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METHODEN
3.3.2 Proteinaufreinigung
3.3.2.1 Fällung mit Trichloressigsäure
Die jeweilige Proteinlösung wurde mit Trichloressigsäure (Endkonzentration 10 % (w/v))
versetzt und über Nacht bei 4 °C stehen gelassen. Durch Zentrifugation (15 min,
18000 x g, 4 °C) wurden die ausgefallenen Proteine sedimentiert, dreimal mit 100 %igem
EtOH gewaschen und danach luftgetrocknet. Das getrocknete Pellet wurde anschließend
in geeignetem Volumen TE-Puffer aufgenommen und mit Proteaseinhibitor (Roche)
versetzt.
3.3.2.2 Nickel-Affinitätschromatographie mit Protino Ni-TED 2000-Säule
Die Aufreinigung His-getaggter Proteine erfolgte nach dem Prinzip der Nickel-Affinitätschromatographie. Hierbei dienen matrixgebundene Nickel (Ni2+)-Ionen als immobilisierte
Liganden, die spezifisch basische Gruppen von Proteinen – in diesem Fall terminale polyHistidin-Reste – reversibel binden. Diese Interaktion mit dem Liganden wird genutzt, um
His-getaggte Proteine selektiv aus einer komplexen Proteinlösung herauszuadsorbieren.
Durch kompetitive Verdrängung mit Imidazol kann das His-getaggte Protein anschließend
wieder aus der Bindung gelöst und eluiert werden.
Für die Aufreinigung wurde das Protino Ni-TED 2000 Packed Columns-Kit (MachereyNagel, siehe 2.9) verwendet. Die Proteinlösung wurde auf eine mit 1x LEW-Puffer
äquilibrierte Protino Ni-TED 2000-Fertigsäule gegeben. Der Durchfluß beruht hierbei auf
der Gravitationskraft. Nach dem Waschen mit 8 ml 1x LEW-Puffer wurden die Hisgetaggten Proteine mit 9 ml 1x EB-Puffer von der Säule eluiert.
Puffer aus dem Protino Ni-TED 2000 Packed Columns-Kit:
1x LEW-Puffer (pH 8,0):
NaH2PO4
NaCl
50 mM
300 mM
1x EB-Puffer (pH 8,0):
NaH2PO4
NaCl
Imidazol
50 mM
300 mM
250 mM
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