une cuillère
en plastique, le placer dans le mortier et
broyer à nouveau en rajoutant 2 ml
d’éthanol.
6. Répéter la filtration grossière comme
expliquée au point 4.
7. Filtrer le contenu du cristallisoir dans
l’erlenmeyer à l’aide de l’entonnoir et du
filtre en papier. Rien ne doit déborder du
filtre ! Presser délicatement le dépôt
contre le filtre avec une cuillère en
plastique afin d’extraire un maximum de
solution de pigments. Il faut veiller à ne
pas endommager le filtre !
Photo 1.
3. Découper les feuilles en petits morceaux
dans le mortier, ajouter une petite pincée
de sable et broyer en additionnant 6 ml
d’éthanol.
Photo 4.
Photo 2.
4. Lorsque les feuilles sont bien broyées,
filtrer grossièrement dans un cristallisoir
à l’aide de la petite passoire. Presser sur
le broyat à l’aide du pilon.
9. Verser le filtrat obtenu dans un petit
récipient en verre d’une contenance
proche de 5 ml (afin de le remplir
complètement avec le filtrat et d’éviter
l’oxydation des pigments) et fermer avec
un bouchon.
Photo 5.
Photo 3.
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B. Chromatographie de partage
La bande de papier ne devra toucher ni le fond
ni les côtés de l’éprouvette.
1. Préparation de la bande de papier :
2. 3 Evaluer la hauteur que devra atteindre
l’éluant dans l’éprouvette. Le bord inférieur du
papier devra plonger dans l’éluant mais le
niveau de l’éluant devra rester en dessous de
la tache de dépôt. Indiquer la hauteur par un
trait au marqueur.
Attention !!! Les bandes de papier Whatman
doivent être manipulées avec beaucoup de
soins.
Elles ne doivent pas être touchées à mains
nues mais seulement avec des gants de
protection.
A défaut de papier pour chromatographie, le
papier buvard blanc peut faire l’affaire (voir
photo 6).
1. 1 A 0,5 mm du bord supérieur de la bande
de papier, au milieu, percer un petit trou pour
pouvoir accrocher la bande au crochet du
bouchon de l’éprouvette.
1. 2 Avec la règle, tracer un petit trait tous les
cm le long de l’un des grands côtés du papier.
A 2 cm du bord inférieur du papier, tracer très
délicatement, en appuyant à peine, une ligne
en travers du papier. Cette ligne sera la ligne
de dépôt.
2. 4 Fabriquer un cache en papier noir qui
sera placé sur l’éprouvette pendant la
séparation des pigments
3. Préparation de l’éluant :
3. 1 Prélever chaque solvant avec une
pipette munie d’une propipette. Utiliser une
pipette par solvant !
Composer le mélange de solvants dans la
petite éprouvette graduée.
Ether de pétrole (85 %), acétone (10 %),
cyclohexane (5%).
3. 2 Retirer le papier du bouchon de
l’éprouvette ! Verser l’éluant dans l’éprouvette
jusqu’à la hauteur repérée (voir 2. 3).
3. 3 Fermer l’éprouvette avec le bouchon et
mouiller les parois de l’éprouvette en lui imprimant
doucement une rotation. Laisser saturer pendant 20
à 30 min le temps d’effectuer les dépôts.
4. Effectuer le dépôt de l’extrait total :
4. 1 Avec le capillaire, prélever une petite quantité
d’extrait de pigments et déposer une goutte sur la
ligne de dépôt.
Figure 1 : préparation d’une bande de papier pour la
chromatographie de partage et test à vide.
2. Faire un test à vide du dispositif :
2. 1 Accrocher la bande sur le crochet du
bouchon et placer le bouchon sur l’éprouvette
1000 ml vide (sans l’éluant).
2. 2 Vérifier, lorsque le système est fermé,
que le bord inférieur du papier ne touche pas
le fond de l’éprouvette. Le cas échéant,
raccourcir la bande de papier et faire un
nouvel essai.
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Photo 6.
4. 2 Laisser complètement sécher avant d’effectuer
un nouveau dépôt. Pour accélérer l’évaporation, il
est d’usage d’utiliser un sèche-cheveux.
4. 3 Effectuer une dizaine de dépôts successifs
en laissant toujours sécher entre chaque dépôt.
La tache ne devrait pas avoir plus de 5 mm de
diamètre. Plus l’extrait est dilué dans l’éthanol plus
la tache sera étendue. Si nécessaire, laisser
s’évaporer l’éthanol pour concentrer l’extrait.
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5. Séparation des pigments :
5. 1 Accrocher la bande de papier au crochet du
bouchon et placer la bande dans l’éprouvette.
Fermer avec le bouchon.
5. 2 Placer le cache en papier sur l’éprouvette et
laisser migrer l’éluant presque jusqu’en haut (± 28
cm). Cela prend environ 50 min.
Il ne faut, en aucun cas, déplacer le dispositif
pendant l’expérience.
5. 3 Lorsque la chromatographie est terminée,
sortir la bande de l’éprouvette et la photographier
immédiatement avec un appareil photo numérique
(facultatif). Ensuite, avec un crayon, marquer le front
de l’éluant ainsi que le centre des taches laissées
par les pigments séparés.
Attention ! La couleur des pigments disparaît au
fur et à mesure que la bande sèche.
Ce qu’il faut obtenir :
Photo 7. Dispositif pour la chromatographie de
partage des pigments végétaux.
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Photo 8. Chromatogramme obtenu à partir d’un
extrait total de Daucus carota (carotte).
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Que s’est-il passé ?
Chromatographie sur papier des pigments végétaux (avec un éluant composé
de 85% d’éther de pétrole, 10% d’acétone et 5% de cyclohexane)
FIGURE A.
•
Le β-carotène est élué en premier et migre
avec le front de l’éluant. Le β-carotène est un pigment
apolaire, liposoluble (il s’agit d’un hydrocarbure en C40
appartenant à la famille des terpénoïdes). Le βcarotène est insoluble dans l’eau de la phase fixe et
soluble dans l’éluant composé de solvants organiques.
Le partage du β-carotène entre le solvant de la phase
liquide stationnaire et le solvant de la phase liquide
mobile n’a pas lieu.
•
Les xanthophylles sont des carotènes oxydés.
Plus polaires que les carotènes, ils sont moins solubles
dans l’éluant et un peu plus solubles dans l’eau que
ces derniers. Ils se partagent donc entre ces 2 solvants
au cours de l’élution et, par conséquent, ils migrent
moins vite que le β-carotène.
La lutéine est la forme oxydée de l’α-carotène et la
zéaxanthine est la forme oxydée du β-carotène.
•
Les chlorophylles sont des molécules
amphiphiles constituées d’un anneau porphyrique
hydrophile et d’une chaîne hydrocarbonée en C20
hydrophobe (insoluble dans l’eau et soluble dans les
solvants organiques).
Les chlorophylles se partagent entre les 2 solvants et
migrent moins vite que les xanthophylles car elles sont
moins solubles dans l’éluant que ces derniers.
Ce sont les molécules qui présentent la plus grande
taille dans le mélange de pigments (Chloro. a :
C55H72O5N4Mg ; Chloro. b : C55H70O6N4Mg).
Figure A. Schématisation d’une chromatographie sur
papier.
•
La chlorophylle b se différencie de la
chlorophylle a par la présence d’un groupe formyle (R2
= CHO) à la place d’un groupe méthyle (R2 = CH3) en
position C(13). La chlorophylle b est donc plus polaire
et moins soluble dans l’éluant que la chlorophylle a.
•
Les pigments hydrosolubles tels que les
anthocyanidines ne migrent pas et restent au niveau
de la tache de dépôt
FIGURE A et B.
Dans la chromatographie de partage, il faut imaginer
une phase mobile ΦM se déplaçant lentement devant
une phase stationnaire (fixe) liquide immobile ΦS avec
la réalisation de N équilibres jusqu’à épuisement de la
concentration du soluté X dans la phase mobile.
Figure B. Schéma du partage d’un soluté entre la
phase mobile et la phase stationnaire (papier en coupe
longitudinale vu de profil)
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Mesurer et calculer :
1. Calculer le rapport frontal (Rf) pour chaque pigment séparé
•
•
•
Mesurer la hauteur de migration de l’éluant (distance entre la ligne de dépôt et le front de
l’éluant).
Mesurer la distance (d) parcourue par chaque pigment (distance entre la ligne de dépôt et
le centre de la tache).
Calculer, pour chaque pigment, le rapport frontal (Rf) :
Rf = distance parcourue par le pigment / distance parcourue par l’éluant
Pour un éluant donné et une espèce chimique donnée le Rf est caractéristique de l’espèce.
Remarque :
L’éluant le plus souvent utilisé pour la chromatographie des pigments végétaux sur papier est celui
qui est utilisé dans cet exemple : éther de pétrole 85 %, acétone 10 %, cyclohexane 5 %.
Il peut être intéressant de faire des essais avec des éluants de composition différente.
Les phéophytines ne sont pas visibles, dans les conditions de l’expérience ! La chromatographie
sur couche mince (CCM) permet de séparer les phéophytines (voir : conclusions page 13).
Il s’agit d’adopter un regard critique en ce qui concerne l’expérience décrite aux pages 122 et 123 de
l’ouvrage suivant : R. Perrier & col., Expériences faciles et moins faciles en sciences biologiques,
Collection Biosciences et techniques, éditeur doin, 1997, 122-123.
2. La technique peut être rendue quantitative (avec une erreur de ± 10 %) de deux façons :
-
par les observations sur le papier : la surface du spot est proportionnelle au log. de la concentration,
mesurer l’absorption à travers le papier après révélation. [4]
-
par les techniques d’élution : découper la région du papier qui contient l’espèce, éluer cette région et
doser l’espèce dans l’éluat). [4]
EXAO : utiliser un logiciel de mesure sur l’image
Matériel :
√ Un appareil photo numérique ou un scanner à plat (ou les deux).
√ Un ordinateur
Les outils de mesure sur l’image du logiciel MESURIM PRO (auteur : J-F. Madre, Académie d’Amiens,
France) permettent d’aborder des mesures de photométrie classique à partir d’objets photographiés ou
scannés.
Ces outils travaillent sur les images telles qu’elles sont représentées dans la mémoire de l’ordinateur, les
résultats dépendent de la qualité de la numérisation et d’indications correctes d’échelle. Ces outils
demandent d’être utilisés avec circonspection (voir avertissement de l’auteur concernant
l’interprétation des résultats).
Annuaire des logiciels de SVT gratuits et disponibles sur internet en téléchargement.
- SVT-Edu.net (http://perso.wanadoo.fr/joudan.eric/logiciel.htm)
- Académie Nantes (http://www.ac.nantes.fr:8080/peda/disc/svt/tice.htm)
Après téléchargement du logiciel, on peut utilement se constituer un mode d’emploi à partir
des explications proposées dans le « Sommaire » et les exemples d’utilisation.
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Exemple 1: mesure d’intensité de lumière avec le logiciel MESURIM PRO.
On peut mesurer la variation d’intensité de couleur dans un canal de couleur ou dans l’ensemble des
canaux, le long d’un segment, suivant une bande plus ou moins large. Les résultats sont donnés sous la
forme d’une courbe qui peut être donnée « en émission » (intensité), « en absorption » (opposé de l’intensité si
la mesure est linéaire) ou « en D.O. estimée » (si la mesure est logarithmique).
Exemple 2 : mesure de lumière dans un rectangle et mesure de lumière sous la surface
colorée.
2. 1 Mesure de la densité optique (D.O.) dans le rectangle du spot de la chlorophylle a
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2. 2 Mesure de la D.O. sous la surface colorée dans le rectangle
Application :
1.1
Mesures de photométrie classique sur l’image du chromatogramme de Daucus
carota obtenue avec un scanner à plat CIS (CanoScan Lide 30).
Graphique 1. Mesure d’intensité de couleur sur une ligne (mesure linéaire en absorption)
dans l’ensemble des 3 canaux RVB (courbe noire), dans le canal bleu (courbe bleue), dans le
canal rouge (courbe rouge) et dans le canal vert (courbe verte).
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Tableau des résultats pour des valeurs choisies (pics)
Position absorp. (R) absorp. (V)
cm
%
%
0
88
91,7
10,9
11
12,4
13,5
14,4
25,6
15,7
25,7
20,9
23,5
15,6
15,8
absorp. (B) absorption
%
%
95,7
91,8
extrait total
12,3
1,93
9,13
7,99
9,55
56,3
47,2
67,8
69,6
67,4
31,4
21,6
34,2
32,8
33,5
7,13
15,9
1,11
7,56
15,1
21,8
7,77
15,1
20,9
22,1
3,6
6,49
3,42
5,85
39,5
32,8
15,5
15,1
24,2
24,5
3,39
2,25
3,24
1,71
27,1
26,8
11,3
10,3
26,5
0,784
0,784
1,57
Rf
chloro. b
12,4 / 26,5
chloro a
15,8 / 26,5
xanthophylles 20,9 / 26,5
β-carotène
24,2 / 26,5
1,05
Interprétation des résultats :
Le graphique montre :
• Une forte absorption dans les 3 canaux pour la tache de l’extrait total.
- La tache rouge brunâtre sur la ligne de dépôt est due aux pigments hydrosolubles qui n’ont pas été
élués
- La forte absorption dans le vert s’explique par la présence de pigments rouges, les
anthocyanidines.
• La chlorophylle b, pigment photosynthétique vert, absorbe principalement dans le rouge et dans
le bleu et en moindre mesure dans le vert. Ceci est à mettre en rapport avec la couleur vert
jaunâtre de la chlorophylle b.
• Une forte absorption dans le bleu au niveau du spot de la chlorophylle b.
Il y a peut-être une superposition d’un pigment jaune (xanthophylle) et de la chlorophylle b. Ceci
expliquerait la couleur jaune visible sur le chromatogramme à cet endroit.
Une chromatographie bidimensionnelle pourrait apporter une réponse mais la coloration des
pigments disparaît dès que le chromatogramme sèche.
• La chlorophylle a, pigment photosynthétique vert - bleuâtre, absorbe dans le rouge et dans le bleu
et en moindre mesure dans le vert.
• Les caroténoïdes (xanthophylles et carotènes) sont des pigments jaunes à orange et absorbent
essentiellement dans le bleu.
La couleur des corps opaques est déterminée par
les rayons réfléchis par ces corps ; en d’autres
mots, par les rayons qu’ils n’absorbent pas.
Pour un composé qui absorbe la lumière à une
longueur d’onde déterminée, la coloration résultante
est celle obtenue par l’addition de toutes les autres
couleurs sauf celle qui est absorbée.
L’œil perçoit cette coloration comme étant la
complémentaire c'est-à-dire celle qui est opposée
dans le triangle des couleurs.
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Question remue-méninges:
Peut-on mettre en relation les résultats obtenus en mesure de photométrie classique à partir
d’objets photographiés ou scannés et les spectres d’absorption des pigments végétaux obtenus
par spectrophotométrie?
Eléments de réponse
1. Spectrophotométrie
1.1 La méthode :
La spectrophotométrie est une méthode d’analyse physico-chimique qui permet d’identifier et
de doser des particules (ions, molécules) présentes dans une solution sans l’altérer.
Utilisée en biochimie, cette méthode est basée sur la mesure de l’intensité d’absorption ou
d’émission d’un rayonnement électromagnétique par les particules à doser.
Les rayonnements le plus souvent utilisés sont l’UV (< 400 nm), la lumière visible (400 nm –
800 nm) et l’IR (> 800 nm).
1. 2 Le spectrophotomètre :
•
•
•
•
•
•
•
•
Une source de lumière blanche (lumière visible) émet un rayonnement vers un réseau par
l’intermédiaire d’un miroir.
Le réseau disperse la lumière blanche en ses lumières monochromatiques (violet, bleu, vert,
jaune, orange et rouge).
Le monochromateur sélectionne une longueur d’onde (λ) à l’aide d’une fente.
La lumière de longueur d’onde sélectionnée (I0 = lumière incidente) traverse une cuve
rectangulaire en quartz de dimension connue (d = trajet optique) et contenant la solution de
l’espèce chimique colorée à analyser.
Une cellule photoélectrique traduit en courant électrique le nombre de photons qu’elle reçoit
(I = lumière transmise).Cette dernière, couplée à un amplificateur électronique, constitue le
détecteur qui permet de mesurer l’intensité lumineuse transmise I et l’intensité lumineuse
incidente I0.
L’appareil affiche la valeur de l’absorbance A = log (I0 / I) (sans unité). Cette valeur est
comprise entre 0 et 2.
Pour réaliser une mesure, il faut effectuer un réglage du zéro avec une solution appelée le
blanc.
Un calculateur (ordinateur) traduit les mesures sous forme du graphique d’une fonction
A (Absorbance) = f (λ).
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1. 3 Les spectres d’absorption des principaux pigments photosynthétiques.
Un spectre d’absorption présente la variation de l’absorption, par une particule (atome, molécule), en
fonction de la longueur d’onde de la lumière incidente. Chaque particule, est caractérisée par la forme
générale de son spectre d’absorption (hauteurs relatives des pics et leur position en longueur d’onde).
En analyse qualitative, le spectre d’absorption permet de déterminer la nature d’une substance chimique.
En analyse quantitative, l’intensité d’absorption est fonction de la concentration de la particule qui absorbe
la lumière.
A chaque longueur d’onde, l’absorption de la lumière par une particule en solution dépend de la nature de
la particule, de sa concentration (c en mol. L-1), du chemin optique (d en cm) parcouru par la lumière à
l’intérieur de la solution et d’un coefficient d’extinction molaire caractéristique de la substance pour un
solvant donné (ελ en L. mol-1. cm-1).
Loi de Beer-Lambert :
Lorsqu’une lumière monochromatique d’intensité « I0 » traverse un milieu homogène, l’intensité de la
lumière transmise « I » décroît selon une fonction exponentielle lorsque le chemin optique « d » et la
concentration « c » augmentent.
Aλ = log I0 / I = ελ c d = D.O (sans unité)
et
c = Aλ / ελ . d
A: absorbance ou densité optique (sans unité) ;
ε: coefficient d’extinction molaire, constante caractéristique de l’espèce moléculaire (L. mol-1. cm-1).
c : concentration (mol. L-1).
d : chemin optique (cm).
λ : longueur d’onde (nm).
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2. Les mesures de photométrie classique à partir d’objets photographiés ou scannés.
2. 1 Acquisition d’images à partir d’un appareil photo numérique.
Comme pour tout appareil photographique, l’image passe d’abord par une série de lentilles optiques.
Ensuite, une cellule photosensible (CCD : Charged Coupled Device = Capteur à transfert de charges)
convertit la lumière en charges électriques. Le CCD ne voit que des nuances de gris : le noir correspond
à une charge nulle et le blanc correspond à une charge maximum.
On obtient des couleurs en filtrant suivant 4 nuances de couleurs (rouge, bleu et 2 nuances de vert) : 1
filtre rouge (R) avec 256 nuances de rouge, 1 filtre bleu (B) avec 256 nuances de bleu et 2 filtres verts
avec 256 nuances de vert chacun. Cela correspond à 16 777 216 couleurs différentes.
2. 2 Acquisition d’images à partir d’un scanner à plat compatible TWAIN.
•
Caractéristiques :
-
-
le pilote : il s’agit d’un programme compatible TWAIN qui sert d’interface entre les logiciels de
traitement d’images et le scanner pour l’acquisition ;
la résolution : correspond au nombre de pixels par pouce qu’un scanner peut acquérir. L’unité
d’acquisition est le dpi ou ppp (dot per inch = points par pouce) qui peut être différente en largeur et
en longueur ;
la palette des couleurs : caractérise chaque scanner et est exprimée en bits.
•
Fonctionnement d’un scanner à plat :
-
Le principe général de fonctionnement d’un scanner consiste en une source lumineuse qui se déplace
près de la surface d’un document. La lumière émise est réfléchie et captée par un capteur photosensible
qui convertit la lumière (valeurs arithmétiques) en charges électriques (valeurs analogiques) qui sont
converties, à leur tour, en signal digital (valeurs numériques) par un convertisseur analogique-numérique.
Un microcontrôleur met l’image en forme (format JPEG) avant son transfert vers l’ordinateur.
Il existe deux technologies différentes : la technologie CCD (voir appareil photo numérique) et la
technologie CIS (Contact Image Sensor = capteur d’images par contacts).
•
Description d’un scanner CIS :
Dans ce système, un dispositif unique est directement en contact au travers de la vitre avec le
document à numériser. Ce dispositif unique regroupe la source lumineuse, la lentille et le capteur.
La lentille cylindrique fait converger vers le capteur la lumière émise par des diodes
électroluminescentes (DEL) de couleurs rouge, bleue et verte. Les capteurs CMOS (Complementary
Metal Oxyd Semi-conductor) utilise une rampe de DEL et requiert une distance très étroite entre les
capteurs et le document.
Les DELs de couleurs émettent dans les longueurs d’onde suivantes : Bleu (450 nm – 500 nm), Vert (500
nm – 570 nm) et Rouge (610 nm – 760 nm).
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•
Fonctionnement d’un scanner CIS :
-
le scanner parcourt le document ligne par ligne ;
chaque ligne est décomposée en « taches élémentaires » correspondant à des pixels ;
le capteur analyse la couleur de chaque pixel ;
la couleur de chaque pixel est décomposée en 3 composantes (rouge, vert et bleu) ;
chacune des composantes de couleur est mesurée et représentée par une valeur numérique.
La numérisation s’effectue en codage binaire (0 ou 1), l’unité élémentaire de stockage (une case
mémoire de l’ordinateur) est appelée « bit » (binary information). L’unité de travail est l’octet,
ensemble constitué de 8 bits ;
en calcul binaire, 1 + 1 = 10 (qui ne se lit pas dix mais un, zéro). Dans un octet, on peut stocker des
valeurs numériques comprises entre 0 et 255 :
Zéro
00000000
1
00000001
2
00000010
3
00000011
4
00000100
5
00000101
…
…………
…
…………
255
11111111
-
-
le pixel qui reçoit la valeur 255 est celui qui correspond à la valeur arithmétique de l’intensité
lumineuse la plus élevée ;
la numérisation conduit à la création de 3 fichiers images digitales : un pour chaque canal de
couleur (R, V et B) ;
chaque canal de couleur (R, V et B) varie entre les valeurs comprises entre 0 et 255 bits ;
une image en couleur est constituée par la superposition de 3 images monochromes (R, V et B)
obtenues à partir des 3 fichiers images (R, V et B).
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Conclusions :
Photométrie classique avec Mesurim
Spectrophotométrie
•
A partir d’un faisceau incident I0
monochromatique, l’appareil mesure
l’intensité de la lumière transmise à
travers une solution de pigment.
•
A partir d’un faisceau incident I0 polychromatique
(RVB) sur une tache de pigment, le logiciel
mesure l’intensité de la lumière réfléchie
•
•
Le spectre d’adsorption représente
graphiquement :
A (sans unité) = f (λ en nm)
Le graphique d’intensité de couleur sur une ligne,
en absorption et mesure linéaire, représente :
A (%) = f (d en cm ou mm)
avec d : distance de migration
• Le graphique d’intensité de couleur sur une ligne,
en absorption et mesure logarithmique,
représente :
D.O. (sans unité) = f (d en cm ou mm)
•
Les 3 canaux de couleurs se superposent pour
chaque valeur de « d »
Commentaires
La chromatographie des pigments végétaux, sur papier, peut paraître désuète en comparaison des
chromatogrammes obtenus en chromatographie d’adsorption sur couche mince (CCM).
Illustration : B. Lourtie
Chromatogramme (CCM) Lactuca sativa.
Cependant, les deux méthodes doivent être maîtrisées par des élèves se destinant à poursuivre des études
scientifiques. D’autre part, la comparaison des chromatogrammes obtenus par chacune des deux méthodes
peut être source de questions intéressantes.
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Sources :
Bibliographie:
•
[1] G. Coutouly & col. Travaux dirigés de biochimie, biologie moléculaire et bioinformatique, 3ème
édition, Collection Biosciences et techniques, éditeur doin, 2006, méthodes
chromatographiques, 254-284.
•
[2] G. Coutouly & col. Travaux dirigés de biochimie, biologie moléculaire et bioinformatique, 3ème
édition, Collection Biosciences et techniques, éditeur doin, 2006, méthodes
spectrophotométriques, 302-304.
•
[3] D. Voet, J.G. Voet, Biochimie, traduction française de la 3ème édition américaine, De Boeck
Université, 2005, 143.
•
[4] A. L. Lehninger, Biochimie, traduction de la 2ème édition, Flammarion Médecine – Sciences,
1977, 105-106.
•
[5] M. Vanbelle, Biochimie descriptive 1ère partie, Introduction à la biochimie moderne pour
agronomes, Faculté des Sciences Agronomiques de l’UCL, 1970, 2, 34-35.
•
[6] B. Julia, B. Proust & col. Physique-Chimie 2de, la chimie au quotidien, Magnard, 2004, 11,
173-184
•
[7] V. Audebert & col. Sciences de la Vie et de la Terre, Terminale S, enseignement de
spécialité, édition Bordas, Collection Tavernier-Lizeaux, 2002, 1, 196
•
[8] J. B. Baudin & col. Chimie, Terminale S, enseignement obligatoire, édition Nathan, Collection
Sirius, 2002, 2, 42-58.
Sites Web :
•
•
•
•
•
•
•
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•
•
Méthodes physiques de séparation et d’analyse et méthodes de dosage des
biomolécules : Techniques chromatographiques : la chromatographie liquide / mécanismes et
modalités.
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/chromato/A62.html
Biologie et Recherche : les différentes techniques de chromatographie.
http://www.123bio.net/cours/chromato/introchromato.html
Colorants alimentaires dans un sirop : fiche du professeur
http://www4b.ac-lille.fr/~physiquechimie/lycee/seconde/pci/chimie/obligatoire/synthe.....
Spectrophotométrie, colorimétrie : dosage de l’acide phosphorique dans le coca-cola
http://www.unige.ch/sciences/chiam/williams/tp/Pharmacie/09_Colorimetrie.pdf
Spectrophotométrie d’absorption, document de travaux pratiques : Principe de
l’absorptiométrie d’espèces chimiques en solution
http://formation.etud.u-psud.fr/chimie/experiences/tp-101a/documents_TP/c3absorption....
YBET, le cours informatique : PC et périphériques, 18. Acquisition image : appareil photo
numérique et scanner
http://www.ybet.be/hard1ch18/hard1_ch18.htm
LMPC Informatique- Monthey : le scanner
http://www.Impc.ch
Numériseur de document
http://fr.wikipedia.org/wiki/Num%C3%A9riseur_de_document
Cnam : ELE 101 Composants électroniques : dispositifs optoélectroniques
http://www.cnam.fr/elau/publi/algani/images/ELE101_CNAM_7_2008.pdf
Diodes électroluminescentes
http://www.rqmp.ca/medias/Projets%20de20recherche/Projet_aimez_LEDS_fr.pdf
Diodes électroluminescentes
http://fr.wikipedia.org/wiki/Diode_%C3%A9lectroluminescente
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