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ウェスタントランスファー法（ウェスタンブロット法）
ウェスタンブロット法としても知られているウェスタント
グリシン　7.2g（最終濃度 96mM）
ランスファー法は、細胞溶解液や血清など複雑なタンパク
メタノール　200mL（最終液量 20%）
質混合物中の特定のタンパク質の有無を確認するための
diH2O　最終液量 1.0L に添加
迅速免疫ブロット法です。この手法は、タンパク質の混合
•抗原特異的結合抗体（一次抗体）
物を別個のタンパク質バンドに分離する SDS-PAGE 法の
•二次抗体（アルカリホスファターゼ標識ロバ抗プローブ
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抗体種）
効率の良さと特定のタンパク質抗原と特異的に相互作用
する免疫化学試薬の機能の両方が活かされています。
ウェスタントランスファー法プロトコル（例：タンパク質
「X」の検出を目的としたもの）には通常、次のステップ
が含まれています。（1）分析対象溶液中のタンパク質を
• 市販のアルカリホスファターゼ標識基質キット
トランスファーのプロトコル
1.4 ～ 20% トリス - グリシンポリアクリルアミドゲル上に
タンパク質試料をロードし、望ましい分離能に達する
SDS-PAGE 法で別個のバンドに分離し、
（2）大きさ別
まで繰り返します（あらかじめ染色した分子量マーカー
に分離されたタンパク質をポリアクリルアミドゲルからニト
ロセルロース膜
（または別の適切なマトリックス）
へ転写し、
（3）タンパク質バンドが転写された膜を（a）非特異的
なタンパク質結合を抑制するための適切なブロッキング
試薬、
（b）結合できなかったブロッキング試薬を洗い流
すための洗浄液、（c）タンパク質「X」と特定の免疫複
合体を形成するプローブ抗体、（d）結合できなかった抗
を用いて電気泳動を行うことができます）。
2.次の記載に従って図 III-2 のようにウェスタントランス
ファーカセットを組み立てます。
a.ウェスタントランスファーバッファーをあらかじめ充
填したトレイ上にトランスファーカセット陰極板を浸
します。
（次頁に続く）
体を除去するための洗浄液、（e）抗タンパク質「X」抗
体の Fc 領域と特異的に結合する酵素標識抗体、（f）結
合できなかった酵素標識抗体を除去するための洗浄液、
そして最後に、
（g）酵素が存在する場合に免疫複合体の
図 III-1 ウェスタントランスファー法.
プロトコルの概略図
タンパク質「X」
のバンド
部位に沈殿する不溶性の発色産物を産生する基質溶液を
ゲル
連続的にインキュベートし、タンパク質「X」のバンドを
可視化します（図 III-1）。
典型的なウェスタントランスファー法
および構築プロトコル
必要な材料
•SDS-PAGE 装置および付属品
•ウェスタントランスファーカセットおよび付属品
•ウェスタントランスファーバッファーにあらかじめ 5 分間
浸漬したゲルと同じくらいの大きさのニトロセルロース膜
（注：膜を取り扱う際には、外来タンパク質による汚染
を回避するために手袋と清浄なピンセットを使用します）
。
ウェスタン
トランスファー
陰性
-
陽性
+
電流
ゲル
ニトロセルロース膜
ニトロセルロース膜
ブロッキング剤
抗タンパク質
「X」抗体
洗浄
抗タンパク質
「X」抗体
酵素標識抗体
洗浄
酵素標識抗体
洗浄
•ウェスタントランスファーバッファー（TOWBIN の半量）
トリス塩基　1.45g（最終濃度 12mM）
170
発色基質
Te l : + 1 ( 6 0 9 ) 4 9 7 - 0 2 5 3 • F a x : + 1 ( 6 0 9 ) 4 9 7 - 0 3 2 1 • E m a i l : j a p a n @ p e p r o t e c h . c o m
ブロッキング剤を添加した
ニトロセルロース膜