Download 1,4 MB - Infoteca-e

Curso: Técnicas de Biologia Molecular aplicadas à produção animal
21
7. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Gisele Batista Veneroni
Luciana Correia de Almeida Regitano
As enzimas de restrição, também chamadas de endonucleases de restrição,
reconhecem uma seqüência específica de bases em uma molécula de DNA e clivam
a molécula naquela seqüência ou próximo dela. A seqüência de reconhecimento é
chamada de sítio de restrição. Diferentes enzimas de restrição reconhecem e clivam
diferentes sítios de restrição.
Elas são indispensáveis na análise da estrutura dos cromossomos, no
isolamento de genes, na criação de moléculas novas de DNA que podem ser
clonadas e em técnicas como polimorfismo de comprimento de fragmentos de
restrição (RFLP). Uma característica marcante de muitos desses sítios de clivagem é
que eles possuem dupla simetria rotacional, isto é, a seqüência de reconhecimento é
palindrômica e os sítios de clivagem são simetricamente posicionados.
7.1. Digestão do DNA – Região promotora do gene liberador de corticotrofina
1. Preparar o MIX de digestão
MIX de digestão
Água Milli Q
MIX 1X
0,87 μL
MIX X
——— μL
BUFFER 10X
1,0 μL
——— μL
HhaI (10 U/μl)
TOTAL
0,13 μL
——— μL
2 μL
——— μL
Concentração final do MIX: 1.3 unidade da
endonuclease de restrição HhaI, Buffer 1X [Tris-acetato
33 mM (pH 7.9), acetato de magnésio 10 mM, acetato de
potássio 66mM e 0,1 mg/ml de BSA]
2. Distribuir 2,0 μL do MIX de digestão + 8 μL do DNA amplificado (produto de
PCR da amplificação da região promotora do gene liberador de corticotrofina),
em uma placa de PCR ou em microtubos de 0,2 mL, sempre sobre o gelinho
3. Incubar essa reação de digestão a 37°C por 3 horas (depende do fabricante
da enzima HhaI) em aparelho Thermomixer 5436 (Eppendorf)