Download (12) 特許協力条約に基づいて公開された国際出願 (19) 世界

(12) 特 許 協 力 条 約 に 基 づ い て 公 開 され た 国 際 出 願
7
(19) 世界 知 的所 有権 機 関
5
2
国際事 務 局
(43) 国 際 公 開 曰
2012 年 3 月 15 日 （15.03.2012)
国際特 許分 類 ：
(51)
C12N
15/09
C12N
1/21 (2006.01)
(81)
(2006.01)
(21)
国際 出願 番 号 ：
(22)
国 際 出願 日：
C12P
7/22 (2006.01)
指定国 （
表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 国 内 保
護 が 可 肯 ) : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,
BB,
PCT/JP20
201 1
年
9
月
7
1 1/070325
GB, GD,
曰（07.09.201 1)
(25)
国際 出願 の 言 語 ：
日本 語
(26)
国際 公 開の 言語 ：
日本 語
(30)
優 先権 デー タ：
特 願 2010-201445
BR,
BW,
GE, GH,
年
9
月
8
曰 （08.09.2010)
(84)
発 明 者 ；お よ び
発 明 者 / 出願 人 （
米 国 に つ い て の み )：湯 川 英 明
〒 6190292 京 都 肘 木 津
(YUKAWA,
Hideaki)
[JP/JP];
川巿木津 川台 9 丁 目 2 番地
グ リー ン フ エ
ノー ル
高機 能 フ エノール 樹脂 製造 技 術研 究
組 合 内 Kyoto (JP). 乾
将 行 （
INUI,
Masayuki)
京都 府 木 津 川 巿 木 津 川 台 9 丁
[JP/JP];
T 6190292
目2 番地
グ リー ン フ I ノ _ ル
高機能 フエ
ノ ー ル 樹 脂 製 造 技 術 研 究 組 合 内 Kyoto (JP).
代 理 人 ：岩 谷
龍 (IWATANI,
阪府 大 阪市 北 区堂 島 2 丁 目
堂 島 ビル 3 階 Osaka (JP).
Ryo);
1
番
3
〒 5300003 大
京阪
1 号
GM,
CA,
GT, HN,
KP,
LS,
LU,
LY,
MA,
MD,
ME,
NI,
NO,
LT,
MY,
ML,
NA,
NG,
KR,
RO, RS, RU, RW,
ST, SV, SY, TH, TJ, TM,
VN,
ZA,
CH,
HR, HU,
KN,
PL, PT, QA,
JP
BZ,
CL,
CN,
CO,
DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI,
KM,
US, UZ, VC,
2010
BY,
DM,
KG,
MX,
出願 人 （
米 国 を 除 く全 て の 指 定 国 に つ い て ) ：グ
リー ン フ ヱ ノ ー ル
高 機能 フ ヱノー ル樹脂 製
造 技 術 研 究 組 合 (Green Phenol Technology
Research
〒 6190292
者府木津川巿木
Association)
[JP/JP];
津 川 台 9 丁 目 2 番 地 Kyoto (JP).
(74)
BH,
JP, KE,
SM,
(71)
BG,
CR, CU, CZ, DE, DK,
ZM,
KZ,
ID, IL, IN, IS,
LA,
MG,
NZ,
LC,
MK,
OM,
LK,
MN,
LR,
MW,
PE, PG, PH,
SC, SD, SE, SG, SK, SL,
TN, TR, TT, TZ, UA,
UG,
ZW.
指定国 （
表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 広 域 保
護 が 可 肯^: ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW,
MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), ユ ー ラ シ ア
ョ一 ロ ッ パ
(AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM),
(AL,
AT,
BE, BG, CH, CY,
CZ, DE, DK,
GB, GR, HR, HU,
IE, IS, IT, LT, LU,
NL,
RO,
(BF,
NE,
NO,
PL,
PT,
RS, SE, SI, SK,
BJ, CF, CG, CI, CM,
GA,
GN,
21
条 (3))
EE, ES, FI, FR,
LV,
MC,
SM,
MK,
TR),
GQ, GW,
MT,
OAPI
ML,
MR,
SN, TD, TG).
添付 公 開書 類 ：
一
一
一
国際調 査報 告
（
条約第
規 則 13 の 2 に 基 づ い て 明 細 書 と は 別 に 提 出 さ
れ た 、 寄 託 され た 生 物 材 料 に 関 す る 表 示 （
規
貝IJ 13 の 2.4(d)(1) 及 び 48.2(a)(viii))
明 細 書 の 別 個 の 部 分 と して 表 した 配 列 リ ス ト
( 規 則 5.2(a))
(54) Title:
(54)
発 明 の 名 称 ：コ リネ 型 細 菌 形 質 転 換 体 及 び そ れ を 用 い る フ ェ ノ ー ル の 製 造 方 法
(57) Abstract:
activity
as a starting
liquid
A transiormant
has been transferred
material.
reaction
mixture
More
under
capable
o f producing
phenol,
into a host Coryne bacterium
specifically,
reduction
a method,
conditions
which
wherein
glutamicum,
comprises
a gene encoding
can efficiently
a step for reacting
and a step for collecting
phenol
an enzyme
produce
having
phenol
the transformant
m the liquid
reaction
：
from
a tyrosine
phenol-lyase
a saccharide
employed
i n a saccharide-containing
mixture,
i s preferred.
要 約 ： チ ロ シ ン フ エ ノ 一 ル - リア 一 ゼ （tyrosine phenol-lyase)
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ 一 ドす る 遺 伝 子
が 、 宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ゥ ム グ ル タ ミ カ ム （Corynebacterium
に 導 入 され た 、 フ エ ノ ー ル 生
glutamicum)
産 能 を 有 す る 形 質 転 換 体 は 、 糖 類 を 原 料 と して 効 率 よ く フ エ ノ ー ル を 製 造 で き る 。 具 体 的 に は 、 こ の 形
質 転 換 体 を 、 還 元 条 件 下 、 糖 類 を 含 有 す る 反 応 液 中 で 反 応 させ る 工 程 と 、 反 応 液 中 の フ エ ノ ー ル を 回 収
す る 工 程 と を 含 む 方 法 が 好 ま しい 。
(57)
明
細
書
発 明 の名称 ：
コ リネ 型 細 菌 形 質 転 換 体 及 び そ れ を 用 い る フ ェ ノ ー ル の 製 造 方 法
技術分野
[0001 ]
本 発 明 は、 フ エ ノー ル 生 産 技 術 に 関 す る。 さ らに詳 し くは、 フ エ ノー ル 生
産 機 能 を付 与 す る た め に特 定 の 遺 伝 子 操 作 が 施 さ れ た コ リネ 型 細 菌 の 形 質 転
換 体 、 及 び こ の 形 質転 換 体 を用 い た効 率 的 な フ エ ノ ー ル の 製 造 方 法 に関 す る
背景技術
[0002]
地 球 温 暖 化 、 及 び 化 石 資 源 枯 渴 問 題 を背 景 に、 再 生 可 能 資 源 を原 料 と した
化 学 品 の 製 造 は、 バ イ オ 燃 料 製 造 と並 び 、 新 産 業 バ イ オ リフ ァイ ナ リ一 と し
て 低 炭 素 社 会 実 現 の 重 要 な 方 策 で あ る こ とが 認 識 さ れ 、 大 きな 注 目が 集 ま つ
て い る。
しか し、 再 生 可 能 資 源 を原 料 と した バ イ オ フ エ ノ ー ル 生 産 は、 乳 酸 や エ タ
ノ ー ル の 生 産 と比 較 して 、 原 料 とな る糖 類 か ら代 謝 反 応 段 数 が 大 変 多 い た め
に 生 産 性 が 低 く、 ま た 生 産 物 で あ る フ エ ノ ー ル に よ り菌 の 増 殖 が 阻 害 さ れ た
り、 フ エ ノー ル に よ る細 胞 毒 性 が あ る等 の 理 由 に よ り、 これ ま で 工 業 的 生 産
が不 可 能 とされ て い た。
[0003]
フ エ ノ ー ル の 重 要 な 用 途 と して 、 フ エ ノ ー ル 樹 脂 が 挙 げ られ る。 フ エ ノ ー
ル 樹 脂 は、 フ エ ノー ル と アル デ ヒ ド類 との 付 加 縮 合 反 応 に よ り生 成 し、 ブ ラ
ス チ ッ ク の 中 で も最 も古 い歴 史 の あ る樹 脂 で あ り、 そ の 優 れ た 耐 熱 性 、 耐 久
性 等 の 特 長 か ら、 現 在 で も 自動 車 用 金 属 代 替 材 料 、 半 導 体 封 止 材 料 、 回 路 基
板 な ど様 々 な 用 途 に 用 い られ て い る。 ま た 、 これ ま で フ エ ノー ル 樹 脂 は、 原
料 の フ エ ノー ル と アル デ ヒ ド類 の 反 応 性 が極 め て 高 く、 得 られ る 高 分 子 が 複
雑 な 三 次 元 網 目構 造 に な る た め 、 ポ リマ ー の 精 密 構 造 設 計 や ナ ノマ テ リアル
へ の 展 開 が 困 難 で あ り、 高 付 加 価 値 の 用 途 へ の 利 用 が 難 しい と さ れ て きた 。
しか しな が ら、 近 年 、 高 分 子 の 物 性 理 論 や シ ミ ュ レ ー シ ョ ン の 急 速 な 発 展 に
よ り、 ネ ッ 卜ワ ー ク構 造 を 精 密 化 す れ ば フ エ ノ ー ル 樹 脂 か ら高 機 能 性 材 料 の
創 製 が 可 能 と な っ て き た 。 こ の よ う な 背 景 か ら 日本 に お け る フ エ ノ 一 ル 樹 脂
生 産 量 も 年 々 増 加 して い る 。
[0004]
フ エ ノ ー ル の 現 在 の 工 業 的 生 産 法 （ク メ ン法 ） は 、 石 油 由 来 の ベ ン ゼ ン と
プ ロ ピ レ ン を 原 料 と し、 多 量 の 溶 剤 類 及 び 多 量 の 熱 エ ネ ル ギ ー を 必 要 と す る
、 典 型 的 な 化 学 工 業 の 高 エ ネ ル ギ ー 消 費 型 プ ロセ ス で あ る。 従 って 、 地 球 環
境 保 全 や 温 室 効 果 ガ ス 削 減 の 観 点 か ら、 二 酸 化 炭 素 排 出 が 少 な い 省 エ ネ ル ギ
一 型 で 、 再 生 可 能 資 源 か ら製 造 で き、 低 廃 棄 物 排 出 の 環 境 調 和 型 プ ロ セ ス の
開 発 、 即 ち バ イ オ フ エ ノ 一 ル 製 造 技 術 確 立 が 急 務 とな って い る。
これ ま で 自然 界 に お い て フ エ ノー ル 生 産 菌 は報 告 さ れ て い な い。
[0005]
遺 伝 子 組 換 え 菌 に よ る フ エ ノ ー ル 生 産 技 術 と して は 、 非 特 許 文 献 1 が 挙 げ
られ る 。 非 特 許 文 献 1 の 方 法 で は 、 溶 媒 耐 性 菌 シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ （Pseu
domonas
put i da)
S 12
ァ ク- ロ メ ラ ン ス
【
こノ《ン 卜エ ア
(Pantoea
agg Lomerans
) 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ を コ ー ドす る t p L遺 伝 子 を 導 入 した 株
、 及 び シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ S 1 2 株 に シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ S 1 2 株 由 来 の DAH
Pシ ンテ タ 一 セ
thase)
(3-deoxy-D-arab
を コ ー ドす る aroF-1
i no-heptu
Losonate
7 - phosphate
(DAHP)
syn
遺 伝 子 を 導 入 した 株 を 作 製 して 使 用 して い る 。 ま
た 、 シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ S 1 2 株 に シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ S 1 2 株 由 来 の DAHP
シ ン テ タ 一 ゼ を コ 一 ドす る aroF-1
遺 伝 子 を 導 入 した 株 の 中 か ら フ エ 二 一 ル ァ
ラ ニ ン及 び タ イ 口 シ ンの ア ナ ロ グ （
代 謝 拮 抗 物 質 ） で あ る m- フ ル 才 口- DL- フ
ェ ニ ル ァ ラ ニ ン (m-f Luoro-DL-pheny
La Lan i ne)
に 耐 性 な 株 を 取 得 して 使 用 し
て い る 。 さ ら に 、 こ の 株 の 中 か らm- フ ル 才 口- L- タ イ 口 シ ン （m-f Luoro-L-tyr
o s i ne)
に 耐 性 な 株 を 取 得 して 使 用 して い る 。 そ して 、 こ れ らの 株 を 、 ダ ル コ
— ス を 唯 一 の 炭 素 源 と した 好 気 的 条 件 で の fed-batch
c u lture
に 供 して フ エ ノ
— ル を 生 産 す る 技 術 を 開 示 して い る 。
しか し、 非 特 許 文 献 1 の 方 法 は 、 フ エ ノ ー ル の 生 産 性 が 実 用 上 十 分 と は い
な い。
先行 技術 文献
非 特 許 文献
[0006]
非 特 許 文 献 1 ：App U ed and Env i ronmenta
L Mi crob i o Lo Logy,
Vo L. 7 1 ,
2005,
8221 -8227.
発 明 の概 要
発 明 が解 決 しょ う とす る課題
[0007]
本 発 明 は 、 糖 類 を 原 料 と して 効 率 よ く フ エ ノ ー ル を製 造 で き る微 生 物 、 及
び こ の 微 生 物 を 用 い て 糖 類 を 原 料 と して 効 率 よ く フ エ ノ ー ル を製 造 で き る 方
法 を提 供 す る こ と を 課 題 と す る。
課題 を解 決 す るた め の手 段
[0008]
上 記 課 題 を解 決 す る た め に 本 発 明 者 らは 研 究 を 重 ね 、 以 下 の 知 見 を得 た 。
( i)
( i i)
コ リネ 型 細 菌 は フ エ ノ ー ル に 対 して 高 い 耐 性 を有 す る。
コ リネ 型 細 菌 に チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ 遺 伝 子 を導 入 した 形 質
転 換 体 は 、 効 率 よ く フ エ ノ ー ル を 生 産 す る。
( i i i)
こ の 形 質 転 換 体 に お い て 、 宿 主 の コ リネ 型 細 菌 の 染 色 体 上 に存 在 す る
プ レ フ エ ン酸 デ ヒ ドラ タ 一 ゼ 遺 伝 子 及 び / 又 は フ エ ノ 一 ル 2 - モ ノ才 キ シ ゲ ナ
— ゼ 遺 伝 子 が 破 壊 又 は 欠 損 して い る と き は 、 一 層 効 率 よ く フ エ ノ ー ル を 生 産
で き る。
( i v)
こ の 形 質 転 換 体 に お い て 、 DAHP シ ン テ タ 一 ゼ 遺 伝 子 、 及 び /
又はコリ
ス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 が 、 形 質 転 換 前 の 宿 主 の 遺 伝 子 発 現 レベ ル に 比 べ て
高 発 現 して い る と き は 、 一 層 効 率 よ く フ エ ノ ー ル を 生 産 で き る。
(V)
こ の 形 質 転 換 体 は 、 還 元 条 件 下 の 反 応 液 中 で 実 質 的 に増 殖 しな い 状 態 で
反 応 させ る場 合 、 好 気 性 の 反 応 液 中 で増 殖 させ つ つ 反 応 させ る場 合 に比 べ て
、 フ エ ノ ー ル 生 産 効 率 が 高 い。
[0009]
本 発 明 は 上 記 知 見 に 基 づ き完 成 さ れ た も の で あ り、 以 下 の 形 質 転 換 体 及 び
フ エ ノ ー ル の 製 造 方 法 を提 供 す る 。
項 1.
チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ （tyros i ne pheno L- Lyase)
活 性 を有
す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子 が 、 宿 主 の コ リネ 型 細 菌 に導 入 さ れ た 、 フ エ ノ
ー ル 生 産 能 を有 す る形 質 転 換 体 。
項 2 .
チ ロシ ン
フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝
子 が 、 パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス （Pantoea agg Lomerans)
シ 卜ロバ ク タ 一 プ ラ ッ キ 一
（C
i t robacter
フ ィ 卜ノくク テ リ ュ _ ム ノヽフ こ エ ン ス
braak
i i)
acus)
由来 の遺 伝 子、 デ スル
(Desu Lf i tobacter
来 の 遺 伝 子 、 ク ロ ロ フ レクサ ス 才 ウ ラ ンテ ィ ア カ ス
由来 の遺 伝 子、
iu
（Ch
hafn i ense)
Lorof
由 来 の 遺 伝 子 、 ノ ス 卜ッ ク ノ《ン ク チ フ 才リレメ (Nostoc
由
Lexus
aurant
punct
i forme)
由 来 の 遺 伝 子 、 又 は トレ不 ネ マ ア ン テ ィ コ ラ （Treponema dent i c o La
i
由来
の 遺 伝 子 で あ る項 1 に記 載 の 形 質 転 換 体 。
項 3 .
チ ロシ ン
子が下記 の
(a)
（a)
フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝
又 は （b) の DNA で あ る 項 1 に 記 載 の 形 質 転 換 体 。
配 列 番 号 3 6 の 塩 基 配 列 か らな る DNA 、 配 列 番 号 3 9 の 塩 基 配 列 か らな る DNA
、 配 列 番 号 4 2 の 塩 基 配 列 か らな る DNA 、 配 列 番 号 4 5 の 塩 基 配 列 か らな る DNA 、
配 列 番 号 4 8 の 塩 基 配 列 か らな る DNA 、 又 は 配 列 番 号 5 1 の 塩 基 配 列 か らな る DNA
(b)
(a) の 何 れ か の 塩 基 配 列 と相 補 的 な 塩 基 配 列 か らな る DNA と ス 卜 リ ン ジ ェ
ン 卜な 条 件 で ハ イ プ リダ イ ズ し、 か つ チ ロ シ ン フ エ ノ 一 ル - リァ 一 ゼ 活 性 を
有 す る ポ リべ プ チ ドを コ ー ドす る DNA
項 4 .
宿 主 の コ リネ 型 細 菌 が 、 そ の 染 色 体 上 に 存 在 す る 下 記 （c) 及 び / 又 は
(d) の 遺 伝 子 が 破 壊 さ れ 、 又 は 欠 損 した も の で あ る 、 項 1 ~ 3 の 何 れ か に 記 載
の形 質転 換 体 。
(c)
プ レ フ ェ ン酸 デ ヒ ドラ タ 一 ゼ （prephenate
dehydratase)
活 性 を有 す る酵
素 を コ 一 ドす る 退 伝 子
(d)
フ エ ノ ー ル 2 - モ ノ 才 キ シ ゲ ナ 一 ゼ （pheno L 2-monooxygenase)
活 性 を有
す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
項 5 .
宿 主 の コ リネ 型 細 菌 の 以 下 の
（e)
及 び / 又 は （f) の 代 謝 遺 伝 子 が 、 宿
主 で 高 発 現 して い る 項 1 ~ 4 の 何 れ か に 記 載 の 形 質 転 換 体 。
e)
AHP)
DAHP シ ン テ タ 一 セ
synthase)
(3-deoxy-D-arab
i no-heptu
Losonate
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
7 - phosphate
(D
コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ
(f)
卜す る 退
項 6 .
仏
（chor i smate
mutase)
活 性 を有 す る酵 素 を コ 一
子
宿 主 の コ リネ 型 細 菌 が コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
ダル タ ミ カ ム で あ る項 1
〜 5 の何 れ か に記 載 の形 質転 換 体 。
項 7 .
宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ウ 厶
グ ル ミ カ ム R (FERM
P _ 18976)
グ ル タ ミ カ ム が 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
、 ATCC 13032,
又 は ATCC1 3869 で あ る 項 6 に 記
載 の形 質転 換 体。
項 8 .
宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ウ 厶
グ ル タ ミ カ ム が 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
グ ル ミ カ ム R (FERM
P _ 18976)
在 す る 下 記 （c) 及 び /
又 は （d) の 遺 伝 子 が 破 壊 さ れ 、 又 は 欠 損 した も の で あ る
、 ATCC 13032,
又 は ATCC1 3869 の 染 色 体 上 に 存
、 項 6 に記 載 の形 質転 換 体 。
プ レ フ ェ ン 酸 デ ヒ ドラ タ 一 ゼ （prephenate
(c)
dehydratase)
活 性 を有 す る酵
素 を コ 一 ドす る 退 伝 子
フ エ ノ ー ル 2- モ ノ 才 キ シ ゲ ナ 一 ゼ
(d)
（pheno L 2-monooxygenase)
活 性 を有
す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
項 9 .
宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ウ 厶
グ ル ミ カ ム R (FERM
の （e) 及 び /
P _ 18976)
グ ル タ ミ カ ム が 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
、 ATCC 13032,
又 は ATCC1 3869 に お い て 、 以 下
又 は （f) の 代 謝 遺 伝 子 が 高 発 現 して い る も の で あ る 、 項 6 又 は 8
に記 載 の形 質転 換 体 。
)
DAHP シ ン テ タ 一 セ
(3-deoxy-D-arab
synthase)
(f)
コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ
項 1 0 .
76)
仏
Losonate
7 - phosphate
(D
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
AHP)
卜す る 退
i no-heptu
（chor i smate
mutase)
活 性 を有 す る酵 素 を コ 一
子
コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム PHE7
( 受 託 番 号 ：NITE
BP-9
形 質転換 体。
項 1 1 .
項 1 ~
1 0 の 何 れ か に記 載 の 形 質 転 換 体 を、 還 元 条 件 下 、 糖 類 を
含 有 す る 反 応 液 中 で 反 応 さ せ る 工 程 と、 反 応 液 中 の フ エ ノ ー ル を 回 収 す る ェ
程 とを含 む フ
I
ノ一ル の製造方法。
項 1 2.
反 応 工 程 に お い て、 形 質転 換 体 が実 質 的 に増 殖 しな い項 1 1 記 載
の フ ヱ ノー ル の 製 造方法。
項 1 3 .
還 元 条 件 下 の反 応 液 の酸 化 還 元 電位 が — 2 0 0 〜 ― 5 0 0 ミ リボ
ル 卜で あ る項 1 1 又 は 1 2 に記 載 の フ エ ノール の製 造 方 法 。
項 14 .
糖 類 が グル コー ス、 フル ク 卜一 ス、 マ ン ノー ス、 キ シ ロー ス、 ァ
ラ ビノ一 ス、 ガ ラ ク 卜一 ス、 ス ク ロー ス、 マル ト一 ス、 ラ ク 卜一 ス、 セ ロ ビ
オ ー ス、 トレハ ロー ス、 及 び マ ンニ トール か らな る群 よ り選 ばれ る もの で あ
る項 1 1 ~ 1 3 の何 れ か に記 載 の フ エ ノール の製 造 方 法 。
発明の効果
[001 0]
本 発 明 の形 質転 換 体 を用 い る こ とに よ り、 従 来 公 知 の形 質転 換 体 に比 べ て
、 糖 類 か らフ エ ノ ー ル を高効 率 で製 造 す る こ とが で きる。
一般 に微 生物 は フ エ ノ一ル の よ うな溶 剤 の細 胞 毒 性 に よ り生 育 が 阻害 され
るた め、 微 生物 を用 い て フ エ ノ ー ル を製 造 す る こ とは 困難 で あ つた が、 本 発
明方 法 に よれ ば、 微 生物 を用 い て、 実 用 上 十 分 に効 率 良 くフ エ ノ ー ル を製 造
す る こ とが で きる。
図面の簡単な説明
[001 1]
[ 図 1] 各 種 の微 生物 の 好 気 条 件 下 に お け る増 殖 に及 ぼ す フ エ ノ一ル の影 響 を示
す 図 で あ る。
[ 図 2 ] コ リネバ クテ リゥ厶 の還 元 条 件 下 に お け る糖 消 費 に及 ぼ す フ エ ノ一ル の
影 響 を示 す 図 で あ る。
[ 図 3 ] 実 施 例 で 用 い た各 種 プ ラ ス ミ ドの構 築 図 で あ る。
[ 図 4 ] 実 施 例 で 用 い た各 種 プ ラ ス ミ ドの構 築 図 で あ る。
発明を実施するための形態
[001 2 ]
以 下、 本 発 明 を詳 細 に説 明 す る。
( I )
フ ヱ ノ ー ル 生 産 能 を有 す る形 質転 換 体
本 発 明 の フ エ ノ ー ル 生産 能 を有 す る形 質転 換 体 は、 チ ロ シ ン フ エ ノ一ル リア一 ゼ (tyros
i ne pheno L- Lyase)
活 性 を有 す る酵 素 を コー ドす る遺 伝 子 が
、 宿 主 の コ リネ型 細 菌 に導 入 され た形 質転 換 体 で あ る。
[00
13 ]
コ リネ 型 細 菌 と は 、 バ 一 ジ 一 ズ
テ リ才 ロ ン 一
99
[Ba rgeys
Manua
マ ニ ュ アル
L of
D e t e r m i nat
デ タ一 ミネ ィテ ィプ
ive
Bac t e r i o Logy
バ ク
V o L.
、
8、 5
〕 に 定 義 さ れ て い る 一 群 の 微 生 物 で あ り、 通 常 の 好 気 的 条 件 で 増
( 1 974)
殖 す る も の な ら ば 特 に 限 定 さ れ る も の で は な い 。 具 体 例 を 挙 げ れ ば 、 コ リネ
パ ク テ リ ゥ 厶 属 菌 、 プ レ ビパ ク テ リ ゥ 厶 属 菌 、 ア ー ス ロ バ ク タ 一 属 菌 、 マ イ
コ バ ク テ リ ゥ 厶 属 菌 、 マ イ ク ロ コ ッ カ ス 属 菌 等 が 挙 げ られ る 。 コ リネ 型 細 菌
の 中 で は コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 属 菌 が 好 ま しい 。
[00
コ リ ネ バ ク テ リ ウ 厶 属 菌 と して は 、 コ リ ネ バ ク テ リ ゥ 厶
14 ]
コ リ ネ ンくク テ リ ウ 厶
不 ノヾ
、ク テ リ ゥ 厶
エ フ イシ エ ン ス
(Co r ynebac
t e
iu
ダル タ ミ カ ム、
、 コ リ
e f f i c i ens)
ア ン モ ニ ア ケ 不 ス
(Co r ynebac
t e r i u m ammon i agenes)
卜レラ ン ス
(Co r ynebac
t e r i u m h a Lo t o Le r ance)
リ 木 ノヾク テ リ ク ム
ノヽロ
リ 不 ノヾ
、ク テ リ ウ ム
ァ リレ力 ノ リテ ィ カ ム
(Co r ynebac
t e r i u m a Lkano
、 コ
、 コ
Ly t i cum)
等 が 挙 げ られ る 。 中 で も 、 安 全 で か つ フ エ ノ ー ル 生 産 性 が 高 い 点 で 、 コ リネ
パ クテ リゥ厶
リウ厶
CC 1 3232
746
6)
15 ]
(Co r ynebac
t e
株 、 ATCC 1 376 1 株 、 ATCC 14020 株 、 ATCC3 1 8 3 1 株 、 MJ-233
、
( FERM
ATCC 1 3032
BP- 1498)
P - 1 8976)
um)
（FERM
、 フ レ ビ ノ义、ク テ リ ク ム テ
、
'
、 コ リ 不 ノヾ
、ク テ リ ウ 厶
【
こ国 名 力《糸
允一 さ れ て し、る
i bac t e r i u m d i v a r i cat
u m DSM
20297T,
フ ラバ ム
ラ ク トフ ア ー メ ン タ ム
イ ノく リ カ タ ム
リ リゥ厶
等 の コ リネ 型 細 菌 も コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
i cum)
BP- 1497)
P - 1 897
株 、 ATCC 1 3869 株 が 好 ま し い 。
La c t o f e rmen t um)
d i v a r i cat
( FERM
等 が 挙 げ ら れ る 。 中 で も 、 R株
、 プ レ ビ ンくク テ リ ゥ 厶
i u m f Lavum)
Lu t a
( FERM
株 、 ATCC 1 3286 株 、 ATCC 1 3287 株 、 ATCC 1 3655 株 、 ATCC 1 3745 株 、 ATCC 1 3
な お 、 分 子 生 物 学 的 分 類 に よ り、 プ レ ビ パ ク テ リ ゥ 厶
m
R株
i u m g Lu t a m i cum)
株 、 ATCC 1 3869 株 、 ATCC 1 3058 株 、 ATCC 1 3059 株 、 ATCC 1 3060 株 、 A T
MJ-233AB-41
、
[00
ダル タ ミ カ ム
ATCC 1 3032
、
ダ ル タ ミ カ ム が 好 ま し い 。 好 適 な 菌 株 と して 、 コ リ ネ バ ク テ
(Co r ynebac
グル タ ミ カ ム
L i e b L,
W.
et
（B
r e v i bac t e
( B r e v i bac t e r i u
( B r e v i bac t e r i u m
t e r i um
L i L i um)
（Co r ynebac
a L. ,
T r ansfe
" B r e v i bac t e r i u m f Lavum"
t e r i um g
r
DSM
of
Br ev
2041
1,
"Brev
cter
i bacter
i u m Lactof
i u m g Lutam i cum
terns.
オ ル
Int
J Syst
ermentum"
and
DSM 2041 2 and
the i r d i s t i nct
Bacter
i o L.
i on by
バ クテ リゥ厶
gene
フ ラ バ ム の MJ-233 株
i bacter
、 MJ-233AB-41
BP-1497)
（FERM
g Lob i form
グ ロ ビ フ オル ミ ス
( 例 え ば ATCC1 921 0 株 、 ATCC27289
bov i s )
f reudenre
ク ロコ ッカス
- 13222)
ich i i)
ルテ ウス
（M
( 例 え ば No.
i crococcus
)、 マ イ ク ロコ ッカス
0 10 株 ） 、 マ イ ク ロ コ ッ カ ス
239 株
Leuteus)
ウ レァ ェ
ロゼ ウス
（M
（M
ボ ビス
（Mycobact
株 ) 等 が 挙 げ られ る 。
マ イ ク ロ コ ッ カ ス 属 菌 と して は 、 マ イ ク ロ コ ッ カ ス
i crococcus
（A
株 ） 等 が 挙 げ られ る 。
マ イ コ バ ク テ リ ウ 厶 属 菌 と して は 、 マ イ コ バ ク テ リ ゥ 厶
iu
ア ンモニ アゲ ネ ス
( 例 え ば ATCC801 0 株 、 ATCC4336 株 、 ATCC21 056 株
is)
、 ATCC31 250 株 、 ATCC31 738 株 、 ATCC35698
e
（FERM
( 例 え ば ATCC6872 株 ) 等 が 挙 げ ら れ る 。
i u m ammon i agenes)
rthrobacter
株
ダル タ ミ カ ム で あ る。
ア ー ス ロ バ ク タ 一 属 菌 と して は 、 ア ー ス ロ バ ク タ 一
[001 6 ]
r i c t i o n pat
ラ ク トフ ア ー メ ン タ ム ATCC1 3869 株 、 プ レ ビ
プ レ ビ バ ク テ リ ウ 厶 属 菌 と して は 、 プ レ ビ パ ク テ リ ゥ 厶
(Brev
rest
Coryneba
( 1987) 〕 。
な ど も 好 適 な コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
BP-1498)
rRNA
and
( 1991 ) 、 駒 形 和 男 ら ， コ リ ネ フ
4 1 : 255-260.
厶 細 菌 の 分 類 ， 発 酵 と 工 業 ， 45: 944-963
旧 分 類 の プ レ ビパ ク テ リ ゥ 厶
141 2 ,
DSM
(FERM
P-1 3221 )
( 例 え ば No.
i crococcus
i crococcus
フ ロイデ ンライ ヒ
ureae)
roseus)
（M
、 マイ
)
240 株
(FERM
P
( 例 え ば IAM1
( 例 え ば IF03
764 株 ） 等 が 挙 げ ら れ る 。
[001 7 ]
ま た 、 コ リネ 型 細 菌 は 、 野 生 株 の 他 に 、 そ の 変 異 株 や 人 為 的 な 遺 伝 子 組 換
え 体 で あ っ て も よ い 。 例 え ば 、 ラ ク テ 一 卜 （乳 酸 ） デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ
t e dehydrogenase
(phosphoeno
dehydrogenase)
：LDH)
Lpyrvate
（Lacta
、 フ ォ ス フ 才 エ ノ 一 ル ピ ル べ 一 卜カ ル ボ キ シ ラ 一 ゼ
carboxy
lase)
、 マ レ 一 卜テ ヒ ドロ ケ ナ 一 セ
(ma Late
な ど の 遺 伝 子 の 破 壊 株 が 挙 げ られ る 。 こ の よ う な 遺 伝 子 破 壊
株 を 宿 主 と して 用 い る こ と に よ り、 フ エ ノ ー ル の 生 産 性 を 向 上 さ せ た り、 畐I」
生 成 物 の 生 成 を 抑 制 した り す る こ と が で き る 。
中 で も 、 ラ ク テ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ 遺 伝 子 の 破 壊 株 が 好 ま し い 。 こ の 遺
伝 子 破 壊 株 は 、 乳 酸 デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ 遺 伝 子 が 破 壊 さ れ て い る こ と に よ り、
ピル ビ ン酸 か ら乳 酸 へ の 代 謝 経 路 が 遮 断 さ れ て い る 。 中 で も 、 コ リネ バ ク テ
リ ウ 厶 ダ ル タ ミ カ ム の 、 特 に R (FERM P-1 8976)
株 の ラ ク テ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ
ナ 一 ゼ 遺 伝 子 の 破 壊 株 が 好 ま しい 。
こ の よ う な 遺 伝 子 破 壊 株 は 、 遺 伝 子 工 学 的 手 法 に よ り常 法 に 従 い 作 製 で き る
。 例 え ば、 W O 2 0 0 5 /
0 1 0 1 8 2 A 1 に 、 乳 酸 デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ 破 壊
株 、 及 び そ の 作 製 方 法 が 記 載 さ れ て い る。
[001 8 ]
チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 酵 素 遺 伝 子 （tp L)
チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ 酵 素 は 、 下 記 の 2 反 応 を 触 媒 す る 酵 素 で あ
る。
[ 化 1]
チ ロシ ン + H
2
O
フ エ ノ ー ル + ピル ビ ン 酸 + N H 3
カ テ コー ル + ピル ビ ン 酸 + N H 3→ L _ D O P A + H 2 0
チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リァ 一 ゼ 活 性 を 有 す る 酵 素 を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 由
来 は 特 に 限 定 さ れ な い が 、 パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス （Pantoea
s)
由 来 の 遺 伝 子 、 シ 卜ロバ ク タ 一 プ ラ ッ キ 一
の 遺 伝 子 、 デ ス レフ
hafn i ense)
o f Lexus
c punct
o La)
aurant
クテ リュ一 厶
（C
i i)
由来
（Desu Lf i tobacter
i um
i t robacter
フニ エ ンス
agg Lomeran
braak
由 来 の 遺 伝 子 、 ク ロ ロ フ レクサ ス 才 ウ ラ ンテ ィ ア カ ス
i acus)
由 来 の 遺 伝 子 、 ノ ス 卜ッ ク
（Ch
Lor
《ン ク チ フ 才リレメ (Nosto
i f orme) 由 来 の 這 伝 子 、 卜レポ 不 マ テ ン テ ィ コ ラ (Treponema
dent i c
由 来 の 遺 伝 子 が 好 ま しい 。 中 で も 、 パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス 、 シ 卜
ロバ ク タ 一 プ ラ ッ キ 一 、 又 は デ ス ル フ ィ 卜バ ク テ リ ュ ー ム ハ フ 二 エ ン ス 由
来 の 遺 伝 子 が 好 ま し く、 シ 卜ロバ ク タ 一 ブ ラ ッ キ ー 由 来 の 遺 伝 子 が よ り好 ま
しい 。
[001 9 ]
パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ 酵 素 遺 伝
子 と して は 、 配 列 番 号 3 6 の 塩 基 配 列 か らな る DNA が 挙 げ られ 、 シ 卜ロバ ク タ 一
プ ラ ッ キ 一 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ 酵 素 遺 伝 子 と して は 、 配 列
番 号 3 9 の 塩 基 配 列 か らな る DNA が 挙 げ られ 、 デ ス ル フ ィ
バ クテ リュ ー ム
フニ エ ン ス 由来 の チ ロシ ン フ エ ノール- リア一 ゼ酵 素 遺伝 子 と して は、 配 列
番 号 4 2 の塩 基 配 列 か らな るDNA が挙 げ られ、 ク ロ ロフ レクサ ス 才 ウラ ンテ ィ
ァ カス 由来 の チ ロシ ン フ エ ノール- リア一 ゼ酵 素 遺伝 子 と して は、 配 列番 号 4
5 の塩 基 配 列 か
らな るDNA が挙 げ られ、 ノス トック パ ンクチ フ オル メ由来 の チ
口シ ン フ エ ノール- リア一 ゼ酵 素 遺伝 子 と して は、 配 列番 号 4 8 の塩 基 配 列 か
らな るDNA が挙 げ られ、 卜レポ ネマ デ ンテ ィコラ由来 の チ ロシ ン フ エ ノール
- リァ― ゼ酵 素 遺伝 子 と して は、 配 列番 号 5 1 の塩 基 配 列 か らな るDNA が挙 げ ら
れ る。
[0020]
また、 本 発 明 で は、 配 列番 号 3 6 、 3 9 、 4 2 、 4 5 、 4 8 、 又 は 5 1 の塩 基 配 列 と相
補 的 な塩 基 配 列 か らな るDNA とス 卜リンジ ェ ン 卜な条 件 でハ イ プ リダイ ズ し、
か つ チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リァ一 ゼ活性 を有 す るポ リぺ プチ ドを コ一 ドす るD
NA も使 用 で きる。
[002 1]
本 発 明 にお いて 「ス トリンジ ェ ン 卜な条 件 」 は、 一般 的 な条 件、 例 え ば、 M
0 Lecu La r
C Lo n i ng,
A Labo r a t o r y Manua l ,
Second
Ed i t i on, 1989, Vo L2,
4 5 に記載 され た条 件 を指 す。 具 体 的 には、 完全 ハ イ ブ リッ
1 1.
ドの融 解 温度 （T m
) よ り5 ~ 10 °C 低 い温度 でハ イ プ リダイゼ 一 シ ヨンが起 こる場 合 を指 す。
チ ロシ ン フ ヱ ノ一ル- リァ一 ゼ活性 は、 後 述 す る実施 例 3 に記載 の方 法 で
測 定 で きる。
また、 本 発 明 で は、 配 列番 号 3 6 、 3 9 、 4 2 、 4 5 、 4 8 、 又 は 5 1 の塩 基 配 列 と同
—性 が 90% 以 上、 好 ま しくは 95% 以 上、 よ り好 ま しくは 98% 以 上 の塩 基 配 列
か らな り、 か つ チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア一 ゼ活性 を有 す るポ リペ プチ ドを
コ 一 ドす るDNA も使 用 で きる。
塩 基 配 列 の 同一性 は、 GENETYX v e r . 8 (GENETYX 株 式会社 ゼ ネテ イ ツクス製
) に よ り算 出 した値 で あ る。
[0022]
配 列番 号 3 6 、 3 9 、 4 2 、 4 5 、 4 8 、 又 は 5 1 の塩 基 配 列 か らな るDNA の ホ モ ログは
、 例 え ば、 これ らの塩 基 配 列 に基 づ き常法 に従 い設 計 した プライマ 一又 は プ
ロー プを用 いた PCR 又 はハ イ プ リダイゼ 一 シ ョンに よ り、 他 生物 種 のDNA ライ
プラ リー か ら選 択 す る こ とが で き、 これ に よ り高確 率 で チ ロシ ン フ エ ノール
- リ ァ 一 ゼ 活 性 を 有 す る ポ リべ プ チ ドを コ 一 ドす る DNA が 得 ら れ る 。
[0023]
形 質転 換 の ため のベ クタ一 の構 築
PCR で 増 幅 した チ ロ シ ン
フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 酵 素 を コ ー ドす る DNA は 、 宿
主 で増 幅 で きる適 切 なベ ク タ一 に ク ロ一 ニ ン グす れ ば よ い。
プ ラ ス ミ ドベ ク タ 一 と して は 、 コ リ ネ 型 細 菌 内 で 自 律 複 製 機 能 を 司 る 遺 伝
子 を 含 む も の で あ れ ば 良 い 。 そ の 具 体 例 と して は 、 プ レ ビパ ク テ リ ゥ 厶
ク トフ ア ー メ ン タ ム
特 開 昭 58-67699
d-produc
ence
of
ys i s of
.
the
ゥ厶
et
aし,
i nformat
B i o し Chem.
i nat i o n o f
ic
Lasm i d s
14 、 pAG50
Last
〕 及び
the
nuc leot
i d e sequ
comp lete
Lasm i d pAM330
Ser.
J.
i n g lutam
iol.
〕 及 び pCRY30
( 1984)
Lasm i d part
i c a c i d-produc
i t i o n funct
5 7 : 759-764
i on
( 1991 )
i on of
i o し 、 15 9 : 306-31
vectors
for
.
102: 93-98
Corynebacter
c Lon i ng,
cont
( 1991 )
the
ana L
16 : 265 - 267
1
i on,
ia
Y.
orm
〔
et
bact
〕 、 コ リネ バ ク テ リ
[Katsumata,
R.
i a wi t
〕 、 pAG1 、 pAG3 、 pAG
( 1984)
express
[Kurusu,
i ng bacter
E i kmanns,
i u m g Lutam i cum/Escher
r o l Led gene
i ng bacter
i n corynef
g Lutamate-produc
〔
特 開 昭 62-1 66890 〕 、 pEK0 、 pEC5 、 pEKExl
A fam i Ly o f
Gene,
Bacter
and
ダ ル タ ミ カ ム ATCC1 3058 由 来 の pHM1 5 1 9
48: 2901 -2903
t ransformat
i c ac i
( 1984)
ダ ル タ ミ カ ム T250 由 来 の pCG4 〔
特 開 昭 57-1 83799 〕 、
Protop
i n g lutam
〔
48: 2901 -2903
Nuc Le i c Ac i d s Symp.
Lasm i d s
Mi crob
ic
ermentum
i on.
2256 由 来 の pAM330
ermentum)
a し ， Crypt
i u m Lactof
Crypt
Env i ron.
h p Lasm i d DNA.
[0024]
ic
et
Determ
i f i cat i o n o f
App L.
a L. ,
a L. ,
aし,
B i o し Chem.
Ident
i a.
et
R.
K.
Agr i c .
Brev i bacter
et
Agr i c .
e
i a.
i t s genet
K.
a L. ,
i,
M i wa,
i u m Lactof
〕 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
( 1985)
Mi wa,
〕、
i ng bacter
[Yamaguch
（Brev i bacter
ラ
B. J .
et
i c h i a c o L i shutt
Le
and
promoter
prob i ng
〕 な ど が 挙 げ られ る 。
好 ま しい プ ロ モ ー タ 一 と して は 、 コ リ ネ パ ク テ リ ゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム R由 来
の ダ リセ ル ア ル デ ヒ ド3 - フ ォ ス フ エ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ A 遺 伝 子 （gapA) の プ
口 モ ー タ 一 PgapA 、 マ レ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ 遺 伝 子
mdh 、 ラ ク テ 一 卜デ ヒ ドロ ゲ ナ 一 ゼ A 遺 伝 子
（LdhA)
（mdh)
の プ ロモー タ一P
の プ ロ モ ー タ 一 P LdhA な ど
が 挙 げ られ 、 中 で も、 PgapA が 好 ま しい。
好 ま しい タ ー ミネ ー タ 一 と して は、 大 腸 菌 rRNA オ ペ ロ ンの r rnB
ミネ
T 1 T2
タ一
一 タ ー 、 大 腸 菌 の t rpA タ ー ミネ ー タ 一、 プ レ ビパ クテ リゥ厶 ラ ク トフ
ァ一 メ ン タ ム (Brev i bacter
i u m Lactof ermentum)
が 挙 げ られ 、 中 で も、 r rnB
T 1 T2
t r
タ 一 ミ不 一 タ 一 な こ
タ ー ミネ ー タ 一 が 好 ま しい。
2
形 質 転 換 方 法 は、 公 知 の 方 法 を制 限 無 く使 用 で き る。 この よ うな 公 知 の 方
法 と して、 例 え ば塩 化 カル シ ウム / 塩 化 ル ビジ ウム 法 、 リン酸 カル シ ウム 法
、 D E A E —デ キ ス トラ ン介 在 トラ ンス フ エ ク シ ヨン、 電 気 穿 孔 法 な どが 挙
げ られ る。 中 で も、 コ リネ型 細 菌 に は、 電 気 パ ル ス法 が 好 適 で あ り、 電 気 パ
ソ
レス） よ、 公 矢口の 力
i o n system
for
Corynef
i c . B i o し Chem.
sence
.
[0026]
of
r r-
）:
[Kurusu,
Y.
orm bacter
54:443-447
e t a L. ,
E Lect roporat
i a by auxot roph i c comp Lementat i on.
( 1 990)
〕 及び
and mcr- Li k e rest r i c t i o n systems
es . Mi crob i o l .
144: 18 1 - 18 5
i on-t ransformat
( 1 993)
Ag
〔Vertes A. A. e t a し， Pre
i n Corynef
orm bacter
ia
〕 に よ り行 う こ とが で き る。
形 質 転 換 体 は、 微 生 物 の 培 養 に通 常 使 用 され る培 地 を用 い て 培 養 す れ ば よ
し、
。 この 培 地 と して は、 通 常 、 炭 素 源 、 窒 素 源 、 無 機 塩 類 及 び そ の他 の 栄 養
物 質 等 を含 有 す る天 然 培 地 又 は合 成 培 地 等 を用 い る こ とが で き る。
炭 素 源 と して は、 グル コー ス、 フル ク 卜一 ス、 ス ク ロー ス、 マ ン ノー ス、
マ ル ト一 ス、 マ ンニ 卜一 ル 、 キ シ ロー ス、 ァ ラ ビ ノー ス、 ガ ラ ク 卜一 ス、 澱
粉 、 糖 蜜 、 ソル ビ 卜一 ル 、 グ リセ リン等 の糖 質 又 は糖 アル コー ル ；酢 酸 、 ク
ェ ン酵 、 乳 酸 、 フマ ル 酸 、 マ レイ ン酸 又 は ダル コ ン酸 等 の有 機 酸 ；ェ タ ノ一
ル 、 プ ロパ ノー ル 等 の アル コー ル 等 が 挙 げ られ る。 また、 所 望 に よ り ノル マ
ル パ ラ フ ィ ン等 の炭 化 水 素 等 も用 い る こ とが で き る。 炭 素 源 は、 1 種 を単 独
で使 用 で き、 又 は 2 種 以 上 を混 合 して使 用 して も よ い。 培 地 中 の これ ら炭 素
源 の濃 度 は、 通 常 、 約 0 . 1~ 10 (w/
v %)
とす れ ば よ い。
窒 素 源 と して は、 塩 化 ア ンモ ニ ゥ厶、 硫 酸 ア ンモ ニ ゥ厶、 硝 酸 ア ンモ ニ ゥ
厶、 酢 酸 ア ンモ ニ ゥ厶 等 の 無 機 又 は有 機 ア ンモ ニ ゥ厶 化 合 物 、 尿 素 、 ア ンモ
ニ ァ 水 、 硝 酸 ナ トリウ ム 、 硝 酸 カ リウ ム 等 が 挙 げ られ る。 ま た 、 コ ー ン ス テ
ィ一 プ リカ 一 、 肉 エ キ ス 、 ペ プ トン、 NZ — ァ ミ ン、 蛋 白 質 加 水 分 解 物 、 ア ミ
ノ酸 等 の 含 窒 素 有 機 化 合 物 等 も使 用 で き る。 窒 素 源 は 、 1 種 を 単 独 で 使 用 し
て も よ く、 ま た 2 種 以 上 を 混 合 して 使 用 して も よ い 。 培 地 中 の 窒 素 源 濃 度 は
、 使 用 す る窒 素 化 合 物 に よ っ て も異 な る が 、 通 常 、 約 0 . 1~ 10 (w/
と
v % )
す れ ば よ い。
無 機 塩 類 と して は 、 例 え ば リ ン酸 第 一 カ リウ ム 、 リ ン酸 第 二 カ リウ ム 、 硫
酸 マ グ ネ シ ウ ム 、 塩 化 ナ トリウ ム 、 硝 酸 第 一 鉄 、 硫 酸 マ ン ガ ン、 硫 酸 亜 鉛 、
硫 酸 コバ ル ト又 は 炭 酸 カ ル シ ウ ム 等 が 挙 げ られ る。 これ ら無 機 塩 は 、 1 種 を
単 独 で 使 用 して も よ く、 ま た 2 種 以 上 を 混 合 して 使 用 して も よ い 。 培 地 中 の 無
機 塩 類 濃 度 は 、 使 用 す る 無 機 塩 に よ っ て も異 な る が 、 通 常 、 約 0 . 0 1 ~ 1 (w/
v
)
とす れ ば よ い。
栄 養 物 質 と して は 、 例 え ば 肉 エ キ ス 、 ペ プ トン、 ポ リペ プ トン、 酵 母 ェ キ
ス 、 乾 燥 酵 母 、 コ 一 ン ス テ ィ一 プ リカ 一 、 脱 脂 粉 乳 、 脱 脂 大 豆 塩 酸 加 水 分 解
物 、 又 は 動 植 物 若 し くは 微 生 物 菌 体 の エ キ ス や そ れ らの 分 解 物 等 が 挙 げ られ
る。 栄 養 物 質 の 培 地 濃 度 は 、 使 用 す る 栄 養 物 質 に よ っ て も異 な る が 、 通 常 、
約 0 . 1~ 10 (w/
v % )
と す れ ば よ い 。 さ ら に、 必 要 に 応 じて 、 ビ タ ミ ン類 を
添 加 す る こ と も で き る。 ビ タ ミ ン類 と して は 、 例 え ば 、 ビ才 チ ン、 チ ア ミ ン
( ビ タ ミ ン B 1 ) 、 ピ リ ドキ シ ン （ビ タ ミ ン B6)
、 パ ン トテ ン 酸 、 イ ノ シ 卜一
ル 、 ニ コ チ ン酸 等 が 挙 げ られ る。
培 地 の p H は 約 5 ~ 8 が 好 ま しい 。
好 ま しい 微 生 物 培 養 培 地 と して は 、 A 培 地 〔Inu i ,
na Lys i s o f
oduct
i ons
techno
cter
Corynebacter
under
し 7 : 182-1 9 6
depr i vat i o n cond i t i ons.
(2004)
J.
〕 、 BT 培 地 [Omumasaba,
ATP- dependent
8 : 9 1 - 103 (2004)
et
i u m g Lutam i cum dur i ng Lactate
i u m g Lutam i cum g Lycera
i t h oppos i te,
L.
oxygen
M.
Ldehyde-3-phosphate
regu lat i on.
〕 等 が 挙 げ られ る。
a L. ,
and
Mo し
C. A.
et
Metabo l i c a
succ i nate
Mi crob i o l .
Mo L.
Bi o
a し ， Coryneba
dehydrogenase
J.
pr
Mi crob i o l .
i soforms
B i otechno
培 養 温 度 は 約 1 5 ~ 4 5 °C と す れ ば よ く、 培 養 時 間 は 約 1 ~ 7 日 間 と す れ
ば よ い。
[0028]
宿 主染 色 体 遺伝 子 の破 壊 又 は欠 失
宿 主 の コ リ ネ 型 細 菌 は 、 そ の 染 色 体 上 に 存 在 す る プ レ フ ェ ン 酸 デ ヒ ドラ タ
— ゼ 、prephenate
、及び
dehydratase)
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ 一 ドす る 遺 伝 子 (pheA)
又 は フ エ ノ 一 ル 2- モ ノ才 キ シ ゲ ナ 一 ゼ
(pheno
l 2-monooxygenase)
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子 （poxF) が 、 破 壊 さ れ 、 ま た は 欠 失 して
い る こ と が 好 ま し く、 こ れ に よ り 一 層 効 率 良 く フ エ ノ ー ル を 製 造 す る こ と が
で き る 。 pheA 及 び poxF が 共 に 破 壊 さ れ 、 ま た は 欠 失 して い る こ と が よ り 好 ま
しい 。
遺 伝 子 の 部 分 配 列 を 欠 失 し、 正 常 に 機 能 す る 酵 素 タ ン パ ク 質 を 産 生 しな い
よ う に 改 変 した 欠 失 型 遺 伝 子 を 作 製 し、 該 遺 伝 子 を 含 む D N A で 細 菌 を 形 質
転 換 して 、 欠 失 型 遺 伝 子 と 染 色 体 上 の 遺 伝 子 と で 相 同 組 換 え を 起 こ さ せ る こ
と に よ り、 染 色 体 上 の 遺 伝 子 を 欠 失 型 又 は 破 壊 型 の 遺 伝 子 に 置 換 す る こ と が
で き る 。 欠 失 型 又 は 破 壊 型 の 遺 伝 子 に よ っ て コ 一 ドさ れ る 酵 素 タ ン パ ク 質 は
、 生 成 した と して も 、 野 生 型 酵 素 タ ン パ ク 質 と は 異 な る 立 体 構 造 を 有 し、 機
能 が 低 下 又 は 消 失 して い る 。 こ の よ う な 相 同 組 換 え を 利 用 した 遺 伝 子 置 換 に
よ る 遺 伝 子 欠 失 又 は 破 壊 は 既 に 確 立 して お り、 温 度 感 受 性 複 製 起 点 を 含 む プ
ラ ス ミ ド、 接 合 伝 達 可 能 な プ ラ ス ミ ドを 用 い る 方 法 、 宿 主 内 で 複 製 起 点 を 持
た な い ス ィ サ イ ドベ ク タ 一 を 利 用 す る 方 法 な ど が あ る （米 国 特 許 第 6303383 号
、 特 開 平 05-007491
号 ）。
具 体 的 に は 、 実 施 例 2 の 項 目 に 記 載 の 方 法 に よ り、 プ レ フ I
ン 酸 デ ヒ ドラ
タ 一 ゼ 酵 素 遺 伝 子 や 、 フ エ ノ 一 ル 2- モ ノ才 キ シ ゲ ナ 一 ゼ 酵 素 遺 伝 子 が 破 壊 又
は 欠 失 した コ リ ネ 型 細 菌 を 得 る こ と が で き る 。
[0029]
代 -謝 遣 ィ
云チ の
ϊ
現.
宿 主 の コ リ ネ 型 細 菌 は 、 DAHP シ ン テ タ 一 ゼ
nate
7-phosphate
ン酸 厶 タ 一 ゼ
(DAHP)
(chor
i smate
synthase)
mutase)
遺伝子
遺伝子
（3-deoxy-D-arab
i no-heptu
（aroG) 、 及 び /
又 は コ リス ミ
（csm)
Loso
が 、 宿 主 の 本 来 の レベ ル
、 即 ち 野 生 型 宿 主 の レベ ル よ り高 発 現 して い る こ と が 好 ま しい 。 こ の 高 発 現
は 、 形 質 転 換 に よ る 遺 伝 子 導 入 、 又 は 宿 主 染 色 体 上 の 遺 伝 子 の コ ピ一 数 を 高
め る こ と に よ り達 成 さ れ る 。 a r o G 及 び csm が 共 に 高 発 現 して い る こ と が よ り好
ま しい 。
形 質 転 換 に つ い て 述 べ れ ば 、 導 入 す る DAHP シ ン テ タ 一 ゼ 遺 伝 子 及 び コ リス
ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 は 、 宿 主 の 遺 伝 子 と 同 じ又 は 実 質 的 に 同 じDAHP シ ン テ
タ 一 ゼ 遺 伝 子 及 び コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 で も よ く、 そ の 他 の DAHP シ ン
テ タ 一 ゼ 遺 伝 子 及 び コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 で あ っ て も よ い 。 宿 主 の 遺
伝 子 と 同 じ又 は 実 質 的 に 同 じ、 DAHP シ ン テ タ 一 ゼ 遺 伝 子 及 び / 又 は コ リス ミ
ン酸 厶 タ ー ゼ 遺 伝 子 を 導 入 す る 方 が 好 ま しい 。
例 え ば 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム 由 来 の DAHP シ ン テ タ 一 ゼ 遺 伝 子
と して は 、 配 列 番 号 3 0 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA が 挙 げ られ 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ
厶 ダ ル タ ミ カ ム 由 来 の コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 と して は 、 配 列 番 号 3 1 の
塩 基 配 列 か ら な る DNA が 挙 げ られ る 。
そ の 他 の コ リネ 型 細 菌 の DHAP シ ン タ 一 ゼ 遺 伝 子 と して は 、 コ リネ バ ク テ リ
ゥ厶
エ フ イシ エ ンス
（Co r ynebac
t e r i u m e f f i c i ens)
号 6 2 、 日 本 DNA デ ー タ バ ン ク ：CE2073)
ス （Mycobac t e r i u m smegmat
バ ン ク ：MSMEG 4244)
is)
由 来 の 遺 伝 子 （酉己列 番
、 マ イ コバ クテ リゥ 厶
ス メ グマテ ィ
由 来 の 遺 伝 子 （配 列 番 号 6 3 、 日 本 DNA デ 一 タ
、 ロ ドコ ッ カ ス
才 パ カ ス （Rhodococcus
opacus)
由
来 の 遺 伝 子 （配 列 番 号 6 4 、 日 本 DNA デ ー タ バ ン ク ：ROP_08400)
な ど が あ り、
コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 と して は 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
エ フ イシ ェ ン
ス 由 来 の 遺 伝 子 （配 列 番 号 6 5 、 日 本 DNA デ ー タ バ ン ク ：CE0929)
テ リゥ 厶
ス メ グ マ テ ィ ス 由 来 の 遺 伝 子 （配 列 番 号 6 6 、 日 本 DNA デ ー タ バ ン ク
：MSMEG_5536)
NA デ
、 マ イ コバ ク
、 ロ ドコ ッ カ ス
ー タ バ ン ク ：R0P 56380)
才 パ カ ス 由 来 の 遺 伝 子 （配 列 番 号 6 7 、 日 本 D
な どが あ る。
ま た 、 DAHP シ ン テ タ 一 ゼ 遺 伝 子 又 は コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 に つ い て
「実 質 的 に 同 じ遺 伝 子 」 と して は 、 当 該 遺 伝 子 が コ 一 ドす る ポ リべ プ チ ドの
ァ ミ ノ酸 配 列 と 9 0 % 以 上 、 好 ま し く は 9 5 % 以 上 、 よ り好 ま し く は 9 8 %
以 上 の 同 一 性 を有 す る ポ リべ プ チ ドで あ って 、 DAHP シ ンテ タ 一 ゼ 活 性 又 は コ
リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 活 性 を有 す る ポ リペ プ チ ドを コ 一 ドす る DNA が 挙 げ られ る
。 ま た 、 DAHP シ ンテ タ 一 ゼ 遺 伝 子 又 は コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 に つ い て
「
実 質 的 に 同 じ遺 伝 子 」 と して は、 当 該 遺 伝 子 と 9 0 % 以 上 、 好 ま し くは 9
5 %
以 上 、 よ り好 ま し くは 9 8 % 以 上 の 同 一 性 を有 す る DNA で あ って 、 DAHP シ
ンテ タ 一 ゼ 活 性 又 は コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 活 性 を有 す る ポ リペ プ チ ドを コ 一
ドす る DNA が 挙 げ られ る。
DAHP シ
ス -4-
ンテ タ 一 ゼ 活 性 の 有 無 は、 ホ ス ホ エ ノ一 ル ビル ビ ン酸 とエ リ トロ一
リン酸 を基 質 と して 反 応 さ せ 、 生 じた 3-deoxy-D-a
e 7-phosphat
p p L.
Env i
e
on.
r a b i no-hept
u Losonat
を、 チ 才 バ ル ビツ ー ル 酸 を 用 い た 発 色 法 に よ り定 量
(DAHP)
Mi c r o b i o
し, 7 4 : 5497-5503
(2008)
. )
（A
す る こ と に よ り検 出 す
る こ とが で き る。
ま た 、 コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 活 性 の 有 無 は、 コ リス ミ酸 を基 質 と して 反 応
後 、 生 じた プ レ フ ェ ン 酸
（p
r ephenat
e)
を終 濃 度 0 . 67N 塩 酸 に よ り フ エ ニ ル
ピル ビ ン酸 （pheny Lp y r uvat e ) に変 換 （
約 10 分 イ ン キ ュベ ー ト） し、 そ の 後 3 2
0 n mの 吸 光 度 増 加
（フ エ 二 ル ビル ビ ン酸 の 生 成 ） に基 づ き検 出 す る こ とが で
き る ( M i c r o b i o l ogy. ,
155,
3382-339
1 (2009)
. )
。
宿 主 染 色 体 上 の DAHP シ ンテ タ 一 ゼ 遺 伝 子 又 は コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子
の コ ピ一 数 を 高 め る方 法 に つ い て 述 べ れ ば、 これ らの 遺 伝 子 を コ リネ 型 細 菌
の 染 色 体 DNA 上 に 多 コ ピー 導 入 す れ ば よ い。 微 生 物 の 染 色 体 DNA 上 に遺 伝 子 を
多 コ ピー で 導 入 す る に は、 染 色 体 DNA 上 に 多 コ ピ一 存 在 す る配 列 を標 的 に利 用
して 、 相 同 糸
且ί ¾ え
bo
Lab.
( 1972) )
）:
(Expe
i men t s i n Mo Lecu La r Gene t i cs,
Co Ld S p r i n g Ha r
に よ り行 う こ とが で き る。 染 色 体 DNA 上 に 多 コ ピー 存 在 す
る配 列 と して は、 レペ テ ィテ ィ ブDNA 、 転 移 因 子 の 端 部 に存 在 す る イ ンバ 一 テ
ッド
リ ピー トが 利 用 で き る。 ま た 、 特 開 平 2 - 109985 号 公 報 に 開 示 さ れ て い
る よ う に、 目的 遺 伝 子 を トラ ン ス ポ ゾ ン と共 に転 移 さ せ て 染 色 体 DNA 上 に 多 コ
ピ一 導 入 す る こ と も可 能 で あ る。 さ らに、 Mu フ ァー ジ を 用 い る方 法 （
特 開平 2
- 109985
号 ） で 宿 主 染 色 体 に 目的 遺 伝 子 を組 み 込 む こ と も で き る。
ま た 、 コ リネ 型 細 菌 の 染 色 体 上 の DAHP シ ン テ タ 一 ゼ 遺 伝 子 及 び / 又 は コ リ
[0031 ]
ス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ 一 等 の 発 現 調 節 配 列 を よ り強 力 な も の
に 置 換 す る こ と に よ つ て も 、 こ れ らの 遺 伝 子 の 発 現 を 高 め る こ と が で き る 。
例 え ば 、 tac プ ロ モ 一 タ 一 、 Lac プ ロ モ 一 タ 一 、 t r c プ ロ モ 一 タ 一 、 t r p プ ロ モ
— タ 一 等 が 強 力 な プ ロ モ ー タ 一 と して 知 られ て い る 。 ま た 、 国 際 公 開 WO00/1 8
935 に 開 示 さ れ て い る よ う に 、 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ 一 領 域 に 数 塩 基 の 塩 基 置 換
を 導 入 し、 よ り強 力 な も の に 改 変 す る こ と も 可 能 で あ る 。 プ ロ モ ー タ 一 の 強
度 の 評 価 法 お よ び 強 力 な プ ロ モ ー タ 一 の 例 は 、 Go Ldste i n らの 論 文 （Prokaryo
t i c promoters
128)
ι n b i otechno
logy.
B i otechno
L.
Annu.
Rev. ,
1995,
1,
10 5 -
等 に記 載 さ れ て い る。 発 現 調 節 配 列 の 置 換 は、 例 え ば、 温 度 感 受 性 ブ ラ
ス ミ ドを 用 い た 遺 伝 子 置 換 と 同 様 に して 行 う こ と が で き る 。
さ ら に 、 リボ ソ ー ム 結 合 部 位
[0032]
（R B S )
と 開 始 コ ドン と の 間 の ス ぺ 一 サ 、
特 に 開 始 コ ドン の す ぐ上 流 の 配 列 に お け る 数 個 の ヌ ク レオ チ ドの 置 換 が mRNA
の 翻 訳 効 率 に 非 常 に 影 響 を 及 ぼ す こ と が 知 られ て お り、 こ れ ら を 改 変 す る こ
と に よ って 、 翻 訳 量 を 向 上 さ せ る こ と も で き る。
上 記 の よ う な 遺 伝 子 置 換 を 行 う方 法 と して は 、 例 え ば 、 温 度 感 受 性 複 製 起
[0033]
点 を 含 む プ ラ ス ミ ド、 接 合 伝 達 可 能 な プ ラ ス ミ ドを 用 い る 方 法 、 宿 主 内 で 複
製 起 点 を 持 た な い ス ィ サ イ ドベ ク タ 一 を 利 用 す る 方 法 な ど が あ る （
米 国特 許
第 6303383 号 明 細 書 、 ま た は 特 開 平 05-007491
[0034]
( I
I )
号 公報 ）。
フ エ ノ一ル の製造方法
上 記 説 明 した 本 発 明 の 形 質 転 換 体 を 、 還 元 条 件 下 、 糖 類 を 含 有 す る 反 応 液
中 で 反 応 さ せ る 工 程 と、 反 応 液 中 の フ エ ノ ー ル を 回 収 す る 工 程 と を 含 む 方 法
に よ り フ エ ノー ル を製 造 す る こ とが で き る。
[0035]
微 生物 の増 殖
反 応 に 先 立 ち 、 形 質 転 換 体 を 好 気 条 件 下 で 、 温 度 約 2 5 ~ 3 8 °C で 、 約 1
2
[0036]
4 8 時 間 培 養 して 増 殖 さ せ る こ と が 好 ま しい 。
培善 用培地
反 応 に先 立 つ形 質 転 換 体 の 好 気 的 培 養 に用 い る培 地 は、 炭 素 源 、 窒 素 源 、
無機 塩 類 お よび その他 の栄養 物 質等 を含有 す る天然 培 地 また は合成 培 地 を用
い る こ とが で きる。
炭 素源 と して、 糖 類 （グル コー ス、 フル ク 卜一 ス、 マ ン ノー ス、 キ シ 口一
ス、 ァ ラ ビノー ス、 ガ ラ ク 卜一 スの よ うな単糖 ；ス ク ロー ス、 マル ト一 ス、
ラ ク 卜一 ス、 セ ロ ビオ ー ス、 キ シ ロ ビ才 一 ス、 トレハ ロー スの よ うな二糖 ；
澱 粉 の よ うな多糖 ；糖 蜜 等 ）、 マ ンニ 卜一ル、 ソル ビ 卜一ル、 キ シ リ 卜一ル
、 グ リセ リンの よ うな糖 アル コール ；酢酸 、 クェ ン酵、 乳酸 、 フマル酸 、 マ
レイ ン酸 、 ダル コ ン酸 の よ うな有機 酸 ；エ タ ノール、 プ ロパ ノール の よ うな
アル コール ；ノル マル パ ラ フ ィンの よ うな炭 化 水 素 等 も用 い る こ とが で きる
炭 素源 は、 1 種 を単 独 で、 又 は 2 種 以 上 を混 合 して使 用 で きる。
[0037]
窒 素源 と して は、 塩 化 ア ンモニ ゥ厶、 硫 酸 ア ンモニ ゥ厶、 硝 酸 ア ンモニ ゥ
厶、 酢酸 ア ンモニ ゥ厶 の よ うな無機 又 は有機 ア ンモニ ゥ厶化 合物 、 尿 素、 ァ
ンモニ ァ水、 硝 酸 ナ トリウム、 硝 酸 カ リウム等 を使 用 で きる。 また、 コー ン
ステ ィ一 プ リカ一、 肉エ キ ス、 ペ プ トン、 NZ —ァ ミ ン、 蛋 白質加 水 分解 物 、
ア ミ ノ酸 等 の含窒 素有機 化 合物 等 も使 用 で きる。 窒 素源 は、 1 種 を単 独 で、
又 は 2 種 以 上 を混 合 して使 用 で きる。 窒 素源 の培 地 中の濃 度 は、 使 用 す る窒
素 化 合物 に よ って も異 な るが、 通 常、 約 0. 1~ 10 (w/
v % ) とすれ ば よい。
無機 塩 類 と して は、 リン酸 第 一 カ リウム、 リン酸 第 二 カ リウム、 硫 酸 マ グ
ネ シ ゥ厶、 塩 化 ナ トリウム、 硝 酸 第 一鉄 、 硫 酸 マ ンガ ン、 硫 酸 亜鉛 、 硫 酸 コ
ノくル
卜、 炭 酸 カル シ ウム等 が挙 げ られ る。 無機 塩 は、 1 種 を単 独 で、 又 は2種
以 上 を混 合 して使 用 で きる。 無機 塩 類 の培 地 中の濃 度 は、 使 用 す る無機 塩 に
よ って も異 な るが、 通 常、 約 0. 0 1 ~ 1 (w/
[0038]
v % ) とすれ ば よい。
栄養 物 質 と して は、 肉エ キ ス、 ペ プ トン、 ポ リペ プ トン、 酵母 エ キ ス、 乾
燥 酵母 、 コー ンステ ィー プ リカ一、 脱 脂 粉 乳、 脱 脂 大豆塩 酸 加 水 分解 物 、 動
植 物 又 は微 生物 菌 体 の エ キ スや それ らの分解 物 等 が挙 げ られ る。 栄養 物 質 の
培 地 中の濃 度 は、 使 用 す る栄養 物 質 に よ って も異 な るが、 通 常約 0. 1~ 10 ( w
/
v
) とすれ ば よい。
さ ら に、 必 要 に 応 じて 、 ビ タ ミ ン類 を 添 加 す る こ と も で き る。 ビ タ ミ ン類
と して は 、 ビ才 チ ン、 チ ア ミ ン （ビ タ ミ ン B 1 ) 、 ピ リ ドキ シ ン （ビ タ ミ ン B6
) 、 パ ン トテ ン酸 、 イ ノ シ 卜一 ル 、 ニ コ チ ン酸 等 が 挙 げ られ る。
培 地 の p H は 約 6 ~ 8 が 好 ま しい 。
具 体 的 な 好 ま しい コ リネ 型 細 菌 用 培 地 と して は 、 A 培 地 〔Inu i ,
Metabo L i c ana lys i s o f
succ i nate
product
i ons
crob i o L.
B i otechno
L.
し, Corynebacter
s e i soforms
L.
B i otechno
Corynebacter
under
oxygen
and
depr i vat i o n cond i t i ons.
J.
し Mi
〕 、 BT 培 地 [Omumasaba,
Ldehyde-3-phosphate
ATP- dependent
8 : 9 1 - 103 (2004)
a L. ,
Lactate
i u m g Lutam i cum g Lycera
L.
et
i u m g Lutam i cum dur i ng
7 : 182-1 9 6 (2004)
i t h oppos i te,
M.
regu lat i on.
Mo
C. A.
et
a
dehydrogena
J.
Mo L.
Mi crob i o
〕 等 が 挙 げ られ る。 これ らの 培 地 に お い て
、 糖 類 濃 度 を 上 記 範 囲 に して 用 い れ ば よ い 。
反応液
反 応 液 と して は 、 炭 素 源 、 窒 素 源 、 無 機 塩 類 お よ び そ の 他 の 栄 養 物 質 等 を
含 有 す る 天 然 培 地 ま た は 合 成 培 地 を 用 い る こ と が で き る。
炭 素 源 と して は 糖 類 を 用 い る。 糖 類 と して は 、 グル コ ー ス 、 フル ク 卜一 ス
、 マ ン ノ ー ス 、 キ シ ロ ー ス 、 ァ ラ ビ ノ ー ス 、 ガ ラ ク 卜一 ス の よ う な 単 糖 ；ス
ク ロ 一 ス 、 マ ル 卜一 ス 、 ラ ク 卜一 ス 、 セ ロ ビ才 一 ス 、 キ シ ロ ビ才 一 ス 、 トレ
ハ ロ ー ス の よ う な 二 糖 ；澱 粉 の よ う な 多 糖 ；糖 蜜 等 が 挙 げ られ る。 中 で も、
単 糖 が 好 ま し く、 グル コ ー ス が よ り好 ま しい 。
炭 素 源 と して 、 糖 類 の 他 に、 マ ン ニ 卜一 ル 、 ソル ビ 卜一 ル 、 キ シ リ 卜一 ル
、 グ リセ リ ン の よ う な 糖 ア ル コ ー ル ；酢 酸 、 ク ェ ン酵 、 乳 酸 、 フ マ ル 酸 、 マ
レイ ン酸 、 ダル コ ン酸 の よ う な 有 機 酸 ；エ タ ノ ー ル 、 プ ロパ ノ ー ル の よ う な
ア ル コ ー ル ；ノル マ ル パ ラ フ ィ ン の よ う な 炭 化 水 素 等 も 用 い る こ と が で き る
炭 素 源 は 、 1 種 を 単 独 で 、 又 は 2 種 以 上 を 混 合 して 使 用 で き る。
反 応 液 中 の 糖 類 の 濃 度 は 、 約 1~20
/
V % )
が よ り好 ま し く、 約 2~5
(w/
(w/
v % )
v % )
が 好 ま し く、 約 2~1 0 ( w
が さ ら に よ り好 ま しい 。
また、糖類 を含 む全炭素源 の反応液 中の濃度 は、通常、約 2~5
(w/
v %
) とすれ ばよい。
[0040]
窒素源 と しては、塩化 ア ンモニ ゥ厶、硫酸 ア ンモニ ゥ厶、硝酸 ア ンモニ ゥ
厶、酢酸 ア ンモニ ゥ厶の よ うな無機 又 は有機 ア ンモニ ゥ厶化合物、尿素、 ァ
ンモニ ァ水、硝酸 ナ トリウム、硝酸 カ リウム等 を使 用で きる。 また、 コー ン
ステ ィ一 プ リカ一、 肉エキス、ペ プ トン、 NZ —ァ ミン、蛋 白質加水分解物、
ア ミノ酸等 の含窒素有機 化合物等 も使 用で きる。窒素源 は、 1 種 を単独 で、
又 は 2 種以上 を混合 して使 用で きる。窒素源 の反応液 中の濃度 は、使 用す る
窒素化合物 によ って も異 な るが、通常、約 0. 1~ 10 (w/
v % ) とすれ ばよい
無機塩類 と しては、 リン酸 第一 カ リウム、 リン酸 第二 カ リウム、硫酸 マ グ
ネシ ゥ厶、塩化 ナ トリウム、硝酸 第一鉄、硫酸 マ ンガ ン、硫酸亜鉛、硫酸 コ
ノくル
卜、炭酸 カル シ ウム等 が挙 げ られ る。無機塩 は、 1 種 を単独 で、又 は2 種
以上 を混合 して使 用で きる。無機塩類 の反応液 中の濃度 は、使 用す る無機塩
によ って も異 な るが、通常、約 0. 0 1 ~ 1 (w/
[0041 ]
v
) とすれ ばよい。
栄養物 質 と しては、 肉エキス、ペ プ トン、 ポ リペ プ トン、酵母 エキス、乾
燥酵母、 コー ンステ ィー プ リカ一、脱脂粉乳、脱脂 大豆塩酸加水分解物、動
植物又 は微 生物菌体 のエキスや それ らの分解物等 が挙 げ られ る。 栄養物 質の
反応液 中の濃度 は、使 用す る栄養物 質 によ って も異 な るが、通常約 0. 1~ 10 (
w/
v % ) とすれ ばよい。
さ らに、必要 に応 じて、 ビタ ミン類 を添加 す る こともで きる。 ビタ ミン類
と しては、 ビ才チ ン、 チ ア ミン （ビタ ミンB 1 ) 、 ピ リ ドキシ ン （ビタ ミンB6
) 、パ ン トテ ン酸、 イ ノシ 卜一ル、 ニ コチ ン酸等 が挙 げ られ る。
反応液 の p H は約 6 ~ 8 が好 ま しい。
[0042]
具体 的な好 ま しい コ リネ型細菌 用培地 と しては、前述 したA培地、 BT 培地等
が挙 げ られ る。 これ らの培地 において、糖類濃度 を上記範 囲 に して用 いれ ば
よい。
[0043]
反応条件
反 応 温度 、 即 ち形 質転 換 体 の生存 温度 は、 約 2 0 ~ 5 0 °C が好 ま しく、 約
2 5 ~ 4 7 °C が よ り好 ま しい。 上 記 温度 範 囲 で あれ ば、 効 率 良 くフ エ ノ ー ル
を製 造 で きる。
また、 反 応 時 間 は、 約 1 ~ 7 日間 が好 ま しく、 約 1 ~ 3 曰間 が よ り好 ま し
い。
培養 は、 バ ッチ式、 流 加 式、 連続 式 の何 れ で も よい。 中で も、 バ ッチ式 が
好 ま しい。
反 応 は、 好 気 的条 件 で行 って も よ く、 還 元 条 件 で行 って も よい。
[0044]
< 還元条件>
還 元 条 件 で は、 コ リネ型 細菌 は実 質 的 に増 殖 せ ず、 一層効 率 的 に フ エ ノ 一
ル を生産 させ る こ とが で きる。
還 元 条 件 は、 反 応液 の酸 化 還 元 電位 で規 定 され る。 反 応液 の酸 化 還 元 電位
は、 約 _ 2 0 0 m V 〜 一 5 0 0 m V が好 ま しく、 約 _ 2 5 0
ソ~ _ 5 0 0
m V が よ り好 ま しい。
反 応液 の還 元状 態 は簡 便 には レサ ズ リン指 示 薬 （
還 元状 態 で あれ ば、 青 色
か ら無 色 へ の脱 色 ） で推 定 で きるが、 正確 には酸 化 還 元 電位 差 計 （
例 え ば、
B ROA D L EY
J A M E S 社製、 O R P
E l e c t r o d e s ) を用
いて測 定 で きる。
[0045]
還 元 条 件 にあ る反 応液 の調 整 方 法 は、 公知 の方 法 を制 限 な く使 用 で きる。
例 え ば、 反 応液 の液 体 媒 体 と して、 蒸 留 水 な どの代 わ りに反 応液 用水溶 液 を
使 用 して も よ く、 反 応液 用水溶 液 の調 整 方 法 は、 例 え ば硫 酸 還 元微 生物 な ど
の絶 対 嫌 気性 微 生物 用 の培養 液 調 整 方 法 （P f e n n i g ,
N
a I .
s u I f a t
( 1 9 8 1)
：T h e
e —r e d u c i n g
y o t e s, A
a t
1a,
i o n
2 6 - 9 4 0,
b a c t e r i a,
H a n d b o o k
a n d
E d.
d i s s i m i l a t o r y
b y
I d e n t
S t a
B e r l i n,
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i f
,
T h e
P r o k a r
H a b i t a t s,
i c a t
M.
S
I n
i o n
P.
i n g e
o f
e t .
e t .
I s o I
B a c t e r
a に
p.
9
V e r l a g. ) や
「
農 芸 化学 実験 書
第 三巻、 京都 大学 農学 部
農 芸 化学 教 室編 、 1 9 9 0 年
第 2 6 刷 、 産 業 図書 株 式会社 出版 」 な どが参考 とな り、 所望 す る還 元 条 件 下
の水溶 液 を得 る こ とが で きる。
具 体 的 には、 蒸 留 水 な どを加 熱 処理 や減 圧 処理 して溶 解 ガス を除去 す る こ
とに よ り、 還 元 条 件 の反 応液 用水溶 液 を得 る こ とが で きる。 この場 合、 約 1
0 m m H g 以 下、 好 ま しくは約 5 m m H g 以 下、 よ り好 ま しくは約 3 m m H
9 以 下 の減 圧 下 で、 約 1 ~ 6 0 分程 度 、 好 ま しくは約 5 ~ 4 0 分程 度 、 蒸 留
水 な どを処理 す る こ とに よ り、 溶 解 ガス、 特 に溶 解 酸 素 を除去 して還 元 条 件
下 の反 応液 用水溶 液 を作成 す る こ とが で きる。
また、 適 当な還 元剤 （
例 え ば、 チ 才 グ リコ ー ル 酸 、 ァ ス コル ビ ン 酸 、 シ ス
テ ィン塩 酸 塩 、 メル カ プ ト酢酸 、 チ才 一ル 酢酸 、 ダル タチオ ン、 硫 化 ソ一 ダ
等 ） を添 加 して還 元 条 件 の反 応液 用水溶 液 を調 整 す る こ ともで きる。
これ らの方 法 を適 宜 組 み合 わ せ る こ とも有 効 な還 元 条 件 の反 応液 用水溶 液
の調 整 方 法 で あ る。
[0046]
反 応 中 も反 応液 を還 元 条 件 に維 持 す る こ とが好 ま しい。 反 応 途 中で の還 元
条 件 を維 持 す るため に、 反 応 系外 か らの酸 素 の混 入 を可 能 な 限 り防止 す る こ
とが望 ま しく、 具 体 的 には、 反 応 系 を窒 素 ガス等 の不 活性 ガスや炭 酸 ガス等
で封 入 す る方 法 が挙 げ られ る。 酸 素 混 入 を よ り効 果 的 に防止 す る方 法 と して
は、 反 応 途 中 にお いて本 発 明 の好 気性 細菌 の菌 体 内の代 謝機 能 を効 率 よ く機
能 させ るため に、 反 応 系 の p H 維 持調 整 液 の添 加 や各種 栄養 素溶 解 液 を適 宜
添 加 す る必 要 が生 じる場 合 もあ るが、 この よ うな場 合 には添 加溶 液 か ら酸 素
を予 め 除去 して お くこ とが有 効 で あ る。
[0047]
フ エ ノー ル の 回収
上 記 の よ うに して培養 す る こ とに よ り、 反 応液 中 に フ エ ノール が生産 され
る。 反 応液 を回収 す る こ とに よ りフ エ ノール を回収 で きるが、 さ らに、 公知
の方 法 で フ エ ノ一ル を反 応液 か ら分離 す る こ ともで きる。 その よ うな公知 の
方 法 と して、 蒸 留 法、 膜 透 過 法、 有機 溶 媒 抽 出法 等 が挙 げ られ る。
実施 例
以 下 、 本 発 明 を 実 施 例 に よ り詳 細 に 説 明 す る が 、 本 発 明 は こ れ らの 実 施 例
[0048]
に 限 定 され る も の で は な い。
実施例 1
フ エ ノ ー ル 生 産 用 宿 主 と して の 谪 性 試 験 ： フ エ ノ ー ル に よ る コ リ
ネ バ クテ リウ 厶 グル タ ミ 力 厶 及 び 他 種 菌 体 へ の 影 響
フ エ ノー ル に よ る好 気 増 殖 へ の影 響
コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム 、 ェ シ エ リ ヒ ア コ リお よ び シ ュ 一 ドモ
プチ ダ に つ い て、 好 気 培 養 に お け る フ エ ノ ー ル の 生 育 阻 害 試 験 を行 った
ナ ス
。 尚 、 本 試 験 に 用 い た シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ S 12 は 、 溶 媒 耐 性 菌 と して 報 告
さ れ て お り、 こ れ ま で に 唯 一 フ エ ノ ー ル 生 産 の 宿 主 と して 用 い られ た 技 術 が
開 示 さ れ て い る。
コ リネ バ ク テ リ ウ 厶 グ ル タ ミ カ ム R を A 寒 天 培 地 [ (NH 2 ) 2C0
g 、 K H2 P0 4 0 . 5 g 、 K2HP0 4
20
+ 0 . 042%
0. 0 1
(w/v)
(w/v)
0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H20
MnS0 4 . 2 H20
t h i a m i n s o lut
casam i n o a c i d
7 g 、 g lucose
0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
1 m し 0 . 02% (w/v)
i o n 2 m し yeast
4 0 g、 寒 天
2 g 、 (NH 4 ) 2S0 4
b i o t i n s o lut
ext ract
7
Fe 2 S0 4 . 7 H
i on
1 mし
2 g 、 v i tam i n assay
15 g を 蒸 留 水 1L に 懸 濁 ] に 塗 布 し
、 3 3 °C 、 15 時 間 暗 所 に 静 置 した 。
上 記 の プ レー 卜で 生 育 した コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム R を 、 A 液 体 培
地 [ (NH 2 ) 2C0
2 g 、 (NH 4 ) 2S0 4
. 5 g 、 0 . 06% (w/v)
/v)
b i o t i n s o lut
Fe 2 S0 4 .
i on
7 g 、 K H2 P0 4 0 5 g 、 K2HP0 4
H20 + 0 . 042%
1 m し 0 . 01% (w/v)
(w/v)
0
MnS0 4 . 2 H20
t h i a m i n s o lut
casam i n o a c i d
5 g 、 MgS0 4 .
H20
1 m し 0 . 02% (
i o n 2 m し yeast
7 g 、 g Lucose
0
e
4 0 g を 森 留 水 1L
x t ract
2 g 、 v i tam i n assay
に溶 解 ]
1 0 m Lの 入 っ た 試 験 管 に 一 白 金 耳 植 菌 し、 3 3 °C に て 13 時 間 、 好 気 的 に
振 盪 培 養 を行 った。
上 記 条 件 で 生 育 した コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 グ ル タ ミ カ 厶 R を 、 A 液 体 培 地 100m
L に 初 期 菌 体 濃 度 OD 610 =0. 0 5 と な る よ う に 植 菌 し、 同 時 に フ ヱ ノ 一 ル が 終 濃 度 0
、 0 . 16 、 0 . 2 、 0 . 2 4 、 0 . 32mM と な る よ う に 添 加 し、 3 3 °C に て 好 気 的 に 振 盪 培 養
を 行 っ た 。 菌 体 の 生 育 は OD 610 の 吸 光 度 を 測 定 す る こ と に よ り行 っ た 。
[0049]
ェ シ エ リ ヒ ア コ リJM1 0 9 を L B 寒 天 培 地
〔1%
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0.
5%
塩 化 ナ トリウ ム 、 お よ び 1.
5%
寒 天 〕 に 塗 布 し、 37 °C 、 15時 間 暗 所
に静 置 した 。
上 記 プ レー 卜で 生 育 した ェ シ エ リ ヒ ア コ リJM1 09 を、 LB液 体 培 地 〔1 % ポ リ
ペ プ トン、 0.
5%
酵 母 エ キ ス お よ び 0.
5%
塩 化 ナ トリウ ム 〕 10 m Lの 入 っ た 試 験
管 に 一 白金 耳 植 菌 し、 37 °C に て 13時 間 、 好 気 的 に振 盪 培 養 を 行 っ た 。
上 記 条 件 で 生 育 した ェ シ エ リ ヒ ア コ リJM1 09 を LB液 体 培 地 100m Lに 初 期 菌 体
濃 度 OD 610 =0. 05 と な る よ う に植 菌 し、 同 時 に フ エ ノ ー ル 濃 度 が 終 濃 度 0、 0. 16、
0. 20mM と な る よ う に 添 加 し、 37 °C に て 好 気 的 に振 盪 培 養 を 行 っ た 。 菌 体 の 生
育 は 0D6 1 0の 吸 光 度 を 測 定 す る こ と に よ り行 っ た 。
[0050]
シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ F 1 お よ び S 1 2 を LB 寒 天 培 地 〔1 % ポ リペ プ トン、 0.
酵 母 エ キ ス 、 0.
5%
塩 化 ナ トリウ ム 、 お よ び 1.
5%
5%
寒 天 〕 に 塗 布 し、 30 °C 、 15
時 間 暗 所 に静 置 した 。
上 記 プ レー 卜で 生 育 した シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ F 1 お よ び S 1 2 を、 LB ( + ダル
コ ー ス ） 液 体 培 地 〔1 % ポ リペ プ トン、 0.
5%
酵 母 エ キ ス 、 0.
5%
塩 化 ナ 卜リウ
厶 お よ び 0. 4 % グル コ ー ス 〕 10 m Lの 入 っ た 試 験 管 に 一 白金 耳 植 菌 し、 30 °C に て 1
3時 間 、 好 気 的 に振 盪 培 養 を 行 っ た 。
上 記 条 件 で 生 育 した シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ F 1 お よ び S 1 2株 を LB ( + ダル コ 一
ス ） 液 体 培 地 100m Lに 初 期 菌 体 濃 度 OD 610 =0. 05 と な る よ う に植 菌 し、 同 時 に フ エ
ノ ー ル 濃 度 が 終 濃 度 0、 0. 10、 0. 20mM と な る よ う に 添 加 し、 30 °C に て 好 気 的 に
振 盪 培 養 を 行 っ た 。 菌 体 の 生 育 は OD 610 の 吸 光 度 を 測 定 す る こ と に よ り行 っ た 。
培 地 中 へ の フ エ ノ ー ル 添 加 に よ る 好 気 増 殖 へ の 影 響 の 解 析 結 果 を 図 】に 示 す
。 図 1 の 縦 軸 は OD 610 で あ る。
[0051 ]
ェ シ エ リ ヒ ア コ リは 、 0. 16 % フ エ ノ ー ル 存 在 下 で 著 し く増 殖 阻 害 を 受 け、 0
. 20% フ エ ノ 一 ル で は 完 全 に増 殖 が 阻 害 さ れ た 。
シ ュ 一 ドモ ナ ス プ チ ダ F 1 及 び 溶 剤 耐 性 菌 と して 報 告 さ れ て い た シ ュ 一 ドモ
ナ ス プ チ ダ S 1 2 は 、 ほ ぼ 同 じ傾 向 を 示 し、 0. 10 % フ エ ノ ー ル 存 在 下 で 著 し く増
殖 阻 害 を 受 け 0. 20% フ エ ノ 一 ル で は 完 全 に増 殖 が 阻 害 さ れ た 。
これ に 対 して 、 コ リネ バ ク テ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム は 、 ェ シ エ リ ヒ ア コ リ
が顕 著 な増 殖 阻害 を受 けた 0 . 1 6 %の フ エ ノ一ル 存 在 下 に お い て も増 殖 へ の影 響
は ほ とん どな く、 ェ シ エ リヒア コ リゃ シ ュ一 ドモ ナ ス プチ ダで は完 全 に増
殖 を阻害 され た 0 . 20% の フ エ ノ一ル 存 在 下 に お い て も良 好 な 生 育 を示 した。 さ
らに 0 . 24% の フ エ ノ一ル 存 在 下 に お い て増 殖 が可 能 で あ つた。
この よ うに、 コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム は ェ シ エ リヒア コ リお よ
び シ ュ一 ドモ ナ ス プチ ダ と比 較 して、 フ エ ノール に対 し高 い耐 性 を有 し、 フ
ェ ノ一ル 生産 の宿 主 と して 高 い適 性 を有 す る こ とが示 され た。
[0052]
フ エ ノ一ル に よ る還 元 条 件 下 で の糖 代 謝 へ の影 響
(2)
コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム R を、 A 寒 天 培 地 に塗 布 し、 3 3 °C 、 2 0 時 間
暗 所 に静 置 した。
上 記 の プ レー 卜で 生 育 した コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム R をA 液 体 培 地
1 0 m Lの 入
った試 験 管 に一 白金 耳 植 菌 し、 3 3 °C にて 15 時 間、 好 気 的 に振 盪 培 養
を行 った。
上 記 条 件 で 生 育 した コ リネバ クテ リゥ厶 グル タ ミカ厶 R をA 液 体 培 地 500m L
の 入 った容 量 2 L の 三 角 フ ラ ス コ に植 菌 し、 3 3 °C にて 15 時 間、 好 気 的 に振 盪 培
を行 った。
この よ うに して培 養 増 殖 した菌 体 は、 遠 心 分 離
（4
°C 、 5 , 000 X g ,
15 分 ）に
よ り回収 した。 得 られ た菌 体 を、 10 w/v% とな る よ うに BT ( - 尿 素 ）液 体 培 地
. 7%
〔0
硫 酸 ア ンモ ニ ゥ厶、 0 . 05% リン酸 二 水 素 カ リウム、 0 . 05% リン酸 水 素 二
カ リウム、 0 . 05% 硫 酸 マ グネ シ ウム
. 00042%
7 水 和 物 、 0 . 0006%
硫 酸 マ ンガ ン水 和 物 、 0 . 00002%
硫酸鉄
ビ才 チ ン、 0 . 00002%
7水和物、 0
チ ア ミ ン塩 酸
塩 〕 に懸 濁 した。 この それ ぞれ の菌 体 懸 濁 液 60m L を容 量 100m L メデ ィウ厶瓶 に
入 れ、 還 元 条 件 下 （
酸 化 還 元 電位 ；-450
mV)
、 グル コー ス を 8 %、 フ エ ノール
濃 度 を 0 、 0 . 2 4 、 0 . 3 8 、 0 . 46mM とな る よ うに添 加 し、 3 3 °C に保 った水 浴 中 で攪
拌 しな が ら反 応 させ た。 この 時、 反 応 液 の p H が 7 . 0 を下 回 らな い よ うに 2 . 5 N の
ア ンモ ニ ア水 を用 い て
23)
[0053]
コ ン トロー ラ一 （エ イ プル 株 式 会 社 製 、 型 式 ：DT- 10
で コ ン トロール しな が ら反 応 した。
コ リネパ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム Rの還 元 条 件 下 に お け る糖 代 謝 に及 ぼ す
フ エ ノ 一 ル の 影 響 を 検 討 した 結 果 を 図 2 に 示 す 。
還 元 条 件 下 に お い て は 、 好 気 培 養 に お い て 増 殖 阻 害 が 認 め られ た 0 . 24% フ エ
ノ ー ル 存 在 下 で も 、 フ エ ノ ー ル に よ る 影 響 は 全 く見 られ ず 、 フ エ ノ ー ル 未 添
加 と 同 等 の 糖 消 費 を 示 した 。
さ ら に 、 0 . 38% の フ エ ノ ー ル 存 在 下 で も 糖 消 費 を 認 め られ 、 0 . 46% の フ エ ノ
— ル 存 在 下 に お い て も 僅 か な が ら糖 消 費 を 示 した 。
こ の よ う に 、 好 気 培 養 と 比 較 して 、 還 元 条 件 で は フ エ ノ ー ル に 対 して 高 い
耐 性 を 示 し、 還 元 条 件 下 に お け る コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム を 宿 主 と
した フ エ ノ 一 ル 生 産 が 、 好 気 条 件 下 に お け る 生 産 と 比 較 して 優 位 で あ る こ と
が示 され た。
[0054]
ま 施 .例 2
畠
フ エ ノー ル
まま
子 の ク ロ ー ニ ン グ とま 現.
勿か ら の ま め ィ
本DNA の ギ
由
コ リ不 ノくク テ リ ゥ ム ク ル タ ミ カ ム
、 K H2 P0 4 0 . 5 g 、 K2 HP0 4
0. 0 1
i urn g Lutam i cum)
か ら の 染 色 体 DNA 抽 出 は 、 A 培 地 [ (NH 2 ) 2C0
ERM P-1 8976)
0 + 0 . 042%
(Corynebacter
(w/v)
(w/v)
0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H20
MnS0 4 . 2 H2 0
t h i a m i n s o lut
casam i n o a c i d
i o n 2 m し yeast
7 g を蒸 留 水 1 L に溶 解 ]
る よ う に 50% (w/v)
2 g 、 (NH 4 ) 2 S0 4
0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
1 m し 0 . 02% (w/v)
b i o t i n s o lut
ext ract
R (F
7 g
Fe 2 S0 4 . 7 H2
1 mし
i on
2 g 、 v i tam i n assay
に 、 炭 素 源 と して 、 最 終 濃 度 4 %に な
グ ル コ ー ス 溶 液 を 添 加 し、 白 金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 対 数 増
殖 期 ま で 3 3 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ ト （
商 品名 ：
Genom i cPrep
Ce L Ls and
T i ssue
DNA Iso lat
i on K i t 、 ア マ シ ャム社 製 )
を用
い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
[0055]
パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス （Pantoea agg Lomerans)
色 体 DNA 抽 出 は 、 NBRC Med i u m No. 802 培 地 [po Lypeptone
2 g,
NBRC 12686 か ら の 染
10 g ,
yeast
ext ract
MgS0 4 - 7 H2 0 1 g を 蒸 留 水 1 L に 溶 解 ] に 、 白 金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 対 数
増 殖 期 ま で 3 0 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ ト（
商 品名
：Genom i cPrep
Ce L Ls and
T i ssue
DNA Iso lat
i on K i t 、 ア マ シ ャム社 製 ) を用
い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
シ 卜ロ バ ク タ 一 プ ラ ッ キ 一
[0056]
体 DNA 抽 出 は 、 Nut r i ent
（C
i t robacter
i i ) ATCC 6750 か ら の 染 色
braak
( べ ク トン . デ ィ ッ キ ン ソ ン 社 製
Broth
BD 234000
) に 、 白 金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 対 数 増 殖 期 ま で 3 7 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体 を 集
菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i cPrep
o Lat i o n K i t
Ce L Ls and
T i ssue
DNA I s
ア マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か
ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
[0057]
デ ス リレフ イ トバ ク テ リ ュ 一 厶
ハ フ二エ ンス
（Desu Lf i tobacter
i u m hafn i e
Y51 か ら の 染 色 体 DNA 抽 出 は 、 MMYP 培 地 [ K2 HP0 4 7 . 8 g 、 K H2P0 4 1. 2 g 、 s o
nse)
d i u m c i t rate
uvate
0 . 5 g 、 MgS0 4 - 7 H20 0 . 1 g 、 yeast
5 . 5 g 、 resazur
i n sod i u m s a l t
ext ract
2 . 0 g 、 sod i u m pyr
1. 0 mg を 蒸 留 水 1 L に 溶 角 及 び p H 7 . 2
に 調 整 ] に 、 白 金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 嫌 気 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム
抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i cPrep
Ce L Ls and
T i ssue
DNA Iso lat
i on K i t
ァ
マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回
リ
又 した 。
ク ロ ロ フ レクサ ス
[0058]
才 ウ ラ ンテ ィ ア カ ス
（Ch
Lorof
- f L) ATCC 29366 か ら の 染 色 体 DNA 抽 出 は 、 Ch Lorof
i c a c i d 0 . 1 g 、 Mi cronut
r i ent
2 H20 0 . 0 6 g 、 MgS0 4
0 . 689
g 、 Na 2 HP0 4 0 . 1 1 1 g 、 NH4C L 0 . 2 g 、 yeast
Mo0 4
2 H20 0 . 025
n : FeC L3 0 . 2905
4
r i ent
6 H20 0 . 045
J-1 0
ext ract
So lut
i o n 1. 0 m し C
g 、 KN0 3 0 . 10 3 g 、 NaN0 3
0 . 5 g 、 g Lycy L-g Lyc
：H2S0 4 0 . 5 m し MnS
i on
7 H20 0 . 5 g 、 H3B0 3 0 . 5 g 、 CuS0 4
g 、 CoC L2
i acus
Lexus 培 地 [ N i t n Lot r i acet
7 H20 0 . 1 g 、 NaCL 0 . 008
i n e 0 . 5 g を 蒸 留 水 1 L に 溶 解 ；Mi cronut
7 H20 2 . 2 8 g 、 ZnS0
aurant
i o n 1. 0 m し FeC L3 So lut
So lut
aS0 4
04
Lexus
2 H20 0 . 025
g を 蒸 留 水 1 L に 溶 解 、 FeC
g 、 Na 2
So Lut i o
g を蒸 留 水 1 L に溶 解 ） ] に、 白金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 タ ン ダ
ス テ ン ラ ン プ 照 射 及 び 5 0 °C で 振 盪 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム 抽 出 キ ッ
卜 ( 商 品 名 ：Genom i cPrep
Ce L Ls and
T i ssue
DNA Iso lat
i on K i t 、 ア マ シ ャ ム
社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回 収 した 。
[0059]
デ ス リレフ イ トバ ク テ リ ュ 一 厶
nse)
ハ フ二エ ンス
（Desu Lf i tobacter
i u m hafn i e
Y51 か ら の 染 色 体 DNA 抽 出 は 、 MMYP 培 地 [ K2 HP0 4 7 . 8 g 、 K H2P0 4 1. 2 g 、 s o
0 . 5 g 、 MgS0
d i um c i t r a t e
uvat
5 . 5 g 、 r esazu
e
4
- 7 H2 0
0 . 1 g 、 yeas
r i n sod i u m s a l t
1 . 0 mg
t
ex t r ac t
2 . 0 g 、 sod i u m p y r
を蒸 留 水 1 L に溶 角 及 び pH 7 . 2
に 調 整 ] に 、 白 金 耳 を 用 い て 植 菌 後 、 嫌 気 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム
抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i c P r e p Ce L Ls and
T i ssue
DNA
ァ
I so l at i on K i t
マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回
リ
又 した 。
ノ ス トッ ク
[0060]
パ ン ク チ フ 才 ル メ （Nos t o c punc t i f o rme)
染 色 体 DNA 抽 出 は 、 B Lue-g
H2 0
g 、 CaC L2 · 2 H2 0
0 . 075
i t rat e
r een
6 . 0 mg 、 EDTA
i x i ng 培
n i t r ogen-f
g、 C i t
0 . 036
ic
1 . 0 mg 、 Na 2 C0 3 0 . 0 2
蒸 留 水 1 L に 溶 解 及 び p H 7 . 1 に 調 整 ；T r ace
L2
4 H2 0
1 . 8 1 g 、 ZnS0
g 、 Co (N0
. 079
後、光照射
3
)
2
ac i d
7 H2 0
4
6 H2 0 49.
（2000 ~3000
0 . 222
4mg
Lux)
6 . 0 mg 、 F e r r i c
Me t a L M i x
4
2 9 13 3
か らの
地 [ K 2 HP0 4 0 . 0 4 g 、 MgS0
g 、 T r ace
g 、 Na 2 Mo0
ATCC
2 H2 0
Me t a L M i x
4
- 7
ammon i u m c
A5
1. 0 m Lを
A 5 ：H3 B0 3 2 . 8 6 g 、 MnC
0 . 3 9 g 、 CuS0
4
5 H2 0
0
を蒸 留 水 1 L に溶 解 ] に、 白金 耳 を 用 い て 植 菌
及 び 2 6 °C で 培 養 し、 菌 体 を 集 菌 後 、 DNA ゲ ノ ム
抽 出 キ ッ 卜（
商 品 名 ：Genom i c P r e p Ce L Ls and
T i ssue
DNA
I so l at i on K i t
ァ
マ シ ャ ム 社 製 ）を 用 い て 、 取 扱 説 明 書 に 従 い 、 集 め た 菌 体 か ら染 色 体 DNA を 回
リ
又 した 。
卜レポ ネ マ
(Cat
[006
1]
a l og
No.
デ ンテ ィ コ ラ
RDB
6 2 17 )
（T
r eponema
den t i c o La )
JCM
8 15 3
の 染 色 体 DNA
は 独 立 行 政 法 人 理 化 学 研 究 所 よ り 入 手 した 。
ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 の 構 築
(2)
ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 PCRB22 の 構 築
コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
起点
カ ゼ ィ JCM 1 2072 由 来 の プ ラ ス ミ ドpCASE I の DNA 複 製
（以 降 、 pCASE 1 - o r i と 記 す ） 配 列 、 及 び ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pHSG298
(
タ カ ラ バ ィ 才 株 式 会 社 製 ） を そ れ ぞ れ 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅
した 。
PCR
に 際 して 、 pCASE 1 - o r i 配 列 、 ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pHSG298 を そ れ ぞ れ
ク ロ ー ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 1 ( pCASE 1 - o r i 配 列 ） 、 配 列 番 号 2 ( ク ロ 一 二
ン グベ ク タ ―
— p H SG298)
を基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を合 成 し
、 使 用 した 。
[0062]
pCASE1 -or i 配 列 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-1 )
； 5' - AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC -3'
( 配 列 番 号 3)
(b-1 )
； 5' - AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC -3'
(配 列 番 号 4)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-1 ) 及 び （
b-1 ) に は 、 Bg LI I 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
[0063]
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pHSG298 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-2)
； 5' - AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG -3'
( 配 列 番 号 5)
(b-2)
； 5' - AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA -3'
( 配 列 番 号 6)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-2)
及び （
b-2)
に は 、 Bg LI I 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い
る。
[0064]
錶 型 DNA は 、 Japan.
リネ バ ク テ リゥ 厶
Co LLect i on of
Mi croorgan
i sms (JCM) よ り入 手 した コ
カ ゼ ィ JCM1 2072 か ら抽 出 した 卜一 タ ル DNA 及 び ク ロ 一 二
ン グベ ク タ 一 PHSG298 ( タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 製 ） を 用 い た 。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp PCR System
9700( ア プ ラ イ ド
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa LA Taq ( タ カ ラ バ
ィ 才 株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
[0065]
反応液 ：
TaKaRa
LA Taq  (5 u n i ts/
10X LA PCR  Buffer
dNTP Mi xture
I I
パ I)
(Mg 2+ free)
(2. 5mM each)
0. 5 〃 I
I
I
錶 型 DNA
5 i I
上 記 記 載 の 2 種 プ ラ イ マ ー *〕
各 々0 . 5
滅 菌蒸 留水
25. 5
以 上 を 混 合 し、 こ の 50
(DNA 含 有 量
l
1 i g 以下)
(最 終 濃 度
1
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
* ) pCASE1 -or i 配 列 を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （
a-1 )
と （
b-1 ) の 組 み 合
わ せ 、 ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 PHSG298 を増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （
a-2)
(b-2)
[0066]
の 組 み 合 わ せ で 行 った。
と
PGR
サ イ クル ：
デ ナ チ ユ レ一 シ ヨン過 程
94 °C
ァ ニ ー リング過 程
52 °C
エ ク ス テ ン シ ョン過 程
72 °C
pCASE 1-or
配列
i
ク ロー ニ ングベ ク タ 一pHSG298
15 0
秒
18 0
秒
以 上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル 行 った。
[0067]
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
を0 .
pCASE 1- o r i 配 列 の 場 合 約 1. 4-kb
7-kb
8 % ァ ガ ロー ス ゲ ル
に よ り電 気 泳 動 を行 い、
、 ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 pHSG298 の 場 合 、 約 2 .
の DNA 断 片 が検 出 で きた。
上 記 の PCR に よ り増 幅 した コ リネパ クテ リゥ厶
pCASE 1- o
i 配 列 含 む 約 1. 4-kb
8 を含 む 約 2 . 7-kb
DNA 断 片 10
カ ゼ ィ株 由来 の プ ラ ス ミ ド
L及 び ク ロ一 ニ ン グベ
ク タ - pHSG29
を各 々制 限 酵 素 Bg LI I で切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処
DNA 断 片 10
理 させ る こ と に よ り制 限 酵 素 を失 活 させ た後 、 両 者 を混 合 し、 これ に T4 DNA
リガ 一 ゼ 10 X 緩 衝 液
un i t
、 T4 DNA リガ 一 ゼ
（タ カ ラバ イ オ 株 式 会 社 製 ） 1
に して、 15 °C で 3 時 間 反 応 させ
の 各 成 分 を添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で 10
、 結 合 させ た。 これ を ラ イ ゲ 一 シ ヨンA 液 と した。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨンA 液 を、 塩 化 カル シ ウム 法
B i o Logy,
53,
カ ナ マ イ シ ン5 0
ス、 0 .
5%
15 9 ( 1970
〔J
o u r na L o f
Mo Lecu La r
) 〕 に よ りェ シ エ リ ヒア コ リJ M10 9 を形 質 転 換 し、
g/m L を含 む L B 寒 天 培 地
塩 化 ナ トリウム、 お よび 1.
5%
〔1
%
ポ リペ プ トン、 0 .
5%
酵母 ェ キ
寒 天 〕 に塗 布 した。
培 地 上 の 生 育 株 を常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ りプ ラ ス ミ ドDNA を抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 Bg LI I で そ れ ぞ れ 切 断 し、 揷 入 断 片 を確 認 した。 こ
の結 果 、 ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 PHSG298 約 2 . 7 配 列 の 約 1. 4-kb
DNA 断 片 が 認 め
断 片 に加 ぇ、 pCASE-o r i
られ た。
pCASE 1- o r i 配 列 を含 む ク ロ一 ニ ン グベ
[0068]
の1
ク タ 一 を pCRB22 と命 名 した。
ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 PCRB 1 1 の構 築
コ リネバ クテ リゥ厶 グル タ ミ カ 厶 内 で複 製 可 能 な プ ラ ス ミ ドPCG 1 [ ( 特 開
昭 5 7 — 134500) ] 由来 の DNA 複 製 起 点 （
以 降 、 pCG 1- o r i と記 す ） 配 列 、 及 び ク
ロ ー ニ ン グベ ク タ 一 P HSG398 ( タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 製 ） を そ れ ぞ れ 含 む DNA
断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅 した 。
PCR に 際
して 、 pCG1 -or i 配 列 、 ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pHSG398 を そ れ ぞ れ ク
ロ ー ン化 す る べ く、 配 列 番 号 7 (pCG1 -or i 配 列 ） 、 配 列 番 号 8 ( ク ロ ー ニ ン グ
ベ ク タ 一 PHSG398) を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を 合 成 し、 使 用
した 。
[0069]
pCG1
-or i 配 列 増 幅 用 プ ラ イ マ ー
(a-3)
； 5' - AT AGATCT AGCATGGTCGTCACAGAG -3'
( 配 列 番 号 9)
(b-3)
； 5' - AT AGATCT GGAACCGTTATCTGCCTATG -3'
( 配 列 番 号 10)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-3)
及び （
b-3)
に は 、 Bg LI I 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
[0070]
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pHSG398 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-4)
； 5' - AT AGATCT GTCGAACGGAAGATCACTTC -3'
( 配 列 番 号 11)
(b-4)
； 5' - AT AGATCT AGTTCCACTGAGCGTCAG -3'
( 配 列 番 号 12)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-4)
及び （
b-4)
に は 、 Bg LI I 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
錶 型 DNA は 、 pCG1 [ ( 特 開 昭 57 — 134500) ] 及 び ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pHSG39
8 ( タ カ ラバ イ オ 株 式 会 社 製 ） を用 い た。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp PCR System
9700( ア プ ラ イ ド
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa LA Taq ( タ カ ラ バ
ィ 才 株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
[ 0071 ]
反応液 :
TaKaRa LA Taq  (5 un i t sな
0X LA PCR  Buffer
25m
MgC
II
(Mg
I)
+
\
.
free)
I
dNTP Mi xture
(2.
5mM
each)
錶 型 DNA
I (DNA 含 有 量
1
上記記載の 2 種 プライマ 一 ぺ
各 々0 . 5 パ I (最 終 濃 度
滅 菌 蒸 留水
25. 5
以 上 を 混 合 し、 こ の 50
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
I
g 以下)
1 j M)
*)
pCG1 -or
i 配 列 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-3) と （b-3) の 組 み 合 わ せ 、
ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 PHSG398 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-4)
と （b-4)
の組 み 合 わ せ で行 った。
[0072]
PCR サ イ ク ル ：
デ ナ チ ユ レー シ ョ ン 過 程
：9 4 °C
60
秒
ァ ニ一 リング過 程
：5 2 °C
60
秒
エ ク ス テ ン シ ョ ン過 程
：7 2 °C
pCG1_or
i 配列
120 秒
ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 PHSG398
150 秒
以 上 を 1 サ イ ク ル と し、 3 0 サ イ ク ル 行 っ た 。
[0073]
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
pCG1 -or
を 0 . 8 %ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に よ り 電 気 泳 動 を 行 い 、
i 配 列 の 場 合 約 1 . 9-kb 、 ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pHSG398 の 場 合 、 約 2 . 2 -
k b の DNA 断 片 が 検 出 で き た 。
[0074]
上 記 の PCR に よ り増 幅 した プ ラ ス ミ ドpCG1 由 来 pCG1 -or
i 遺 伝 子 含 む 約 1 . 9-kb
L及 び ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pHSG398 を 含 む 約 2 . 2-kb
DNA 断 片 10
DNA 断 片 10
L を 各 々 制 限 酵 素 Bg LI I で 切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処 理 さ せ る こ と に よ り制 限 酵
素 を 失 活 さ せ た 後 、 両 者 を 混 合 し、 こ れ に T4 DNA リ ガ 一 ゼ 10 X 緩 衝 液
1
L
、 丁4 DNA リ ガ 一 ゼ
（タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 製 ）
1 u n i t の 各 成 分 を 添 加 し、
滅 菌 蒸 留 水 で 10
に して 、 15 °C で 3 時 間 反 応 さ せ 、 結 合 さ せ た 。 こ れ を ラ イ
ゲ 一 シ ヨ ン B液 と した 。
得 ら れ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン B液 を 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
B i o Logy,
53,
15 9
( 1970) 〕 に よ り ェ シ エ リ ヒ ア
ク ロ ラ ム フ エ ニ コ 一 ル 50
9 / m Lを 含 む L B寒 天 培 地
〔Journa L o f
Mo Lecu Lar
コ リJM1 0 9 を 形 質 転 換 し、
〔1%
ポ リペ プ トン 、 0 . 5 %
酵 母 エ キ ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1 . 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り プ ラ ス ミ ドDNA を 抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 Bg LII で そ れ ぞ れ 切 断 し、 揷 入 断 片 を 確 認 した 。 こ
の 結 果 、 ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 PHSG398 約 2 . 2 配 列 の 約 1 . 9-kb
pCG1 -or
の1
断 片 に 加 ぇ 、 pCG1 -or
DNA 断 片 が 認 め ら れ た 。
i 配 列 を 含 む ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 を pCRB1 1 と 命 名 した 。
i
[0075]
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pCRB1 5の 構 築
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 PCRB1 1を 含 む DNA 断 片 及 び pSELECT-zeo-mcs
(インビ
卜口 ジ ェ ン株 式 会 社 製 ） 由 来 の ゼ オ シ ン耐 性 遺 伝 子 を そ れ ぞ れ 含 む DNA 断 片 を
以 下 の PCR 法 に よ り増 幅 した 。
PCR に 際
して 、 ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pCRB1 1及 び ゼ 才 シ ン耐 性 遺 伝 子 を そ れ
ぞ れ ク ロ ー ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 13 (pCRB1 1) 及 び 配 列 番 号 14 ( ゼ 才 シ ン
耐 性 遺 伝 子 ） を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を 合 成 し、 使 用 した
[0076]
ク ロ ー ニ ン グべ ク タ 一 pCRB1 1配 列 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-5)
； 5' - AT GATATC CGAAGTGATCTTCCGTTCGA -3'
( 配 列 番 号 15)
(b-5)
； 5' - AT GATATC AAGGCAGTTATTGGTGCCCT -3'
( 配 列 番 号 16)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-5)
及び （
b-5)
に は 、 EcoRV 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
[0077]
ゼ 才 シ ン耐 性 遺 伝 子 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-6)
； 5' - AT GATATC TAGCTTATCCTCAGTCCTGC -3'
( 配 列 番 号 17)
(b-6)
； 5' - AT GATATC CCATCCACGCTGTTTTGACA -3'
( 配 列 番 号 18)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-6)
及び （
b-6)
に は 、 EcoRV 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
[0078]
錶 型 DNA は 、 ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pCRB1 1及 び pSELECT-zeo-mcs
(インビ 卜
ロジ ェ ン株 式 会 社 製 ） を用 い た。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp PCR System
9700( ア プ ラ イ ド
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa LA Taq ( タ カ ラ バ
ィ 才 株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
[0079]
反 J心液 ：
TaKaRa
LA Taq  (5 u n i t s な
0 X LA PGR  Buffer
I I
I)
(Mg
+
0. 5
free)
MgC I
25
5
dNTP M i xtu r e
錶型
I
l
(2. 5 M each)
5 i I
DNA
上 記 記 載 の 2 種 プライ マー
各々
滅 菌 蒸 留水
25. 5
以 上 を混 合 し、 この 5 0
(DNA
含有量
以下 )
(最 終 濃 度
I
の反 応 液 を PCR にか けた。
* ) ク ロー ニ ン グべ ク タ 一pCRB 1 1 配 列 を増 幅 す る場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-5) と （
b-5)
の組 み 合 わ せ、 ゼ 才 シ ン耐 性 遺 伝 子 を増 幅 す る場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-6)
と （b-6) の組 み 合 わ せ で行 った。
[0080]
PCR
サ イ クル ：
デナ チ ユ レー シ ョン過 程
：94 °C
60
秒
ァ ニ一 リング過 程
：5 2 °C
60
秒
エク ス テ ンシ ョン過 程
：7 2 °C
PCR
配列
200
ゼ ォ シ ン耐 性 遺 伝 子
45
秒
秒
以 上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル 行 った。
上 記 で 生成 した反 応 液 10
[008 1]
を 0 . 8 % ァ ガ ロー ス ゲル に よ り電 気 泳 動 を行 い、
ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一pCRB 1 1 配 列 の場 合 約 3 . 3-kb 、 ゼ 才 シ ン耐 性 遺 伝 子 の場
合 約 0 . 5-kb の DNA 断 片 が検 出 で きた。
上 記 の PCR に よ り増 幅 した ク ロ一 ニ ン グベ ク タ一 pCRB 1 1 を含 む約 3 . 3-kb
断 片 10
. 5-kb
L及 び pSELECT-zeo-mcs
DNA 断 片 10
プ ラ ス ミ ド由来 ゼ 才 シ ン耐 性 遺 伝 子 を含 む約 0
を各 々制 限酵 素 EcoRV で切 断 し、 70 °C で 10 分 処 理 させ る こ
とに よ り制 限酵 素 を失 活 させ た後 、 両 者 を混 合 し、 これ にT4
X
緩衝液
1
DNA
、 T4 DNA リガ一 ゼ
成 分 を添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で
DNA
リガ一 ゼ 10
（タ カ ラバ イオ株 式 会 社 製 ） 1 u n i t の各
に して、 15 °C で 3 時 間反 応 させ、 結 合 させ
た。 これ を ラ イ ゲ 一 シ ヨンC液 と した。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨンC液 を、 塩 化 カル シ ウム法
B i o Logy,
53,
15 9 ( 1970
〔J
o u r na L o f
Mo Lecu La r
) 〕 に よ りェ シ エ リヒア コ リJ M10 9 を形 質転 換 し、
ゼ 才 シ ン 25
.
5%
g/ mLを 含 む LB 寒 天 培 地 〔1 % ポ リペ プ トン、 0.
塩 化 ナ トリウ ム 、 お よ び 1.
5%
5%
酵 母 エ キ ス、 0
寒 天 〕 に 塗 布 した 。
培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り プ ラ ス ミ ドDNA を 抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 EcoRV で そ れ ぞ れ 切 断 し、 揷 入 断 片 を確 認 した 。 こ
の 結 果 、 ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pCRB1 1由 来 約 3. 3-kb の DNA 断 片 に 加 え 、 ゼ オ シ
ン耐 性 遺 伝 子 の 場 合 、 約 0. 5-kb
DNA 断 片 が 認 め られ た 。
ゼ 才 シ ン 耐 性 遺 伝 子 を 含 む ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 を pCRB1 5 と命 名 した 。
[0082]
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pCRB207 の 構 築
コ リネ バ ク テ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム R由 来 の ダ リセ ル ア ル デ ヒ ド3 リ ン酸 デ ヒ
ドロ ケ ナ 一 セ ( g Lycera Ldehyde-3-phosphate
dehydrogenase)
を コ 一 ドす るg
apA 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ 一 配 列 （
以 降 、 PgapA と記 す ） を 含 む DNA 断 片 、 及 び ク
ロ ー ニ ン グべ ク タ 一 PKK223-3 ( フ アル マ シ ア社 製 ） 由 来 r rnBT1 T2 双 方 向 タ 一
ミネ 一 タ一配 列 （
以 降 、 タ ー ミ ネ ー タ — 配 列 と記 す ） を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の
方 法 に よ り増 幅 した 。
PCR に 際
して 、 PgapA 配 列 及 び タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 を そ れ ぞ れ ク ロ ー ン 化 す
る べ く、 配 列 番 号 19 (PgapA 配 列 ） 、 配 列 番 号 20 ( タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 ） を 基
に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を 合 成 し、 使 用 した 。
[0083]
PgapA 配 列 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-7)
；5' - CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG -3'
( 配 列 番 号 2 1)
(b-7)
；5' - CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG -3'
( 配 列 番 号 22)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-7)
は 、 Sa LI
[0084]
に は 、 Sa LI 制 限 酵 素 部 位 が 、 プ ラ イ マ 一 （
b-7)
BamHI 及 び Ncol 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い る。
ター ミネ ー タ一配 列増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-8)
； 5' - CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3'
( 配 列 番 号 23)
(b-8)
； 5' - CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG - 3
( 配 列 番 号 24)
に
尚 、 プ ラ イ マ 一 （a-8) に は 、 Sphl 及 び Ncol 制 限 酵 素 部 位 が 、 プ ラ イ マ 一 （
に は 、 Sphl 及 び BspHI 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い る 。
b-8)
[0085]
錶 型 DNA は 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム R (FERM P-1 8976) か ら抽 出
した 染 色 体 DNA 及 び PKK223-3 プ ラ ス ミ ド （フ アル マ シ ア 社 製 ） を 用 い た 。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp PCR System
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
9700( ア プ ラ イ ド
LA Taq
( タ カ ラバ
ィ 才 株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
[ 0086 ]
反応 液 :
TaKaRa
LA Taq  ( 5 u n i t s な
10X LA PCR  Buffer
25m
I I
I)
(Mg 2+ free)
MgC I
dNTP Mi xture
0. 5
I
5が I
5が I
(2. 5mM each)
8バ I
錶 型 DNA
I
(DNA 含 有 量
上記記載の 2 種 プライマ ー め
各 々0. 5 u l ( 最 終 濃 度
滅 菌蒸 留水
25. 5 / / I
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
*)
以下)
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
PgapA 配 列 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-7) と （b-7) の 組 み 合 わ せ 、 タ
— ミ ネ 一 タ 一 配 列 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-8)
と （b-8) の 組 み 合 わ せ
で 行 った。
[0087]
PGR
サ イ クル :
デ ナ チ ユ レ一 シ ョ ン過 程
：94 °C
60 秒
ア ニー リング過 程
：5 2 °C
60 秒
エ ク ス テ ン シ ョ ン過 程
：72 °C
PgapA 配 列
タ ー ミネ ー タ 一 配 列
以 上 を 1 サ イ ク ル と し、 3 0 サ イ ク ル 行 っ た 。
[0088]
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
を 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に よ り電 気 泳 動 を 行 い 、
PgapA 配 列 の 場 合 約 0 . 6-kb 、 タ 一 ミ ネ 一 タ 一 配 列 の 場 合 、 約 0 . 4-kb の DNA 断 片
が検 出 で きた。
上 記 の PCR に よ り増 幅 した コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム R 由 来 PgapA 配
列 を 含 む 約 0 . 6-kb
DNA 断 片 10
と ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pCRB22 約 4 . 1-kb を 各
々 制 限 酵 素 Sa LI で 切 断 し、 7 0 °C で 1 0 分 処 理 さ せ る こ と に よ り制 限 酵 素 を 失 活
さ せ た 後 、 両 者 を 混 合 し、 こ れ に T4 DNA リガ 一 ゼ 1 0
X
緩衝液
、 Τ4 DNA
リガ 一 ゼ
（タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 製 ） 1 u n i t の 各 成 分 を 添 加 し、 滅 菌 蒸 留
水で
に して 、
1 5 °C
で 3 時 間 反 応 さ せ 、 結 合 さ せ た 。 これ を ラ イ ゲ 一 シ ョ
ン D液 と した 。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン D液 を 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
B i o Logy,
〔Journa L o f Mo Lecu Lar
15 9 ( 1970) 〕 に よ りェ シ エ リ ヒ ア コ リJM1 0 9 を 形 質 転 換 し、
53,
カ ナ マ イ シ ン50
g / mL を 含 む L B 寒 天 培 地
〔1%
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1. 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り プ ラ ス ミ ドDNA を 抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 Sa LI で そ れ ぞ れ 切 断 し、 揷 入 断 片 を 確 認 した 。 こ
の 結 果 、 ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 pCRB22 約 4 . 1-kb の DNA 断 片 に 加 え 、 PgapA 配 列
) の 約 0 . 6-kb
DNA 断 片 が 認 め られ た 。
PgapA 配 列 を 含 む ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 を pCRB206 と命 名 した 。
上 記 PCR に よ り増 幅 した PKK223-3 プ ラ ス ミ ド由 来 タ 一 ミ ネ 一 タ 一 配 列 を 含 む
約 0. 4-kb
DNA 断 片 10
ク タ 一 PCRB206
2
を 制 限 酵 素 Ncol 及 び BspHI で 、 上 述 の ク ロ ー ニ ン グ べ
Lを制
限 酵 素 Ncol で 切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処 理 さ せ る こ と に
よ り制 限 酵 素 を 失 活 さ せ た 後 、 両 者 を 混 合 し、 こ れ に T4 DNA リガ 一 ゼ 1 0
衝液
、 T4 DNA リガ 一 ゼ
を 添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で
X
緩
（タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 製 ） 1 u n i t の 各 成 分
に して 、
1 5 °C
で3 時 間反 応 させ、 結 合 させ た。
こ れ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン E液 と した 。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン E液 を 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
B i o Logy,
53,
カ ナ マ イ シ ン50
〔Journa L o f Mo Lecu Lar
15 9 ( 1970) 〕 に よ りェ シ エ リ ヒ ア コ リJM1 0 9 を 形 質 転 換 し、
g / mL を 含 む L B 寒 天 培 地
〔1%
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1. 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り プ ラ ス ミ ドDNA を 抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 で 切 断 し、 揷 入 断 片 を 確 認 した 。 こ の 結 果 、 ク ロ
— ニ ン グ ベ ク タ 一 PCRB206 約 4 . 7-kb の DNA 断 片 に 加 え 、 タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 の
約 0 . 4-kb
DNA 断 片 が 認 め ら れ た 。
r r nBT1 T2 タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 を 含 む ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 を pCRB207 と 命 名
した 。
[0090]
ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 PCRB209 の 構 築
コ リ ネ ンくク テ リ ゥ 厶
ate
dehydrogenase
A)
グ ル タ ミ カ ム R 由 来 の gapA
遺伝 子 の プ ロモー タ一
( g Lycera
Ldehyde
3-phosph
（以 降 、 PgapA と 記 す ） 配 列 を
含 む DNA 断 片 を 以 下 の 方 法 に よ り増 幅 した 。
PCR に 際 して 、 pCRB207 配 列 を ク ロ 一 ン 化 す る べ く、 配 列 番 号 2 5
(pCRB207)
を 基 に 、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を 合 成 し、 使 用 した 。
[0091 ]
PCRB207 配 列 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-9)
； 5'
-
CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG -3'
(b-9)
； 5'
-
CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG
尚、 プ ラ イ マ 一
（a-9) 及 び
（b-9)
( 配 列 番 号 26)
-3'
( 配 列 番 号 27)
に は Ndel 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い
る。
[0092]
錶 型 DNA は 、 gapA プ ロ モ ー タ 一 及 び r rnBT1 T2 タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 を 含 有 す る
ク ロ 一 ニ ン グ ベ ク タ 一 PCRB207 を 用 い た 。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR System
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
9700(
LA Taq
アプライ ド
(宝酒 造株
式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の条 件 で行 った。
[0093]
反応液 ：
TaKaRa
LA Taq  ( 5 u n i t s な
10X LA PCR  Buffer
I I
(Mg
25mM MgC I
dNTP M i xture
I)
+
free)
.
µ I
5バ I
5バ I
(2. 5mM each)
8 i I
µ I (DNA 含 有 量
錶 型 DNA
1 j
上記 記載 の 2 種 プライマー*
各 々0 . 5 ぉ 1 (最 終 濃 度
滅菌蒸留水
25. 5 / / I
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
*)
g
以下)
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
PCRB207 配 列 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-9) と （b-9) の 組 み 合 わ せ で
行 った。
[0094]
PCR
サ イ クル :
デナ チ ユ レ一 シ ヨン過程
9 4 °C
60
秒
アニー リング過程
5 2 。C
60
秒
エ クス テ ンシ ョン過程
7 2 °C
307
秒
以 上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル 行 った。
[0095]
上 記 で生成 した反 応液 10
を 0 . 8 % ァ ガ ロー スゲル に よ り電 気泳 動 を行 い、
ク ロ一 ニ ングベ クタ 一pCRB207 配 列 を含 む約 5 . 1-kb の DNA 断 片が検 出で きた。
[0096]
上 記 の PCR に よ り増 幅 した pCRB207 由来 遺伝 子 を含 む約 5 . 1-kb
DNA
断 片 10
L
を制 限酵 素 Nde I で切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処理 させ る こ とに よ り制 限酵 素 を失活
させ た後 、 これ にT4
DNA
リガ一 ゼ 10 X 緩 衝 液
、 T4
DNA
リガ一 ゼ
酒 造株 式会社 製 ） 1 u n i t の各成 分 を添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で 10
（
宝
に して、 15
°C で 3 時 間反 応 させ、 結 合 させ た。 これ を ライゲ 一 シ ヨンF液 と した。
得 られ た ライゲ 一 シ ヨンF液 を、 塩 化 カル シ ウム法
B i o Logy,
53,
15 9 ( 1970
カナ マ イ シ ン5 0
ス、 0 .
5%
〔J
o u r na L o f
Mo Lecu La r
) 〕 に よ りェ シ エ リヒア コ リJ M10 9 を形 質転 換 し、
g/m L を含 む L B 寒 天培 地
塩 化 ナ トリウム、 お よび 1.
5%
〔1
%
ポ リペ プ トン、 0 .
5%
酵母 ェ キ
寒 天 〕 に塗 布 した。
この培 地 上 の生育株 を常法 に よ り液 体 培養 し、 培養 液 よ りブラス ミ ドDNA を
抽 出、 該 プラス ミ ドを制 限酵 素 Nde l で切 断 し、 制 限酵 素 サ イ トの揷 入 を確 認
した。
PgapA
PCRB209
[0097]
配 列 及 び r r nBT 1T2 タ一 ミネ一 タ一配 列 を含 む ク ロ一 ニ ングべ クタ 一を
と命 名 した。
ク ロ一 ニ ングベ クタ一！
3CRB2 10 の構 築
コ リネ ンくクテ リゥ厶 グル タ ミカム R 由来 の gapA
a t e dehyd r ogenase
A)
( g Lyce r a Ldehyde
3-phosph
遺伝 子 の プ ロモー タ一 （
以 降、 PgapA と記 す）配 列 を
含 む DNA 断 片 を以 下 の方 法 に よ り増 幅 した。
PCR に際
して、 pCRB207 配 列 を ク ロ一 ン化 す るべ く、 配 列番 号 2 5 ( pCRB207)
を基 に、 それ ぞれ 下記 の一対 の プライマ 一 を合成 し、 使 用 した。
[0098]
PCRB207
配 列増 幅 用 プライマ 一
(a-1 0 )
； 5'
-
CTCT GATATC CTGTTTTGGCGGATGAGAGA -3'
( 配 列 番 号 28)
(b-1 0 )
； 5'
-
CTCT GATATC TCTCCTCTAAAGATTGTAGGAAATG -3'
( 配 列 番 号 29)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-1 0 ) 及 び （
b-1 0 ) に は EcoRV 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
錶 型 DNA は 、 gapA プ ロ モ ー タ 一 及 び r rnBT1 T2 タ 一 ミ ネ 一 タ 一 配 列 を 含 有 す る
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 PCRB207 を 用 い た 。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp PCR System
9700( ア プ ラ イ ド
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa LA Taq
(宝酒造株
式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
[0099]
反応液 ：
TaKaRa LA Taq  (5 u n i t s な
10X LA PCR Buffer
II
(Mg
I)
+
I
free)
25mM MgC I 2
dNTP Mi xture
0. 5
5 i l
µ \
(2. 5 M each)
µ I
錶 型 DNA
(DNA 含 有 量
上 記 記 載 の 2 種 プライ マー
各 々0 . 5
滅菌蒸留水
25. 5 i I
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
I
以下）
(最 終 濃 度
pCRB207 配 列 を増
幅 す る場 合 は プ ラ イ マ 一 （
a-1 0 ) と （
b-1 0 ) の 組 み 合 わ せ で 行 つ た 。
[01 00]
PCR
サ イクル :
デ ナ チ ユ レ一 シ ヨン過 程
：94 。C
60 秒
ァ ニ ー リング過 程
：5 2 。C
60 秒
エ ク ス テ ン シ ョン過 程
： 2 °C
307 秒
以 上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル 行 っ た 。
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
L を 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に よ り電 気 泳 動 を 行 い 、
ク ロ 一 ニ ン グベ ク タ 一 pCRB207 配 列 を 含 む 約 5 . 1-kb の DNA 断 片 が 検 出 で き た 。
[01 0 1 ]
上記の
に よ り増 幅 した pCRB207 由 来 遺 伝 子 を 含 む 約 5 . 1-kb
断 片 10
を制 限 酵 素 EcoRV で 切 断 し、 7 0 °C で 10 分 処 理 さ せ る こ と に よ り制 限 酵 素 を 失 活
さ せ た 後 、 これ に T4 DNA リガ 一 ゼ 10 X 緩 衝 液
、 T4 DNA リガ 一 ゼ
（宝
酒造株 式会社製 ）
1
un i t
の 各 成 分 を 添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で 1 0
に して 、 15
°C で 3 時 間 反 応 さ せ 、 結 合 さ せ た 。 こ れ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン G 液 と し た 。
得 ら れ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン G液 を 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
B i o Logy,
53,
15 9
カ ナ マ イ シ ン50
) 〕 に よ りェ シ エ リ ヒア
( 1 970
g/m
Lを
含 む LB寒 天 培 地
〔1
%
〔J
ou r na L of
Mo Lecu
La r
コ リ J M 1 0 9 を 形 質 転 換 し、
ポ リペ プ トン 、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1 . 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
こ の 培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り 液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り ブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出 、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 EcoRV で 切 断 し、 制 限 酵 素 サ イ トの 揷 入 を 確 認
した 。
PgapA
PCRB2 1 0
[ 0 1 02]
配 列 及 び r r nBT 1 T 2 タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 を 含 む ク ロ 一 ニ ン グ べ ク タ 一 を
と 命 名 した 。
フ エ ノール 生 産 遺 伝 子 の ク ロー ニ ン グ
(3)
コ リネ バ ク テ リゥ 厶
グル タ ミ カ ム 由夹 の フ エ ノー ル 生 産 遺 伝 子 の ク ロ一 ニ ン
コ リネ バ ク テ リゥ 厶
o G遺
ダ ル タ ミ カ ム 由 来 の DAHP シ ン テ タ 一 ゼ を コ 一 ドす る a r
伝 子 、 コ リ ス ミ 酸 厶 タ 一 ゼ を コ 一 ドす る csm 遺 伝 子 を そ れ ぞ れ 含 む DNA 断
片 を 以 下 の PCR 法 に よ り 増 幅 し た 。
PCR
に 際 し て 、 a r o G 遺 伝 子 及 び csm 遺 伝 子 を そ れ ぞ れ ク ロ ー ン 化 す る べ く 、
配 列 番 号 30
( コ リネ バ ク テ リゥ 厶
( コ リネ バ ク テ リゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム csm 遺 伝 子 ） を 基 に 、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一
対 の プ ラ イ マ 一 を、 ア プ ラ イ ド
社製
「394 DNA/RNA
ダ ル タ ミ カ ム a r o G遺 伝 子 ） 及 び 配 列 番 号 3 1
バ イオ システ ム ズ
シ ンセ サ イザ 一
（syn t hes i z e r )
（App
ed
B i osys
t ems)
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用
した 。
[ 0 1 03]
a r o G遺
伝 子増 幅 用 プライマ ー
(a-
1 1)
； 5'
-
CTCT
CATATG
AATAGGGGTGTGAGTTGG
(b-
1 1)
； 5'
-
CTCT
CATATG
TTAATTACGCAGCATTTCTGCAACG
( 配 列 番 号 32)
-3'
-3'
( 配 列 番 号 33)
尚、 プ ラ イ マ 一
（a- 1 1 )
及び
（b- 1 1 )
に は 、 Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
csm 遺 伝 子 増 幅 用 プ ラ イ マ ー
(a-1 2)
； 5' - CTCT CATATG ACTAATGCAGGTGACAACTTC -3'
( 配 列 番 号 34)
(b-1 2)
； 5' - CTCT CATATG TTATCCGAGCTTTCCGCG -3'
( 配 列 番 号 35)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-1 2) 及 び （
b-1 2) に は 、 Ndel 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て
い る。
[01 04]
パ ン 卜エ ア ア グ ロ メ ラ ン ス 由 来 の フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一 ニ ン グ
パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ 活 性 を有
す る 遺 伝 子 を コ ー ドす る t p L遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅 し
た。
PCR に 際
して 、 t p L遺 伝 子 を ク ロ ー ン化 す る べ く、 配 列 番 号 36 ( パ ン トエ ア
ア グ ロ メ ラ ン ス t p L遺 伝 子 ） を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を、 ァ
プライ ド
バ イオ システ ム ズ （
App
セサ イザ 一 （
synthes i zer)
[01 05]
ed B i osystems)
社製 「
394 DNA/RNA シ ン
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
t p L遺 伝 子 増 幅 用 プ ラ イ マ ー
(a-1 3)
； 5' - CTCT CATATG AACTATCCTGCCGAGC -3'
( 配 列 番 号 37)
(b-1 3)
； 5' - CTCT CATATG TTAAATAAAGTCAAAACGCGCAGTAAAG -3'
( 配 列 番 号 38)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-1 3) 及 び （
b-1 3) に は 、 Ndel 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
[01 06]
シ 卜ロバ ク タ 一
プ ラ ッキ 一 由来 の フ エ ノー ル 生 産 遺 伝 子 の ク ロ一 ニ ン グ
シ 卜ロバ ク タ 一 プ ラ ッ キ 一 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ 活 性 を有
す る 遺 伝 子 を コ ー ドす る t p L遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅 し
た。
PCR に 際
して 、 t p L遺 伝 子 を ク ロ ー ン化 す る べ く、 配 列 番 号 39 ( シ トロ
バ ク タ 一 プ ラ ッ キ 一 t p L遺 伝 子 ） を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一
を、 ア プ ラ イ ド
NA シ
[01 07]
バ イオ システ ム ズ （
App
ンセ サ イ ザ 一 （
synthes i zer)
t p L遺 伝 子 増 幅 用 プ ラ イ マ ー
ed B i osystems)
社製 「
394 DNA/R
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
(a-14)
； 5' - CTCT TCATGA ATTATCCGGCAGAACCC -3'
( 配 列 番 号 40)
(b-14)
； 5' - CTCT TCATGA TTAGATATAGTCAAAGCGTGCAG -3'
( 配 列 番 号 4 1)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-14)
及び （
b-14)
に は 、 BspHI 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
[01 08]
デ ス ル フ ィ 卜バ ク テ リュ ー ム ハ フ 二 エ ン ス 由 来 の フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 の ク
ロー ニ ン グ
デ ス ル フ ィ 卜バ ク テ リュ ー ム ハ フ 二 エ ン ス 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リ
ァ 一 ゼ 活 性 を有 す る 遺 伝 子 を コ ー ドす る t p L遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR
法 に よ り増 幅 した 。
PCR に 際
して 、 t p L遺 伝 子 を ク ロ ー ン化 す る べ く、 配 列 番 号 42 ( デ ス ル フ ィ
卜バ ク テ リュ ー ム ハ フ 二 エ ン ス t p L遺 伝 子 ） を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の
プ ラ イ マ 一 を、 ア プ ラ イ ド
バ イオ システ ム ズ （
App
「
394 DNA/RNA シ ン セ サ イ ザ 一 （
synthes i zer)
[01 09]
ed B i osystems)
社製
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した
t p L遺 伝 子 増 幅 用 プ ラ イ マ ー
(a-1 5)
； 5' - CTCT GATATC ATGAAAACCTATCCTGCAGAACC -3'
( 配 列 番 号 43)
(b-1 5)
； 5' - CTCT GATATC TCAAATGTGTTCAAATCTGGCGG -3'
( 配 列 番 号 44)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-1 5) 及 び （
b-1 5) に は 、 EcoRV 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
[01 10]
ク ロ ロ フ レ ク サ ス 才 ウ ラ ンテ ィ ア カ ス 由 来 の フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一
ニ ング
ク ロ ロ フ レ ク サ ス 才 ウ ラ ンテ ィ ア カ ス 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一
ゼ 活 性 を有 す る 遺 伝 子 を コ ー ドす る t p L遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に
よ り増 幅 した 。
PCR に 際
して 、 t p L遺 伝 子 を ク ロ ー ン化 す る べ く、 配 列 番 号 45 ( ク ロ ロ フ レ
ク サ ス 才 ウ ラ ンテ ィ ア カ ス t p L遺 伝 子 ） を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の ブ ラ
イ マ 一 を、 ア プ ラ イ ド
バ イオ システ ム ズ （
App
DNA/RNA シ ン セ サ イ ザ 一 （
synthes
i zer)
ed B i osystems)
社製 「
394
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
t p L遺 伝 子 増 幅 用 プ ラ イ マ 一
(a-1 6)
； 5' - CTCT CATATG CAGGAACAAGACTACCC -3'
( 配 列 番 号 46)
(b-1 6)
； 5' - CTCT CATATG TCATTCCACCGGTTCAAACC -3'
( 配 列 番 号 47)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-1 6) 及 び （
b-1 6) に は 、 Ndel 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
[01 11]
ノ ス トッ ク パ ン ク チ フ オル メ 由 来 の フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一 ニ ン グ
ノ ス トッ ク パ ン ク チ フ オル メ 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ 活 性 を
有 す る 遺 伝 子 を コ ー ドす る t p L遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅
した 。
PCR に 際
して 、 t p L遺 伝 子 を ク ロ ー ン化 す る べ く、 配 列 番 号 48 ( ノ ス トッ ク
パ ン ク チ フ オ ル メ t p L遺 伝 子 ） を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を、
アプライ ド
バ イオ システ ム ズ （
App
ンセ サ イ ザ 一 （
synthes i zer)
[01 12]
ed B i osystems)
社製 「
394 DNA/RNA シ
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
t p L遺 伝 子 増 幅 用 プ ラ イ マ ー
(a-1 7)
； 5' - CTCT CATATG ACCGATGCCAAGCAAAC -3'
( 配 列 番 号 49)
(b-1 7)
； 5' - CTCT CATATG TTACTGCAATTCAAATCTTGCTTGAAAG -3'
( 配 列 番 号 50)
尚、 プ ラ イ マ 一 （
a-1 7) 及 び （
b-1 7) に は 、 Ndel 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
[01 13]
卜レポ ネ マ デ ンテ ィ コ ラ 由 来 の フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 の ク ロ 一 ニ ン グ
卜レポ ネ マ デ ンテ ィ コ ラ 由 来 の チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ 活 性 を有 す
る 遺 伝 子 を コ ー ドす る t p L遺 伝 子 を 含 む DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅 した
PCR に 際
して 、 t p L遺 伝 子 を ク ロ ー ン化 す る べ く、 配 列 番 号 5 1 ( 卜レポ ネ マ
デ ンテ ィ コ ラ t p L遺 伝 子 ） を 基 に、 そ れ ぞ れ 下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を、 ア ブ
ライ ド
バ イオ システムズ
サ イザ一
[ 0
4]
t
P
(a-
L遺
（syn t hes i z e r )
（App
ed
B i osys
社製
t ems)
「394 DNA/RNA
シ ンセ
」 を 用 い て 合 成 し、 使 用 した 。
伝 子増幅用 プライマ ー
； 5'
18 )
-
CTCT
CATATG
GATATTAAAAATTATCCTGCGGAAC
-3'
( 配 列 番 号 52)
(b-
； 5'
18 )
-
CTCT
CATATG
TTAGATATGCTCAAAGCGTGCC
-3'
( 配 列 番 号 53)
尚、 プ ラ イ マ 一
及び
（a- 1 8 )
（b- 1 8 )
に は 、 Nde l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ
て い る。
[ 0 1 15 ]
錶 型 DNA は 、 コ リ ネ バ ク テ リ ゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム は 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
グ
ル タ ミ カ ム R か ら 抽 出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス は
、 N ITE
B i o Lo g i c a l
ロ メ ラ ン ス NBRC
Resou
Cen t e r
(NBRC)
よ り 入 手 した パ ン トエ ア ァ グ
か ら 抽 出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 シ 卜ロ バ ク タ 一
1 2686
ラ ッ キ ー は 、 Ame r i can
バ クタ一
rce
Type
プ ラ ッ キ 一 ATCC
Cu l t u r e
6750
C o L Le c t i o n
(ATCC)
プ
よ り 入 手 した シ トロ
か ら 抽 出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 デ ス ル フ ィ
卜バ ク テ リ ュ ー ム ハ フ 二 エ ン ス は 、 デ ス ル フ ィ 卜バ ク テ リ ュ ー ム ハ フ ニ ェ
ン ス Y 5 1 か ら 抽 出 した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 ク ロ ロ フ レ ク サ ス 才 ウ ラ ン テ ィ
ァ カ ス は 、 Ame r i can
Type
Cu l t u r e
レクサ ス 才 ウ ラ ンテ ィア カ ス
C o L Le c t i o n
J - 1 0-f
1 ATCC
(ATCC)
29366
よ り 入 手 した ク ロ ロ フ
か ら 抽 出 した 染 色 体 DNA
を 用 い た 。 ノ ス ト ッ ク ノ《ン ク チ フ オ リレメ は 、 Ame r i can
t ion
(ATCC)
Type
よ り 入 手 した ノ ス ト ッ ク パ ン ク チ フ 才 ル メ ATCC
した 染 色 体 DNA を 用 い た 。 卜 レ ポ ネ マ デ ン テ ィ コ ラ は 、 J apan
M i c r o o rgan
t a Lo g
[ 0 1 16 ]
No.
i sms
RDB
(JCM)
6 2 17 )
Cu l t u r e
2 9 13 3
C o L Le c
か ら抽 出
C o L Le c t i o n
よ り 入 手 した 卜 レ ポ ネ マ デ ン テ ィ コ ラ 染 色 体 DNA
of
(ca
を用 いた。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR
Sys t e m 9700
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
ィ才株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の条 件 で行 った。
L A Taq
(
アプライ ド
( タ カ ラバ
反応液 ：
TaKaRa
L A Taq  ( 5 u n i t s / /
10X LA PCR  Buffer
2 5m
I I
(Mg
I)
+
.
free)
5バ I
gC I
dNTP M i xture
(2. 5mM each)
8バI
錶 型 DNA
5〃l
上記 記載 の 2 種 プライマ一
各 々 0 . 5 ぉ 1 ( 最 終 濃 度 1 i M)
滅菌蒸 留水
25. 5
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
*)
(DNA 含 有 量 1
g 以下 )
I
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム aroG 遺 伝 子 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ
マ 一 （a-1 1)
と （b-1 1) の 組 み 合 わ せ 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム csm
遺 伝 子 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-1 2 )
と （b-1 2 ) 、 パ ン トエ ア ァ グ ロ
メ ラ ン ス t p L遺 伝 子 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-1 3 )
と （b-1 3 ) の 組 み 合
わ せ 、 シ 卜ロ バ ク タ 一 プ ラ ッ キ 一 t p L遺 伝 子 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a14)
と （b-14) の 組 み 合 わ せ 、 デ ス ル フ ィ 卜バ ク テ リ ュ ー ム ハ フ 二 エ ン ス t p
L遺 伝 子 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-1 5 )
と （b-1 5 ) の 組 み 合 わ せ 、 ク ロ
ロ フ レ ク サ ス 才 ウ ラ ン テ ィ ア カ ス t p L遺 伝 子 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a16 )
と （b-1 6 ) の 組 み 合 わ せ 、 ノ ス トッ ク パ ン ク チ フ オ ル メ t p L遺 伝 子 を 増
幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-1 7 )
と （b-1 7 ) の 組 み 合 わ せ 、 卜 レポ ネ マ デ ン
テ ィ コ ラ t p L遺 伝 子 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ ー （a-1 8 )
と （b-1 8 ) の 組 み 合
わ せ で 行 った。
PGR サ イ ク ル ：
デ ナ チ ユ レー シ ョ ン 過 程
：94 °C
60 秒
ァ ニ一 リング過 程
：5 2 °C
60 秒
エ ク ス テ ン シ ョ ン過 程
：7 2 °C
コ リネ バ ク テ リ ウ ム グ ル タ ミ カ ム
aroG 遺 伝 子
84 秒
コ リネ バ ク テ リ ウ ム グ ル タ ミ カ ム
csm 遺 伝 子
18 秒
パ ン トエ ア
ア グ ロ メ ラ ンス
シ トロパ ク タ ー
ブ ラ ツキ 一
t pl 遺伝子
ノ ス トッ ク
トレポ ネ マ
ハ フ二 エ ンス
ォ ウ ラ ンテ ィア カス
パ ンクチ フオル メ
デ ンテ ィ コ ラ
82 秒
t pl 遺伝子
デ ス ル フ イ トバ ク テ リ ュ 一 ム
ク ロ ロ フ レク サ ス
82 秒
t p l 遺伝子
t p l 遺伝子
t p l 遺伝子
t p l 遺伝子
82 秒
85 秒
84 秒
83 秒
以上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル行 った。
[ 0 118 ]
上記 で生成 した反応液 10
を0 . 8 % ァガ ロースゲル によ り電気泳動 を行 い、
コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカムa r o G遺伝 子の場合約 1. 4-kb 、 コ リネバ クテ
リウ厶 ダル タ ミカムcsm 遺伝 子の場合約 0 . 3-kb 、パ ン トエ ア アグロメラ ンス
t p L遺伝 子の場合約 1. 4-kb
. 4-kb
、 シ 卜ロバ クタ一 プラ ッキ一 t p L遺伝 子の場合約 1
、 デ スル フ イ トバ クテ リューム
b 、 クロロフ レクサ ス
トツク
ハ フ二エ ンス t p L遺伝 子の場合約 1. 4-k
才 ウラ ンテ ィアカス t p L遺伝 子の場合約 1. 4-kb 、 ノス
パ ンクチ フオル メ t p L遺伝 子の場合約 1. 4-kb 、 卜レポネマ
デ ンテ
ィコラ t p L遺伝 子の場合約 1. 4-kb のDNA 断 片が検 出で きた。
[ 0 119 ]
フエノール
(4)
産；
貴 子発現 プラス ミ ド' の構築
フエノール生産遺伝 子の DCRB207 へ の クロ一ニ ング
上記項 (3) に示 したPCR によ り増幅 したシ 卜ロバ クタ一 プラ ッキ一株 由来 t
p L遺伝 子 を含 む約 1. 4-kb
DNA 断 片 10
Lを制 限酵素 BspH I
— を含有 す るクローニ ングべ クタ一 PCRB207
7 0 °C
2
で、 PgapA プロモー タ
を制 限酵素 Nco l で切 断 し、
で 10 分処理 させ る ことによ り制 限酵素 を失活 させた後、両者 を混合 し、
これ にT4
リガ一ゼ 10 X 緩衝液
DNA
式会社製 ）
1 un i t
1从
、 T4 DNA リガ一ゼ （
タカラバ イオ株
に して、 15 °C で3
の各成分 を添加 し、滅菌蒸留水 で 10
時間反応 させ、結合 させた。 これ をライゲ一シ ヨンH液 と した。
得 られた ライゲ一シ ヨンH液 を、塩化 カル シ ウム法
B i o Logy,
53,
カナマイシ ン50
159 ( 1970 ) 〕 によ りェシ エ リヒア
g/m Lを含 む LB 寒天培地
〔1
%
〔J
o u r na L o f Mo Lecu La r
コ リJ M109 を形 質転換 し、
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵母 ェキ
ス、 0 . 5 % 塩化 ナ トリウム、 および 1. 5 % 寒天〕 に塗布 した。
各 々培地上 の生育株 を常法 によ り液体培養 し、培養液 よ りプラス ミ ドDNA を
抽 出、該 プラス ミ ドを制 限酵素 でそれ ぞれ切 断 し、揷 入断 片を確認 した。 こ
の結果、 プラス ミ ドPCRB207 約 5 . 1-kb のDNA 断 片に加 え、 シ 卜ロバ クタ一 ブラ
ツキ一株 由来 t p L遺伝 子 （ライゲ一シ ヨンH液 ）の場合、長 さ約 1. 4-kb の挿 入
断 片が認め られた。
シ 卜ロバ クタ一 プラ ッキ一株 由来 t p L遺伝 子 を含 む プラス ミ ドをpCRB207-t
p L/CB と命名
[ 0 120]
した （
図3 ) 。
フエノール生産遺伝子のpCRB209 への クロ一ニ ング
上記項 (3) に示 したPCR によ り増幅 した コ リネパ クテ リゥ厶 ダル タミカム株
由来 a r o G遺伝子 を含む約 1. 4-kb
DNA 断片、 コ リネパ クテ
株 由来 csm 遺伝子 を含む約 0 . 3-kb
来 t p L遺伝子 を含む約 1. 4-kb
DNA 断片、 パ
ン トエ ア アグロメ ラ ンス 株 由
DNA 断片、 クロロフ レクサス
ス株 由来 t p L遺伝子 を含む約 1. 4-kb
株 由来 t p L遺伝子 を含む約 1. 4-kb
来 t p L遺伝子 を含む約 1. 4-kb
リゥ厶 ダル タミカム
DNA 断片、 ノス
DNA 断片及び
DNA 断片 10
るクロ一ニ ングベ クタ一pCRB209
2
才 ウランテ ィア力
トック パ ンクチ フ オル メ
卜レポネマ
デ ンテ ィコラ株 由
及びPgapA プロモ ータ一を含有 す
L を各 々制 限酵素 Nde l
で切断 し、 7 0 °C で
10 分処理 させ ることによ り制 限酵素 を失活 させた後、両者 を混合
4 DNA
リガ一ゼ 10 X 緩衝液
1从
、 T4
DNA
リガ一ゼ
社製） 1 un i t の各成分 を添加 し、滅菌蒸留水で 10
し、 これ にT
（
タカラバ イオ株式会
に して、 15 °C で3 時間
反応 させ、結合 させた。 これ をライゲ一シ ヨンI 液、J液 、 K液、 L液、 M液及び
N液 と した。
[ 0 12 1]
得 られた6 種 のライゲ一シ ヨンI 液、J液 、 K液、 L液、 M液及びN液 それぞれ を
、塩化 カル シウム法 [ J o u r na l o f
Mo Lecu La r B i o Logy,
53,
よ りェシエ リヒア コ リJ M109 を形質転換 し、 カナマイシ ン50
寒天培地
〔1
%
159 ( 1970 ) 〕 に
g/m Lを含むLB
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵母 エキス、 0 . 5 % 塩化ナ トリウム、 およ
び 1. 5 % 寒天〕 に塗布 した。
各 々培地上の生育株 を常法 によ り液体培養 し、培養液 よ りプラス ミ ドDNA を
抽 出、該 プラス ミ ドを制 限酵素でそれぞれ切断 し、揷入断片を確認 した。 こ
の結果、 プラス ミ ドpCRB209 約 5 . 1-kb のDNA 断片に加 え、 コ リネバ クテ リゥ厶
ダル タミカム株 由来 a r o G遺伝子 （
ライゲ一シ ヨンI 液）の場合、長 さ約 1. 4-kb
の揷入断片が、 コ リネパ クテ リゥ厶 ダル タミカム株 由来 csm 遺伝子 （
ライゲ
—シ ヨン」液）の場合、長 さ約 0 . 3-kb の揷入断片が、パ ン トエア アグロメラ
ンス株 由来 t p L遺伝子 （
ライゲ一シ ヨンK液）の場合、長 さ約 1. 4-kb の揷入断
片が、 クロロフ レクサス 才 ウランテ ィアカス株 由来 t p L遺伝子 （
ライゲ一シ
ヨンL 液 ） の場 合 、 長 さ約 1. 4-kb の揷 入 断 片 が、 ノス トック パ ン クチ フ オル
メ株 由来 t p L遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨンM液 ） の場 合 、 長 さ約 1. 4-kb の挿 入 断 片
が、 卜レポ ネ マ デ ンテ ィコ ラ株 由来 t p L遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨンN液 ） の場
合 、 長 さ約 1. 4-kb の揷 入 断 片 が認 め られ た。
[ 0 122]
コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム株 由来 a r o G遺 伝 子 を含 む プ ラ ス ミ ドを p C
RB209-a
コ リネバ クテ リゥ厶 グル タ ミカ厶株 由来 csm 遺 伝 子 を含 む プ
r oG/CG
ラ ス ミ ドを pCRB209-csm/CG
、 パ ン トエ ア ア グ ロメ ラ ン ス 株 由来 t p L遺 伝 子 を
含 む プ ラ ス ミ ドを pCRB209-t
p L/PA
、 ク ロ ロ フ レクサ ス 才 ウ ラ ンテ ィア カ ス株
由来 t p L遺 伝 子 を含 む プ ラ ス ミ ドを pCRB209-t
p L/CA
、 ノス トック パ ン クチ フ
オル メ株 由来 t p L遺 伝 子 を含 む プ ラ ス ミ ドを pCRB209-t
p L/NP
ンテ ィコ ラ株 由来 t p L遺 伝 子 を含 む プ ラ ス ミ ドを pCRB209-t
、 卜レポ ネ マ デ
p L/TD
とそれ ぞれ
命 名 した （
図3 ) 。
[ 0 123]
フ エ ノール 生 産 遺 伝 子 の DCRB2 10 へ の ク ロ一 ニ ン グ
上 記 項 (3) に示 した PCR に よ り増 幅 した デ スル フ ィ 卜バ クテ リュー ム ハ フ二
エ ン ス 株 由来 t p L遺 伝 子 を含 む約 1. 4-kb
DNA 断 片 10
を含 有 す る ク ロー ニ ン グべ ク タ一 PCRB2 10
2
及 び PgapA プ ロ モ ー タ一
を各 々制 限酵 素 EcoRV で切 断
し、 7 0 °C で 10 分 処 理 させ る こ とに よ り制 限酵 素 を失 活 させ た後 、 両 者 を混 合
し、 これ にT4
DNA
リガ一 ゼ 10 X 緩 衝 液
、 T4
DNA
リガ一 ゼ
（タ カ ラバ
ィ才株 式 会 社 製 ） 1 u n i t の各 成 分 を添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で 10
に して、 15
°C で 3 時 間反 応 させ、 結 合 させ た。 これ を ラ イ ゲ 一 シ ヨン0 液 と した。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨン0 液 を、 塩 化 カル シ ウム法
B i o Logy,
53,
カナ マ イ シ ン5 0
ス、 0 .
5%
15 9 ( 1970
〔J
o u r na L o f
Mo Lecu La r
) 〕 に よ りェ シ エ リヒア コ リJ M10 9 を形 質転 換 し、
g/m L を含 む L B 寒 天 培 地
塩 化 ナ トリウム、 お よび 1.
5%
〔1
%
ポ リペ プ トン、 0 .
5%
酵母 ェ キ
寒 天 〕 に塗 布 した。
各 々培 地 上 の 生 育 株 を常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ りプ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限酵 素 で それ ぞれ切 断 し、 揷 入 断 片 を確 認 した。 こ
の結 果 、 プ ラ ス ミ ドPCRB2 10 約 5 . 1-kb の DNA 断 片 に加 え、 デ スル フ イ トバ クテ
リュー ム ハ フ二 エ ンス株 由来 t p L遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨン0 液 ） の場 合 、 長 さ
約 1 . 4-kb の 揷 入 断 片 が 認 め られ た 。
デ ス ル フ ィ 卜バ クテ リュ ー ム ハ フ 二 エ ン ス 株 由 来 t p L遺 伝 子 を含 む プ ラ ス
ミ ドを pCRB2 10-t p L/DH と命 名 した （図 3 ) 。
[ 0 124]
フ エ ノー ル 生 産 遺 伝 子 の pCRB 1 へ の ク ロ一 ニ ン グ
上 述 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-a
r oG/CG
を制 限 酵 素 BamH I で 切 断 し、 ァ ガ 口 一 ス
電 気 泳 動 後 、 ァ ガ ロー ス ゲ ル か らQIAq u i c k Ge L Ex t r a c t i o n K i t
(株 式 会 社 キ
ァ ゲ ン社 製 ） に よ って 回 収 した gapA プ ロ モ ー タ 一 と コ リネ バ クテ リゥ 厶 ダル
タ ミ カ ム 株 由 来 a r o G遺 伝 子 及 び タ ー ミ ネ ー タ 一 配 列 を連 結 した 約 2 . 4-kb の DNA
断 片 と BamH I で 切 断 した ク ロ一 ニ ン グベ ク タ 一 pCRB 1
[Nakat
ec t o r s f o r
t er ia;
(ed.
n,
t h e gene t i c s eng i nee r i n g o f
) ：
Fe rmen t a t i o n B i o t echno
Ame
i can
l ogy,
Chem i c a l Soc i e t y
c o r ynebac
a,
K.
et
i n Saha,
ACS Sympos i u m Se r i e s 862.
a L. ,
V
B. C.
Wash i n g t o
： 175- 19 1 (2003 ) 〕 約 4 . 1-kb を 7 0 °C で 10 分 処
理 さ せ る こ と に よ り制 限 酵 素 を 失 活 さ せ た DNA 断 片 を混 合 し、 これ に T4 DNA リ
ガ ー ゼ 10 X 緩 衝 液
nit
、 T4
1
DNA
リガ 一 ゼ （タ カ ラバ イ オ 株 式 会 社 製 ）
の 各 成 分 を添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で 10
1
u
に して 、 15 °C で 3 時 間 反 応 さ せ 、
結 合 さ せ た 。 これ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン P液 と した 。
得 られ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン P液 を 用 い、 塩 化 カル シ ウ ム 法
u La r B i o Logy,
53,
15 9
( 1970
し、 ク ロ ラ ム フ エ ニ コ 一 ル 5 0
5%
酵 母 エ キ ス、 0 .
5%
〔J
o u r na L o f
Mo Le c
) 〕 に よ りェ シ エ リ ヒア コ リJ M10 9 を形 質 転 換
g/m L を含 む L B 寒 天 培 地
塩 化 ナ トリウ ム 、 お よ び 1 .
5%
〔1
%
ポ リペ プ トン、 0 .
寒 天 〕 に塗 布 した 。
この 培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り ブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 BamH I で 切 断 し、 揷 入 断 片 を確 認 した 。 こ の 結
果 、 プ ラ ス ミ ドpCRB 1 約 4 . 1-kb の DNA 断 片 に加 え、 コ リネ パ クテ リゥ 厶 グル タ
ミ カ 厶 株 由 来 a r o G遺 伝 子 （ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン P液 ） の 場 合 、 長 さ約 2 . 4-kb の 揷 入
断 片 が 認 め られ た 。
コ リネ バ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム 株 由 来 a r o G遺 伝 子 を含 む プ ラ ス ミ ドを p C
RB 1- a r oG/CG
[ 0 125]
と命 名 した （図 4 ) 。
フ エ ノー ル 生 産 遺 伝 子 の DCRB 15 へ の ク ロ一 ニ ン ク"
上 述 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-csm/CG
を 制 限 酵 素 BamH I で 切 断 し、 ァ ガ 口 一 ス 電
気 泳 動 後 、 ァ ガ ロ ー ス ゲ ル か ら QIAq u i c k Ge L E x t r a c t i o n K i t
(株 式 会 社 キ ア
ゲ ン 社 製 ） に よ っ て 回 収 した gapA プ ロ モ ー タ 一 と コ リ ネ バ ク テ リ ゥ 厶
ミ カ 厶 株 由 来 csm 遺 伝 子 及 び タ 一 ミ ネ 一 タ 一 配 列 を 連 結 した 約 1 . 3-kb
片 と BamH I で 切 断 した 上 述 の プ ラ ス ミ ドpCRB 1 5 約 3 . 8-kb
グル タ
の DNA 断
を 7 0 °C で 1 0 分 処 理 さ せ
る こ と に よ り制 限 酵 素 を 失 活 さ せ た DNA 断 片 を 混 合 し、 こ れ に T 4 DNA リ ガ 一 ゼ
緩衝液
10 X
、 T4
1
リガ 一 ゼ
（タ カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 製 ） 1 u n i t の
に して 、 1 5 °C で 3 時 間 反 応 さ せ 、 結 合 さ
各 成 分 を 添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で
せ た 。 こ れ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン Q液 と した 。
得 ら れ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン Q液 を 用 い 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
u La r
B i o Logy,
53,
し、 ゼ 才 シ ン 2 5
15 9
( 1 970
g/m L を 含
〔J
o u r na L o f
Mo Le c
) 〕 に よ り ェ シ エ リ ヒ ア コ リJ M1 0 9 を 形 質 転 換
む L B寒 天 培 地
〔1
%
ポ リペ プ トン 、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1 . 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
こ の 培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り ブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出 、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 BamH I で 切 断 し、 揷 入 断 片 を 確 認 した 。 こ の 結
果 、 プ ラ ス ミ ドpCRB 1 5 約 3 . 8 タ ミ カ ム 株 由 来 csm 遺 伝 子
の1
断 片 に 加 ぇ 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
ダル
（ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン Q液 ） の 場 合 、 長 さ 約 1 . 3-kb
の揷
入 断 片 が 認 め られ た 。
コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
B 1 5-csm/CG
(5)
と 命 名 した
コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム 株 由 来 csm 遺 伝 子 を 含 む プ ラ ス ミ ドを pCR
（図 4 ) 。
グ ル タ ミ カ ム の 染 色 体 遺 伝 子 破 壊 用 プ ラ ス ミ ドの 構
鎏
コ リネ バ ク テ リ ウ 厶
グ ル タ ミ 力 厶 株 pheA 遺 伝 子 破 壊 用 ブ ラ ス ミ ドの 構 築
コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム 株 の 染 色 体 上 pheA 遺 伝 子 の マ 一 力 一 レ ス
破 壊 用 プ ラ ス ミ ドを 構 築 す る た め に 必 要 な DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅
した 。
PCR
に 際 して コ リ ネ パ ク テ リ ゥ 厶
ダル タ ミ カ ム
下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を、 ア プ ラ イ ド
Rの 配
列 を基 に、 そ れ ぞ れ
バ イ オ シ ス テ ム ズ （App
ed
B i osy
社製
s t ems)
「394 DNA/RNA
シ ンセ サ イザ 一
」 を用 いて合成 し
（syn t hes i z e r )
、 使 用 した 。
[ 0 1 27]
1領
pheA-
域増幅用 プライマ一
(a-
19 )
； 5'
-
CTCT
(b-
19 )
； 5'
-
GCTTAGCTAGTTGGTCGGTTGCAATGATTTGCACGTTGGAG
CTGCAG
TGAAGTGCGTGTAAACGCAC
( 配 列 番 号 54)
-3'
-3'
( 配 列 番 号 55)
尚、 プ ラ イ マ 一
[ 0 1 28]
（a- 1 9 )
に は 、 Ps t l 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い る 。
領域増幅用 プライマー
pheA-2
(a-20)
；
5'
-
AACCGACCAACTAGCTAAGC
(b-20)
；
5'
-
CTCT
尚、 プ ラ イ マ 一
TCTAGA
（b-20)
AATTACTCCTGCCATGGCAG
( 配 列 番 号 57)
-3'
に は 、 Xbal 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い る 。
錶 型 DNA は 、 コ リ ネ バ ク テ リ ウ 厶
[ 0 1 29]
( 配 列 番 号 56)
-3'
グ ル タ ミ カ ム R か ら抽 出 した 染 色 体 DNA を
用 いた。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR Sys t e m 9700
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
(
アプライ ド
( タ カ ラバ
L A Taq
ィ才株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の条 件 で行 った。
[0
13 0
]
反応液 ：
L A Taq 
TaKaRa
1 0 X L A PCR  Buffe
2 5m
MgC I
dNTP
M i xtu
re
(5 u n i t sな
r
I I
+
free)
0. 5
I
5
バI
5
I
(2. 5 M each)
I
錶 型 DNA
5µ
上記 記載 の 2 種 プライマ一ぺ
各 々0 . 5
滅 菌蒸 留水
25. 5 µ
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
* )
pheA-
せ 、 pheA-2
[ 0 13 1 ]
(Mg
I)
1領
I
(DNA
含有量 1
I
g
以下)
(最 終 濃 度 1
M)
I
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
域 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a- 1 9 )
領 域 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-20)
と （b- 1 9 )
の組 み合 わ
と （b-20) で 行 っ た 。
PCR
サ イクル ：
デナ チ ユ レ一 シ ヨン過程
ァニ一 リング過程
：94 。C
：5 2 。C
：72 °C
エクス テ ンシ ョン過程
PheA-1
領域
50
秒
PheA-2
領域
50
秒
以上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル行 った。
[ 0 132]
上記 で生成 した反応液 10
を0 . 8 % ァガ ロー スゲル によ り電気泳動 を行 い、
コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム コ リpheA- 1領 域 の場合約 0 . 9-kb 、 pheA-2 領
域 の場合約 0 . 8-kb のDNA 断 片が検 出で きた。
[ 0 133]
次 に、 上記 の PCR によ り増 幅 した pheA- 1領 域 断 片 とpheA-2 領 域 断 片 を
ず
つ混合 し、 PCR によ り2 種 の断 片の結 合反応 を行 った。
実 際 の PCR は、 サ 一マル サ イ クラ一
GeneAmp PCR Sys t e m 9700 ( ア プライ
ド
バ イオ システ ム ズ社製 ）を用 い、 反応試薬 と してTaKaRa LA Taq ( タカラバ
ィ才株 式会社製 ） を用 いて下記 の条件 で行 った。
反 'に
、
液 ：
TaKaRa LA Taq  (5 un i t s な I )
0X LA PCR  Buffer
II
(Mg 2+ free)
(2.
6
o
5 M
各 々1 は
滅菌蒸留水
29.
* ) pheA- 1領 域 断 片
PCR
秒
each)
上記記載の 2 種断片め
以上 を混合 し、 この 5 0
[ 0 134]
5 i I
I
5 バI
2 5 M MgC I 2
dNTP Mi xture
.
I
の反応液 をPCR にか けた。
と pheA-2 領 域 断 片で行 った。
サ イクル ：
デナ チ ユ レ一 シ ヨン過程
9 5 °C
20
ァ ニ ー リング過程
5 2 °C
5
エクステ ンシ ョン過程
7 2 °C
50
以上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル行 った。
秒
秒
秒
さ ら に 、 得 られ た pheA-1 及 び pheA - 2 の 結 合 断 片 を 錶 型 と し、 PCR に よ り phe
[01 35]
A欠 失 断 片 の 増 幅 を 行 っ た 。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp PCR System
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
9700( ア プ ラ イ ド
LA Taq
( タ カ ラバ
ィ 才 株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の 条 件 で 行 った。
反応液 ：
TaKaRa
LA Taq  (5 u n i t s な
10X LA PGR Buffer
I I
.
I)
( g 2+ free)
µ
I
I
25mM MgC I 2
dNTP Mi xture
(2. 5mM each)
I
錶 型 DNA
5 バ 1 (DNA 含 有 量 1 パ g 以 下 ）
上記記載 の 2 種 プライマ一
各 々0 . 5 パ 1 (最 終 濃 度
滅菌蒸留水
25. 5 〃 I
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
*)
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
pheA 欠 失 断 片 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ ー （a-1 9 )
と （b-20) の 組 み 合
わ せ で 行 った。
PCR サ イ ク ル ：
デ ナ チ ユ レ一 シ ヨ ン過 程
95 °C
20 秒
ア ニー リング過 程
5 2 。C
5 秒
エ ク ス テ ン シ ョ ン過 程
72 °C
97 秒
以 上 を 1 サ イ ク ル と し、 3 0 サ イ ク ル 行 っ た 。
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
L を 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に よ り電 気 泳 動 を 行 い 、
pheA 欠 失 断 片 約 1. 6-kb が 検 出 で き た 。
[01 37]
上 記 の PCR に よ り増 幅 した コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム R 由 来 pheA 欠
失 配 列 約 1. 6-kb
DNA 断 片 10
プ ラ ス ミ ドpCRA725
04)
[J.
Mo
、 ( 特 開 2006-1 24440)
と約 4 . 4-kb の マ 一 カ ー レス 染 色 体 遺 伝 子 導 入 用
し Mi crob i o L. B i otechno
]
し、 Vo L. 8 、 243-254(20
2 从 を 各 々 制 限 酵 素 Pstl
及 び Xbal で 切 断 し、 7 0
°C で 10 分 処 理 さ せ る こ と に よ り制 限 酵 素 を 失 活 さ せ た 後 、 両 者 を 混 合 し、 こ
れ にT4
DNA
リガ 一 ゼ 10 X 緩 衝 液
1
L
、 T4
DNA
リガ 一 ゼ
式 会 社 製 ） 1 u n i t の 各 成 分 を 添 加 し、 滅 菌 蒸 留 水 で 10
（タ カ ラ バ イ オ 株
に して 、 15 °C で 3
時 間 反 応 さ せ 、 結 合 さ せ た 。 こ れ を ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン R液 と した 。
得 ら れ た ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン R液 を 、 塩 化 カ ル シ ウ ム 法
B i o Logy,
53,
15 9
カ ナ マ イ シ ン5 0
( 1 970
〔J
o u r na L o f
Mo Lecu La r
) 〕 に よ り ェ シ エ リ ヒ ア コ リJ M1 0 9 を 形 質 転 換 し、
g/m L を 含
む L B寒 天 培 地
〔1
%
ポ リペ プ トン 、 0 . 5 % 酵 母 ェ キ
ス 、 0 . 5 % 塩 化 ナ ト リ ウ ム 、 お よ び 1 . 5 % 寒 天 〕 に 塗 布 した 。
培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り プ ラ ス ミ ドDNA を 抽 出
、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 P s t l 及 び Xbal
で そ れ ぞ れ 切 断 し、 揷 入 断 片 を 確 認
した 。 こ の 結 果 、 プ ラ ス ミ ドPCRA725 約 4 . 4-kb
テ リゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム 株 由 来 pheA 欠 失 遺 伝 子
、 長 さ 約 1 . 6-kb
（ラ イ ゲ 一 シ ヨ ン R液 ） の 場 合
の 揷 入 断 片 が 認 め られ た 。
コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶
を pCRA725-pheA/CG
[ 0 1 38]
の DNA 断 片 に 加 え 、 コ リ ネ バ ク
ダ ル タ ミ カ ム 株 由 来 pheA 欠 失 遺 伝 子 を 含 む プ ラ ス ミ ド
と 命 名 した 。
コ リネ パ ク テ リ ゥ ム
グル タ ミ カ ム 株
コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
DOXF
遣伝 子破读 用 プラス ミ
ド'
の構 築
ダ ル タ ミ カ ム 株 の 染 色 体 上 poxF 遺 伝 子 の マ 一 力 一 レ ス
破 壊 用 プ ラ ス ミ ドを 構 築 す る た め に 必 要 な DNA 断 片 を 以 下 の PCR 法 に よ り増 幅
した 。
PCR
に 際 して コ リ ネ パ ク テ リ ゥ 厶
ダル タ ミ カ ム
下 記 の 一 対 の プ ラ イ マ 一 を、 ア プ ラ イ ド
社製
s t ems)
「394 DNA/RNA
シ ンセ サ イザ 一
Rの 配
列 を基 に、 そ れ ぞ れ
バ イ オ シ ス テ ム ズ （App
（syn t hes i z e r )
ed
B i osy
」 を用 いて合成 し
、 使 用 した 。
[ 0 1 39]
poxF-
1領
域増幅用 プライマ 一
(a-2
1)
； 5'
-
CTCT
(b-2
1)
； 5'
-
GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC
TCTAGA
TACGTCCTAAACACCCGAC
( 配 列 番 号 58)
-3'
-3'
( 配 列 番 号 59)
尚、 プ ラ イ マ 一
[ 0 140]
poxF-2
（a-2 1 )
に は 、 Xbal 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い る 。
領域増幅用 プライマ ー
(a-22)
；
5'
-
CAAGTCAGCAATGGTTGGTC
(b-22)
；
5'
-
CTCT
TCTAGA
( 配 列 番 号 60)
- 3
TGATCAGTACCAAGGGTGAG
-3'
( 配 列 番 号 6 1)
尚 、 プ ラ イ マ 一 （b-22)
[0141 ]
に は 、 Xbal 制 限 酵 素 部 位 が 付 加 さ れ て い る 。
錶 型 DNA は 、 コ リネ バ ク テ リ ウ 厶 グ ル タ ミ カ ム R か ら抽 出 した 染 色 体 DNA を
用 いた。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR System
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
9700(
LA Taq
アプライ ド
( タ カ ラバ
ィ才株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の条 件 で行 った。
[0142]
反応液 ：
TaKaRa
L A Taq  (5 u n i t s な
10X LA PCR Buffer
I I
(Mg
I)
+
0.
free)
5
I
I
25mM MgC I 2
dNTP Mi xture
(2. 5 M each)
錶 型 DNA
5バI
上記 記載 の 2 種 プライ マー
各 々0. 5
滅菌蒸留水
25. 5 j
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
*)
poxF
せ 、 poxF
[0143]
(DNA 含 有 量 1 〃 g 以 下 ）
l
( 最 終 濃 度 1 バ M)
I
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
- 1領 域 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-21 )
- 2 領 域 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ 一 （a-22)
と （b-21 ) の 組 み 合 わ
と （b-22) で 行 っ た 。
PGR サ イ ク ル ：
デ ナ チ ュ レー シ ヨ ン 過 程
9 4 °C
60 秒
ァ ニ ー リング過 程
5 2 °C
60 秒
エ ク ス テ ン シ ョ ン過 程
7 2 °C
poxF-1
領域
50 秒
poxF-2
領域
50 秒
以 上 を 1 サ イ ク ル と し、 3 0 サ イ ク ル 行 っ た 。
[0144]
上 記 で 生 成 した 反 応 液 10
コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
を 0 . 8 % ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に よ り電 気 泳 動 を 行 い 、
グ ル タ ミ カ 厶 poxF-1 領 域 の 場 合 約 0 . 8-kb 、 poxF-2 領 域
の 場 合 約 0 . 8-kb の DNA 断 片 が 検 出 で き た 。
[0145]
次 に 、 上 記 の PCR に よ り増 幅 した poxF-1 領 域 断 片 と poxF-2 領 域 断 片 を
ず
つ 混 合 し、 PCR に よ り 2 種 の 断 片 の 結 合 反 応 を 行 っ た 。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR System
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
9700(
LA Taq
アプライ ド
( タ カ ラバ
ィ才株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の条 件 で行 った。
心液 ：
TaKaRa LA Taq  (5 un i t s/
0X LA PCR  Buffer
II
I)
0. 5
(Mg 2+ free)
5バI
25mM MgC I 2
5 i I
dNTP Mi xture
上記記載の
(2. 5 M each)
8
29. 5
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
1領
poxF-
域断片
I
各 々1バ
種 断 片*
滅 菌蒸留水
* )
I
I
の 反 応 液 を PCR に か け た <
と poxF-2
領 域 断 片 で行 った。
PGR サ イ ク ル ：
デ ナ チ ュ レー シ ヨ ン 過 程
95 。C
20 秒
ア ニー リング過 程
52 °C
5 秒
エ ク ス テ ン シ ョン過 程
72 °C
50 秒
以 上 を 1 サ イ ク ル と し、 3 0 サ イ ク ル 行 っ た 。
[ 0 147]
さ ら に 、 得 ら れ た poxF-
1及
び poxF-2
の 結 合 断 片 を 錶 型 と し、 PCR に よ り poxF
欠 失 断 片 の増 幅 を行 った。
実 際 の PCR は 、 サ 一 マ ル サ イ ク ラ 一
GeneAmp
PCR
Sys t e m 9700
バ イ オ シ ス テ ム ズ 社 製 ）を 用 い 、 反 応 試 薬 と して TaKaRa
(
L A Taq
アプライ ド
( タ カ ラバ
ィ才株 式 会 社 製 ） を用 い て 下 記 の条 件 で行 った。
[ 0 148]
反応液 ：
TaKaRa LA Taq  (5 u n i t s/
0X LA PCR  Buffer
25m
II
(Mg 2+ free)
MgC I
dNTP Mi xture
I)
0. 5
I
5お I
5リ I
(2. 5 M each)
8バ I
錶 型 DNA
5 〃 I (DNA 含 有 量 1 /
上記記載の 2 種 プライマーぺ
各 々 0. 5
滅 菌蒸 留水
25. 5 µ I
以 上 を 混 合 し、 こ の 5 0
* )
poxF
l
以下)
(最 終 濃 度
の 反 応 液 を PCR に か け た 。
欠 失 断 片 を 増 幅 す る 場 合 は プ ラ イ マ ー （a-2 1 )
と （b-22)
の組 み合
わせで行 った。
[ 0 149]
PCR
サ イクル :
デナチ ユ レ一 シ ヨン過程
95 °C
20 秒
ァ ニ ー リング過程
52 °C
5秒
エクステ ンシ ョン過程
72 °C
97 秒
以上 を 1 サ イ クル と し、 3 0 サ イ クル行 った。
上記 で生成 した反応液 10
poxF
Lを0 . 8 % ァガ ロースゲル によ り電気泳動 を行 い、
欠失断 片約 1. 6-kb が検 出で きた。
上記 のPCR によ り増幅 した コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム R由来 poxF 欠
[ 0 150]
失配列約 1. 7-kb
DNA 断 片 10
プラス ミ ドpCRA725 [ J .
04)
Mo
、 （
特 開2006- 124440)
と約4 . 4-kb のマ一 カー レス染色体遺伝 子導 入用
し Mi c r ob i o L. B i o t echno し、 Vo L. 8、 243-254 (20
を各 々制 限酵素 Xbal で切 断 し、 7 0 °C で 10 分
]
処理 させ る ことによ り制 限酵素 を失活 させた後、両者 を混合 し、 これ にT4
A
リガ一ゼ 10 X 緩衝液
1 un i t
1从
、 T4 DNA
リガ一ゼ
DN
（タカラバ イオ株 式会社製 ）
に して、 15 °C で3 時間反応 さ
の各成分 を添加 し、滅菌蒸留水 で 10
せ、結合 させた。 これ をライゲ一シ ヨンS液 と した。
得 られた ライゲ一シ ヨンS液 を、塩化 カル シ ウム法
B i o Logy,
53,
159 ( 1970
カナマイシ ン50
〔J
o u r na L o f Mo Lecu La r
) 〕 によ りェシ エ リヒア コ リJ M109 を形 質転換 し、
g/m Lを含 む LB 寒天培地
〔1
%
ポ リペ プ トン、 0 . 5 % 酵母 ェキ
ス、 0 . 5 % 塩化 ナ トリウム、 および 1. 5 % 寒天〕 に塗布 した。
培地上 の生育株 を常法 によ り液体培養 し、培養液 よ りプラス ミ ドDNA を抽 出
、該 プラス ミ ドを制 限酵素 Xbal でそれ ぞれ切 断 し、揷 入断 片を確認 した。 こ
の結果、 プラス ミ ドPCRA725 約4 . 4 -
の1
断 片に加 ぇ、 コ リネパ クテ リゥ厶
ダル タ ミカム株 由来 pheA 欠失遺伝 子 （ライゲ一シ ヨンS液 ）の場合、長 さ約 1.
7-kb
の揷 入断 片が認め られた。
コ リネパ クテ リゥ厶 ダル タ ミカム株 由来 poxF 欠失遺伝 子 を含 む プラス ミ ド
をPCRA725- poxF/CG と命名 した。
[ 0 15 1]
(6)
おお
び フヱノールせ
に
わ るまィ
云 石
皮 ほ のネ
マ 一 力 一 レス 染 色 体 遺 伝 子 導 入 用 べ ク タ 一 PCRA725 は 、 コ リネ バ ク テ リゥ 厶
ダル タ ミ カ ム R 内 で 複 製 不 能 な プ ラ ス ミ ドで あ る。 pCRA725-pheA/CG
、 電 気 パ ル ス 法 [Ag
i c r ob i o
し、 V o L.
ic.
Bio
し Chem. 、 V o L. 5 4 、 443-447
W/V)
)
g/m L を 含
M
むA寒 天 培 地 〔
A液 体 培 地
寒 天 〕 に 塗 布 した 。 上 記 の 培 地 で 得 られ た 一 重 交 叉 株 を、 1 0 % (
5%
ス ク ロ ー ス 含 有 BT 寒 天 培 地 [ (NH 2 ) 2 C0
K2 HP0 4
及 び Res.
に よ り、 コ リネ バ ク テ リゥ 厶 グル タ
14 4 、 18 1- 18 5 ( 1993) ]
ミ カ 厶 R を形 質 転 換 し、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
、 お よ び 1.
( 1990)
を用 い て
0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H2 0
1 m し 0 . 02%
MnS0 4 . 2 H2 0
2 g 、 (NH 4 ) 2 S0 4
0 . 5 g 、 0 . 06%
(w/v)
(w/v)
F e 2 S0 4 . 7 H2 0 + 0 . 042%
b i ot i n so l ut i on
を 蒸 留 水 1 しに溶 解 、 お よ び 1 .
ami n s o l u t i o n 2
プ ラ ス ミ ドpCRA725-pheA/CG
7 g 、 K H2 P0 4 0 . 5 g 、
5%
1 m し 0 . 0 1% (w/v)
(w/v
t hi
寒 天 ] に 塗 付 した 。
が 染 色 体 上 の相 同領 域 との 一 重 交 叉 株 の 場 合 、
上 の カ ナ マ イ シ ン耐 性 遺 伝 子 の 発 現 に よ る カ ナ マ イ シ ン耐 性
pCRA725-pheA/CG
と、 バ チ ラ ス
サ プ チ リス （
Bac は Lu s subt
は i s ) の sacR-sacB
遺伝 子 の発現
に よ る ス ク ロ ー ス 含 有 培 地 で の 致 死 性 を 示 す の に 対 し、 二 重 交 叉 株 の 場 合 、 p
上 の カ ナ マ イ シ ン耐 性 遺 伝 子 の 脱 落 に よ る カ ナ マ イ シ ン感 受
CRA725-pheA/CG
性 と、 sacR-sacB
遺 伝 子 の脱 落 に よ る ス ク ロー ス含 有 培 地 で の 生 育 性 を示 す。
従 っ て 、 マ 一 力 一 レス 染 色 体 遺 伝 子 破 壊 株 は 、 カ ナ マ イ シ ン感 受 性 及 び ス ク
ロー ス含 有 培 地 生 育 性 を示 す。
そ こ で 、 カ ナ マ イ シ ン感 受 性 及 び ス ク 口 一 ス 含 有 培 地 生 育 性 を 示 した 株 を
選 択 した 。 こ の コ リネ バ ク テ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム R株 pheA 遺 伝 子 マ 一 カ ー レ
ス 破 壊 株 を コ リ ネ ンくク テ リゥ ム クリレタ ミ カ ム (Co r ynebac
)
PHE 1 と命 名
t e
iu
g Lu t a m i cum
した （
表 1 ) 。
同 様 に、 上 記 （
5 ) で 構 築 した 、 コ リネ パ ク テ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム R株 に お
い て フ エ ノ ー ル 2 - モ ノ 才 キ シ ゲ ナ 一 ゼ 活 性 を有 す る 酵 素 を コ ー ドす る poxF 遺
伝 子 マ 一 力 一 レス 破 壊 用 プ ラ ス ミ ドpCRA725-poxF/CG
g
ic.
Bio
し Chem. 、 V o L. 5 4 、 443-447
4 4 、 18 1- 18 5 ( 1993) ]
( 1990)
を用 い て 電 気 パ ル ス法 [ A
及 び Res.
Mi c r ob i o
し、 V o L.
に よ り、 コ リネ バ ク テ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム A pheA 株 を
形 質 転 換 し、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
g/m L を 含
む A 寒 天 培 地 に 塗 布 した 。 上 記 の 培
1
地 で 得 られ た 一 重 交 叉 株 を 、 10%(W/V) ス ク 口 一 ス 含 有 BT 寒 天 培 地 に 塗 付 し力
ナ マ イ シ ン 感 受 性 及 び ス ク ロ ー ス 含 有 培 地 生 育 性 を 選 択 した 。
こ の 得 られ た pheA 遺 伝 子 及 び poxF 遺 伝 子 マ 一 力 一 レ ス 破 壊 株 を コ リネ バ ク
テ リ ゥ 厶 グ ル タ ミ カ ム （Corynebacter
i u m g Lutam i cum)
PHE2 と命 名 した
（
表
)
[ 表 1]
コ リネ パ ク テ リゥ ム グ ル タ ミカ ム の 染 色 体 遺 伝 子 破 壊 株
[01 54]
(7)
チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 活 性 を 有 す る t p L酵 素 遺 伝 子 導 入 株 の 構 築
上 述 の プ ラ ス ミ ド6 種 類 pCRB209-tp
、
CRB209-tp
L/CA
L/PA 、
CRB207-tp
L/NP 及 び pCRB209-tp
pCRB209-tp
ス 法 [Agr i c . B i o し Chem. 、 Vo L. 54 、 443-447(1
990)
L/CB
CRB21 0 - t
L/DH
L/TD を 用 い て 、 電 気 パ ル
及び
es .
Mi crob i o l .
に よ り、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム R
、 Vo L. 144 、 18 1 - 185(1 993) ]
株 を 形 質 転 換 し、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
g/m L を 含 む A 寒 天 培 地 に 塗 布 した 。
こ の 培 地 上 の 生 育 株 を 常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ り ブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出 、 該 プ ラ ス ミ ドを 制 限 酵 素 で 切 断 し、 挿 入 断 片 を 確 認 した 。 こ の 結 果 、
上 記 で 作 製 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-tp
、
CRB209-tp
L/CA
得 られ た 株 を コ
i cum)
-tp
[01 55]
(8)
R/pCRB209-tp
L/PA
L/CA 、 R/pCRB209-tp
フエノール
993) ]
L/CB
L/NP 及 び R/pCRB209-tp
54 、 443-447(1
CRB21 0 - t
L/DH
L/TD の 導 入 が 認 め られ た
R/pCRB21 0 - t
i u m g Lutam
L/DH
R/pCRB209
L/TD と命 名 した 。
入ほ の ネ
上 述 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-tp
Chem. 、 Vo L.
L/CB
リ ゥ ム クつレタ ミ カ ム (Corynebacter
R/pCRB207-tp
ままィ
云
CRB207-tp
L/NP 及 び pCRB209-tp
pCRB209-tp
リ ネ ンくク テ
L/PA 、
990)
L/PA を 用 い て 、 電 気 パ ル ス 法
及 び Res.
Mi crob i o し、 Vo L.
[Agr
iに
B i o L.
144 、 18 1 - 185(
に よ り、 コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム R株 を 形 質 転 換 し、 カ ナ マ
イ シ ン 50
g/m L を含 む A 寒 天 培 地
に塗 布 した。
この 培 地 上 の 生 育 株 を常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ りブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 で切 断 し、 揷 入 プ ラ ス ミ ドを確 認 した。 この
結 果 、 上 記 で 作 製 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-t
p L/PA
の導 入 が 認 め られ た。
得 られ た株 を コ リネ ンくクテ リゥム クつレタ ミ カ ム (Co r ynebac t e i u
i cum)
PHE3
と命 名 した。
また、 上 述 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-t
[ 0 156]
p L/PA
及 び pCRB 1- a r oG/CG を用 い て、 電 気
パ ル ス法 [Ag r i c . B i o し Chem. 、 Vo L. 54 、 443-447
o
し、 Vo L. 14 4 、 18 1- 18 5 ( 1993) ]
R株
g Lu t a
Mi c r o b i
に よ り、 コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミ カ ム
を形 質 転 換 し、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
L を含 む A 寒 天 培 地
及 び Res.
( 1990)
g/m L及 び
ク ロ ラ ム フ エニ コ一 ル 5
g/m
に塗 布 した。 尚、 これ ら2 種 類 の プ ラ ス ミ ドは、 コ リネパ ク
テ リゥ厶 ダル タ ミ カ ム 内 で 共 存 可 能 な プ ラ ス ミ ドで あ る。
この 培 地 上 の 生 育 株 を常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ りブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 で切 断 し、 挿 入 断 片 を確 認 した。 この結 果 、
上 記 で 作 製 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-t
p L/PA
及 び pCRB 1- a r oG/CG の導 入 が 認 め られ
た。 得 られ た株 を コ リネバ クテ リゥ厶 グル タ ミ カ ム
a m i cum)
PHE4
い て、 電 気 パ ル ス法 [Ag
s.
Mi c r o b i o
ic.
p L/PA 、 pCRB 1- a r oG/CG
Bio
t e r i u m g Lu t
し、 Vo L. 14 4 、 18 1- 18 5 ( 1993) ]
g/m L及 び ゼ 才 シ ン2 5
及 び pCRB 15-csm/CG
し Chem. 、 Vo L. 54 、 443-447
( 1990)
を用
及 び Re
に よ り、 コ リネバ クテ リゥ厶 グ
ル タ ミ カ ム R株 を形 質 転 換 し、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
ル 5
r ynebac
と命 名 した。
上 述 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-t
[ 0 157]
（Co
g/m
g/m L を含 む A 寒 天 培 地
し ク ロ ラ ム フ エニ コ一
に塗 布 した。 尚、 これ ら3
種 類 の プ ラ ス ミ ドは、 コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミ カ ム 内 で 共 存 可 能 な ブ ラ
ス ミ ドで あ る。
この 培 地 上 の 生 育 株 を常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ りブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 で切 断 し、 挿 入 断 片 を確 認 した。 この結 果 、
上 記 で 作 製 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-t
p L/PA 、 pCRB 1- a r oG/CG
及 び pCRB 15-csm/CG
の導 入 が 認 め られ た。 得 られ た株 を コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミ カ ム
（Co
ry
nebac t e
iu
g Lu t a m i cum)
PHE5
と命 名 した。 尚、 本 株 の 遺 伝 子 組 換 え の概 要
は、 表 2 に ま とめ て 示 した。
[表2]
フ エ ノ ー ル 生産遺伝 子 導 入株
* )
表 2 内 の表 示 の 略 語 は以 下 の 通 り
< 遺伝 子起源 略語 >
PA ；
CG
(9)
；
パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス
コ リネバ クテ リウ厶 グル タ ミ カ ム
副 生経路 及 び フ ェ ノ ー ル 分解 遺伝 子破 壊 株 へ の フ ェ ノ ー ル 生産 遺伝 子 の
上 述 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-t
い て、 電 気 パ ル ス法 [Ag
s.
R
Mi c r o b i o
ic.
p L/PA 、 pCRB 1- a r oG/CG
Bio
し Chem. 、 Vo L. 54 、 443-447
し、 Vo L. 14 4 、 18 1- 18 5 ( 1993) ]
ル タ ミ カ ム PHE 1 (
pheA)
及 び pCRB 15-csm/CG
株 、 及 び PHE2 (
( 1990)
を用
及 び Re
に よ り、 コ リネバ クテ リゥ厶 グ
pheA
株 を形 質 転 換 し、
poxF )
カナ マ イ シ ン 50
g/m
し ク ロ ラ ム フ エニ コ一 ル 5
g/m L及 び ゼ 才 シ ン2 5
m L を含 む A 寒 天 培 地
に塗 布 した。 尚、 これ ら3 種 類 の プ ラ ス ミ ドは、 コ リネバ
g/
クテ リゥ厶 ダル タ ミ カ ム 内 で 共 存 可 能 な プ ラ ス ミ ドで あ る。
この 培 地 上 の 生 育 株 を常 法 に よ り液 体 培 養 し、 培 養 液 よ りブ ラ ス ミ ドDNA を
抽 出、 該 プ ラ ス ミ ドを制 限 酵 素 で切 断 し、 挿 入 断 片 を確 認 した。 この結 果 、
上 記 で 作 製 の プ ラ ス ミ ドpCRB209-t
の導 入 が 認 め られ た。 PHE 1 (
ダル タ ミ カ ム (Co r ynebac t e i u
p L/PA 、 pCRB 1- a r oG/CG
pheA)
株 に導 入 した株 を コ リネパ クテ リゥ厶
g Lu t a m i cum)
PHE6 、 PHE2
株 に導 入 した株 を コ リネバ クテ リゥ厶 ダル タ ミ カ ム
a
i cum)
PHE7
及 び pCRB 15-csm/CG
（Co
( ∆ ρ θΑ ∆ LdhA)
r ynebac
t e r i u m g Lu t
と命 名 した。 尚、 本 株 の 遺 伝 子 組 換 え の概 要 は、 表 6 に ま とめ て
示 した 。 コ リ ネ ンヾ
、
ク テ リ ゥ ム ク、
、
リレタ ミ カ ム (Corynebacter
PHE7 は 、 曰本 国 千 葉 県 木 更 津 市 か ず さ 鎌 足 2-5-8
行政 法 人製 品評価技術 基盤機 構
[01 60]
P-976)
( 郵 便 番 号 292-081 8 ) の 独 立
特 許 微 生 物 寄 託 セ ン タ ー に 寄 託 した （受 託
曰 ：201 1 年 8 月 12 曰、 受 託 番 号 ：NITE BP-976)
3 1 曰、 受 託 番 号 ：NITE
i u m g Lutam i cum)
( 原 寄 託 の 受 託 曰 ：201 0 年 8 月
。
[ 表 3]
遺 伝 子 破 壊 株 へ の フ エノー ル 生 産 遺 伝 子 の 導 入
* )
表 内 の表 示 の 略 語 は以 下 の通 り
< 遺伝 子起源 略語>
PA ；
CG
[01 6 1 ]
；
ま 施ィ
列3
ア グ ロメラ ン ス
パ ン トエ ア
コ リネ バ ク テ リ ウ 厶 グ ル タ ミ カ ム
t
D
に貴
R
子 導 入株 に お け る チ ロ シ ン フ エ ノー ル - ' ァ 一 ゼ 活 件 目
II
、
;
定
( 1)
チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リア 一 ゼ の 活 性 測 定
実 施 例 2 (7) に お い て 構 築 した チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 遺 伝 子 を 導 入
した コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム R/pCRB209-tp
、 R/pCRB21 0-tp
L/DH
R/pCRB209-tp
p L/TD を 、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
、 K H2 P0 4 0 . 5 g 、 K2HP0 4
0 + 0 . 042% (w/v)
0. 0 1
(w/v)
L/CA
R/pCRB209-tp
g / mL含 む A 寒 天 培 地
0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H20
MnS0 4 . 2 H20
7 g 、 g lucose
[ (NH 2 ) 2C0
2 g 、 (NH 4 ) 2S0 4
7g
Fe 2 S0 4 . 7 H2
b i o t i n s o lut i o n
ext ract
L/CB
L/NP 及 び R/pCRB209-t
0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
1 m し 0 . 02% (w/v)
t h i a m i n s o lut i o n 2 m し yeast
casam i no a c i d
L/PA 、 R/pCRB207-tp
1 mし
2 g 、 v i tam i n assay
4 0 g 、 寒 天 15 g を 蒸 留 水 1L に 懸 濁 ]
に塗布 し
、 2 8 °C 、 2 0 時 間 暗 所 に 静 置 した 。
上 記 の プ レー 卜で 生 育 した 各 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム チ ロ シ ン
フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 遺 伝 子 導 入 株 を、 カ ナ マ イ シ ン 50
地 [ (NH 2 ) 2 C0
2 g 、 (NH 4 ) 2 S0 4
. 5 g 、 0 . 06%
(w/v)
/v)
b i o t i n s o lut
7 g 、 K H2 P0 4 0 5 g 、 K2 HP0 4
Fe 2 S0 4 . 7 H20 + 0 . 042%
i on
g/m L を 含 む A 液 体 培
1 m し 0 . 01%
(w/v)
(w/v)
0
1 m し 0 . 02%
MnS0 4 . 2 H20
t h i a m i n s o lut
casam i n o a c i d
5 g 、 MgS0 4 . 7 H2 0
i o n 2 m し yeast
7 g 、 g Lucose
0
(
e
4 0 g を 森 留 水 1L
x t ract
2 g 、 v i tam i n assay
に溶 解 ]
1 0 m Lの 入 っ た 試 験 管 に 一 白 金 耳 植 菌 し、 3 3 °C に て 16 時 間 、 好 気 的 に
振 盪 培 養 を行 った。
上 記 条 件 で 生 育 した チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 遺 伝 子 導 入 株 を 、 カ ナ
[01 62]
マ イ シ ン 50
g / m L を 含 有 した A 液 体 培 地 100m L に 植 菌 し、 3 3 °C に て 16 時 間 、 好
気 的 に 振 盪 培 養 を 行 っ た 。 コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム R は 、 A培 地 に
カ ナ マ イ シ ン を 添 加 しな い こ と 以 外 は 同 様 の 条 件 に て 培 養 した 。
こ の よ う に して 培 養 増 殖 さ れ た そ れ ぞ れ の 菌 体 を 、 遠 心 分 離
X g,
離
（1
（4
°C 、 8 , 000
10 分 ）に よ り 回 収 した 。 ガ ラ ス ビ ー ズ で 菌 体 細 胞 を 破 砕 した 後 、 遠 心 分
5 , 000
rpm,
2 0 m i n ) に よ っ て 得 た 細 胞 破 砕 上 清 を 粗 酵 素 液 と して 用 い 、
以 下 の 方 法 に よ り T p L活 性 を 測 定 した 。
50
M
リ ン酸 カ リ ウ ム バ ッ フ ァ 一 ， pH 8 . 0,
2. 5
M
L-Tyr,
0. 1
M
ピリ ド
キ サ 一 ル リ ン 酸 ， 20% グ リ セ 口 一 ル 、 粗 酵 素 液 を 混 合 し、 3 0 °C 、 3 0 分 間 反 応
を 行 っ た 。 反 応 停 止 は 0. 6N 塩 酸
（
終 濃 度 ） 添 加 に よ り行 っ た 。 こ れ を フ ィ ル
タ ー ろ 過 後 、 生 じた フ エ ノ ー ル は HPLC で 分 析 、 定 量 した
,
移 動 相 20% MeOH,
0 . 07
（Cosmos は C 1 8 ARII
過 塩 素 酸 ） 。 酵 素 反 応 に よ り 生 じた フ エ ノ ー ル と
、 酵 素 比 活 性 を 表 4 に 示 した 。
[01 63]
こ の 結 果 、 コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム で 発 現 さ せ た パ ン トエ ア ァ
グ ロ メ ラ ン ス 株 由 来 t p L遺 伝 子 、 シ 卜ロ バ ク タ 一
プ ラ ッ キ 一 株 由 来 t p L遺 伝 子
及 び デ ス ル フ ィ 卜バ ク テ リ ュ ー ム ハ フ 二 エ ン ス 株 由 来 t p L遺 伝 子 は 特 に 高 い
活 性 を 示 し、 ク ロ ロ フ レ ク サ ス 才 ウ ラ ン テ ィ ア カ ス 株 由 来 t p L遺 伝 子 、 ノ ス
ト ツ ク パ ン ク チ フ オ ル メ 株 由 来 t p L遺 伝 子 、 卜 レ ポ ネ マ デ ン テ ィ コ ラ 株 由 来
t p L遺 伝 子 に つ い て も 活 性 が 認 め ら れ た 。
[表4]
コ リネ バ ク テ リゥ ム グ ル タ ミカ ム の tpl
実施例 4
遺 伝 子 組 み 換 え株 の 活 性 測 定
コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶 グ ル タ ミ カ ム
フ エ ノー ル 生 産 遺 伝 子 導 入株
の フ エ ノ ー ル 牛 成 幸 ,験
フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 で あ る チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リァ 一 ゼ 酵 素 活 性 を有
す る 酵 素 を コ ー ドす る パ ン トエ ア ア グ ロ メ ラ ン ス の t p L遺 伝 子 、 DAHP シ ン テ
タ 一 ゼ を コ ー ドす る コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム の aroG 遺 伝 子 、 コ リス
ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ を コ 一 ドす る コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
ダ ル タ ミ カ ム の csm 遺 伝 子
の 効 果 を 調 べ る 為 に 、 コ リネ バ ク テ リ ウ 厶 グ ル タ ミ カ ム
R株 に 各 遺 伝 子 を
順 番 に 積 み 重 ね て 導 入 し、 フ エ ノ 一 ル の 生 産 比 較 を 行 っ た 。
実 施 例 2 で 構 築 した （
表 2 参 照 ） PHE3(t
P
L遺 伝 子 導 入 ) 、 PHE4
(tp L遺 伝 子 及
び aroG 遺 伝 子 導 入 ） 及 び PHE5 (tp L遺 伝 子 、 aroG 遺 伝 子 及 び csm 遺 伝 子 導 入 ）
株 を 、 PHE3 株 は カ ナ マ イ シ ン 5 0
ク ロラム フ エニ コ一ル 5
フ エニ コ一ル 5
(NH 4 ) 2 S0 4
)
Fe 2 S0 4 .
i on
濁]
g / m し PHE5 株 は カ ナ マ イ シ ン 5 0
g / mL及 び ゼ 才 シ ン 2 5
7 g 、 K H2 P0 4 0 . 5 g 、 K2 HP0 4
H20 + 0 . 042%
1 m し 0 . 01% (w/v)
a m i n assay
g / m し PHE4 株 は カ ナ マ イ シ ン 5 0
(w/v)
g / mし ク ロ ラ ム
g / mL を 含 む A 寒 天 培 地 [ (NH 2 ) 2 C0
0 . 5 g 、 MgS0 4 .
MnS0 4 . 2 H20
t h i a m i n s o lut
casam i n o a c i d
g / mL及 び
H2 0
7 g 、 g Lucose
0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v
1 m し 0 . 02% (w/v)
i o n 2 m し yeast
4 0 g、 寒 天
に 塗 布 し、 2 8 °C 、 2 0 時 間 暗 所 に 静 置 した 。
2g、
ext ract
b i o t i n s o Lut
2 g、 v i t
15 g を 森 留 水 1L に 懸
上 記 の プ レー 卜で 生 育 した コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム 単 一 遺 伝 子 導
[01 66]
入 株 を 、 各 抗 生 物 質 を 含 む A 液 体 培 地 [ (NH 2 ) 2C0
5 g 、 K2 HP0 4
(w/v)
)
0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H20
MnS0 4 . 2 H20
c id
7 g 、 g lucose
0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
1 m し 0 . 02% (w/v)
t h i a m i n s o lut i o n 2 m し yeast
2 g 、 (NH 4 ) 2S0 4
Fe 2 S0 4 . 7 H20 + 0 . 042%
b i o t i n s o lut i o n
ext ract
4 0 g を 蒸 留 水 1L に 溶 解 ]
7 g 、 K H2 P0 4 0 .
1 m し 0 . 01% (w/v
2 g 、 v i tam i n assay
casam i n o a
1 0 m Lの 入 っ た 試 験 管 に 一 白 金 耳
植 菌 し、 2 8 °C に て 15 時 間 、 好 気 的 に 振 盪 培 養 を 行 っ た 。
上 記 条 件 で 生 育 した フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 導 入 株 を 、 各 抗 生 物 質 を 含 む A 液
体 培 地 1 00m L に 植 菌 し、 3 3 °C に て 2 4 時 間 、 好 気 的 に 振 盪 培 養 を 行 っ た 。
フ エ ノ ー ル の 定 量 は 、 サ ン プ リ ン グ した 反 応 液 を 遠 心 分 離
（4
°C 、 15 , 000 X
g 、 10 分 ） し、 得 られ た 上 清 液 を 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー で 分 析 す る こ と に よ
り行 っ た 。
結 果 を 以 下 の 表 5 に 示 す 。 コ リネ パ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム
時 間後 に0. 1
mM の
、 24 時 間 後 に 0 . 4
PHE3 は 、 2 4
フ エ ノ ー ル を 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム
mM の
E5 は 、 2 4 時 間 後 に 0 . 9
PHE4 は
フ エ ノ ー ル を 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム
mM の
PH
フ エ ノ ー ル を 培 養 液 中 に 生 産 して い た 。 す な わ ち
、 t p L遺 伝 子 の 導 入 に よ り グ ル コ ー ス か ら フ エ ノ ー ル 生 成 を 可 能 と し、 aroG 遺
伝 子 及 び csm 遺 伝 子 の 導 入 に よ る 代 謝 改 変 に よ り、 フ エ ノ ー ル 生 成 量 の 増 大 を
達 成 した 。
[01 67]
[ 表 5]
フ エ ノー ル 生産遺伝 子導 入株 に お け る フ ヱ ノ一 ル 生成実験
* )
表 内の表 示 の略語 は以 下 の通 り
< 遺伝 子起源 略語>
PA ;
CG
[01 68]
パ ン トエ ア
；
ア グ ロメラ ン ス
コ リネ バ ク テ リ ウ 厶 グ ル タ ミ カ ム
実施例 5
R
フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 を 導 入 した 、 副 生 経 路 及 び フ エ ノ ー ル 分 解
遺伝 子破壊株 の フI
ノール 生成
験
実 施 例 2 に お い て 構 築 した フ エ ノ 一 ル 生 産 遺 伝 子 発 現 プ ラ ス ミ ドpCRB209-t
p L/PA 、 pCRB1 -aroG/CG
及 び pCRB1 5-csm/CG
を 導 入 した コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 グ
ル タ ミ カ 厶 染 色 体 遺 伝 子 マ 一 力 一 レ ス 破 壊 株 PHE6 ( ∆ pheA) 、 及 び PHE7 ( ∆ pheA
△ poxF) 株 を 、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
g / mし ク ロ ラ ム フ エ ニ コ 一 ル 5
ゼ 才 シ ン2 5
[ (NH 2 ) 2C0
、 K2 HP0 4
/v)
9 / mL含 む A 寒 天 培 地
0 . 5 g 、 MgS0 4 . 7 H20
MnS0 4 . 2 H20
0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
1 m し 0 . 02% (w/v)
i o n 2 m し yeast
h i a m i n s o lut
7 g 、 g lucose
4 0 g、 寒 天
2 g 、 (NH 4 ) 2S0 4
7 g 、 K H2 P0 4 0 . 5 g
Fe 2 S0 4 . 7 H20 + 0 . 042%
b i o t i n s o lut
ext ract
g / mL及 び
i on
1 m し 0 . 01% (w/v)
2 g 、 v i tam i n assay
15 g を 蒸 留 水 1L に 懸 濁 ]
(w
t
casam i n o a c i d
に 塗 布 し、 2 8 °C 、 2 0 時
間 暗 所 に 静 置 した （
表 6 )。
上 記 の プ レー 卜で 生 育 した フ エ ノ ー ル 生 産 遺 伝 子 導 入 株 を 、 カ ナ マ イ シ ン
[01 69]
50
g / mし ク ロ ラ ム フ エ ニ コ 一 ル 5
培 地 [ (NH 2 ) 2C0
2 g 、 (NH 4 ) 2S0 4
0 . 5 g 、 0 . 06% (w/v)
(w/v)
t
b i o t i n s o lut
ext ract
水 1L に 溶 解 ]
7 g 、 K H2 P0 4 0 5 g 、 K2HP0 4
Fe 2 S0 4 .
i on
g / mL及 び ゼ 才 シ ン 2 5
H20 + 0 . 042%
1 m し 0 . 01% (w/v)
2 g 、 v i tam i n assay
(w/v)
g / mL を 含 む A 液 体
0
H20
1 m し 0 . 02%
MnS0 4 . 2 H20
t h i a m i n s o lut
casam i n o a c i d
5 g 、 MgS0 4 .
i o n 2 m し yeas
7 g 、 g Lucose
40 g を森 留
1 0 m Lの 入 っ た 試 験 管 に 一 白 金 耳 植 菌 し、 3 3 °C に て 16 時 間 、 好 気
的 に振 盪 培 養 を行 った 。
上 記 条 件 で 生 育 した フ エ ノ 一 ル 生 産 遺 伝 子 導 入 株 を 、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
し ク ロラム フ エニ コ一ル 5
g / mL及 び ゼ 才 シ ン 2 5
g/ m
g / mL を 含 有 した A 液 体 培
地 100m L に 植 菌 し、 3 3 °C に て 2 4 時 間 、 好 気 的 に 振 盪 培 養 を 行 っ た 。
フ エ ノ ー ル の 定 量 は 、 サ ン プ リ ン グ した 反 応 液 を 遠 心 分 離
（4
°C 、 15 , 000Xg
、 10 分 ） し、 得 られ た 上 清 液 を 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー で 分 析 す る こ と に よ
り行 っ た 。
この 結 果 、 2 4 時 間 後 に、 コ リネ パ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム 野 生 株 を宿 主 と
[ 0 170]
した PHE5 は、 2 4 時 間 後 に 0 . 9
mM の
フ エ ノー ル を 生 成 した の に対 して 、 pheA 遺
伝 子 を破 壊 した コ リネ パ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム を宿 主 と した PHE6 は、 5 . 8
mM の
フ エ ノー ル を、 pheA 及 び poxF 遺 伝 子 を破 壊 した コ リネ バ クテ リゥ 厶 ダル
タ ミ カ ム を宿 主 と した PHE7 は、 6 . 9
mM の
フ エ ノー ル を 生 成 して い た 。
す な わ ち 、 フ エ 二 一 ル ァ ラ ニ ンへ の 副 生 経 路 を遮 断 した pheA 遺 伝 子 破 壊 、
及 び フ ェ ノー ル の 分 解 経 路 を遮 断 した poxF 遺 伝 子 破 壊 に よ る代 謝 工 学 的 改 変
に よ り、 順 次 フ ェ ノ一 ル 生 産 性 の 向 上 が 達 成 さ れ た 。
[ 0 17 1 ]
[ 表 6]
フ エノ一 ル
生産遺 伝 子 を導 入 した 、副 生経 路 及 び フ ェ ノ 一 ル 分解 遺伝 子破 壊
株のフ
* )
ノール 生 成実験
表 内 の表 示 の 略 語 は以 下 の通 り
< 遺伝 子起源 略語>
PA ；
CG
[ 0 172]
；
実施例 6
パ ン トエ ア
ア グ ロメ ラ ン ス
コ リネ バ クテ リウ 厶 グル タ ミ カ ム
コ リネ パ クテ リゥ 厶 グル タ ミ カ ム PHE7 を 用 い た 還 元 条 件 下 に お け
るフ エ ノー ル 生成
験
実 施 例 2 で 創 製 した コ リネ パ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム PHE7 フ エ ノー ル 生 成
株 を、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
5
g/m L
g/m
し ク ロラム フ エニ コ一ル 5
g/m L及 び ゼ 才 シ
ン2
を含 有 した A 寒 天 培 地 に塗 布 し、 2 8 °C 、 2 0 時 間 暗 所 に静 置 した 。
上 記 の プ レー 卜で 生 育 した コ リネ バ クテ リゥ 厶 ダル タ ミ カ ム PHE7 フ エ ノー
ル 生 成 株 を、 カ ナ マ イ シ ン 5 0
才 シ ン2 5
g/m L
g/m
し ク ロラム フ エニ コ一ル 5
g/m L及 び ゼ
を含 有 した A 液 体 培 地 1 0 m L の 入 った 試 験 管 に 一 白金 耳 植 菌 し
、 2 8 °C に て 15 時 間、 好 気 的 に振 盪 培 養 を行 った。
上 記 条 件 で 生 育 した コ リネパ クテ リゥ厶 ダル タ ミ カ ム PHE7 フ エ ノー ル 生 成
株 を、 カ ナ マ イ シ ン5 0
5
g/m L
g/m
し ク ロ ラ ム フ エニ コ一 ル 5
g/m L及 び ゼ 才 シ ン2
を含 有 した A 液 体 培 地 500m Lの 入 つた 容 量 2 L の 三 角 フ ラ ス コ に植 菌 し
、 2 8 °C に て 15 時 間、 好 気 的 に振 盪 培 養 を行 った。
[ 0 173]
この よ う に して 培 養 増 殖 され た そ れ ぞ れ の菌 体 は、 遠 心 分 離
g,
（4
15 分 ）に よ り菌 体 を 回収 した。 得 られ た菌 体 を、 終 濃 度 OD 610 =35 とな る よ
う に BT ( - 尿 素 ）液 体 培 地
〔0. 7 %
硫 酸 ア ンモ ニ ゥ厶、 0 . 05% リン酸 二 水 素 カ リ
ゥ厶、 0 . 05% リン酸 水 素 二 カ リウム、 0 . 05% 硫 酸 マ グ ネ シ ウム
0006%
°C 、 5 , 000
硫酸鉄
、 0 . 00002%
7 水 和 物 、 0 . 00042%
7水和物、 0.
硫 酸 マ ン ガ ン水 和 物 、 0 . 00002%
ビ才 チ ン
チ ア ミ ン塩 酸 塩 〕 に懸 濁 した。 この そ れ ぞ れ の菌 体 懸 濁 液 60m L を
容 量 100m L メデ ィ ウ厶瓶 に入 れ 、 還 元 条 件 下 （
酸 化 還 元 電 位 ；-450
mV)
、グ
ル コー ス を 8 % とな る よ う に添 加 し、 3 3 °C に保 つた 水 浴 中 で攪 拌 しな が ら反 応
させ た。 この 時 、 反 応 液 の p H が 7 . 0 を下 回 らな い よ う に 2 . 5 N の ア ンモ ニ ア水 を
用 い て p H コ ン トロー ラ 一 （エ イ プル 株 式 会 社 製 、 型 式 ：DT- 1023)
で コ ン ト口
— ル しな が ら反 応 した。
サ ン プ リン グ した 反 応 液 を遠 心 分 離
（4
°C 、 15 , 000 X g 、 10 分 ） し、 得 られ
た 上 清 液 を用 い て フ ェ ノ一 ル の 定 量 を行 った。
この結 果 、 コ リネパ クテ リゥ厶 ダル タ ミ カ ム PHE7 フ エ ノー ル 生 成 株 は、 還
元 条 件 下 に お け る反 応 に お い て、 好 気 培 養 と比 較 して 高 い 生 産 性 を示 し、 2 4
時 間後 に 1 1. 3
mM の
フ エ ノ一 ル を生 成 して い た。
産 業 上 の利 用 可 能 性
[ 0 174]
本 発 明 方 法 に よれ ば、 微 生 物 を用 い て 実 用 的 な効 率 で フ エ ノー ル を製 造 す
る こ とが で き る。
請 求 の範 囲
[ 請 求 項 1]
チ ロシ ン
フ エ ノー ル - リア 一 ゼ
（tyros i n e pheno L- Lyase)
活性 を
有 す る 酵 素 を コ 一 ドす る 遺 伝 子 が 、 宿 主 の コ リネ 型 細 菌 に 導 入 さ れ た
、 フ エ ノ ー ル 生 産 能 を有 す る形 質 転 換 体 。
[ 請 求項 2]
チ ロ シ ン フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝
子 が 、 ノ《ン 卜エ ア ア グ ロ メ ラ ン ス （Pantoea agg Lomerans)
由来 の遺
伝 子 、 シ 卜ロ バ ク タ 一 プ ラ ッ キ 一
由来 の遺
（C
i t robacter
braak
i i)
伝 子 、 デ ス リレフ ィ 卜バ ク テ リ ュ 一 厶 ハ フ 二 エ ン ス （Desu Lf i tobacter
iu
hafn i ense)
カス
(Ch Lorof
由 来 の 遺 伝 子 、 ク ロ ロ フ レクサ ス 才 ウ ラ ンテ ィ ア
Lexus
aurant
ク チ フ オ ル メ （Nostoc punct
デ ン テ ィ コ ラ (Treponema
i acus)
i forme)
dent
由来 の遺
子 、 ノ ス 卜ッ ク
ノ《ン
由 来 の 遺 伝 子 、 又 は 卜 レポ ネ マ
i c o La)
由来 の 遺 伝 子 で あ る請 求 項 1
に記 載 の形 質 転 換 体 。
[ 請 求項 3]
チ ロシ ン
フ エ ノ ー ル - リ ア 一 ゼ 活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝
子 が 下 記 の （a) 又 は （b) の DNA で あ る 請 求 項 1 に 記 載 の 形 質 転 換 体 。
(a)
配 列 番 号 3 6 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 配 列 番 号 3 9 の 塩 基 配 列 か ら
な る DNA 、 配 列 番 号 4 2 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 配 列 番 号 4 5 の 塩 基 配 列
か ら な る DNA 、 配 列 番 号 4 8 の 塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 又 は 配 列 番 号 5 1 の
塩 基 配 列 か ら な る DNA
(b)
(a) の 何 れ か の 塩 基 配 列 と相 補 的 な 塩 基 配 列 か ら な る DNA と ス 卜
リ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 で ハ イ プ リ ダ イ ズ し、 か つ チ ロ シ ン フ エ ノ 一 ル リ ァ 一 ゼ 活 性 を 有 す る ポ リべ プ チ ドを コ 一 ドす る DNA
[ 請 求項4]
宿 主 の コ リネ 型 細 菌 が 、 そ の 染 色 体 上 に 存 在 す る 下 記 （c) 及 び / 又
は （d) の 遺 伝 子 が 破 壊 さ れ 、 又 は 欠 損 した も の で あ る 、 請 求 項 1 ~ 3
の何 れ か に記 載 の形 質 転 換 体 。
(c)
プ レ フ ェ ン酸 デ ヒ ドラ タ 一 ゼ (prephenate
dehydratase)
活性 を
有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
(d)
フ エ ノ 一 リレ2 - モ ノ 才 キ シ ケ ナ 一 セ
(pheno
L 2-monooxyqenase)
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
宿 主 の コ リネ 型 細 菌 の 以 下 の （e) 及 び / 又 は （f) の 代 謝 遺 伝 子 が 、 宿
主 で 高 発 現 して い る 請 求 項 1 ~ 4 の 何 れ か に 記 載 の 形 質 転 換 体 。
(e)
DAHP シ ン テ タ 一 セ
(3-deoxy-D-arab
hate
(DAHP)
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
(f)
コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ （chor i smate
synthase)
を コ 一 ドす る 追
仏
i no-heptu
mutase)
Losonate
7-phosp
活 性 を有 す る酵 素
子
宿 主 の コ リネ 型 細 菌 が コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム で あ る 請
求 項 1 ~ 5 の何 れ か に記 載 の形 質 転 換 体 。
宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム が 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
グ ル ミ カ ム R (FERM
P — 18976)
、 ATCC 13032,
又 は ATCC1 3869 で あ る
請 求 項 6 に記 載 の形 質 転 換 体 。
宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム が 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
グ ル ミ カ ム R (FERM
P _ 18976)
、 ATCC1 3032 、 又 は ATCC1 3869 の 染 色
体 上 に 存 在 す る 下 記 （c) 及 び / 又 は （d) の 遺 伝 子 が 破 壊 さ れ 、 又 は 欠 損
した も の で あ る 、 請 求 項 6 に 記 載 の 形 質 転 換 体 。
プ レ フ ェ ン酸 デ ヒ ドラ タ 一 ゼ (prephenate
(c)
dehydratase)
活性 を
有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
(d)
フ エ ノ 一 リレ2 - モ ノ 才 キ シ ケ ナ 一 セ
(pheno
L 2-monooxygenase)
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
宿 主 の コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶 ダ ル タ ミ カ ム が 、 コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
グ ル ミ カ ム R (FERM
P _ 18976)
、 ATCC1 3032 、 又 は ATCC 13869 に お い
て 、 以 下 の お ）及 び / 又 は （f) の 代 謝 遺 伝 子 が 高 発 現 して い る も の で あ
る、 請 求 項 6 又 は 8 に記 載 の 形 質 転 換 体 。
(e)
DAHP シ ン テ タ 一 セ
(3-deoxy-D-arab
hate
(DAHP)
活 性 を 有 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
(f)
コ リス ミ ン酸 厶 タ 一 ゼ （chor i smate
synthase)
を コ 一 ドす る 追
仏
子
i no-heptu
mutase)
Losonate
7-phosp
活 性 を有 す る酵 素
[ 請 求 項 10 ]
コ リネ バ ク テ リ ゥ 厶
6)
[ 請 求 項 1 1]
ダ ル タ ミ カ ム PHE7
( 受 託 番 号 ：NITE
BP -97
形 質転換 体。
請 求項 1 ~
1 0 の何 れ か に記 載 の形 質 転 換 体 を、 還 元 条 件 下 、 糖 類
を 含 有 す る 反 応 液 中 で 反 応 さ せ る 工 程 と、 反 応 液 中 の フ エ ノ ー ル を 回
収 す る工 程 とを含 む フ ェ ノ一ル の製 造 方 法 。
[ 請 求 項 12 ]
反 応 工 程 に お い て 、 形 質 転 換 体 が 実 質 的 に 増 殖 しな い 請 求 項 1 1 記
載 の フ ヱ ノール の製 造 方 法 。
[ 請 求 項 13 ]
還 元 条 件 下 の 反 応 液 の 酸 化 還 元 電 位 が — 2 0 0 〜 ― 5 0 0 ミ リボ ル
卜で あ る 請 求 項 1 1 又 は 1 2 に 記 載 の フ ヱ ノ ー ル の 製 造 方 法 。
[ 請 求 項 14]
糖 類 が グ ル コ ー ス 、 フ ル ク 卜一 ス 、 マ ン ノ ー ス 、 キ シ ロ ー ス 、 ァ ラ
ピ ノ 一 ス 、 ガ ラ ク 卜一 ス 、 ス ク ロ ー ス 、 マ ル ト一 ス 、 ラ ク 卜一 ス 、 セ
口 ビ 才 一 ス 、 ト レハ ロ ー ス 、 及 び マ ン ニ トー ル か ら な る 群 よ り 選 ば れ
る もの で あ る請 求項 1 1 ~
法。
1 3 の何 れ か に記 載 の フ エ ノール の製 造 方
Y
X
------
INTERNATIONAL
A.
CLASSIFICATION
C 1 2N1 5/09
SEARCH
OF SUBJECT MATTER
(2
6
1 ) i ,
C 1 2N1 /21
According to International Patent Classification
B.
International application No.
REPORT
(2 0 0 6 . 0 1 )
01)
(IPC) or t o both national classification and IPC
FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification
C 1 2N1 5 / 0 9 , C 1 2N1 / 2 1 , C 1 2 P 7 / 2 2
Documentation
searched other than minimum documentation t o the extent that such documents are included in the fields searched
Electronic data base consulted during the international
search (name of data base and, where practicable, search terms used)
CA/ B I 〇S I S /MEDLINE
/WPI DS ( S T N ) ,
JST Plus ( JDreaml
l )
C.
DOCUMENTS
CONSIDERED
Category*
GenBank/
T O B E RELEVANT
J P
3- 2 4 04 92
Ltd
. ) ,
A
(Mit
Octobe
r
1991
J P
63 - 2 22 682
A
16
Septembe
1988
r
a m i l y ： none
(A
Pet
Hiaeaki
Kenkyu
,
no . 6,
page
inomoto
" S e kai
May
s
49
2010
t o
no
s u 〃,
Kaihat
01
f inery
Do k o
i ndus
(0 1 . 05 . 2 0 10 ) ,
vol
document which may throw doubts on priority claim(s) or which i s
cited t o establish the publication
date of another citation or other
special reason (as specified)
document referring t o an oral disclosure, use, exhibnion
2 , 3 , 6, 7
,4 , 5 , 8- 14
.57,
"
later document published after the international filing date or priority
date and not in conflict with the application but cited to understand
the principle or theory underlying tiie invention
"X"
document of particular relevance; the claimed invention cannot b e
considered novel or cannot b e considered t o involve an inventive
step when the document i s taken alone
"Y"
document of particular relevance; the claimed invention cannot b e
considered t o involve an inventive step when the document i s
combined with one or more other such documents, such combination
being obvious to a person skilled i n the art
"&"
document member of the same patent family
or other means
filing date but later than
search
(2 6 . 0 9 . 1 1 )
Date of mailing of the international search report
0 4 Octobe
r , 2011
(0 . 10 . 11 )
Authorized
officer
Telephone No.
(second sheet) (July 2009)
t o
trial
See patent family annex.
of Box C .
or patent but published on or after the international
Name and mailing address of the ISA/
Japane
s e Patent
Of f i c e
2 , 3 , 6, 7
54
earlier application
filing date
Date of the actual completion of the international
I nc . )
, 4 , 5 , 8- 14
cal
"E
t o the international
s
Chemi
document defining the general state of the art which i s not considered
to b e of particular relevance
Facsimile No.
Form PCT/ISA/210
2 , 3 , 6, 7
B i ore
Special categories of cited documents:
2011
I nc . ) ,
(Mi t sui
Chemi cal
(3 0 . 1 1 . 2 0 0 6 ) ,
*
r ,
1, 6
4 , 5 , 8- 14
Co . ,
"A
Septembe
Co .
(16 . 0 9 . 1 988 ) ,
Further documents are listed in the continuation
2 6
cal
4 , 5 , 8- 14
YUKAWA,
no
e conomy
"P"
r o chemi
)
J P 2 0 0 6- 3 2 023 8 A
3 0 November
2006
( a mi l y ： none )
RI TE
shi
(25 . 1 0 . 1 991 ) ,
)
(
subi
Relevant t o claim No.
2 , 3 , 7
a m i l y ： none
(
"O"
E B L / DDB J / Gene Seq,
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
25
L
symbols)
INTERNATIONAL
C (Continuation).
Category*
SEARCH REPORT
International application No.
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
A
WIERCKX
J e t a l . , Engi nee r i n g o f s o lventtol erant
Ps eudomona s putida
S1 2 f o r
bioproducti
o n o f phenol
from gluco s e , Appl .
Envi ron . Mi crobio l . , 2 0 05 , Vol . 7 1 , No . 12 ,
p p . 82 2 1 - 8 2 2 7
1- 14
A
WIERCKX
J et a l . ,
r a n s crip tome analys i s o f a
pheno l -producing
Ps eudomonas
put ida S1 2
con s t ruct ： geneti c and phys o l o g cal bas i s for
improved
producti
o n , J . Bacterio
l . , 2008 ,
Vol . 1 90 , No . 8 , p p . 2 82 2 - 2 83 0
1- 14
A
SAKAI S e t a l . , E ffect
o f l i gnocel lulo s e derived
i nhibitor
s o n growth
o f and ethano l
product
ion b y growth- arre s ted Co rynebacterium
glutami
cum R, Appl . Envi ron . Mi crobi o l . , 2 0 0 7 ,
Vol . 7 3 , No . 7 , p p . 2 3 4 9- 2 3 5 3
1- 14
A
J P 2 0 0 6- 2 62 82 4 A ( Sumi tomo Bakel i t e Co . ,
Ltd . ) ,
0 5 Octobe r 2 0 0 6 ( 05 . 1 0 . 2 0 0 6 ) ,
( ami l y ： none )
1- 14
A
LUTKE -EVERS LOH T e t a l . , Per spective
s of
biote chno logi cal production
o f L-tyro
s ine and
i t s appl
cati o n s , Appl . Mi crobio l . Biote chno l . ,
2 0 0 7 , Vol . 7 7 , No . , p p . 75 1 - 7 62
1- 14
A
L I PP e t a l . , Genet i c and b i ochemi cal
i dent
f cat o n o f the chori smate mutas e from
Corynebacte
rium glutami
cum , Mi crobio logy , 2 0 0 9 ,
Vol . 1 5 5 , Pt . 1 0 , p p . 3 3 82 - 3 3 91
1- 14
A
HSU SK e t
a l . , Mutati onal
anal y s i s o f feedback
i nhibit
ion and catalyti
c s ite s o f prephenate
dehydrata
s e from Co rynebacte
rium glutami
cum,
Arch . Mi crobi o l . , 2 0 0 4 , Vo l . 1 8 1 , No . 3 , p p . 2 3 72 44
1- 14
A
a s ayuki
INUI e t a l . , " A RI TE p e rspe c t ive o n
global
b i ore f inery
R & D trends
" , Ce l lul o s e
Commun . , 2 0 0 9 , v o l . 1 6 , n o . 4 , page s 1 5 1 t o 1 6
1- 14
A
J P 9- 2 7 9 A (Nippon
Sho kubai
Co . , Ltd . ) ,
0 7 January
1 9 97 ( 0 7 . 0 1 . 1 9 9 7 ) ,
( ami l y ： none )
1- 14
Hideaki
YUKAWA, "Bi ore f n e r y ： Wo r l d Trends
and RI TE ' S R & D〃, Chemi cal Engi neering
o f Japan ,
2 0 1 1 . 0 1 , v o l . 75 , n o . 1 , page s 2 3 t o 2 5
1- 14
P, A
Form PCT/ISA/2 10 (continuation of second sheet) (July 2009)
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
P C T
J P 2 0 1 1 /
0 7 0 3 2 5
A
Y
発 明 の属 す る分 野 の分 類 （
国 際特 許 分 類 （I
Int .C l .
C12N15/09
(2006.
01) i ,
C12N1/21
P C )
(2006.
01) i
)
，C12P7/22
(2006.
01)
調 査 を行 っ た分 野
B .
調 査 を行 っ た最 小 限資 料 （
国 際特 許 分 類 （I
Int .C l .
C12N15/09,
C12N1/21,
P C )
)
C12P7/22
最 小 限資 料 以 外 の資 料 で調 査 を行 った分 野 に含 まれ る もの
国 際調 査 で使 用 した電 子 デ
CA/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS
C .
-ス
(STN)
（
デぃ
-ス の 名 称 、調 査 に使 用 した用 語 )
，GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq,
JSTPlus
(JDreaml
l )
関連 す る と認 め られ る文 献
引用 文 献 の
カ テ ゴ リー *
引用 文 献 名
関連 す る
請 求項 の 番 号
及 び 一 部 の箇 所 が 関連 す る とき は、 そ の 関連 す る箇 所 の表 示
1, 6
JP 3-240492
A (三 菱 油 化 株 式 会 社 ） 1991· 10. 25 ， （
フ ァ ミ リ一 な し)
2 ，3 ，7
4 ，5 ，8—14
1
A (味 の 素 株 式 会 社 ） 1988. 09. 16,
JP 63-222682
2 ，3 , 6 ，7
( フ ア ミ リー な し)
4 ，5 ，8—14
c 欄 の続 き に も 文 献 が列 挙 され て い るc
*
パ テ ン ト フ ァ ミ リー に 関す る別 紙 を参 照。
引用 文 献
ΓΑ 」特 に 関連 の あ る文 献 で は な く、一 般 的技術 水 準 を示 す
もの
ΓΕ 」国 際 出願 日前 の 出願 ま た は特 許 で あ るが 、国 際 出願 日
以後 に公 表 され た も の
「L 」優 先 権 主 張 に疑 義 を提 起 す る文 献 又 は他 の文 献 の発 行
日若 し くは他 の 特 別 な理 由 を確 立 す る た め に 引用 す
る文 献 （
理 由 を付 す ）
Γθ 」 口頭 に よ る開示 、使 用 、展 示 等 に言 及 す る文 献
ΓΡ 」国 際 出願 日前 で 、かつ 優 先 権 の 主 張 の基礎 とな る出願
2 6 .
0 9 .
l
S A
特 に 関連 の あ る文 献 で あ って 、 当該 文 献 の み で発 明
の新 規 性 又 は進 歩 性 が ない と考 え られ る もの
「Y 」特 に 関連 の あ る文 献 で あ って 、 当該 文 献 と他 の 1 以
上 の文 献 との 、 当業 者 に とって 自明 で あ る組 合 せ に
よって進 歩 性 が ない と考 え
Γ& 」 同一 パ テ ン トフ ア ミ リー 文 献
2 0
国 際調 査機 関 の名 称 及 び あ て先
日本 国特 許 庁 （I S A
J Ρ )
郵便番 号 1 0 0 — 8 9 1 5
東 京 都 千 代 田区霞 が 関三 丁 目 4 番
P C T
x
国 際調 査 報 告 の発 送 日
国 際調 査 を完 了 した 日
様式
の 日の後 に公 表 され た文 献
Γτ 」 国 際 出願 日又 は優 先 日後 に公 表 され た文 献 で あ って
出願 と矛 盾 す る もの で は な く、発 明 の原 理 又 は理 論
の理解 の た め に 引用 す る もの
2 1 0
(第
2
0 4 .
0 .
4 N
特許 庁審 査 官 （
権 限 の あ る職 員 ）
西村
3
号
ペ ー ジ） （2
年
7
月）
3 4 3 5
亜希 子
0 3 0 0 9
2 0
3 5 8 1 -
1 1 0
内線
3 4 8 8
国 際 出願 番 号
国 際調 査報 告
c
(続 き） .
P 2 0
P C
関連す る と認 め られ る文 献
引用文 献 の
カテ ゴ リ一 水
引用 文献名
関連す る
請 求項 の番 号
及 び一 部 の箇 所 が 関連 す る ときは、そ の 関連 す る箇所 の表示
A ( 三 井 化 学 株 式 会 社 ） 2006. 11. 30,
Y
J P 2006-320238
A
(フ ア ミ
Y
A
湯 川 英 明 ， 世 界 の バ イ オ リフ ァイ ナ リー 動 向 と RITE の研 究 開発 ， 化
学 経 済 ， 2010. 05. 0 1， Vol. 57 ， No. 6 ， pp. 49-54
A
WIERCKX NJ et al. ， Engineering
Environ.
1，4 ，5 ，8-14
bioproduction
Microbiol.
o f solvent-tolerant
o f phenol
， 2005 ， Vol. 7 1，
WIERCKX NJ et al. ， Transcriptome
Pseudomonas
basis
2 ，3 ，6 ，7
リー な し ）
put i a S12 for
A
0 7 0 3 2 5
for
production,
glucose,
1，4 ，5 ，8-14
1-14
Appl.
o . 12 ， pp. 8221—8227
analysis
put i a S12 construct
improved
from
Pseudomonas
2 ，3 ，6 ，7
o f a phenol-producing
： genetic
1-14
and physiological
J . Bacteriol.
008 , Vol. 190 ，
，
No. 8 ， pp. 2822-2830
A
SAKAI S et al. ， Effect
o f lignocellulose-derived
growth
production
o f and ethanol
Corynebacterium
glutamicum
innibitors
on
1-14
b y growth-arrested
R, Appl.
Environ.
Microbiol.
， 00 7,
Vol. 73 ， No. 7 ， pp. 2349-2353
A
J P 2006-262824
(フ ア ミ
A
A
LUTKE-EVERSLOH T et al. ， Perspectives
o f L-tyrosine
Biotechnol.
， 2007 ， Vol. 77 ， No. 4 ， pp. 751—762
L I PP et al. ， Genetic
mutase
様式 P C T
from
Appl.
logical
Microbiol.
identification
Corynebacterium
1-14
o f the
al. ， Mutational
catalytic
sites
glutamicum,
analysis
o f prephenate
Arch.
Microbiol.
o f feedback
dehydratase
， 2004 ， Vol.
inhibition
and
I SA
Coraraun. ,
181 ， No. 3 ， pp. 237-244
1-14
2009 ， Vol. 16, No. 4 , pp. 151- 156
A (株 式 会 社 日本 触 媒 ） 1997· 01. 0 7 ， （
フ ァ ミ リー な し）
2 1 0
1-14
from Corynebacterium
乾 将 行 ほ か ， バ イ オ リフ ァイ ナ リー を取 り巻 く世 界 の現 状 と RITE の
J P 9-279
1-14
2009 ， Vol. 155 ， Pt. 10 ， pp. 3382—3391
研 究 開発 ， Cellulose
A
applications,
and biochemical
HSU SK et
glutamicum,
and its
o f biotechno
production
Microbiology,
A
1-14
リー な し ）
chorismate
A
A (住 友 べ 一 ク ライ ト株 式 会 社 ） 2006. 10. 05,
(第 2 ペ ー ジの続 き） （2 0 0 9 年 7 月）
1-14
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
C
(続 き ） .
P C
P 2 0
関 連 す る と認 め ら れ る 文 献
引用文 献 の
関連す る
カ テ ゴ リー *
P, A
引用 文 献 名
及 び 一 部 の 箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の 表 示
湯 川 英 明 ， バ イ オ リ フ ァ イ ナ リ ー ：世 界 の 動 向 と RITE の 研 究 開 発 ，
化 学 工 学 ， 2011. 0 1 ， Vol.
様式 P C T
0 7 0 3 2 5
I S A
2 1 0
75,
(第 2 ペ ー ジ の 続 き ）
No. 1,
pp. 23-25
（2 0 0 9 年 7 月 ）
請 求項 の番 号
1—14