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8
卜
〇
(12) 特許協 力条約 に基 づ いて公 開 され た国際 出願
(43) 国際公 開 曰
2012 年 7 月 5 日（
05.07.2012)
(51)
(10) 国際 公 開番 号
W 画P O
国際特 許分 類 ：
(81)
C12N 1/21 (2006.01)
C12P 13/00 (2006.01)
C12N 15/09 (2006.01)
C12R 1/15 (2006.01)
(21)
国際 出願 番 号 ：
(22)
国際 出願 日：
(25)
国際 出願 の 言語 ：
日本語
(26)
国際 公 開の 言語 ：
日本語
月 27 日（27. 12.201
1)
(30) 優 先権 デー タ：
特願
(71)
(72)
(75)
(74)
2010
年
12
月 2 8 曰（28. 12.2010)
JP
INSTITUTE
O F INNOVATIVE
TECHNOLOGY
FOR
THE EARTH)
[JP/JP]; 〒6190292 京者 府 木 津 川巿 木
指定国 （
表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 広 域 保
護 が 可 肯巨）
：ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW,
MZ, NA, RW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), ュ 一 ラ シ
ァ （AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ョ 一
ロ ッパ (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE,
津 川 台 9 丁 目 2 番 地 Kyoto (JP). 住 友 ゴム 工 業株
式会 社 （
SUMITOMO
RUBBER
INDUSTRIES,
LTD.)
[JP/JP]; 〒65 10072 兵 庫 県 神 戸 市 中 央 区脇 浜 町 3
丁 目 6 番 9 号 Hyogo (JP).
ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC,
MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR),
OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML,
MR, NE, SN, TD, TG).
(84)
出願 人 （
米 国 を除 く全 ての 指 定 国 につ いて ）
：公益
財 団法 人地球 環 境 産 業技 術研 究機 構 (RESEARCH
発 明者 ；お よび
発 明者 / 出願 人 （
米 国 に つ い て の み )：湯 川 英 明
(YUKAWA,
HideaH) [JP/JP]; 〒6190292 ¾ 者 府 木 津
川巿 木 津 川 台 9 丁 目 2 番 地 公 益財 団法 人地球
環 境 産 業 技 術 研 究 機 構 内 Kyoto (JP). 乾 将 行
(INUI, Masayuki)
[JP/JP]; 〒 6190292 京 者 府 木 津 川
巿 木 津 川 台 9 丁 目 2 番 地 公 益 財 団法 人地 球 環
境産 業技 術研 究機 構 内 Kyoto (JP).
添付 公 開書 類 ：
一
一
一
国際調 査 報 告 （
条約 第
2 1 条 (3))
規 則 13 の 2 に基 づ い て 明細 書 とは別 に提 出 され
た 、寄 託 され た生 物 材 料 に関す る表 示 （
規 則 13
の 2.4(d)(1) 及 び 48.2(a)(viii))
明 細 書 の 別 個 の 部 分 と して 表 した 配 列 リス ト
(規 則 5.2(a))
代 理 人 ：岩 谷 龍 (IWATANI,
Ryo) ；〒5300003 大 阪
府 大 阪市 北 区堂 島 2 丁 目 1 番 3 1 号 京 阪 堂 島
ビノ
レ3 階 Osaka (JP).
(54) Title:
SAME
(54)
2010-293972
指定国 （
表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 国 内保
護 が 可 肯 ) : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,
BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO,
CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI,
GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, YL, IN, IS,
JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS,
LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX,
MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PE, PG, PH, PL, PT,
QA, RO, RS, RU, RW, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST,
SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ,
VC, VN, ZA, ZM, ZW.
PCT/JP201 1/0801 5 1
201 1 年 12
W O 2012/090978 A 1
PCT
TRANSFORMANT
O F CORYNEFORM
BACTERIUM,
AND
METHOD
FOR
PRODUCING
ANILINE
USING
発 明の名 称 ：コ リネ型細 菌 形 質転 換 体 及 びそれ を用 い るァ ニ リンの 製造 方法
(57) Abstract:
A transformant which i s produced by introducing
a gene encoding an enzvme having an aminobenzoate de
carboxylase activity into a host coryneform bacterium and which i s capable of producing aniline; and a method for producing anil ine, comprising a step of reacting the transformant in a reaction solution containing aminobenzoic acid, an ester thereof and/or a salt
thereof under reductive conditions and a step of collecting aniline fixim a reaction culture medium.
要 約 ： ァ ミノベ ン ゾ エ ー ト デ カル ボキ シ ラー ゼ (aminobenzoate decarboxylase) 活性 を有 す る酵 素 を コー ド
す る遺 伝 子 が 、宿 主 の コ リネ型 細 菌 に導 入 され た 、 ァ ニ リン生産 能 を有 す る形 質転 換 体 。 この 形 質転 換 体
を、還 元 条 件 下 、 ァ ミノ安 息香 酸 、 その エ ス テ ル 、及 びノ 又 はその 塩 を含 有 す る反 応 液 中 で反応 させ るェ
程 と、反応 培 地 中の ァ ニ リンを回収 す る工程 とを含 む ァ ニ リンの 製造 方 法 。
(57)
明
細
書
発 明 の名称 ：
コ リネ 型 細 菌 形 質 転 換 体 及 び そ れ を 用 い る ァ ニ リンの 製 造 方 法
技術分野
[0001 ]
本 発 明 は、 ァ ニ リン生 産 技 術 に 関 す る。 さ らに詳 し くは、 ァ ニ リン生 産 機
能 を付 与 す る た め に特 定 の 遺 伝 子 操 作 が 施 さ れ た コ リネ 型 細 菌 の 形 質 転 換 体
、 及 び この 形 質 転 換 体 を 用 い た 効 率 的 な ァ ニ リンの 製 造 技 術 に 関 す る。
背景技術
[0002]
地 球 温 暖 化 、 及 び 化 石 資 源 枯 渴 問 題 を背 景 に、 再 生 可 能 資 源 を原 料 と した
化 学 品 の 製 造 は、 バ イ オ 燃 料 製 造 と並 び 、 新 産 業 バ イ オ リフ ァイ ナ リ一 と し
て 低 炭 素 社 会 実 現 の 重 要 な 方 策 で あ る こ とが 認 識 さ れ 、 大 きな 注 目が 集 ま つ
て い る。
こ こで 、 ァ ニ リン は、 染 料 、 タ イ ヤ の 加 硫 促 進 剤 や 老 化 防 止 剤 等 の ゴ ム 製
品 材 料 の よ うな 化 学 製 品 ；繊 維 、 導 電 性 ポ リマ ー の よ うな機 能 材 料 ；農 薬 ；
医 薬 品 な どの 原 料 と して 広 く利 用 さ れ て い る。
[0003]
現 在 、 ァ ニ リン は、 原 油 を原 料 と して 化 学 的 に 生 産 さ れ て い る。 化 学 的 ァ
ニ リン製 造 方 法 と して は、 ニ トロベ ンゼ ン を ス ズ ま た は鉄 と塩 酸 で 還 元 す る
方 法 、 銅 、 ニ ッケ ル な どの 金 属 触 媒 を 用 い て ニ トロベ ンゼ ン に水 素 添 加 す る
還 元 法 、 高 温 高 圧 下 に ク ロ 口ベ ンゼ ン と ア ン モ ニ ア と を反 応 さ せ る方 法 （ァ
ン モ ノ リシ ス ） な どが あ る が 、 い ず れ も溶 剤 類 及 び 高 熱 エ ネ ル ギ ー を必 要 と
す る、 典 型 的 な 化 学 工 業 の 高 エ ネ ル ギ ー 消 費 型 プ ロセ ス で あ る。 従 って 、 地
球 環 境 保 全 や 温 室 効 果 ガ ス 削 減 の 観 点 か ら、 二 酸 化 炭 素 排 出 が 少 な い 省 エ ネ
ル ギ ー 型 で 、 再 生 可 能 資 源 か ら製 造 で き、 低 廃 棄 物 排 出 の 環 境 調 和 型 プ ロセ
ス の 開 発 、 即 ち バ イ オ ァ ニ リン製 造 技 術 確 立 が 急 務 とな って い る。
しか し、 再 生 可 能 資 源 を原 料 と した バ イ オ ア 二 リン生 産 は、 乳 酸 ゃ ェ タ ノ
— ル の 生 産 と比 較 して 、 原 料 とな る糖 類 か らの 代 謝 反 応 段 数 が 非 常 に 多 い た
め に 生 産 性 が 低 い。 ま た 、 生 産 物 で あ る ァ ニ リン に よ る菌 の 増 殖 阻 害 や 、 ァ
二 リ ン に よ る 細 胞 毒 性 等 の 難 点 が あ る。 こ の た め 、 工 業 的 生 産 は 不 可 能 と さ
れ て い る。
[0004]
非 遺 伝 子 組 換 え 菌 に よ る ァ ニ リ ン生 成 技 術 と して 、 具 体 的 に は 、 以 下 の 方
法 が 知 られ て い る。
例 え ば 、 非 特 許 文 献 1 は 、 マ イ コバ ク テ リゥ 厶 ス メ グ マ テ ィ ス （Mycobacte
r iu
smegmat i s ) を 培 養 した 後 、 洗 菌 した 細 胞 に 4 - ァ ミ ノ安 息 香 酸 を 添 加 す る
と、 微 量 の ァ ニ リ ン が 生 成 す る こ と を 開 示 して い る。 しか し、 非 特 許 文 献 1
の 方 法 は ァ ニ リ ン生 産 性 が 実 用 上 十 分 で は な い 。 な お 、 非 特 許 文 献 1 は 、 4 ァ ミ ノ安 息 香 酸 か らの ァ ニ リ ン生 成 に 関 わ る 酵 素 、 そ の 活 性 、 及 び 活 性 を有
す る 酵 素 遺 伝 子 に は 言 及 して い な い 。
ま た 、 非 特 許 文 献 2 は 、 病 原 性 大 腸 菌 ェ シ エ リキ ア コ リ （Escher i c h i a c o
L i ) 0 1 1 1 の 洗 菌 した 細 胞 、 又 は 細 胞 抽 出 液 に、 ア ン トラ ニ ル 酸
（2- ア ミ ノ安
息 香 酸 ） 、 又 は 4 - ァ ミ ノ安 息 香 酸 を 添 加 す る と、 微 量 の ァ ニ リ ン が 生 成 す る
こ と を 開 示 して い る。 しか し、 非 特 許 文 献 2 の 方 法 は ァ ニ リ ン生 産 性 が 実 用
上 十 分 で は な い 。 な お 、 非 特 許 文 献 2 は 、 ア ン トラ ニ ル 酸 、 又 は 4 - ア ミ ノ安
息 香 酸 か らの ァ ニ リ ン生 成 に 関 わ る 酵 素 、 そ の 活 性 、 及 び 活 性 を有 す る 酵 素
遺 伝 子 に は 言 及 して い な い 。
ま た 、 特 許 文 献 1 は 、 ス トレ プ トマ イ セ ス グ リセ ウ ス
seus)
を、 ァ ニ リ ン原 料 と して グル コ ー ス を 含 む TSB (Trypt
) 培 地 で 、 好 気 条 件 下 に 4~5
（St reptomyces
i case
g i
Soy Broth
日 間 培 養 す る こ と に よ り、 培 養 液 中 に ァ ニ リ ン
を 生 成 さ せ る技 術 を 開 示 して い る。 しか し、 特 許 文 献 1 に は 、 具 体 的 な ァ ニ
リ ン の 生 産 量 や 、 生 産 効 率 な ど が 示 さ れ て お らず 、 特 許 文 献 1 の 方 法 の 実 用
性 に つ い て は 不 明 で あ る。
先行 技術 文献
特 許 文献
[0005]
特 許 文 献 1 ：特 開 2008-274225
号 公報
非特 許 文献
[0006]
非 特 許 文 献 1 ：The Journa
l of
B i o Log i c a L Chem i s t ry,
Vo L. 193,
1951 , 453-
非 特 許 文 南犬2 : Journa
l of
the
Amer i can
Chem i c a l Soc i ety,
Vo L. 79,
1957,
628-630.
発 明 の概 要
発 明 が解 決 しょ う とす る課 題
[0007]
本 発 明 は 、 ァ ミ ノ 安 息 香 酸 を 原 料 と して 効 率 よ く ァ ニ リ ン を 製 造 で き る 微
生 物 、 及 び ア ミ ノ 安 息 香 酸 を 原 料 と して 効 率 よ く ァ ニ リ ン を 製 造 で き る 方 法
を提 供 す る こ と を課 題 とす る。
課 題 を解 決 す る た め の手 段
[0008]
上 記 課 題 を 解 決 す る た め に 本 発 明 者 ら は 研 究 を 重 ね 、 コ リネ 型 細 菌 に ア ミ
ノ べ ン ゾ ェ 一 卜 テ カ リレポ キ シ ラ 一 セ (am i nobenzoate
decarboxy
lase)
這伝 子
を 導 入 した 形 質 転 換 体 は 、 効 率 よ く ァ ミ ノ 安 息 香 酸 か ら ァ ニ リ ン を 生 産 す る
こ と を 見 出 した 。 ま た 、 こ の 形 質 転 換 体 は 、 還 元 条 件 下 の 反 応 液 中 で 実 質 的
に 増 殖 しな い 状 態 で 反 応 さ せ る 場 合 、 特 に 、 ァ ニ リ ン 生 産 効 率 が 高 い こ と を
見 出 した 。
[0009]
本 発 明 は 上 記 知 見 に 基 づ き 完 成 さ れ た も の で あ り、 以 下 の 形 質 転 換 体 及 び
ァ ニ リンの 製 造 方 法 を提 供 す る。
I貝 1
ァ ミ ノ べ ン ゾ ェ 一 卜 テ カ リレポ キ シ ラ 一 セ (am i nobenzoate
decarboxy
Lase) 活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 、 宿 主 の コ リネ 型 細 菌 に 導 入 さ
れ た 、 ァ ニ リン生 産 能 を有 す る形 質 転 換 体 。
項 2 .
ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 活 性 を有 す る 酵 素 を コ ー ド
す る 遺 伝 子 が 、 バ チ ラ ス サ プ チ リス （Bac は Lus subt
ラ ク トノくチ リレス
ラム ノ一サ ス
(Lactobac
i L Lus
rhamnosus)
ラ ク 卜バ チ ラ ス プ レ ビ ス （Lactobac は Lus brev i s )
モ ナ ス プ チ ダ （Pseudomonas put i da)
i Li s )
由来 の遺伝 子、
由来 の 遺伝 子、
由来 の遺伝 子、 シ ユー ド
由 来 の 遺 伝 子 、 ェ シ エ リキ ア コ リ
（E
scher
i c h i a c o Li )
由 来 の 遺 伝 子 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス セ レ ビ シ ェ (Saccharom
yces
cerev
由 来 の 遺 伝 子 、 又 は ェ ン テ ロ バ ク タ 一 ク ロ ァ カ ェ （Enter
obacter
i s i ae)
c loacae)
由 来 の 遺 伝 子 で あ る項 1 に記 載 の 形 質 転 換 体 。
項 3 .
ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 活 性 を有 す る 酵 素 を コ ー ド
す る 遺 伝 子 が 下 記 の （a) 又 は （b) の DNA で あ る 項 1 に 記 載 の 形 質 転 換 体 。
配 列 番 号 16 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 配 列 番 号 19 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA
(a)
、 配 列 番 号 2 2 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 配 列 番 号 2 5 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA、
配 列 番 号 2 8 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 配 列 番 号 3 1 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 又
は 配 列 番 号 3 4 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA
(a) の 何 れ か の 塩 基 配 列 と 相 補 的 な 塩 基 配 列 か ら な る DNA と ス 卜 リ ン ジ ェ
(b)
ン 卜な 条 件 で ハ イ プ リ ダ イ ズ し、 か つ ァ ミ ノ べ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ ー
ゼ 活 性 を 有 す る ポ リペ プ チ ドを コ ー ドす る DNA
項 4 .
宿 主 の コ リネ 型 細 菌 が コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
ダル タ ミ カ ム で あ る項 1
〜 3 の何 れ か に記 載 の形 質転 換 体 。
項 5 .
宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ウ 厶
グ ル ミ カ ム R (FERM
P — 18976)
グ ル タ ミ カ ム が 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
、 ATCC 13032,
又 は ATCC1 3869 で あ る 項 4 に 記
載 の形 質転 換 体。
項 6 .
コ リネ バ ク テ リ ウ 厶
グ ル タ ミ カ ム ANI-1
( 受 託 番 号 ：NITE
BP-1 001
) 形 質転換 体。
項 7 .
項 1 ~ 6 の 何 れ か に 記 載 の 形 質 転 換 体 を、 還 元 条 件 下 、 ァ ミ ノ安 息
香酸、 そのエ ステル、 及び/
又 は そ の塩 を含 有 す る反 応 液 中 で反 応 させ るェ
程 と、 反 応 培 地 中 の ァ ニ リ ン を 回 収 す る 工 程 と を 含 む ァ ニ リ ン の 製 造 方 法 。
項 8 .
反 応 工 程 に お い て 、 形 質 転 換 体 が 実 質 的 に 増 殖 しな い 項 7 に 記 載 の
ァニ リンの製 造 方 法 。
項 9 .
還 元 条 件 下 の 反 応 液 の 酸 化 還 元 電 位 が — 2 0 0 〜 ― 5 0 0 ミ リボ ル
卜で あ る 項 7 又 は 8 に 記 載 の ァ ニ リ ン の 製 造 方 法 。
発 明 の効 果
本 発 明 の 形 質 転 換 体 を 用 い る こ と に よ り、 ァ ミ ノ 安 息 香 酸 、 そ の 塩 、 又 は
そ の エ ス テ ル か らァ ニ リン を 高 効 率 で 製 造 す る こ とが で き る。
一 般 に 微 生 物 は ァ ニ リ ン の よ う な 溶 剤 の 細 胞 毒 性 に よ り生 育 が 阻 害 さ れ る
た め 、 微 生 物 を 用 い て ァ ニ リン を製 造 す る こ と は 困 難 で あ つた が 、 本 発 明 方
法 に よ れ ば、 微 生 物 を 用 い て 、 実 用 上 十 分 に効 率 良 くァ ニ リン を製 造 す る こ
とが で き る。
図面 の簡単 な説 明
[00 1 1 ]
[ 図 1 ] 実 施 例 で 用 い た プ ラ ス ミ ドの 構 成 を示 す 図 で あ る。
発 明 を実施 す るための形 態
以 下 、 本 発 明 を詳 細 に説 明 す る。
[00 12 ]
ァ ニ リン生 産 能 を有 す る形 質 転 換 体
(
本 発 明 の ァ ニ リン生 産 能 を有 す る形 質 転 換 体 は、 ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ
ル ポ キ シ ラ ー ゼ 活 性 を有 す る酵 素 を コ 一 ドす る遺 伝 子 が 、 宿 主 の コ リネ 型 細
菌 に導 入 さ れ た 形 質 転 換 体 で あ る。
[00 13 ]
コ リネ 型 細 菌 と は、 バ 一 ジ 一 ズ
テ リ才 ロ
99
ン
一
[Ba rgeys
Manua l
of
マ ニ ュ アル
デ タ一 ミネ ィテ ィプ
バク
De t e r m i nat i v e Bac t e r i o Logy 、 Vo L.
8、 5
〕 に 定 義 さ れ て い る 一 群 の 微 生 物 で あ り、 通 常 の 好 気 的 条 件 で 増
( 1974)
殖 す る も の な らば特 に 限 定 さ れ る も の で は な い。 具 体 例 を挙 げ れ ば、 コ リネ
パ クテ リゥ 厶 属 菌 、 プ レ ビパ クテ リゥ 厶 属 菌 、 ア ー ス ロバ ク タ 一 属 菌 、 マ イ
コバ クテ リゥ 厶 属 菌 、 マ イ ク ロ コ ッ カ ス 属 菌 等 が 挙 げ られ る。 コ リネ 型 細 菌
の 中 で は コ リネ バ クテ リゥ 厶 属 菌 が 好 ま しい。
コ リネ バ クテ リウ 厶 属 菌 と して は、 コ リネ バ クテ リゥ 厶
[00 14 ]
コリ
不
ネ
ンく
クテ リウ 厶
、
クテ リゥ 厶
ノヾ
ダル タ ミ カ ム 、
エ フ イシ エ ン ス (Co r ynebac t e i u m e f f i c i ens)
、コリ
ア ン モ ニ ア ケ 不 ス (Co r ynebac t e r i u m ammon i agenes)
卜レラ ン ス (Co r ynebac t e r i u m h a Lo t o Le r ance)
、コ
リ木 ノ ヾクテ リク ム
ノヽ ロ
、コ
リ不 ノ ヾ、クテ リウ ム
ァリ
レ力 ノ リテ ィ カ ム (Co r ynebac t e r i u m a Lkano Ly t i cum)
等 が 挙 げ られ る。
中 で も、 安 全 で か つ ァ ニ リン生 産 性 が 高 い 点 で 、 コ リネ パ クテ リゥ 厶
ル タ ミ カ ム が 好 ま しい。 好 適 な 菌 株 と して 、 コ リネ バ クテ リゥ 厶
カ ム (Co r ynebac t e i u m g Lu t
TCC 13869
a m i cum)
R株
( FERM P- 18976)
グ
ダル タ ミ
、 ATCC 13032 株 、 A
株 、 ATCC 13058 株 、 ATCC 13059 株 、 ATCC 13060 株 、 ATCC 13232 株 、 ATCC 1
株 、 ATCC 1 3287 株 、 ATCC 1 3655 株 、 ATCC 1 3745 株 、 ATCC 1 3746 株 、 ATCC 1 376 1
3286
株 、 ATCC 14020 株 、 ATCC3 1 8 3 1 株 、 MJ-233
等 が 挙 げ ら れ る 。 中 で も 、 R株
R M BP- 1498)
ATCC 1 3869
、
[00
( FERM
BP- 1497)
P - 1 8976)
（FERM
、 プ レ ビ ンくク テ リ ウ 厶
t e
urn f Lavum)
i um
La c t o f e rmen t um)
u m d i v a r i cat
、 フ レ ビ ノ义、ク テ リ ク ム テ
、
'
、 コ リ 不 ノヾ、ク テ リ ウ 厶
um)
【
こ
i cum)
" B r e v i bac t e r i u m
I nt
J
Sys t
and
t he i r
Bac t e
i o L.
バ クテ リゥ厶
BP- 1498)
フ ラ バ ム の MJ-233
W.
et
DSM
2041
2
and
[00
r RNA
r t h r obac
、
t er
ATCC3 1 250
T r ansfe
14 1 2 ,
gene
iu
bov
ク ロコ ッカス
e ich i i)
ルテ ウス
（M
and
2041
C o r yne
〕
p
。
ラ ク トフ ア ー メ ン タ ム ATCC 1 3869 株 、 プ レ ビ
株
（FERM
BP- 1497)
、
( 例 え ば ATCC6872
（FERM
ア ンモニ アゲ ネ ス
株 ) 等 が 挙 げ られ る 。
グ ロ ビ フ オル ミ ス
（A
株 、 ATCC2 1 056 株
株 ） 等 が 挙 げ られ る 。
( 例 え ば No.
i c r ococcus
株
MJ-233AB-41
ダル タ ミ カ ム で あ る。
( 例 え ば ATCC 1 9 2 1 0 株 、 ATCC27289
f r euden
DSM
Br
( 1 987)
239
（Mycobac t
株 ) 等 が 挙 げ られ る 。
マ イ ク ロ コ ッ カ ス 属 菌 と して は 、 マ イ ク ロ コ ッ カ ス
i c r ococcus
of
、 駒 形 和 男 ら， コ リネ
株 、 ATCC3 1 738 株 、 ATCC35698
is)
r
r es t r i c t i on
マ イ コ バ ク テ リ ウ 厶 属 菌 と して は 、 マ イ コ バ ク テ リ ゥ 厶 ボ ビ ス
e
t e r i um
( 19 9 1)
( 例 え ば ATCC80 1 0 株 、 ATCC4336
g Lo b i f o r m i s )
L i L i um
4 1 : 255-260.
ア ー ス ロ バ ク タ 一 属 菌 と して は 、 ア ー ス ロ バ ク タ 一
16 ]
t e r i um
by
プ レ ビ バ ク テ リ ウ 厶 属 菌 と して は 、 プ レ ビ パ ク テ リ ゥ 厶
i u m ammon i agenes)
( B r e v i bac t e r i
d i s t i nc t i on
な ど も 好 適 な コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
( B r e v i bac t e
( B r e v i bac t e r
（Co r ynebac
a L. ,
DSM
r e v i bac
（B
" B r e v i bac t e r i u m f Lavum"
フ オ ル 厶 細 菌 の 分 類 ， 発 酵 と 工 業 ， 4 5 : 944-963
旧 分 類 の プ レ ビパ ク テ リ ゥ 厶
(Co r ynebac
グル タ ミ カ ム
L i e b L,
20297T,
La c t o f e rmen t um"
bac t e r i u m g Lu t a m i cum
a t t e r ns.
u m DSM
フ ラバ ム
イ ノく リ カ タ ム
リ リゥ厶
名 力《糸
允一 さ れ て し、る
e v i bac t e r i u m d i v a r i cat
1,
株
ATCC 1 3032
、
ラ ク 卜フ ァ 一 メ ン タ ム
) 等 の コ リネ 型 細 菌 も コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
g Lu t a
( FE
株 が 好 ま しい 。
な お 、 分 子 生 物 学 的 分 類 に よ り、 プ レ ビ パ ク テ リ ゥ 厶
15 ]
MJ-233AB-41
、
株
Le u t eus)
( FERM
フ ロイデ ンライ ヒ
P - 1 322 1 )
( 例 え ば No.
240
)
株
（M
、 マイ
( FERM
P
- 13222)
) 、 マ イ ク ロ コ ッ カ ス ウ レァ ェ
0 10 株 ） 、 マ イ ク ロ コ ッ カ ス
ロゼ ウス
（M
（M
i crococcus
i crococcus
ureae)
roseus)
( 例 え ば IAM1
( 例 え ば IF03
764 株 ） 等 が 挙 げ ら れ る 。
ま た 、 コ リネ 型 細 菌 は 、 野 生 株 の 他 に 、 そ の 変 異 株 や 人 為 的 な 遺 伝 子 組 換
[001 7 ]
え 体 で あ っ て も よ い 。 例 え ば 、 ラ ク テ 一 卜 （乳 酸 ） デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ
t e dehydrogenase
(phosphoeno
dehydrogenase)
：LDH)
Lpyrvate
（Lacta
、 フ ォ ス フ 才 エ ノ 一 ル ピル べ 一 卜カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ
carboxy
lase)
、 マ レ 一 卜テ ヒ ドロ ケ ナ 一 セ
(ma Late
な ど の 遺 伝 子 の 破 壊 株 が 挙 げ られ る 。 こ の よ う な 遺 伝 子 破 壊
株 を 宿 主 と して 用 い る こ と に よ り、 ァ ニ リ ン の 生 産 性 を 向 上 さ せ た り、 副 生
成 物 の 生 成 を 抑 制 した り す る こ と が で き る 。
中 で も 、 ラ ク テ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ 遺 伝 子 の 破 壊 株 が 好 ま しい 。 こ の 遺
伝 子 破 壊 株 は 、 乳 酸 デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ 遺 伝 子 が 破 壊 さ れ て い る こ と に よ り、
ピル ビ ン 酸 か ら乳 酸 へ の 代 謝 経 路 が 遮 断 さ れ て い る 。 中 で も 、 コ リ ネ バ ク テ
リウ 厶
ダ ル タ ミ カ ム の 、 特 に R (FERM P-1 8976)
株 の ラ ク テ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ
ナ 一 ゼ 遺 伝 子 の 破 壊 株 が 好 ま しい 。
こ の よ う な 遺 伝 子 破 壊 株 は 、 遺 伝 子 工 学 的 手 法 に よ り常 法 に 従 い 作 製 で き
る 。 例 え ば 、 WO2005/01
0 1 82A1 に 、 乳 酸 デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ 破 壊 株 、 及 び そ の
作 製 方 法 が 記 載 さ れ て い る。
コ リネ 型 細 菌 は 、 他 細 菌 に 比 べ て 、 ァ ニ リ ン の よ う な 溶 剤 に 対 す る 耐 性 が
高 い 。 ま た 、 コ リ ネ 型 細 菌 は 、 他 の 好 気 性 細 菌 に 比 べ て 、 実 質 的 に 増 殖 しな
い 還 元 条 件 下 で 効 率 よ く物 質 生 産 を 行 え る 。 こ れ ら の 点 で 、 コ リ ネ 型 細 菌 は
本 発 明 方 法 に よ る ァ ニ リ ン製 造 に 好 適 で あ る 。
[001 8 ]
ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 酵 素 遺 伝 子
ァ ミ ノ ベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ は 、 ァ ミ ノ 安 息 香 酸 か ら炭 酸 を 脱
離 さ せ て ァ ニ リン を 生 成 す る反 応 、 及 び そ の 逆 反 応 を触 媒 す る酵 素 で あ る。
ァ ミ ノ ベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 活 性 を 有 す る 酵 素 を コ 一 ドす る 遺
伝 子 の 由 来 は 特 に 限 定 さ れ な い が 、 バ チ ラ ス サ プ チ リ ス （Bac は Lus subt
s)
由来 の遺伝 子、 ラ ク
卜 ノく チ
リレス ラ ム ノ 一 サ ス (Lactobac
i L Lus
i Li
rhamnosus
) 由 来 の 遺 伝 子 、 ラ ク 卜バ チ ラ ス プ レ ビ ス （Lac t obac は Lu s b r e v i s )
遺 伝 子 、 シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ （Pseudomonas p u t i da)
エ リキ ア コ リ （Esche r i c h i a c o
ピ シ ェ (Saccha
ク ロァカェ
r omyces
（En t e r obac
)
c e r e v i s i ae)
t er
c l oacae)
由来 の
由来 の遺伝 子、 ェ シ
由来 の 遺 伝 子 、 サ ッカ ロマ イ セ ス セ レ
由 来 の 遺 伝 子 、 又 は ェ ンテ
クタ一
由 来 の 遺 伝 子 が 好 ま しい 。 中 で
チ ラ ス サ プ チ リス 由 来 の 遺 伝 子 、 及 び ェ ン テ ロバ ク タ 一 ク ロ ァ カ ェ 由 来 の
遺 伝 子 が 好 ま しい 。 特 に 、 ア ン トラ ニ ル 酸
（2- ァ ミ ノ安 息 香 酸 ） を 基 質 と し
た 場 合 は バ チ ラ ス サ プ チ リス 由 来 の 遺 伝 子 が 好 ま し く、 4 - ァ ミ ノ安 息 香 酸 を
基 質 と した 場 合 は ェ ン テ ロバ ク タ 一 ク ロ ァ カ ェ 由 来 の 遺 伝 子 が 好 ま しい 。
[00 1 9 ]
バ チ ラ ス サ プ チ リス 由 来 の 遺 伝 子 と して は 配 列 番 号 1 6 の 塩 基 配 列 か らな る
DNA が 挙
げ られ 、 ラ ク 卜バ チ ル ス ラ ム ノ 一 サ ス 由 来 の 遺 伝 子 と して は 配 列 番
号 1 9 の 塩 基 配 列 か らな る DNA が 挙 げ られ 、 ラ ク 卜バ チ ラ ス プ レ ビ ス 由 来 の 遺
伝 子 と して は 配 列 番 号 2 2 の 塩 基 配 列 か らな る DNA が 挙 げ られ 、 シ ュ 一 ドモ ナ ス
プ チ ダ 由 来 の 遺 伝 子 と して は 配 列 番 号 2 5 の 塩 基 配 列 か らな る DNA が 挙 げ られ
、 ェ シ エ リキ ア コ リ由 来 の 遺 伝 子 と して は 配 列 番 号 2 8 の 塩 基 配 列 か らな る D N
Aが挙
げ られ 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス セ レ ピ シ ェ 由 来 の 遺 伝 子 と して は 配 列 番 号 3
1の塩
基 配 列 か らな る DNA が 挙 げ られ 、 ェ ン テ ロ パ ク タ ー
ク ロァ カェ 由来 遺伝
子 と して は 配 列 番 号 3 4 の 塩 基 配 列 か らな る DNA が 挙 げ られ る 。
ま た 、 本 発 明 で は 、 配 列 番 号 1 6 、 1 9 、 2 2 、 2 5 、 2 8 、 3 1、 又 は 3 4 の 塩 基 配 列
[0020]
と相 補 的 な 塩 基 配 列 か らな る DNA と ス 卜 リ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 で ハ イ プ リダ イ ズ
し、 か つ ア ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 活 性 を 有 す る ポ リペ プ チ ド
を コ 一 ドす る DNA も 使 用 で き る 。
本 発 明 に お い て 「ス ト リ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 」 は 、 一 般 的 な 条 件 、 例 え ば 、 M
0 Lecu La r
1. 4 5
C Lo n i ng,
A Labo r a t o r y Manua l ,
Second
Ed i t i on,
1 989,
V o L2,
に 記 載 さ れ た 条 件 を 指 す 。 具 体 的 に は 、 完 全 ハ イ ブ リ ッ ドの 融 解 温 度
p1
（Tm
) よ り 5 ~ 1 0 °C 低 い 温 度 で ハ イ プ リダ イ ゼ 一 シ ヨ ン が 起 こ る 場 合 を 指 す 。
[002
1]
ァ ミ ノべ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 活 性 は 、 丄
628-630
( 1 957)
A m . Chem.
Soc.
,
79,
に 記 載 の 方 法 を 改 変 して 測 定 で き る 。 簡 単 に 説 明 す る と、 コ
リネ 型 細 菌 を 栄 養 培 地 で 、 18 時 間 3 3 °C で 培 養 した も の を 、 最 少 培 地 で 2 回 洗
菌 した 後 、 最 少 培 地 に 再 懸 濁 、 Intact
Ce L L と す る 。 次 に 反 応 と して 、 Intact
Ce L L に HEPES(pH7. 0 ) を 緩 衝 液 と して 25mM 加 え 、 基 質 と して ア ン トラ ニ ル 酸
、 又 は 4 - ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜を 終 濃 度 5 m M に な る よ う に 添 加 す る 。 3 3 °C 、 2 0
0rpm で 6 時 間 振 と う後 、 反 応 液 を 菌 と上 清 に 遠 心 分 離 し、 上 清 を 0 . 2 2
m のフ
ィル タ ー で 濾 過 した も の を サ ン プ ル と す る 。 生 じた ァ ニ リ ン 生 成 量 を GC/MS 、
又 は HPLC で 定 量 で き る 。
ま た 、 本 発 明 で は 、 配 列 番 号 16、 19、 2 2 、 2 5、 2 8 、 3 1 、 又 は 34 の 塩 基 配 列
と 同 一 性 が 90% 以 上 、 好 ま し くは 95% 以 上 、 よ り好 ま し くは 98% 以 上 の 塩 基
配 列 か らな り、 か つ ア ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 活 性 を 有 す る ポ
リぺ プ チ ドを コ 一 ドす る DNA も 使 用 で き る 。
本 発 明 に お い て 、 塩 基 配 列 の 同 一 性 は 、 GENETYX ver. 8 (GENETYX 株 式 会 社
ゼ ネ テ ィ ッ ク ス 製 ） に よ り算 出 した 値 で あ る 。
配 列 番 号 16、 19、 2 2 、 2 5、 2 8 、 3 1 、 又 は 34 の 塩 基 配 列 か らな る DNA の ホ モ 口
[0022]
グ は 、 例 え ば 、 こ れ らの 塩 基 配 列 に 基 づ き 常 法 に 従 い 設 計 した プ ラ イ マ 一 又
は プ ロ 一 プ を 用 い た PCR 又 は ハ イ プ リダ イ ゼ 一 シ ョ ン に よ り、 他 生 物 種 の DNA
ラ ィ ブ ラ リ一 か ら選 択 す る こ と が で き、 こ れ に よ り高 確 率 で ア ミ ノベ ン ゾ ェ
-
卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 活 性 を 有 す る ポ リべ プ チ ドを コ 一 ドす る DNA が 得 ら
れ る。
[0023]
形 質転 換 の た め のベ ク タ一 の構 築
PCR で 増
幅 した ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 酵 素 を コ 一 ドす る D
NA は 、 そ れ ぞ れ 、 宿 主 で 増 幅 で き る 適 切 な ベ ク タ 一 に ク ロ 一 ニ ン グ す れ ば よ
い。
プ ラ ス ミ ドベ ク タ 一 と して は 、 コ リネ 型 細 菌 内 で 自律 複 製 機 能 を 司 る 遺 伝
子 を 含 む も の で あ れ ば 良 い 。 そ の 具 体 例 と して は 、 プ レ ビパ ク テ リ ゥ 厶 ラ ク
トフ ア ー メ ン タ ム （Brev i bacter
開日
召58 - 67699 〕 、
produc
i ng bacter
M i wa,
i a.
K.
Agr i c .
et
i u m Lactof
a し,
Crypt
B i o し Chem.
ermentum)
ic
2256 由 来 の pAM330
Lasm i d s
48: 2901 -2903
〔
特
i n g lutam i c a c i d ( 1984)
〕 及び
〔
Yamaguch
i,
a し,
et
R.
ce of
the
Brev i bacter
i s of
i t s genet
ic
Determ
i nat i o n o f
i u m Lactof
i nformat
i on.
〕 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
985)
a,
K.
g
ic.
et
a L. ,
Crypt
B i o し Chem.
.,
Ident
a.
App L.
ic
Env i ron.
ermentum
Protop
last
i n g lutam
( 1984)
Lasm i d part
iol.
p Lasm i d DNA.
[0024]
J.
t ransformat
Bacter
i c a c i d-produc
〕 及 び pCRY30
i t i o n funct
5 7 : 759-764
i on
AG5 0
.,
A fam i Ly o f
i on of
( 1991 )
ctors
for
c Lon i ng,
Gene,
102: 93-98
cont
1
(1
express
i ng bacter
[Kurusu,
i a.
Y.
orm
Mi
et
A
aL
bacter
i
[Katsumata,
i ng bacter
R.
ia
et
ith
〕 、 pAG1 、 pAG3 、 pAG14
( 1984)
E i kmanns,
i u m g Lutam i cum/Escher
r o l Led gene
( 1991 )
ana Lys
〕 、 コ リネ バ ク テ リ ウ
g Lutamate-produc
i o し、 15 9 : 306-31
Corynebacter
the
: 265-267
i n corynef
〔
特 開 昭 62-1 66890 〕 、 pEK0 、 pEC5 、 pEKExl
、
i d e sequen
and
Ser.
厶 グ ル タ ミ カ ム T250 由 来 の pCG4 〔
特 開 昭 57-1 83799 〕 、
a L. ,
nuc leot
Lasm i d pAM330
Nuc Le i c Ac i d s Symp.
Lasm i d s
Mi crob
comp lete
ダ ル タ ミ カ ム ATCC1 3058 由 来 の pHM1 5 1 9
48: 2901 -2903
i f i cat i o n o f
the
B. J .
i c h i a c o L i shutt
i on,
and
promoter
et
aL
Le v e
prob i ng 國
〕 な ど が 挙 げ られ る 。
好 ま しい プ ロ モ ー タ 一 と して は 、 コ リ ネ バ ク テ リ ウ 厶
グ ル タ ミ カ ム R由 来
の ダ リセ ル ア ル デ ヒ ド3 - フ ォ ス フ エ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ A 遺 伝 子 （gapA) の プ
口 モ ー タ 一 PgapA 、 マ レ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ 遺 伝 子
mdh 、 ラ ク テ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ A 遺 伝 子
（LdhA)
（mdh)
の プ ロモー タ一P
の プ ロ モ ー タ 一 P LdhA な ど
が 挙 げ ら れ 、 中 で も 、 PgapA が 好 ま しい 。
好 ま しい タ ー ミ ネ ー タ 一 と して は 、 大 腸 菌 rRNA オ ペ ロ ン の r rnB
ミ ネ
一 タ ー 、 大 腸 菌 の t rpA
ァ 一 メ ン タ ム (Brev
i bacter
が 挙 げ ら れ 、 中 で も 、 r rnB
T 1 T2
タ一
タ ー ミ ネ ー タ 一 、 プ レ ビパ ク テ リ ゥ 厶 ラ ク トフ
i u m Lactof
T 1 T2
ermentum)
t r
タ一 ミ不一 タ一 な こ
タ ー ミ ネ ー タ 一 が 好 ま しい 。
2
形 質 転 換 方 法 は 、 公 知 の 方 法 を 制 限 無 く使 用 で き る 。 こ の よ う な 公 知 の 方
法 と して 、 例 え ば 塩 化 カ ル シ ウ ム / 塩 化 ル ビ ジ ウ ム 法 、 リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 法
、 D E A E
— デ キ ス トラ ン 介 在 トラ ン ス フ エ ク シ ヨ ン 、 電 気 穿 孔 法 な ど が 挙
げ られ る。 中 で も、 コ リネ型 細 菌 に は、 電 気 パ ル ス 法 が 好 適 で あ り、 電 気 パ
ソレス ） よ、 公 矢口の 力
i o n system
for
Corynef
i c . B i o し Chem.
sence
.
of
r r-
）:
[Kurusu,
Y.
orm bacter
54:443-447
e t a L. ,
E Lect roporat
i a by auxot roph i c comp Lementat i on.
( 1 990)
〕 及び
and mcr- Li k e rest r i c t i o n systems
es . Mi crob i o l .
144: 18 1 - 18 5
i on-t ransformat
( 1 993)
Ag
〔Vertes A. A. e t a し ， Pre
i n Corynef
orm bacter
ia
〕 に よ り行 う こ とが で き る。
形 質 転 換 体 は、 微 生 物 の 培 養 に通 常 使 用 され る培 地 を用 い て 培 養 す れ ば よ
し、。 こ の 培 地 と して は、 通 常 、 炭 素 源 、 窒 素 源 、 無 機 塩 類 及 び そ の他 の 栄 養
物 質 等 を含 有 す る天 然 培 地 又 は合 成 培 地 等 を用 い る こ とが で き る。
炭 素 源 と して は 、 グ ル コ ー ス 、 フ ル ク 卜一 ス 、 ス ク ロ ー ス 、 マ ン ノ ー ス 、
マ ル ト一 ス 、 マ ン ニ 卜一 ル 、 キ シ ロ ー ス 、 ァ ラ ビ ノ ー ス 、 ガ ラ ク 卜一 ス 、 澱
粉 、 糖 蜜 、 ソル ビ 卜一 ル 、 グ リセ リン等 の糖 質 又 は糖 アル コー ル ；酢 酸 、 ク
ェ ン酸 、 乳 酸 、 フマ ル 酸 、 マ レイ ン酸 又 は ダル コ ン酸 等 の有 機 酸 ；ェ タ ノ一
ル 、 プ ロパ ノー ル 等 の アル コー ル 等 が 挙 げ られ る。 また、 所 望 に よ り ノル マ
ル パ ラ フ ィ ン 等 の炭 化 水 素 等 も用 い る こ とが で き る。 炭 素 源 は、 1 種 を単 独
で使 用 で き、 又 は 2 種 以 上 を混 合 して使 用 して も よ い。 培 地 中 の これ ら炭 素
源 の濃 度 は、 通 常 、 約 0 . 1~ 10 (w/
v %)
とす れ ば よ い。
窒 素 源 と して は、 塩 化 ア ンモ ニ ゥ厶、 硫 酸 ア ンモ ニ ゥ厶、 硝 酸 ア ンモ ニ ゥ
厶 、 酢酸 ア ン モ ニ ゥ 厶 等 の 無機 又 は 有機 ア ン モ ニ ゥ 厶 化 合物 、 尿 素、 ア ン モ
ニ ァ水 、 硝 酸 ナ トリウム、 硝 酸 カ リウム 等 が 挙 げ られ る。 また、 コー ンス テ
ィ一 プ リカ 一、 肉 エ キ ス、 ペ プ トン、 NZ — ァ ミ ン、 蛋 白質 加 水 分 解 物 、 ア ミ
ノ酸 等 の 含 窒 素 有 機 化 合 物 等 も使 用 で き る。 窒 素 源 は、 1 種 を単 独 で使 用 し
て も よ く、 また 2 種 以 上 を混 合 して使 用 して も よ い。 培 地 中 の窒 素 源 濃 度 は
、 使 用 す る窒 素 化 合 物 に よ って も異 な る が、 通 常 、 約 0 . 1~ 10 (w/
v %)
と
す れ ば よ い。
無 機 塩 類 と して は、 例 え ば リン酸 第 一 カ リウム、 リン酸 第 二 カ リウム、 硫
酸 マ グ ネ シ ウム、 塩 化 ナ トリウム、 硝 酸 第 一 鉄 、 硫 酸 マ ン ガ ン、 硫 酸 亜 鉛 、
硫 酸 コバ ル ト、 又 は炭 酸 カル シ ウム 等 が 挙 げ られ る。 これ ら無 機 塩 は、 1 種
を 単 独 で 使 用 して も よ く、 ま た 2 種 以 上 を 混 合 して 使 用 して も よ い 。 培 地 中 の
無 機 塩 類 濃 度 は 、 使 用 す る 無 機 塩 に よ っ て も異 な る が 、 通 常 、 約 0 . 0 1 ~ 1 ( w
/
v
)
とす れ ば よ い。
栄 養 物 質 と して は 、 例 え ば 肉 エ キ ス 、 ペ プ トン、 ポ リペ プ トン、 酵 母 ェ キ
ス 、 乾 燥 酵 母 、 コ 一 ン ス テ ィ一 プ リカ 一 、 脱 脂 粉 乳 、 脱 脂 大 豆 塩 酸 加 水 分 解
物 、 又 は 動 植 物 若 し くは 微 生 物 菌 体 の エ キ ス や そ れ らの 分 解 物 等 が 挙 げ られ
る。 栄 養 物 質 の 培 地 濃 度 は 、 使 用 す る 栄 養 物 質 に よ っ て も異 な る が 、 通 常 、
約 0 . 1~ 10 (w/
v % )
と す れ ば よ い 。 さ ら に、 必 要 に 応 じて 、 ビ タ ミ ン類 を
添 加 す る こ と も で き る。 ビ タ ミ ン類 と して は 、 例 え ば 、 ビ才 チ ン、 チ ア ミ ン
、 パ ン トテ ン 酸 、 イ ノ シ 卜一
( ビ タ ミ ン B 1 ) 、 ピ リ ドキ シ ン （ビ タ ミ ン B6)
ル 、 ニ コ チ ン酸 等 が 挙 げ られ る。
培 地 の p H は 約 5~8 が 好 ま しい 。
好 ま しい 微 生 物 培 養 培 地 と して は 、 A 培 地 〔Inu i ,
[0027]
M.
e t a L. ,
na Lys i s o f Corynebacter
i u m g Lutam i cum dur i ng Lactate
oduct
depr i vat i o n cond i t i ons.
i ons
techno
cter
under
し 7 : 182-1 9 6 (2004)
ATP - dependent
regu lat i on.
and succ i nate
J . Mo し Mi crob i o l .
〕 、 BT 培 地 [Omumasaba,
i u m g Lutam i cum g Lycera Ldehyde-3-phosphate
i t h oppos i te,
L.
oxygen
Metabo l i c a
C. A.
Bi o
e t a し ， Coryneba
dehydrogenase
J . Mo L.
pr
Mi crob i o l .
i soforms
B i otechno
8 : 9 1 - 103 (2004) 〕 等 が 挙 げ られ る。
培 養 温 度 は 約 15~45 °C と す れ ば よ く、 培 養 時 間 は 約 1~ 7 日 間 と す れ ば よ い
[0028]
( I I ) ァニ リンの製造方法
上 記 説 明 した 本 発 明 の 形 質 転 換 体 を、 ァ ミ ノ安 息 香 酸 、 そ の 塩 、 及 び / 又
は そ の エ ス テ ル を 含 有 す る 反 応 液 中 で 反 応 さ せ る 工 程 と、 反 応 液 中 の ァ ニ リ
ン を 回 収 す る 工 程 と を 含 む 方 法 に よ り ァ ニ リ ン を製 造 す る こ と が で き る。
㈱ まゆ のほ 歹
直
反 応 に 先 立 ち 、 形 質 転 換 体 を 好 気 条 件 下 で 、 温 度 約 25~35
時 間 培 養 して 増 殖 さ せ る こ と が 好 ま しい 。
°C で 、 約 12~48
[0029]
培善 用培地
反応 に先立 つ形 質転換 体 の好気 的培養 に用 い る培地 は、炭 素源、窒 素源、
無機 塩類 お よび その他 の栄養物 質等 を含有 す る天然培地 また は合成 培地 を用
い る ことがで きる。
炭 素源 と して、糖類 （グル コー ス、 フル ク 卜一 ス、 マ ンノー ス、 キシ 口一
ス、 ァラ ビノー ス、 ガラ ク 卜一 スの よ うな単糖 ；ス ク ロー ス、 マル ト一 ス、
ラ ク 卜一 ス、 セ ロ ビオ ー ス、 キシ ロ ビ才 一 ス、 トレハ ロー スの よ うな二糖 ；
澱粉 の よ うな多糖 ；糖 蜜等 ）、 マ ンニ 卜一ル、 ソル ビ 卜一ル、 キシ リ 卜一ル
、 グ リセ リンの よ うな糖 アル コール ；酢酸、 クェ ン酵、 乳酸、 フマル酸、 マ
レイ ン酸、 ダル コ ン酸 の よ うな有機 酸 ；エ タ ノール、 プ ロパ ノール の よ うな
アル コール ；ノル マルパ ラ フ ィンの よ うな炭 化水素等 も用 い る ことがで きる
炭 素源 は、 1 種 を単独 で、 又 は 2 種 以上 を混合 して使 用 で きる。
[0030]
窒 素源 と して は、塩 化 ア ンモニ ゥ厶、硫酸 ア ンモニ ゥ厶、硝酸 ア ンモニ ゥ
厶、 酢酸 ア ンモニ ゥ厶の よ うな無機 又 は有機 ア ンモニ ゥ厶化合物、 尿素、 ァ
ンモニ ァ水、硝酸 ナ トリウム、硝酸 カ リウム等 を使 用 で きる。 また、 コー ン
ステ ィ一 プ リカ一、 肉エ キス、 ペ プ トン、 NZ —ァ ミン、 蛋 白質加水分解物、
ア ミノ酸 等 の含窒 素有機 化合物 等 も使 用 で きる。窒 素源 は、 1 種 を単独 で、
又 は 2 種 以上 を混合 して使 用 で きる。窒 素源 の培地 中の濃度 は、使 用 す る窒
素化合物 によ って も異 な るが、 通 常、 約 0. 1~ 10 (w/
v % ) とすれ ば よし
、
。
無機 塩類 と して は、 リン酸 第一 カ リウム、 リン酸 第二 カ リウム、硫酸 マ グ
ネシ ゥ厶、塩 化 ナ トリウム、硝酸 第一鉄、硫酸 マ ンガ ン、硫酸 亜鉛、硫酸 コ
ノくル
卜、炭酸 カル シ ウム等 が挙 げ られ る。 無機 塩 は、 1 種 を単独 で、 又 は 2
種 以上 を混合 して使 用 で きる。 無機 塩類 の培地 中の濃度 は、使 用 す る無機 塩
によ って も異 な るが、 通 常、 約 0. 0 1 ~ 1 (w/v%)
[0031 ]
とすれ ば よい。
栄養物 質 と して は、 肉エ キス、 ペ プ トン、 ポ リペ プ トン、 酵母 エ キス、乾
燥 酵母、 コー ンステ ィー プ リカ一、脱脂粉 乳、脱脂 大豆塩酸 加水分解物、 動
植物 又 は微 生物菌 体 のエ キスや それ らの分解物 等 が挙 げ られ る。 栄養物 質 の
培 地 中 の 濃 度 は 、 使 用 す る 栄 養 物 質 に よ っ て も異 な る が 、 通 常 約 0 . 1~ 10 ( w
/
v
)
とす れ ば よ い。
さ ら に、 必 要 に 応 じて 、 ビ タ ミ ン類 を 添 加 す る こ と も で き る。 ビ タ ミ ン類
と して は 、 ビ才 チ ン、 チ ア ミ ン （ビ タ ミ ン B 1 ) 、 ピ リ ドキ シ ン （ビ タ ミ ン B6
) 、 パ ン トテ ン 酸 、 イ ノ シ 卜一 ル 、 ニ コ チ ン 酸 等 が 挙 げ られ る。
培 地 の p H は 約 6~8 が 好 ま しい 。
具 体 的 な 好 ま しい コ リネ 型 細 菌 用 培 地 と して は 、 A 培 地 〔Inu i ,
[0032]
Metabo L i c ana lys i s o f
succ i nate
product
i ons
crob i o L.
B i otechno
L.
し, Corynebacter
s e i soforms
L.
B i otechno
Corynebacter
under
oxygen
depr i vat i o n cond i t i ons.
Ldehyde-3-phosphate
ATP- dependent
8 : 9 1 - 103 (2004)
J.
〕 、 BT 培 地 [Omumasaba,
i u m g Lutam i cum g Lycera
L.
et
i u m g Lutam i cum dur i ng Lactate
7 : 182-1 9 6 (2004)
i t h oppos i te,
M.
regu lat i on.
Mo
C. A.
a L. ,
and
し Mi
et
a
dehydrogena
J.
Mo L.
Mi crob i o
〕 等 が 挙 げ られ る。 これ らの 培 地 に お い て
、 糖 類 濃 度 を 上 記 範 囲 に して 用 い れ ば よ い 。
[0033]
ほ碰
反 応 液 は 、 ァ ニ リ ン 前 駆 体 （ァ ニ リ ン 原 料 ） を 含 有 す る 水 、 緩 衝 液 、 無 機
塩 培 地 な ど を 用 い る こ と が で き る。
前 駆 体 と して は 、 ァ ミ ノ安 息 香 酸 、 そ の 塩 、 及 び / 又 は そ の エ ス テ ル を 用
い る こ と が で き る。 ァ ミ ノ安 息 香 酸 と して は 、 2 - ァ ミ ノ安 息 香 酸 （
0 - ア ミ ノ安
息 香 酸 ；ア ン トラ ニ ル 酸 ）、 3 - ァ ミ ノ 安 息 香 酸
（m- ァ
ミ ノ 安 息 香 酸 ）、 4 - ァ ミ ノ
安 息 香 酸 （P- ァ ミ ノ安 息 香 酸 ）の 何 れ も使 用 で き る。 中 で も、 水 溶 性 で あ る た
め 反 応 に使 用 し易 い 点 で 、 2 - ァ ミ ノ安 息 香 酸 、 4 - ァ ミ ノ安 息 香 酸 が 好 ま しい
塩 と して は 、 ナ トリウ ム 塩 、 カ リウ ム 塩 、 塩 酸 塩 な ど が 挙 げ られ る。 ま た
、 エ ス テ ル と して は 、 炭 素 数 1 ~ 4 の ア ル コ ー ル と の エ ス テ ル な ど が 挙 げ ら
れ る。
反 応 液 へ の 溶 解 度 が 高 くな る 点 で 、 塩 が 好 ま しい 。 前 駆 体 は 、 1 種 を 単 独
で 、 又 は 2 種 以 上 を 混 合 して 使 用 で き る。
反 応 液 中 の ア ミ ノ安 息 香 酸 、 そ の 塩 、 及 び / 又 は そ の エ ス テ ル の 濃 度 は 、
約 0 . 1~ 10 (w/v%)
が 好 ま し く、 約 0 . 5~7
(w/v%)
が よ り好 ま し く、 約 0 . 5
が さ ら に よ り好 ま しい 。 上 記 範 囲 で あ れ ば 、 効 率 良 く、 ァ ニ リ
~ 5 (w/v%)
ン を製 造 で き る。
緩 衝 液 と して は 、 リ ン酸 バ ッ フ ァ一 、 卜リス バ フ ァ 一 、 炭 酸 バ ッ フ ァ一 な
ど が 挙 げ られ る。 緩 衝 液 の 濃 度 は 、 約 10~1 5 0
mM が 好
ま しい 。
無 機 塩 培 地 と して は 、 リ ン酸 第 一 カ リウ ム 、 リ ン酸 第 二 カ リウ ム 、 硫 酸 マ
グ ネ シ ゥ 厶 、 塩 化 ナ トリウ ム 、 硝 酸 第 一 鉄 、 硫 酸 マ ン ガ ン、 硫 酸 亜 鉛 、 硫 酸
コバ ル 卜、 炭 酸 カ ル シ ウ ム 等 の 無 機 塩 の 1 種 又 は 2 種 以 上 を 含 む 培 地 が 挙 げ
られ る。 中 で も、 硫 酸 マ グ ネ シ ウ ム を 含 む 培 地 が 好 ま しい 。 無 機 塩 培 地 と し
て 、 具 体 的 に は 、 BT±¾±fe [Omumasaba,
mi cum g Lycera Ldehyde-3-phosphate
, ATP - dependent
regu lat i on.
C. A.
e t a L. ,
dehydrogenase
J . Mo L.
Mi crob i o l .
Corynebacter
i soforms
B i otechno
i u m g Luta
i t h oppos i t e
L.
8 : 9 1 - 103 (
2004) 〕 等 が 挙 げ られ る。 無 機 塩 類 の 培 地 中 の 濃 度 は 、 使 用 す る 無 機 塩 に よ つ
て も異 な る が 、 通 常 、 約 0 . 0 1 ~ 1 (w/
v % )
とす れ ば よ い。
反 応 液 の P H は 約 6~8 が 好 ま しい 。 反 応 中 は 、 ア ン モ ニ ア 水 溶 液 、 水 酸 化
ナ トリゥ 厶 水 溶 液 な ど を 用 い て 、 p H コ ン 卜ロ ー ラ 一 （
例 え ば 、 エ イ プル 株
式 会 社 製 、 型 式 ：DT-1 023)
で、 反 応 液 の p H を 中性 付 近 、 特 に約 7 に コ ン ト
ロ ー ル しな が ら反 応 さ せ る こ と が 好 ま しい 。
反ま、 牛
反 応 温 度 、 即 ち 反 応 中 の 形 質 転 換 体 の 生 存 温 度 は 、 約 20~40
、 約 25~35
°C が 好 ま し く
°C が よ り好 ま しい 。 上 記 温 度 範 囲 で あ れ ば 、 効 率 良 くァ ニ リ ン を
製 造 で き る。
ま た 、 反 応 時 間 は 、 約 1~ 7 日 間 が 好 ま し く、 約 1~ 3 日 間 が よ り好 ま しい 。
培 養 は 、 バ ッチ 式 、 流 加 式 、 連 続 式 の 何 れ で も よ い 。 中 で も、 バ ッチ 式 が
好 ま しい 。
< 還元条件>
反 応 は 、 好 気 的 条 件 で 行 っ て も よ く、 還 元 条 件 で 行 っ て も よ い が 、 還 元 条
件 で 行 う こ と が 好 ま しい 。 還 元 条 件 で は 、 コ リネ 型 細 菌 は 実 質 的 に 増 殖 せ ず
、 一 層 効 率 的 に ァ ニ リン を 生 産 さ せ る こ とが で き る。
還 元 条 件 は、 反 応 液 の 酸 化 還 元 電 位 で 規 定 さ れ る。 反 応 液 の 酸 化 還 元 電 位
は 、 約 一 200 mV~ -500
mV が 好
ま し く、 約 一 250 mV~ -500
mV が
よ り好 ま し
い。
反 応 液 の 還 元 状 態 は 簡 便 に は レサ ズ リ ン指 示 薬 （
還 元 状 態 で あ れ ば、 青 色
か ら無 色 へ の 脱 色 ） で 推 定 で き る が 、 正 確 に は 酸 化 還 元 電 位 差 計 （
例 え ば、 B
ROADLEY
JAMES 社 製 、 ORP E lect
rodes)
を 用 い て 測 定 で き る。
還 元 条 件 に あ る 反 応 液 の 調 整 方 法 は 、 公 知 の 方 法 を 制 限 な く使 用 で き る 。
例 え ば 、 反 応 液 調 製 用 の 液 体 媒 体 と して 、 蒸 留 水 な ど の 代 わ り に 反 応 液 用 水
溶 液 を 使 用 して も よ く、 反 応 液 用 水 溶 液 の 調 整 方 法 は 、 例 え ば 硫 酸 還 元 微 生
物 な ど の 絶 対 嫌 気 性 微 生 物 用 の 培 養 液 調 整 方 法 （Pfenn i g , N. e t a L.
)
：The d i s s i mi Latory
A Handbook
By Star r ,
化学実験書
s u Lf ate-reduc
o n Hab i tats,
M. P.
et
i ng bacter
Iso Lat i o n and
a し p926-940,
Ident
Ber l i n ,
第三巻、 京都 大学 農学部
i a,
I n The
i f i cat i o n o f
Spr i nger
( 1981
Prokaryotes,
Bacter
Ver Lag.
i a,
Ed.
) や 「
農芸
農 芸 化 学 教 室 編 、 1990 年 第 2 6 刷 、 産
業 図 書 株 式 会 社 出 版 」 な ど が 参 考 と な り、 所 望 す る 還 元 条 件 下 の 水 溶 液 を 得
る こ とが で き る。
具 体 的 に は 、 蒸 留 水 な ど を 加 熱 処 理 や 減 圧 処 理 して 溶 解 ガ ス を 除 去 す る こ
と に よ り、 還 元 条 件 の 反 応 液 用 水 溶 液 を 得 る こ と が で き る 。 こ の 場 合 、 約 10
mmHg 以
下 、 好 ま し くは 約 5
mmHg 以
下 、 よ り好 ま し くは 約 3
で 、 約 1~60 分 程 度 、 好 ま し くは 約 5~40
mmHg 以
下 の減 圧 下
分 程 度 、 蒸 留 水 な ど を処 理 す る こ と
に よ り、 溶 解 ガ ス 、 特 に 溶 解 酸 素 を 除 去 して 還 元 条 件 下 の 反 応 液 用 水 溶 液 を
作 成 す る こ とが で き る。
また、 適 当 な還 元 剤 （
例 え ば、 チ 才 グ リ コ ー ル 酸 、 ァ ス コ ル ビ ン酸 、 シ ス
テ ィ ン塩 酸 塩 、 メ ル カ プ ト酢 酸 、 チ 才 一 ル 酢 酸 、 ダ ル タ チ オ ン、 硫 化 ソ 一 ダ
等 ） を 添 加 して 還 元 条 件 の 反 応 液 用 水 溶 液 を 調 整 す る こ と も で き る 。
こ れ らの 方 法 を 適 宜 組 み 合 わ せ る こ と も 有 効 な 還 元 条 件 の 反 応 液 用 水 溶 液
の 調 整 方 法 で あ る。
[0036]
反 応 中 も 反 応 液 を 還 元 条 件 に 維 持 す る こ と が 好 ま しい 。 反 応 途 中 で の 還 元
条 件 を維 持 す る た め に、 反 応 系 外 か らの 酸 素 の 混 入 を 可 能 な 限 り防 止 す る こ
と が 望 ま し く、 具 体 的 に は 、 反 応 系 を 窒 素 ガ ス 等 の 不 活 性 ガ ス や 炭 酸 ガ ス 等
で 封 入 す る 方 法 が 挙 げ られ る 。 酸 素 混 入 を よ り効 果 的 に 防 止 す る 方 法 と して
は 、 反 応 途 中 に お い て 本 発 明 の 好 気 性 細 菌 の 菌 体 内 の 代 謝 機 能 を 効 率 よ く機
能 さ せ る た め に、 反 応 系 の p H 維 持 調 整 液 の 添 加 や 各 種 栄 養 素 溶 解 液 を適 宜
添 加 す る 必 要 が 生 じる 場 合 も あ る が 、 こ の よ う な 場 合 に は 添 加 溶 液 か ら酸 素
を 予 め 除 去 して お く こ と が 有 効 で あ る 。
[0037]
ァ ニ リンの 回収
上 記 の よ う に して 培 養 す る こ と に よ り、 反 応 液 中 に ァ ニ リ ン が 生 産 さ れ る
。 反 応 液 を 回 収 す る こ と に よ りァ ニ リン を 回 収 で き る が 、 さ らに、 公 知 の 方
法 で ァ ニ リ ン を 反 応 液 か ら分 離 す る こ と も で き る 。 そ の よ う な 公 知 の 方 法 と
して 、 蒸 留 法 、 膜 透 過 法 、 有 機 溶 媒 抽 出 法 等 が 挙 げ られ る 。
実施例
[0038]
以 下 、 本 発 明 を 実 施 例 に よ り詳 細 に 説 明 す る が 、 本 発 明 は こ れ ら の 実 施 例
に 限 定 され る も の で は な い。
施例 1
ァ ニ リ ン生 産 遣 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ と発 現
( 1) 微 生 物 か ら の 染 色 体 DNA の 抽 出
バ チ ル ス サ プ チ リス (Bac i L Lus subt i L i s ) NBRC 141 4 4 か ら の 染 色 体 DNA 抽
出 は 、 NBRC Med i u m No. 802 培 地 [po Lypeptone
S0 4 - 7 H20 1 g を 蒸 留 水 1 L に 溶 解 ]
10 g ,
yeast
ext ract
2 g,
Mg
に、 白金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 対 数 増 殖 期 ま
で 3 7 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ ト（
商 品 名 ：Genom i c
Prep
Ce L Ls and
T i ssue
DNA Iso lat
i on K i t
ア マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取
扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
[0039]
ラ ク 卜バ チ ル ス ラ ム ノ 一 サ ス （Lactobac は Lus rhamnosus)
の 染 色 体 DNA 抽 出 は 、 NBRC Med i u m No. 804 培 地 [po Lypeptone
ract
5 g,
g lucose
5 g,
MgS0 4 - 7 H20 1 g を 蒸 留 水 1 L に 溶 解 ]
NBRC 3425 か ら
5 g,
yeast
ext
に、 白金 耳 を
用 い て 植 菌 後 、 対 数 増 殖 期 ま で 3 0 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム
抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i cPrep
Ce L Ls and
T i ssue
DNA Iso lat
ァ
i on K i t
マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回
リ
又した 。
ラ ク 卜バ チ ラ ス プ レ ビ ス （Lactobac は Lus b r e i s ) ATCC 367 か らの 染 色 体
[0040]
DNA 抽 出 は 、
Lactobac
MRS broth
( べ ク トン ' デ ィ ッ キ ン ソ ン社 製
BD
に 、 白 金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 対 数 増 殖 期 ま で 3 0 °C で 振 盪 培 養 し、 菌
2881 30)
体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i cPrep
DNA Iso lat
i on K i t
Ce L Ls and
T i ssue
ア マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た
菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ （Pseudomonas put i d a KT2440)
[0041 ]
染 色 体 DNA 抽 出 は 、 LB培 地 [ t ryptone
蒸 留 水 1 L に溶 解 ]
10 g ,
yeast
ATCC 47054 か らの
ext ract
NaC L 5 g を
5 g,
に 、 白 金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 対 数 増 殖 期 ま で 3 7 °C で 振 盪 培
養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i cPrep
T i ssue
DNA Iso lat
i on K i t
Ce L Ls and
ア マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い
、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
ェ シ エ リキ ア コ リ (Escher
[0042]
出 は 、 LB培 地 [ t ryptone
溶解]
か らの 染 色 体 DNA 抽
i c h i a c o L i K-1 2 MG1 655)
10 g ,
yeast
ext ract
5 g,
NaC L 5 g を 蒸 留 水 1 しに
に 、 白 金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 対 数 増 殖 期 ま で 3 7 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体
を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i cPrep
A Iso lat i o n K i t
Ce L Ls and
T i ssue
DN
ア マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌
体 か ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
サ ッ カ ロ マ イ セ ス セ レ ピ シ ェ （Saccharomyces
[0043]
cerev
i s i ae)
らの 染 色 体 DNA 抽 出 は 、 NBRC Med i u m No. 108 培 地 [ g lucose
g,
yeast
ext ract
3 g,
ma Lt
ext ract
NBRC 1021 7 か
10 g ,
3 g を 蒸 留 水 1 L に 溶 角？]
peptone
5
に、 白金 耳 を
用 い て 植 菌 後 、 対 数 増 殖 期 ま で 24 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム
抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i cPrep
Ce L Ls and
T i ssue
DNA Iso lat
i on K i t
ァ
マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回
リ
又した 。
ェ ンテ ロバ ク タ 一 ク ロ ァ カ ェ
[0044]
（En t e r obac t e r
c l oacae)
NBRC 13535
染 色 体 DNA 抽 出 は 、 NBRC Med i u m No. 802 培 地 [ p o Lypept one
ac t
2 g,
MgS0 4 - 7 H2 0
1 g
10 g ,
か らの
yeas t
ex t r
を 蒸 留 水 1 L に溶 解 ] に、 白金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、
対 数 増 殖 期 ま で 3 7 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ ト（
商
品 名 ：Genom i c P r e p Ce L Ls and
T i ssue
アマ シ ャム社 製 ）
DNA I s o l a t i o n K i t
を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
[0045]
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 の 構 築
(2)
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 PCRB22 の 構 築
コ リネ バ ク テ リゥ 厶
カ ゼ ィ JCM 12072 由 来 の プ ラ ス ミ ドpCASE I の DNA 複 製
起点 （
以 降 、 pCASE 1- o r i と記 す ） 配 列 、 及 び ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pHSG298
(
タ カ ラ バ ィ 才 株 式 会 社 製 ） を そ れ ぞ れ 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅
した 。
PCR に 際
して 、 pCASE 1- o r i 配 列 、 ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pHSG298 を そ れ ぞ れ
ク ロ ー ン化 す る べ く、 配 列 番 号 1 ( pCASE 1- o r i 配 列 ） 、 配 列 番 号 2 ( ク ロ 一 二
ン グベ ク タ ―
— p H SG298)
を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を 合 成 し
、 使 用 した 。
[0046]
pCASE 1- o
i
配 列増 幅 用 プライマ 一
(a- 1 )
； 5'
-
AT AGATCT
AGAACGTCCGTAGGAGC
(b- 1 )
； 5'
-
AT AGATCT
GACTTGGTTACGATGGAC
(配 列番 号3 )
-3'
(配 列番 号4 )
-3'
尚 、 プ ラ イ マ 一 （a- 1 ) 及 び （b- 1 ) に は 、 Bg LI I 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い
る。
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 PHSG298 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-2)
； 5'
-
AT AGATCT
AGGTTTCCCGACTGGAAAG
(b-2)
； 5'
-
AT AGATCT
CGTGCCAGCTGCATTAATGA
-3'
-3'
(配 列番 号 5)
(配 列番 号 6)
尚 、 プ ラ イ マ 一 （a-2) 及 び （b-2) に は 、 Bg LI I 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い
る。
[0047]
錶 型 DNA は 、 J apan.
Co L Le c t i o n o f
M i c r o o rgan
i sms
(JCM)
よ り入 手 した コ
リネバ クテ リゥ厶
カ ゼ ィ JCM 12072 か ら抽 出 した 卜一 タル DNA 及 び ク ロ一 二
ン グベ ク タ 一 PHSG298
( タ カ ラバ イ オ 株 式 会 社 製 ） を用 い た
実 際 の PCR は、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR Sys t e m 9700 (
バ イ オ シ ス テ ム ズ社 製 ）を用 い、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
LA Taq
ア プライ ド
( タ カ ラバ
ィ 才 株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
[0048]
反応 液 ：
TaKaRa
L A Taq  (5 u n i ts/
10 X LA PCR  Buffer
I I
.
I)
(Mg 2+
f r ee)
5バ
MgC I
25
5な
dNTP Mi xture
錶型
(2. 5mM each)
(DNA
DNA
上 記 記 載 の 2 種 プライ マ 一 り
各 々0 . 5
滅 菌蒸 留 水
含有量
以 下）
(最 終 濃度
25. 5 / /
以上 を混 合 し、 この 5 0 パ 1 の反応 液 を PCR にか けた 。
* ) pGASE1 -or
i
配 列 を増幅 す る場 合 は プライマー
（a-1 )
と
（b-1 )
の組み 合 わ
せ 、ク ロー ニ ン グベ ク ター PHSG298 を増 幅 す る場 合 は プライ マー （a-2) と （b-2)
の組 み 合 わ せ で行 った 。
[0049]
PCR
サ イ クル ：
デナ チ ユ レ一 シ ヨ ン 過 程
：9 4 °C
60
秒
ア ニー リング過 程
：5 2 °C
60
秒
エ クス テ ンシ ョン過 程
：7 2 °C
15 0
秒
18 0
秒
pCASE1 -or
i
配列
ク ロ一 ニ ン グベ ク タ一 PHSG298
以上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル 行 った 。
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
L を 0 . 8 % ァ ガ ロー ス ゲ ル
pCASE 1- o r i 配 列 の 場 合 約 1 . 4-kb
7-kb
、 ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 pHSG298 の 場 合 、 約 2 .
の DNA 断 片 が検 出 で きた。
上 記 の PCR に よ り増 幅 した コ リネパ クテ リゥ厶
[0050]
pCASE 1- o
8
に よ り電 気 泳 動 を行 い、
i 配 列 含 む 約 1 . 4-kb
を含 む 約 2 . 7-kb
DNA 断 片 10
DNA 断 片 10
L及 び
カ ゼ ィ株 由来 の プ ラ ス ミ ド
ク ロ一 ニ ン グベ ク タ - pHSG29
を各 々制 限 酵 素 Bg LI I で切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処
理 させ る こ と に よ り制 限 酵 素 を失 活 させ た後 、 両 者 を混 合 し、 これ に T4 DNA
リガ 一 ゼ 10 X 緩 衝 液
、 T4 DNA リガ 一 ゼ
（タ カ ラバ イ オ 株 式 会 社 製 ） 1
un i t
に して 、 15 °C で 3 時 間 反 応 さ せ
の 各 成 分 を添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で 10
、 結 合 さ せ た 。 これ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ンA 液 と した 。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ンA 液 を、 塩 化 カル シ ウ ム 法
B i o Logy,
53,
15 9
カ ナ マ イ シ ン5 0
ス、 0 .
5%
( 1970
〔J
o u r na L o f
Mo Lecu La r
) 〕 に よ りェ シ エ リ ヒア コ リJ M10 9 を形 質 転 換 し、
g/m L を含 む L B 寒 天 培 地
塩 化 ナ トリウ ム 、 お よ び 1 .
5%
〔1
%
ポ リペ プ トン、 0 .
5%
酵母 ェキ
寒 天 〕 に塗 布 した 。
培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り プ ラ ス ミ ドDNA を抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 Bg LI I で そ れ ぞ れ 切 断 し、 揷 入 断 片 を確 認 した 。 こ
の 結 果 、 ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 PHSG298 約 2 . 7-kb の DNA 断 片 に加 え、 pCASE-o r i
配 列 の 約 1 . 4-kb
pCASE 1- o r i
[005 1 ]
DNA 断 片 が 認 め
られ た 。
配 列 を含 む ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 を pCRB22 と命 名 した 。
ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 ！
3CRB207 の 構 築
コ リネ バ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム R 由 来 の ダ リセ ル アル デ ヒ ド3 リン酸 デ ヒ
ドロケ ナ 一 セ ( g Lyce
apA
a Ldehyde-3-phosphat
e dehyd
ogenase)
を コ 一 ドす る g
遺 伝 子 の プ ロモ ー タ一配 列 （
以 降 、 PgapA と記 す ） を含 む DNA 断 片、 及 び ク
ロー ニ ン グべ ク タ 一 PKK223-3
( フ アル マ シ ア社 製 ） 由 来 r r nBT 1T 2 双 方 向 タ 一
ミネ 一 タ一配 列 （
以 降 、 タ ー ミ ネ ー タ — 配 列 と記 す ） を含 む DNA 断 片 を以 下 の
方 法 に よ り増 幅 した 。
PCR に 際
して 、 PgapA 配 列 及 び タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 を そ れ ぞ れ ク ロー ン化 す
るべ く、 配 列 番 号 7 (PgapA 配 列 ） 、 配 列 番 号 8 ( タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 ） を基 に
、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を合 成 し、 使 用 した 。
[0052]
PgapA
配 列増 幅 用 プライマ 一
(a-3)
； 5'
-
CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG
(b-3)
； 5'
-
CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG
-3'
(配 列番 号 9)
-3'
( 配 列 番 号 10 )
尚、 プ ラ イ マ 一 （a-3) に は、 Sa LI 制 限 酵 素 部 位 が 、 プ ラ イ マ 一 （b-3) に は
、 Sa LI
BamH I
及 び Nco l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い る。
ター ミネ ー タ一配 列増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-4)
；
5' - CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3'
( 配 列 番 号 11)
(b-4)
；
5' - CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG - 3
( 配 列 番 号 12)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-4)
b-4)
[0053]
に は 、 Sphl 及 び Ncol 制 限 酵 素 部 位 が 、 プ ラ イ マ 一 （
に は 、 Sphl 及 び BspHI 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い る
錶 型 DNA は 、
リネ バ ク テ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム R (FERM P-1 8976) か ら抽 出
した 染 色 体 DNA 及 び PKK223-3 プ ラ ス ミ ド （フ アル マ シ ア社 製 ） を 用 い た 。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp PCR System
9700( ア プ ラ イ ド
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa LA Taq ( タ カ ラ バ
ィ 才 株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
[ 0054 ]
反応 液 ：
TaKaRa LA Taq  (5 un i ts/
0X LA PCR  Buffer
I)
0. 5 〃
µ
I I ( g 2+ free)
25mM MgCI 2
dNTP Mi xture
錶型
(2.
5m
each)
5
DNA
上 記 記 載 の 2 種 プライ マ一め
各 々0 . 5 〃
滅 菌 蒸 留水
以 上 を混 合 し、 この 50
(DNA 含 有 量
(最 終 濃 度
1お g 以 下 ）
1ぉ
1)
25. 5 な
l の反応液 を
PCR
に か けた 。
* ) PgapA 配 列 を増 幅 す る場 合 は プ ラ イ マー (a-7) と （
b-7) の 組 み 合 わ せ 、 ター
ミネ ー タ ー 配 列 を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ ー （
a -8)
と （
b-8)
の組 み 合 わ せ で
行 った 。
[0055]
PCR
サ イ クル ：
デ ナ チ ュ レー シ ヨン過
94 。C
60 秒
ァ ニー リング過 程
52 °C
60 秒
ェ ク ス テ ン シ ョ ン過 程
72 °C
PgapA 配 列
45 秒
タ ー ミネ ー タ 一配 列
30 秒
以 上 を 1 サ イ ク ル と し、 30 サ イ ク ル 行 っ た 。
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
Lを 0. 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に よ り電 気 泳 動 を 行 い 、
PgapA 配 列 の 場 合 約 0. 6-kb 、 タ 一 ミ ネ 一 タ 一 配 列 の 場 合 、 約 0. 4-kb の DNA 断 片
が検 出 で きた。
上 記 の PCR に よ り増 幅 した コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム R 由 来 PgapA 配
[0056]
列 を 含 む 約 0 . 6 -kb DNA 断 片 10
と ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pCRB22 約 4 . 1-kb を 各
々 制 限 酵 素 Sa LI で 切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処 理 さ せ る こ と に よ り制 限 酵 素 を 失 活
さ せ た 後 、 両 者 を 混 合 し、 こ れ に T4 DNA リガ 一 ゼ 1 0 X 緩 衝 液 1 从 し T4 DNA リ
ガーゼ
（タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 製 ） 1 u n i t の 各 成 分 を 添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水
で
に して 、 1 5 °C で 3 時 間 反 応 さ せ 、 結 合 さ せ た 。 こ れ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン
B液 と した 。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン B液 を 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
B i o Logy,
〔Journa L o f Mo Lecu Lar
15 9 ( 1970) 〕 に よ りェ シ エ リ ヒ ア コ リJM1 0 9 を 形 質 転 換 し、
53,
カ ナ マ イ シ ン50
g / mL を 含 む L B 寒 天 培 地
〔1%
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1. 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り プ ラ ス ミ ドDNA を 抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 Sa LI で そ れ ぞ れ 切 断 し、 揷 入 断 片 を 確 認 した 。 こ
の 結 果 、 ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pCRB22 約 4 . 1-kb の DNA 断 片 に 加 え 、 PgapA 配 列
) の 約 0 . 6-kb
DNA 断 片 が 認 め られ た 。
PgapA 配 列 を 含 む ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 を pCRB206 と命 名 した 。
[0057]
上 記 PCR に よ り増 幅 した PKK223-3 プ ラ ス ミ ド由 来 タ 一 ミ ネ 一 タ 一 配 列 を 含 む
約 0. 4-kb DNA 断 片 10
ク タ 一 PCRB206
2
を 制 限 酵 素 Ncol 及 び BspHI で 、 上 述 の ク ロ ー ニ ン グ べ
Lを制
限 酵 素 Ncol で 切 断 し、 7 0 °C で 1 0 分 処 理 さ せ る こ と に
よ り制 限 酵 素 を 失 活 さ せ た 後 、 両 者 を 混 合 し、 こ れ に T4 DNA リガ 一 ゼ 1 0 X 緩
衝液
、 T4 DNA リガ 一 ゼ
を 添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で
（タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 製 ） 1 u n i t の 各 成 分
に して 、 1 5 °C で 3 時 間 反 応 さ せ 、 結 合 さ せ た 。
こ れ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン C液 と した 。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン C液 を 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
B i o Logy,
53,
カ ナ マ イ シ ン50
〔Journa L o f Mo Lecu Lar
15 9 ( 1970) 〕 に よ りェ シ エ リ ヒ ア コ リJM1 0 9 を 形 質 転 換 し、
g / mL を 含 む L B 寒 天 培 地
〔1%
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1. 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
培 地 上 の 生 育 株 を常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ りプ ラ ス ミ ドDNA を抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 で切 断 し、 揷 入 断 片 を確 認 した。 この結 果 、 ク ロ
— ニ ン グベ ク タ 一 PCRB206 約 4 . 7-kb の DNA 断 片 に加 え、 タ ー ミネ ー タ 一 配 列 の
約 0 . 4-kb
DNA 断 片 が 認 め
r r nBT 1T2 タ ー
られ た。
ミネ ー タ 一 配 列 を含 む ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 を pCRB207 と命 名
した。
[0058]
ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 PCRB209 の構 築
コ リネ ンくクテ リゥ厶 グル タ ミ カ ム R 由来 の gapA
a t e dehyd r ogenase
A)
( g Lyce r a Ldehyde
3-phosph
遺 伝 子 の プ ロモ ー タ 一 （
以 降 、 PgapA と記 す ） 配 列 を
含 む DNA 断 片 を以 下 の 方 法 に よ り増 幅 した。
PCR に際
して、 pCRB207 配 列 を ク ロ一 ン化 す るべ く、 配 列 番 号 13 ( pCRB207)
を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を合 成 し、 使 用 した。
[0059]
PCRB207
配 列増 幅 用 プライマ 一
(a-5)
； 5 ' - CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG -3'
( 配 列 番 号 14 )
(b-5)
； 5 ' - CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3'
( 配 列 番 号 15 )
尚、 プ ラ イ マ 一 （a-5) 及 び （b-5) に は Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 され て い る
錶 型 DNA は、 gapA プ ロモ ー タ 一 及 び r r nBT 1T2 タ 一 ミネ 一 タ 一 配 列 を含 有 す る
ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 PCRB207 を用 い た。
実 際 の PCR は、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR Sys t e m 9700 (
バ イ オ シ ス テ ム ズ社 製 ）を用 い、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
[0060]
LA Taq
ア プライ ド
(宝酒造株
反応液 ：
TaKaRa
LA Taq  ( 5 u n i ts/
0 X LA PC  Buffer
2 5m
II
が I)
0. 5
(Mg 2+ free)
5バ
MgCI
5バ
dNTP Mi xture
(2. 5 m
each)
8バ
錶 型 DNA
5バ
上記記載 の 2 種 プライマー《
各 々0. 5
(DNA 含 有 量
(最 終 濃 度
1
g 以下)
ま
25. 5
滅菌蒸留水
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0 バ I の 反 応 液 を PCR に か け た 。
*)
pCRB207
配 列 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ ー (a-9)
と （b-9) の 組 み 合 わ せ で 行
つた 。
PCR サ イ ク ル
デ ナ チ ュ レー シ ヨ ン 過 程
9 4 °C
60 秒
ァ ニ ー リング過 程
5 2 °C
60 秒
エ ク ス テ ン シ ョン過 程
7 2 °C
307 秒
以 上 を 1 サ イ ク ル と し、 3 0 サ イ ク ル 行 っ た 。
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
L を 0 . 8 %ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に よ り 電 気 泳 動 を 行 い 、
ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pCRB207 配 列 を 含 む 約 5 . 1-kb の DNA 断 片 が 検 出 で き た 。
上 記 の PCR に よ り増 幅 した pCRB207 由 来 遺 伝 子 を 含 む 約 5 . 1-kb
断 片 10
を 制 限 酵 素 Nde I で 切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処 理 さ せ る こ と に よ り制 限 酵 素 を 失 活
さ せ た 後 、 こ れ に T4 DNA リ ガ 一 ゼ 10 X 緩 衝 液
、 T4 DNA リ ガ 一 ゼ
1 u n i t の 各 成 分 を 添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で 10
酒造株式会社製）
（宝
に して 、 15
°C で 3 時 間 反 応 さ せ 、 結 合 さ せ た 。 こ れ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン D液 と した 。
得 ら れ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン D液 を 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
B i o Logy,
53,
カ ナ マ イ シ ン50
15 9
( 1970) 〕 に よ り ェ シ エ リ ヒ ア
g / m Lを 含 む L B寒 天 培 地
〔1%
〔Journa L o f
Mo Lecu Lar
コ リJM1 0 9 を 形 質 転 換 し、
ポ リペ プ トン 、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1 . 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
こ の 培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り ブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出 、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 Ndel で 切 断 し、 制 限 酵 素 サ イ トの 揷 入 を 確 認
した 。
PgapA 配 列 及 び r r nBT 1T 2 タ 一 ミ ネ 一 タ 一 配 列 を 含 む ク ロ 一 ニ ン グ べ ク タ 一 を
pCRB209
[0063]
と 命 名 した 。
ァ ニ リン生 産 遺 伝 子 の ク ロー ニ ン グ
(3)
バ チ ラ ス サ プ チ リス 由 来 の ァ ニ リ ン 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一 ニ ン グ
バ チ ラ ス サ プ チ リス 由 来 の ァ ミ ノべ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ を コ
ー ドす る bsdBCD
( 以 降 、 dec/BS
と 記 載 ） 遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法
に よ り増 幅 した 。
PCR
に 際 して 、 dec/BS
サ プ チ リ ス dec/BS
アプライ ド
ンセ サ イザ 一
[0064]
遺 伝 子 を ク ロ ー ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 1 6 ( バ チ ラ ス
遺 伝 子 ） を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を、
バ イオ システ ム ズ
（App U e d
B i osys
t ems)
社製
「394 DNA/RNA
シ
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
（syn t hes i z e r )
遺伝 子増 幅 用 プライマ ー
dec/BS
(a-6)
； 5'
-
CTCT
CATATG
AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG
(b-6)
； 5'
-
CTCT
CATATG
GATCAAGCCTTTCGTTCCG
尚、 プ ラ イ マ 一
（a-6)
及び
（b-6)
-3'
( 配 列 番 号 17 )
( 配 列 番 号 18 )
-3'
に は 、 Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
[0065]
ラ ク 卜バ チ ル ス ラ ム ノ 一 サ ス 由 夹 の ァ 二 リ ン 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一 ニ ン グ
ラ ク 卜バ チ ル ス ラ ム ノ 一 サ ス 由 来 の ァ ミ ノ べ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ
— ゼ を コ ー ドす る u b i D X ( 以 降 、 dec/LR
と 記 載 ） 遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下
の PCR 法 に よ り増 幅 した 。
PCR
に 際 して 、 dec/LR
チル ス
ラ ム ノ ー サ ス dec/LR
マ 一 を、 ア プ ラ イ ド
NA/RNA
[0066]
dec/LR
遺 伝 子 を ク ロ 一 ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 1 9 ( ラ ク 卜バ
シ ンセ サ イザ 一
遺 伝 子 ） を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ
バ イオ システ ム ズ
（syn t hes i z e r )
（App U e d
t ems)
社製
「394 D
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
遺伝 子増 幅 用 プライマ ー
(a-7)
； 5'
-
CTCT
CATATG
ACAGCATCACCTTGGG
(b-7)
； 5'
-
CTCT
CATATG
TCATCTTAACGACGCTCCATTC
尚、 プ ラ イ マ 一
い る。
B i osys
（a-7)
及び
（b-7)
( 配 列 番 号 20)
-3'
-3'
(配 列 番 号 2 1)
に は 、 Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
ラ ク 卜バ チ ル ス プ レ ビ ス 由 来 の ァ ニ リ ン 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一 ニ ン グ
[0067]
ラ ク 卜バ チ ル ス プ レ ビ ス 由 来 の ァ ミ ノ べ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ
を コ ー ドす る LVIS
987-LVIS
1 986
( 以 降 、 dec/LB
と 記 載 ) 遺 伝 子 を 含 む DNA
断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅 した 。
PCR
に 際 して 、 dec/LB
チル ス
プ レ ビ ス dec/LB
を、 ア プ ラ イ ド
NA シ
[0068]
（syn t hes i z e r )
社製
「394 DNA/R
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
遺伝 子増 幅 用 プライマ ー
； 5'
(a-8)
遺 伝 子 ） を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一
バ イ オ シ ス テ ム ズ （App U e d B i osys t ems)
ンセ サ イザ 一
dec/LB
遺 伝 子 を ク ロ 一 ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 2 2 ( ラ ク 卜バ
-
CTCT
CATATG
GTAAATGATCCTTATGATTTACGAAAAG
-3'
( 配 列 番 号 23)
； 5'
(b-8)
-
CTCT
尚、 プ ラ イ マ 一
CATATG
（a-8)
CTAATCTCCCTCCCAACG
及び
（b-8)
-3'
( 配 列 番 号 24)
に は 、 Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ 由 夹 の ァ ニ リ ン 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一 ニ ン グ
[0069]
シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ 由 来 の ァ ミ ノ べ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ を
コ ー ドす る u b i D ( 以 降 、 dec/PP
と 記 載 ） 遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法
に よ り増 幅 した 。
PCR
に 際 して 、 dec/PP
モナス
プ チ ダ dec/PP
、 アプライ ド
dec/PP
遺 伝 子 ） を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を
バ イ オ シ ス テ ム ズ （App U e d B i osys t ems)
シ ンセ サ イザ 一
[0070]
遺 伝 子 を ク ロ 一 ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 2 5 ( シ ュ 一 ド
（syn t hes i z e r )
社製
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
遺伝 子増 幅 用 プライマ ー
(a-9)
； 5'
-
CTCT
CATATG
AACGGGCCGGAAC
(b-9)
； 5'
-
CTCT
CATATG
TCAATCATCCACCCCGAAG
尚、 プ ラ イ マ 一
（a-9)
及び
（b-9)
( 配 列 番 号 26)
-3'
-3'
( 配 列 番 号 27)
に は 、 Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
[007
1]
「394 DNA/RNA
ェ シ ェ Iえキ ア コ リ 由 来 の ァ ニ リ ン 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一 ニ ン ク"
ェ シ エ リキ ア
コ リ由 来 の ァ ミ ノべ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ を コ 一
ドす る p u r E K ( 以 降 、 dec/EC
と 記 載 ） 遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ
り増 幅 した 。
PCR
に 際 して 、 dec/EC
キア
コ リdec/EC
プライ ド
(ェ シ エ リ
遺 伝 子 ） を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を、 ァ
バ イオ システムズ
セサ イザ一
[0072]
遺 伝 子 を ク ロ 一 ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 2 8
（App
ed
B i osys
t ems)
社製
「394 DNA/RNA
シン
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
（syn t hes i z e r )
遺伝 子増幅用 プライマ ー
dec/EC
(a-
10 )
； 5'
-
CTCT
CATATG
TCTTCCCGCAATAATCCG
(b-
10 )
； 5'
-
CTCT
CATATG
TTAACCGAACTTACTCTGCGC
尚、 プ ラ イ マ 一
（a- 1 0 )
及び
( 配 列 番 号 29)
-3'
( 配 列 番 号 30)
-3'
に は 、 Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
（b- 1 0 )
て い る。
[0073]
サ ッカ ロマ イ セ ス セ レ ピシ ェ 由夹 の ァ ニ リン生 産 遺 伝 子 の ク ロ一 ニ ン グ
サ ッ カ ロ マ イ セ ス セ レ ピシ ェ 由 来 の ァ ミ ノべ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ
— ゼ を コ ー ドす る ADE2
PCR
( 以 降 、 dec/SC
法 に よ り増 幅 した 。
PCR
に 際 して 、 dec/SC
マイセス
遺 伝 子 を ク ロ 一 ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 3 1 ( サ ッ カ ロ
セ レ ピ シ ェ dec/SC
マ 一 を、 ア プ ラ イ ド
NA/RNA
[0074]
と 記 載 ） 遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の
遺 伝 子 ） を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ
バ イオ システムズ
シ ンセ サ イザ 一
（syn t hes i z e r )
（App
ed
B i osys
社製
t ems)
「394 D
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
遺伝 子増幅用 プライマ ー
dec/SC
(a-
1 1)
； 5'
-
CTCT
CCATGG
ATTCTAGAACAGTTGGTATATTAG
(b-
1 1)
； 5'
-
CTCT
CCATGG
TTACTTGTTTTCTAGATAAGCTTCGTAAC
-3'
( 配 列 番 号 32)
-3'
( 配 列 番 号 33)
尚、 プ ラ イ マ 一
（a- 1 1 )
及び
（b- 1 1 )
に は 、 Nco l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
[0075]
ェ ンテ ロバ ク タ 一
ク ロ ァ カ ェ 由来 の ァ ニ リン生 産 遺 伝 子 の ク ロ一 ニ ン グ
ェ ンテ ロバ ク タ 一
ク ロ ァ カ ェ 由 来 の ァ ミ ノべ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ
— ゼ を コ ー ドす る E C に 04083-EC
に 04082-EC
に 0408 1 ( 以 降 、 dec/ECL
と記 載 ）
遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅 した 。
PCR
に 際 して 、 dec/ECL
ロバ ク タ 一
遺 伝 子 を ク ロ ー ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 3 4
ク ロ ァ カ ェ dec/ECL
イ マ 一 を、 ア プ ラ イ ド
遺 伝 子 ） を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の ブ ラ
バ イオ システ ム ズ
シ ンセ サ イザ 一
DNA/RNA
( ェ ンテ
（App U e d
B i osys
社製
t ems)
「394
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
（syn t hes i z e r )
遺伝 子増 幅 用 プライマ ー
dec/ECL
(a-
12 )
；
5'
-
CTCT
CATATG
AGATTGATCGTGGGAATGAC
-3'
( 配 列 番 号 35)
(b-
12 )
；
5'
-
CTCT
CATATG
TTACAGCAATGGCGGAATGG
-3'
( 配 列 番 号 36)
尚、 プ ラ イ マ 一
（a- 1 2 )
及び
（b- 1 2 )
に は 、 Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
錶 型 DNA は 、 バ チ ラ ス サ プ チ リ ス は 、 N ITE
[0076]
よ り 入 手 した バ チ ル ス サ プ チ リ ス
NBRC)
A
B i o Lo g i c a L Resou
NBRC
14 14 4
を 用 い た 。 ラ ク 卜バ チ ル ス ラ ム ノ 一 サ ス は 、 N ITE
nt e r
(NBRC)
t ure
C o L Le c t i o n
(ATCC)
u Lt u r e
4
B i o Lo g i c a L Resou
C o L Le c t i o n
よ り 入 手 した ラ ク 卜バ チ ラ ス
(ATCC)
NBRC
(
プ レ ビス
Type
プチ ダ
Ce
Cu L
367
か
Type
C
ATCC
プ チ ダ は 、 Ame r i can
よ り 入 手 した シ ュ 一 ドモ ナ ス
rce
か ら抽
3425
プ レ ビ ス は 、 Ame r i can
ら抽 出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 シ ュ 一 ドモ ナ ス
Cen t e r
か ら抽 出 した 染 色 体 D N
よ り 入 手 した ラ ク 卜バ チ ル ス ラ ム ノ 一 サ ス
出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 ラ ク 卜バ チ ル ス
rce
ATCC
4705
か ら抽 出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 ェ シ エ リ キ ア コ リ は 、 ェ シ エ リ キ ア コ
リ
K- 12
MG 1 655
シ ェ は 、 N ITE
か ら抽 出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 サ ッ カ ロ マ イ セ ス セ レ ビ
B i o Lo g i c a L Resou
イ セ ス セ レ ピシ ェ
バ クタ一
NBRC
10 2 17
ク ロ ァ カ ェ は 、 N ITE
手 した ェ ン テ ロ バ ク タ 一
rce
Cen t e r
よ り 入 手 した サ ッ カ ロ マ
(NBRC)
か ら抽 出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 ェ ン テ ロ
B i o Lo g i c a L Resou
ク ロァカェ
NBRC
rce
1 3535
Cen t e r
(NBRC)
よ り入
か ら抽 出 した 染 色 体 DNA を
用 いた。
[0077]
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR
Sys t e m 9700
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
L A Taq
(
アプライ ド
( タ カ ラバ
ィ 才 株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
反応液 ：
TaKaRa
LA Taq  ( 5 u n i ts/
10X LA PCR  Buffer
II
I)
(Mg
+
0. 5 i
free)
25mM MgC I
dNTP Mi xture
5 i
(2. 5mM each)
8 i
錶 型 DNA
5 i
上 記 記 載 の 2 種 プ ラ イ マ ー *】
各 々0. 5 i
(DNA 含 有 量 1
(最 終 濃 度 1
以下)
M)
25. 5 i
滅菌蒸留水
以 上 を混 合 し、 この 50 パ I の 反 応 液 を PCR に か け た 。
* ) バ チ ラス
サ プ チ リス dec/BS 遺 伝 子 を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-6)
と （b-6) の 組 み 合 わ せ 、 ラ ク 卜バ チ ル ス
ラ ム ノ 一 サ ス dec/LR 遺 伝 子 を増 幅
す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-7) と （b-7) 、 ラ ク 卜バ チ ル ス
プ レ ビス dec/LB 遺
伝 子 を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-8) と （b-8) の 組 み 合 わ せ 、 シ ュ 一 ドモ
ナス
プ チ ダ dec/PP 遺 伝 子 を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ ー （a-9) と （b-9) の 組
み 合 わ せ 、 ェ シ エ リキ ア
10 )
コ リdec/EC 遺 伝 子 を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-
と （b-1 0 ) の 組 み 合 わ せ 、 サ ッ カ ロ マ イ セ ス
を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-1 1)
セ レ ピシ ェ dec/SC 遺 伝 子
と （b-1 1) の 組 み 合 わ せ 、 ェ ンテ ロパ ク
タ 一 ク ロ ァ カ ェ dec/ECL 遺 伝 子 を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-1 2 )
と （b-1 2
) の 組 み 合 わ せ で 行 った。
PCR
サ イ クル ：
デ ナ チ ユ レ一 シ ョ ン過 程
：94 °C
60 秒
ア ニ ー リン グ 過 程
：5 2 °C
60 秒
エ ク ス テ ン シ ョン過 程
：72 °C
バ チ ラス
サ ブ チ リス
dec/BS
遺伝子
13 7 秒
ラ ク トバ チ ル ス
ラム ノ一 サ ス
dec/LR
遺伝子
12 3 秒
ラ ク トバ チ ル ス
ブ レ ビス
dec/LB
遺伝子
12 3 秒
シ ユ ー ドモ ナ ス
プチ ダ
dec/PP
遺伝子
45 秒
dec/EC
遺伝子
94 秒
dec/SC
遺伝子
10 3 秒
ェ シ エ リキ ア
コリ
サ ッカ ロマ イ セ ス
セ レ ピシ ェ
ェ ン テ ロパ ク タ ー ク ロァ カ ェ
dec/ECL
以 上 を 1 サ イ ク ル と し、 30 サ イ ク ル 行 った
遺伝子
13 5 秒
上記 で生成 した反応液 10
[0079]
を0 . 8 % ァガ ロー スゲル によ り電気泳動 を行 い、
バ チ ラス サ プチ リスdec/BS 遺伝 子 の場合約 2 . 3-kb 、 ラ ク 卜バ チル ス ラム ノ
—サ スdec/LR 遺伝 子 の場合約 2 . 1-kb 、 ラ ク 卜バ チル ス プ レビスdec/LB 遺伝 子
の場合約 2 . 0-kb 、 シ ユー ドモナ ス プチ ダdec/PP 遺伝 子 の場合約 0 . 6-kb 、 ェ シ
エ リキ ア コ リdec/EC 遺伝 子 の場合約 1. 6-kb 、 サ ッカ ロマ イセ ス セ レピシェd
ec/SC
遺伝 子 の場合約 1. 7-kb 、 ェ ンテ ロバ クタ一 ク ロァカェdec/ECL 遺伝 子 の
場合約 2 . 3-kb のDNA 断 片が検 出で きた。
[0080]
(4)
ァニ リン生産遺伝 子発現 プラス ミ ドの構築
ァニ リン生産遺伝 子 の PCRB207 へ の ク ロ一ニ ング
上記項 （3) に示 した PCR によ り増 幅 したサ ッカ ロマ イセ ス セ レピシェ株 由来
dec/SC
遺伝 子 を含 む約 1. 7-kb の
DNA 断 片 10
す る ク ロ一ニ ングベ クタ一 pCRB207
2
L及び PgapA
プ ロモー タ一 を含有
L を制 限酵素 Nco l
で切 断 し、 7 0 °C で 10
分処理 させ る ことによ り制 限酵素 を失活 させ た後、 両者 を混合 し、 これ にT4
DNA
)
リガ一ゼ 10 X 緩衝液
un i t
1从
、 T4
DNA
リガ一ゼ （タカラバ イオ株 式会社製
の各成 分 を添加 し、滅菌 蒸留水 で 10
に して、 15 °C で3 時 間反応
させ、結 合 させ た。 これ をライゲ一 シ ヨンE液 と した。
得 られ た ライゲ一 シ ヨンE液 を、塩 化 カル シ ウム法
B i o Logy,
53,
カナマ イシ ン5 0
15 9 ( 1970
〔J
o u r na L o f Mo Lecu La r
) 〕 によ りェ シ エ リヒア コ リJ M10 9 を形 質転換 し、
g/m Lを含 む LB 寒天培地
〔1
%
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵母 ェ キ
ス、 0 . 5 % 塩 化 ナ トリウム、 お よび 1. 5 % 寒天〕 に塗布 した。
培地上 の生育株 を常法 によ り液 体培養 し、 培養液 よ りプラス ミ ドDNA を抽 出
、 該 プラス ミ ドを制 限酵素 で それ ぞれ切 断 し、揷 入断 片 を確 認 した。 この結
果、 プラス ミ ドPCRB207 約 5 . 1-kb のDNA 断 片 に加 え、 サ ッカ ロマ イセ ス セ レビ
シェ株 由来 dec/SC 遺伝 子 （ライゲ一 シ ヨンE液 ） の場合、 長 さ約 1. 7-kb の揷 入
断 片が認 め られ た。
サ ッカ ロマ イセ ス セ レピシェ株 由来 dec/SC 遺伝 子 を含 む プラス ミ ドをpCRB
207-dec/SC
[008 1]
と命 名 した ( 図 1) 。
ァニ リ
_ ン生産遺伝 子 の PCRB209 へ の ク ロ一ニ ンク：
上 記 項 (3) に示 した PCR に よ り増 幅 した バ チ ラ ス サ ブチ リス株 由来 dec/BS 遺
伝 子 を含 む 約 2 . 3-kb の DNA 断 片、 ラ ク 卜バ チ ル ス ラ ム ノ一 サ ス株 由来 dec/LR
遺 伝 子 を含 む 約 2 . 1-kb の DNA 断 片、 ラ ク 卜バ チ ル ス プ レ ビス株 由来 dec/LB 遺
伝 子 を含 む 約 2 . 0-kb の DNA 断 片、 シ ュ一 ドモ ナ ス プチ ダ株 由来 dec/PP 遺 伝 子
を含 む 約 0 . 6-kb
の DNA 断 片、 ェ シ エ リキ ア コ リ株 由来 dec/EC 遺 伝 子 を含 む 約
1. 6-kb の DNA 断 片、 ェ ン テ ロ パ ク タ ー
ク ロ ァ カ ェ株 由来 dec/ECL 遺 伝 子 を含
む 約 2 . 3-kb の DNA 断 片 10 µ L及 び PgapA プ 口モ ー タ 一 を含 有 す る ク ロ一 ニ ン グ
ベ ク タ 一 PCRB209
2
を各 々制 限 酵 素 Ndel で切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処 理 させ る
こ と に よ り制 限 酵 素 を失 活 させ た後 、 両 者 を混 合 し、 これ に T4 DNA リガ 一 ゼ 1
0 X 緩衝液
1
、 T4
リガ 一 ゼ （タ カ ラバ イ オ 株 式 会 社 製 ） 1 un i t の 各
に して、 15 °C で 3 時 間 反 応 させ 、 結 合 させ
成 分 を添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で
た。 これ を ラ イ ゲ 一 シ ヨン F液 、 G液 、 H液 、 I 液 、 J 液 及 び K液 と した。
得 られ た 6 種 の ラ イ ゲ 一 シ ヨン F液 、 G液 、 H液 、 I 液 、 J 液 及 び K液 そ れ ぞ れ を
、 塩 化 カル シ ウム 法 [Journa
l o f Mo Lecu Lar B i o Logy,
53,
よ りェ シ エ リ ヒア コ リJM1 09 を形 質 転 換 し、 カ ナ マ イ シ ン50
寒天培地
び 1.
5%
〔1%
ポ リペ プ トン、 0 .
5%
酵 母 エ キ ス、 0 .
5%
159 ( 1 970) 〕 に
g/ mLを含 む LB
塩 化 ナ トリウム、 お よ
寒 天 〕 に塗 布 した。
各 々 の 培 地 上 の 生 育 株 を常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ りブ ラ ス ミ ドDNA
を抽 出、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 で そ れ ぞ れ 切 断 し、 揷 入 断 片 を確 認 した。
この結 果 、 プ ラ ス ミ ドPCRB209 約 5 . 1-kb の DNA 断 片 に加 え、 バ チ ラ ス サ ブチ リ
ス株 由来 dec/BS 遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨン F液 ） の 場 合 、 長 さ約 2 . 3-kb の揷 入 断
片 が、 ラ ク 卜バ チ ル ス ラ ム ノ一 サ ス株 由来 dec/LR 遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨンG
液 ） の 場 合 、 長 さ約 2 . 1-kb の揷 入 断 片 が、 ラ ク 卜バ チ ル ス プ レ ビス株 由来 d e
c/LB 遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨン H液 ） の 場 合 、 長 さ約 2 . 0-kb の揷 入 断 片 が、 シ ュ
— ドモ ナ ス プチ ダ株 由来 dec/PP 遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨン I 液 ） の 場 合 、 長 さ
約 0 . 6-kb の揷 入 断 片 が、 ェ シ エ リキ ア コ リ株 由来 dec/EC 遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ
ヨン」液 ） の 場 合 、 長 さ約 1. 6-kb の揷 入 断 片 が、 ェ ン テ ロ パ ク タ ー
ク ロァ カ
ェ株 由来 dec/ECL 遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨンK液 ） の 場 合 、 長 さ約 2 . 3-kb の揷 入
断 片が認 め られ た。
バ チ ラス サ プチ リス株 由来 dec/BS 遺伝 子 を含 む プラス ミ ドをpCRB209-dec/
[0083]
BS 、 ラ ク
卜バ チル ス ラム ノ一サ ス株 由来 dec/LR 遺伝 子 を含 む プラス ミ ドをp C
、 ラ ク 卜バ チル ス プ レビス株 由来 dec/LB 遺伝 子 を含 む プラス ミ
RB209-dec/LR
ドをpCRB209-dec/LB
、 シ ュ一 ドモナ ス プチ ダ株 由来 dec/PP 遺伝 子 を含 む ブラ
ス ミ ドをpCRB209-dec/PP
、 ェ シ エ リキ ア コ リ株 由来 dec/EC 遺伝 子 を含 む ブラ
ス ミ ドをpCRB209-dec/EC
、 ェ ン テ ロ パ ク タ ー ク ロァカェ株 由来 dec/ECL 遺伝
子 を含 む プラス ミ ドをpCRB209-dec/ECL
[0084]
とそれ ぞれ命 名 した （
図 1) 。
ァニ リン生産遺伝 子導 入株 の構築
(5)
上述 の プラス ミ ド6 種類 pCRB209-dec/BS
、 pCRB209-dec/PP
、 pCRB209-dec/EC
用 いて、 電気パル ス法 [Ag
i c.
、 pCRB209-dec/LR
、 pCRB207-dec/SC
及び pCRB209-dec/ECL
B i o し Chem. 、 Vo L. 54 、 443-447
Mi c r o b i o し、 Vo L. 14 4 、 18 1- 18 5 ( 1993) ]
Res.
、 pCRB209-dec/LB
( 1990)
を
及び
によ り、 コ リネバ クテ リゥ厶
ダル タ ミカム R 株 を形 質転換 し、 カナマ イシ ン 5 0 バg/m Lを含 むA 寒天培地 に
塗布 した。
この培地上 の生育株 を常法 によ り液 体培養 し、 培養液 よ りブラス ミ ドDNA を
抽 出、 該 プラス ミ ドを制 限酵素 で切 断 し、挿 入断 片 を確 認 した。 この結 果、
上記 で作製 の プラス ミ ドpCRB209-dec/BS
、 pCRB209-dec/PP
、 pCRB209-dec/EC
、 pCRB209-dec/LR
、 pCRB207-dec/SC
、 pCRB209-dec/LB
及び pCRB209-dec/ECL
の
導 入 が認 め られ た。
[0085]
pCRB209-dec/BS
厶
（Co
プラス ミ ドを導 入 した株 を コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミ力
r ynebac t e r i u m g Lu t a m i cum)
A N I - 1、 pCRB209-dec/LR
プラス ミ ドを導 入
した株 を コ リ不ノくクテ リゥム ク、
、
リ
レタ ミカム (Co r ynebac t e i u m g Lu t a m i cum;
A N I-2
、 pCRB209-dec/LB
タ ミカム
（Co
プラス ミ ドを導 入 した株 を コ リネバ クテ リゥ厶 ダル
r ynebac t e r i u m g Lu t a m i cum)
A N I-3
、 pCRB209-dec/PP
プラス ミ ド
を導 入 した株 を コ リネンくクテ リゥム クつレタ ミカム (Co r ynebac t e i u m g Lu t a
i cum)
A N I-4
、 pCRB209-dec/EC
プラス ミ ドを導 入 した株 を コ リネバ クテ リゥ厶
ダル タ ミカム (Co r ynebac t e i u m g Lu t a m i cum)
A N ト 5 、 pCRB207-dec/SC
プラ
ス ミ ドを導 入 した株 を コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム
g Lu t a m i cum)
A N I-6
コ リネバ クテ リゥ厶 グル タ ミカム
（Co
0 10 年 1 1 月 16 曰、 受託番号
[0087]
実施例 2
A NI - 7
と命 名 した。
r ynebac t e r i u m g Lu t a m i cum)
は、 曰本 国千葉 県木 更津市 かず さ鎌 足 2-5-8
法 人製 品評価技術 基盤機 構
r ynebac t e r i u m
プラス ミ ドを導 入 した株 を コ リネバ ク
、 pCRB209-dec/ECL
テ リゥ厶 グル タ ミカム (Co r ynebac t e i u m g Lu t a m i cum)
[0086]
（Co
A NI - 1
(郵 便番号 292-08 18 ) の独立行政
特 許微 生物 寄託 セ ンター に寄託 した （
受託 曰 ：2
：NITE BP- 10 0 1) 。
コ リネパ クテ リゥ厶 グル タ ミカム
ァニ リン生産遺伝 子導 入株 の
ア ン トラニル酸 か らの ァニ リン生成 実験
実施例 1 において作製 した コ リネパ クテ リゥ厶 ダル タ ミカムA N I - 1~AN I-7
株 を、 カナマ イシ ン5 0
g/m L を含 むA 寒天培地 [ (NH 2 ) 2C0 2 g 、
P0 4 0 . 5 g 、 K2HP0 4 0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H20 0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
42% (w/v)
v)
MnS0 4 . 2 H20 1 m し 0 . 02% (w/v)
t h i a m i n s o l u t i o n 2 m し yeas t
c i d 7 g 、 g l ucose
（NH 4 ) 2S0 4
7 g 、 K H2
Fe 2 S0 4 . 7 H20 + 0 . 0
b i o t i n s o l u t i o n 1 m し 0 . 0 1% (w/
e x t r a c t 2 g 、 v i t a m i n assay
4 0 g 、 寒天 15 g を蒸留水 1L に懸濁 ]
casam i no a
に塗布 し、 3 3 °C 、 2 0
時 間暗所 に静 置 した。
上記 の プ レー 卜で生育 した コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカムA N I - 1~AN I-7
[0088]
株 を、 カナマ イシ ン5 0
g/m L を含有
したA 液 体培地 10 m L の入 った試験管 に一 白
金耳植菌 し、 3 3 °C にて 2 0 時 間、 好気 的 に振盪 培養 を行 った。 この よ うに して
培養増 殖 され た それ ぞれ の菌 体 は、 遠心 分離
（4
°C 、 15 , 000 X g、 10 分 ） によ
り菌 体 を回収 した。得 られ た菌 体 を、 10 mL の BT 液 体培地 〔（NH 2 ) 2C0 2 g 、 (NH 4
) 2S0 4 7 g 、 K H2P0 4 0 . 5 g 、 K2 HP0 4 0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H20 0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
4.
7 H20 + 0 . 042% (w/v)
、 0 . 0 1% (w/v)
MnS0 4 . 2 H20 1 m し 0 . 02% (w/v)
t h i a m i n s o l u t i o n 2 mL]
Fe 2 S O
b i ot i n so l ut i on 1
L
で 2 回洗浄 した後、 OD 6 1 0= 10 とな るよ
うにBT 液 体培地 で懸濁 した。 この菌 体懸濁液 を容量 15 m L遠心管 に入れ、 還元
条件 下 （
酸 化還元 電位 ；-450
mV)
、 基 質 と して ア ン トラニル酸 を2 5
mM
とな
るよ うに添加 し、 3 3 °C に保 った水浴 中で攪 拌 しなが ら6 時 間反応 させ た。 サ ン
プ リング した反応液 を遠心 分離
（4
°C 、 15 , 000 X g、 10 分 ）
し、得 られ た上清
液 を 用 い て ァ ニ リン を GC/MS に よ って 定 量 した 。
この 結 果 、 コ リネ パ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム ANI-1 ~ANI-7
株 は、 還 元 条 件
下 に お け る反 応 に お い て 、 下 記 表 1 の よ う に ァ ニ リン を 生 成 して い た 。
[ 表 1]
ア ン トラニル 酸 を基 質 と した場 合 の コ リネバ ク テ リゥム グル タ ミカム
ANI-1 〜 A N 卜7 株 の ァ ニ リン生成 実 験
な お、 カ ナ マ イ シ ン を培 地 に添 加 しな い こ と以 外 は 上 記 と同 様 の 実 験 を コ
リネ パ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム 野 生 株 に対 して 行 った と こ ろ、 ァ ニ リン生 成
は 認 め られ な か った 。
実施例 3
コ リネ パ クテ リゥ 厶 グル タ ミ カ ム
ァ ニ リン生 産 遺 伝 子 導 入 株 の
4 - ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜か らの ァ ニ リン生 成 実 験
実 施 例 1 に お い て 作 製 した コ リネ パ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム ANI-1 ~ANI-7
株 を、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
g / mLを含 む A 寒 天 培 地 [ (NH 2 ) 2C0 2 g 、
P0 4 0 . 5 g 、 K2HP0 4 0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H20 0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
42% (w/v)
v)
MnS0 4 . 2 H20 1 m し 0 . 02% (w/v)
t h i a m i n s o lut i o n 2 m し yeast
c i d 7 g 、 g lucose
ext ract
（NH 4 ) 2S0 4
7 g 、 K H2
Fe 2 S0 4 . 7 H20 + 0 . 0
b i o t i n s o lut i o n 1 m し 0 . 01% (w/
2 g 、 v i tam i n assay
4 0 g 、 寒 天 15 g を蒸 留 水 1L に懸 濁 ]
casam i no a
に塗 布 し、 3 3 °C 、 2 0
時 間 暗 所 に静 置 した。
上 記 の プ レー 卜で 生 育 した コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム A N I - 1 ~AN I-7
[009 1]
株 を、 カナ マ イ シ ン5 0
g/m L を含 有
した A 液 体 培 地 1 0 m L の 入 った試 験 管 に一 白
金 耳 植 菌 し、 3 3 °C にて 2 0 時 間、 好 気 的 に振 盪 培 養 を行 った。 この よ うに して
培 養 増 殖 され た それ ぞれ の菌 体 は、 遠 心 分 離
（4
°C 、 15 , 000 X g 、 10 分 ） に よ
り菌 体 を回収 した。 得 られ た菌 体 を、 10 mL の BT 液 体 培 地 〔（NH 2 ) 2C0 2 g 、 (NH 4
) 2S0 4 7 g 、 K H2P0 4 0 . 5 g 、 K2 HP0 4 0 . 5 g 、 MgS0 4 .
4.
7 H20 + 0 . 042%
、 0 . 0 1% (w/v)
(w/v)
H20 0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
MnS0 4 . 2 H20 1 m し 0 . 02% (w/v)
t h i a m i n s o l u t i o n 2 mL]
Fe 2 S O
b i ot i n so l ut i on 1
L
で 2 回洗 浄 した後 、 OD 6 1 0= 10 とな る よ
うに BT 液 体 培 地 で懸 濁 した。 この菌 体 懸 濁 液 を容 量 1 5 m L遠 心 管 に入 れ、 還 元
条件下 （
酸 化 還 元 電位 ；-450
mV)
、 基 質 と して 4 - ァ ミ ノベ ン ゾェ 一 卜を 5
mM
とな る よ うに添 加 し、 3 3 °C に保 った水 浴 中 で攪 拌 しな が ら6 時 間反 応 させ た。
サ ン プ リン グ した反 応 液 を遠 心 分 離
（4
°C 、 15 , 000 X g 、 10 分 ） し、 得 られ た
上 清 液 を用 い て ァニ リンをGC/MS に よ って 定 量 した。
この結 果 、 コ リネパ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム A N I - 1 ~AN I-7 株 は、 還 元 条 件
下 に お け る反 応 に お い て、 下 記 表 2 の よ うに ァニ リンを生成 して い た。
[0092]
[表2]
4-
ァ ミノベ ン ゾェ一 トを基 質 と した 場 合 の コ リネバ ク テ リゥム グル タ ミカム
AN I -
-AN
I-
株 の ァ ニ リン生 成 実 験
な お 、 カ ナ マ イ シ ン を 培 地 に 添 加 しな い こ と以 外 は 上 記 と 同 様 の 実 験 を コ
リネ パ ク テ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム 野 生 株 に 対 して 行 っ た と こ ろ、 ァ ニ リ ン生 成
は 認 め られ な か っ た 。
産業 上 の利 用可能 性
本 発 明 方 法 に よ れ ば 、 微 生 物 を 用 い て 実 用 的 な 効 率 で ァ ミ ノ安 息 香 酸 か ら
ァ ニ リ ン を製 造 す る こ と が で き る。
請 求 の範 囲
[ 請 求 項 1」
ァ ミ ノ べ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ リレポ キ シ ラ 一 ゼ (am i nobenzoate
decarbox
y Lase) 活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 、 宿 主 の コ リ ネ 型 細 菌
に導 入 され た、 ァ ニ リン生 産 能 を有 す る形 質 転 換 体 。
[ 請 求項 2]
ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 活 性 を有 す る 酵 素 を コ 一
ドす る 遺 伝 子 が 、 バ チ ラ ス サ プ チ リ ス
遺伝 子、 ラ ク
チ リレス
ラム ノ— サ ス
（Bac は Lus
(Lactobac
由 来 の 遺 伝 子 、 ラ ク 卜バ チ ラ ス
プ レ ビス
由 来 の 遺 伝 子 、 シ ュ 一 ドモ ナ ス
プチ ダ
の 遺 伝 子 、 ェ シ エ リキ ア
遺 伝 子 、 又 は ェ ンテ
)
i L Lus
（Pseudomonas
(i>accharomyces
クタ一
由来 の
i Li s )
rhamnosus)
（Lactobac は Lus brev
コ リ （Escher i c h i a c o
サ ッカ ロマ イ セ ス セ レ ヒシ ェ
subt
クロァカェ
)
is)
由来
put i da)
由来 の遺伝 子、
cerev
i s i ae)
(Enterobacter
由来 の
c loacae
由来 の遺 伝 子 で あ る請 求項 1 に記 載 の形 質転 換 体 。
[ 請 求項 3]
ァ ミ ノベ ン ゾ ェ 一 卜 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 活 性 を有 す る 酵 素 を コ 一
ドす る 遺 伝 子 が 下 記 の （a) 又 は （b) の DNA で あ る 請 求 項 1 に 記 載 の 形 質
¾ 換体。
(a)
配 列 番 号 16 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 配 列 番 号 19 の 塩 基 配 列 か ら
な る DNA 、 配 列 番 号 2 2 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 配 列 番 号 2 5 の 塩 基 配 列
か ら な る DNA 、 配 列 番 号 2 8 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 配 列 番 号 3 1 の 塩 基
配 列 か ら な る DNA 、 又 は 配 列 番 号 3 4 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA
(b)
(a) の 何 れ か の 塩 基 配 列 と 相 補 的 な 塩 基 配 列 か ら な る DNA と ス 卜
リ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 で ハ イ プ リ ダ イ ズ し、 か つ ァ ミ ノ べ ン ゾ ェ 一 卜
デ カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ 活 性 を 有 す る ポ リべ プ チ ドを コ 一 ドす る DNA
[請 求項4]
宿 主 の コ リネ 型 細 菌 が コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
グル タ ミ カ 厶 で あ る請
求項 1 ~ 3 の何 れ か に記 載 の形 質転 換 体 。
[ 請 求 項 5]
宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ウ 厶
グ ル ミ カ ム R (FERM
グ ル タ ミ カ ム が 、 コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶
P — 18976)
請 求項 4 に記 載 の形 質転 換 体 。
、 ATCC 13032,
又 は ATCC1 3869 で あ る
[ 請 求 項 6]
コ リネ バ ク テ リウ 厶 グル タ ミ カ ム ANI-1
( 受 託 番 号 ：NITE BP-1 00
1) 形 質 転 換 体 。
[ 請 求項 7]
請 求 項 1 ~ 6 の 何 れ か に 記 載 の 形 質 転 換 体 を、 還 元 条 件 下 、 ァ ミ ノ
安 息 香 酸 、 そ の エ ス テ ル 、 及 び / 又 は そ の塩 を含 有 す る反 応 液 中 で 反
応 さ せ る 工 程 と、 反 応 培 地 中 の ァ ニ リ ン を 回 収 す る 工 程 と を 含 む ァ ニ
リンの製 造 方 法 。
[ 請 求 項 8]
反 応 工 程 に お い て 、 形 質 転 換 体 が 実 質 的 に増 殖 しな い 請 求 項 7 に 記
載 の ァ ニ リンの製 造 方 法 。
[ 請 求 項 9]
還 元 条 件 下 の 反 応 液 の 酸 化 還 元 電 位 が — 2 0 0 〜 ― 5 0 0 ミ リボ ル
卜で あ る 請 求 項 7 又 は 8 に 記 載 の ァ ニ リ ン の 製 造 方 法 。
INTERNATIONAL
International application No.
SEARCH REPORT
I
A.
CLASSIFICATION
C 1 2N1 /21
PCT / JP2 0 1 1 / 0 8 0 1 5 1
OF SUBJECT MATTER
(2 0 0 6 . 0 1 ) i ,
C 1 2P1 3/0
0 (2 0 0
1) i ,
C 1 2N1 5/09
(2 0 0
1)
f
C 1 2R1 / 1 5
(2 0 0 6 . 0 1 ) n
According to International Patent Classification (IPC) or t o both national classification and IPC
B.
FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
C 1 2N1 / 2 1 , C 1 2 P 1 3 / 0 0 , C 1 2N1 5 / 0 9 , C 1 2 R 1 / 1 5
Documentation searched other than minimum documentation t o the extent that such documents are included in the fields searched
Jitsuyo
Shinan
Koho
1922-1 996
Jitsuyo
Shinan
Toroku
Koho
1996-2012
Kokai
Jitsuyo
Shinan
Koho
1 971-2012
Toroku
Jitsuyo
Shinan
Koho
1994-2012
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)
CA/ B I 〇 S I S /MEDLINE
/WPI D S ( S T N ) , JST Plus
/ JMEDPlus
/ JST 7 8 0 ( JDreaml
l ) ,
GenBank/EMBL/
C.
DOCUMENTS
DDBJ/
CONSIDERED
Category*
A
S loane
Uni
Prot
/ GeneS
,
.
Smegmat
H.
.
McCul
et
zo
i s ,
1 95 1 ,
lough
,
.
the
Ameri
p .
62 8- 63 0
JP
2008- 274225
. ) ,
13
November
example
G.
of
can
Ltd
aci
S tudie
d
of
p .
on
of
al . ,
c
Journal
193 ,
Decarboxylati
s
on
metabol
Biol
ogi
cal
Chemi
9
st r y ,
et
al . ,
the
cal
( Sumi
2008
E n zymati
Ami nobenz
S ociety
tomo
c
oate
,
Rubber
s - ,
Journal
1957 ,
Vol .
I ndus
trie
79
s
9
11 . 2008 ) ,
s
2008/ 0242823
& EP
1975240
&
602008000176
& CN
1012 74 996
DE
i sm
Mycobacterium
2008111877
Al
A
A
See patent family annex.
Further documents are listed in the continuation of Box C .
*
Special categories of cited documents:
"A
document defining the general state of the art which i s not considered
to be of particular relevance
"E
earlier application or patent but published on or after the international
filing date
L
document which may throw doubts on priority claim(s) or which i s
cited t o establish the publication date of another citation or other
special reason (as specified)
"P"
the
Relevant t o claim No.
453- 458
Chemi
A
by
& US
& RU
"O"
eq
T O B E RELEVANT
p - aminoben
Vol
A
eq ,
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
of
A
GeneS
"
later document published after the international filing date or priority
date and not in conflict with the application but cited to understand
the principle or theory underlying tiie invention
"X"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered novel or cannot b e considered t o involve an inventive
step when the document i s taken alone
"Y"
document of particular relevance; the claimed invention cannot be
considered t o involve an inventive step when the document i s
combined with one or more other such documents, such combination
being obvious to a person skilled i n the art
"&"
document member of the same patent family
document referring t o an oral disclosure, use, exhibnion or other means
t o the international filing date but later than
Date of the actual completion of the international search
1 4 March
, 2 012 (1 . 03 . 12 )
Date of mailing of the international search report
2 7 March
, 2 0 1 2 (2 7 . 03 . 1 2 )
Name and mailing address of the ISA/
Japane
s e Patent
Of f i c e
Authorized officer
Facsimile No.
Form PCT/ISA/210 (second sheet) (July 2009)
Telephone No.
INTERNATIONAL
SEARCH REPORT
International application No.
PCT / JP2 0 1 1 / 0 8 0 1 5 1
C (Continuation).
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Category*
Relevant to claim No.
A
a s ayuki
INOUE , " Synthe s i s o f Bi o-Ani l ine
Reducti o n o f Ni troben zene b y Immobi l i z e d
Baker ' s Yea s t " , Chemi cal Educati
o n , 1 9 91 ,
vol . 3 9 , n o . 5 , page s 5 72 t o 5 73
A
Stot z , Agathe
and Linde r , Patri c k , The ADE 2
gene from Sa c char omyce s c e revi s i a e ： sequence
and new vecto r s , Gene , 1 9 9 0 , Vol . 95 , p . 9 1- 98
1- 9
A
T iedeman , A . A . e t a l ,
u c l e o t ide sequence
analys i s o f the purEK operon
encoding
-pho sphoribo
s y l - 5 -ami noimi d a z o l e carboxyla
se
o f Es cheri chi a c o l i K- 1 2 . , Journal
of
Bacte r i o l ogy , 1 98 9 , Vol . 1 7 1 , No . 1 , p . 2 05 - 2 12
1- 9
A
Kahng , H . - Y . e t a l . , Characteri
z a t o n o f s trai n
HY 9 9 , a novel
mi croorgani
s m capabl e o f aerobi c
and anaerobi
c degradati
o n o f ani l i n e , FE S
Mi crobi o l ogy Letter
s , 2 0 0 0 , Vo l . 1 90 , p . 2 15 -
1- 9
：
1- 9
221
A
NELSON , K . E . e t a l . , Complete
genome sequence
and comparative
analys i s o f the metabo l cal l y
ver sati l e Pseudomonas
puti d a KT2 4 4 0 . ,
Envi ronmental
Mi crobi o l ogy , 2 0 02 , Vo l . 4 , No 1 2 , p . 7 9 9- 8 0 8
1- 9
A
MAT SUI ,
T . e t a l , Puri f i cati o n ,
characteri
z a t o n , and gene cloni n g o f 4 一
hydroxybenz
oate decarboxyl
a s e o f Enterobacte
r
cloacae
P2 4 0 . , Archive
s o f Mi crobi o l ogy , Vol .
1 8 6 , 2 0 0 6 , p . 2 1- 2 9
1- 9
A
Lupa , B . e t a l . , Propertie
s o f the rever s ibl e
nonoxi dat v e vani l l ate / 4 -hydroxybenz
oate
decarboxyla
s e from Baci l l u s subt i l i s . , Canadian
Journal
o f Mi crobio logy , 2 0 0 8 , Vol . 5 4 , p . 75 - 8 1
1- 9
2 0 11 / 05 032 6 Al
( GENOMAT I CA , INC . ) ,
2 8 Apri l 2 0 1 1 ( 2 8 . 0 4 . 2 0 1 1 ) ,
a who l e art
cle ; page 1 9 , l i n e 9 ； f i g . 2
& U S 2 0 1 1 / 0 0 9 7 7 67 A l
1- 9
P, X
WO
Form PCT/ISA/2 10 (continuation of second sheet) (July 2009)
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International application No.
PCT / JP2 0 1 1 / 0 8 0 1 5 1
Conti nuat ion o f B . FI ELDS SEARCHE D
El e c t roni c data bas e consul ted duri ng the inte rnat ional
search
( name o f data bas e and, whe r e practi cabl e , s earch t e rms u s ed )
REGI STRY ( STN )
Form PCT/ISA/210 (extra sheet) (July 2009)
国際出願番 号
国際調査報告
J P 2 0
P C
0 8 0 1 5
発 明の属す る分野の分類 （
国際特許分類 （I P C ) )
Int.Cl.
C12N1 /2K2006.
01) i , C12P13/00 (2006. 01) i
，C12N15/09
(2006. 01) n, C12R1/15 (2006. 01)
B . — 調査 を行 った分野
調査 を行 った最小 限資料 （
国際特許分類 （I P C ) )
Int.Cl.
C12N1/21,
C12P13/00,
C12N15/09,
C12R1/15
最小限資料以外の資料 で調査 を行 った分野に含 まれ るもの
日本 国実用新案公報
日本 国公 開実用新案公報
日本 国実用新案登録公報
日本 国登録実用新案公報
2
1
国際調査で使用 した電子デ
o
9
-ス の 9
名 称 、調査 に使用 した用 語)
6
2
(JDreamll) , GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq.
-ス （
デぃ
111
CA/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS (STN) ，
UniProt/GeneSeq,
SwissProt/PIR/GeneSeq,
REGISTRY (STN)
C.
関連す ると認 め られ る文献
引用文献の
カ テ ゴ リー *
引用文献名 及び一部 の箇所 が関連す る ときは、 そ の 関連す る箇所 の表示
A
S loane,
. H. e t a l .
，
t u
a c i d b y Mycobacterium
Chemi stry,
McCul
Vo l .
lough,
.
7 9 ，p .
， 195 1 ， p .
et
al .
，Journal
Aminobenzoates.
Vo l .
Sraegraat i s ,
193
G.
i e s o n the
Journal
Ameri
引用文献
もの
ΓΕ 」国際出願 日前 の出願 または特許 であ るが、国際出願 日
以後 に公表 され た も の
「L 」優先権主張に疑義 を提起す る文献又 は他 の文献 の発行
日若 しくは他 の特別 な理 由を確 立す るた めに引用す
る文献 （
理 由を付す）
Γθ 」 口頭 に よる開示、使用、展示等 に言及す る文献
ΓΡ 」国際出願 日前 で、かつ優先権の主張の基礎 とな る出願
1-9
cal
can Chemi cal
ion
of
Soc i ety,
the
1957
1-9
，
パ テ ン トフ ァ ミ リー に関す る別紙 を参照。
の 日の後 に公表 された文献
「
Τ 」国際出願 日又 は優先 日後 に公表 され た文献 であって
出願 と矛盾す るものではな く、発 明の原理又は理論
の理解 のために引用す るもの
「
X 」特 に関連 のあ る文献 であって、当該文献 のみで発 明
の 新規性又 は進歩性 がない と考 え られ る もの
ΓΥ 」特 に関連 のあ る文献 であって、当該文献 と他 の 1 以
上の文献 との、当業者 に とって 自明である組合せ に
よって進歩性 がない と考 え
Γ& 」同一 パ テ ン トフ ァ ミ リー 文献
国際調査報告 の発送 日
国際調査 を完 了 した 日
4 .
0 3.
2 0 1 2
国際調査機 関の名称及 びあて先
日本 国特許庁 （I S A
J Ρ )
郵便番 号 1 0 0 — 8 9 1 5
東京都千代 田区霞が関三丁 目4 番 3 号
l SA
i c
628-630
ΓΑ 」特 に関連 のあ る文献 ではな く、一般 的技術水準 を示す
様式 P C T
Bio logi
i c Decarboxylat
C 欄 の続 きに も文献が列挙 されてい るc
*
of
p-arainobenzo
453—458
， Enzymat
o f the
metaDo l i s m o
関連す る
請求項 の 番号
2 1 0
2 7.
0 3.
4B
特許庁審査官 （
権限のあ る職員）
(第 2 ページ） （2 0 0 9 年 7 月）
2 0 1 2
3 7 6 3
濱 田 光浩
0 3 - 3 5 8 1 - 1 1 0
内線
3 4 4 8
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
C
(続 き） .
J P 2 0
P C
関連 す る と認 め られ る文 献
引用 文 献 の
カ テ ゴ リー *
A
0 8 0 1 5
引用 文 献 名
A (住 友 ゴ ム 工 業 株 式 会 社 ）2008. 11. 13 ， 実 施 例 & US | 1-9
J P 2008-274225
2008/0242823
A 1 & EP 1975240 A 1 & DE 602008000176
A & RU 2008111877
固定 化 パ ン 酵 母 に よ るニ トロ
ベ ン ゼ ン の 還 元 一 ， 化 学 と教 育 ， 1991 ， Vol.
Agathe
and Linder,
Saccharomyces
Vol.
D & CN 101274996
A
井 上正 之，バ イオ ' ァニ リン の合成
Stotz,
関連 す る
請 求 項 の番 号
及 び一 部 の箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の表 示
cerevisiae
Patrick,
39 ， No. 5 ， p . 572-573
The ADE
: sequence
1 1-9
I 1-9
gene from
and new vectors,
Gene,
1990
9 5 ， p . 91-98
Tiedeman,
operon
A. A. et al,
encoding
5' -phosphor
o f Escherichia
171 ， No.
Kahng,
coli
1， p .
H. _Y.
sequence
ibosyl-5-araino
K-12. ， Journal
analysis
o f the purEK
imidazole
carboxylase
o f Bacteriology,
capable
o f aerobic
FEMS Microbiology
1989 ， Vol.
o f strain
and anaerobic
Letters,
genome sequence
analysis
versatile
the
metabolically
KT2440. ， Environmental
Microbiology,
HY99,
a novel
degradation
2000 ， Vol.
NELSON, K. E. et al. ， Complete
of
I 1-9
205-212
et al. ， Characterization
microorganism
aniline,
Nucleotide
I 1-9
of
190 ， p . 215-221
I 1-9
and comparative
Pseudomonas
2002 ， Vol.
put i a
4 ， No.
12 ， p .
799-808
MATSUI,
T.
cloning
o f 4-hydroxybenzoate
cloacae
Lupa,
Purification,
P240. , Archives
B.
/
，
characterization,
decarboxylase
o f Microbiology,
et al. ， Properties
vanillate
subtilis.
et al,
of
4-hydroxybenzoate
Canadian
Journal
the
Vol.
reversible
decarboxylase
o f Microbiology,
I 1-9
and gene
o f Enterobacter
186 ， 2006 ， p . 21-29
I 1 9
nonoxidative
from
2008,
Bacillus
Vol.
54 ， p .
75-81
P.
X
0
2011/050326
第 9 fi
様式 P C T
I SA
FIG.
2 1 0
Al
(GEN0MATICA,
2 & US 2011/0097767
INC. )
2011. 04. 28,
Al
(第 2 ペ ー ジ の 続 き） （2 0 0 9 年 7 月）
全 体 、p .
19
I 卜9