Download WO 2013/111897 A 1

〇
V
A
(12) 特 許 協 力 条 約 に 基 づ い て 公 開 され た 国 際 出 願
c
c
(10) 国 際 公 開 番 号
(43) 国 際 公 開 曰
2013 年 8 月 1 日 （01.08.2013)
(51)
W 画P O
〒 5650871 大 阪 府 吹 田 巿 山 田 丘 1 番 1 号
国立
大 学 法 人 大 阪 大 学 内 Osaka (JP). 森
正 樹 (MORI,
〒 5650871 大 阪 府 吹 田 巿 山 田 丘 1 番 1 号
Masaki);
国立大学法 人大
大 学 内 O sa a (JP). 石 井
秀始
〒 5650871 大 阪 府 吹 田 巿 山 田 丘 1
(ISHII,
Hideshi);
番 1 号
国 立 大 学 法 人 大 阪 大 学 内 Osaka (JP).
国際特 許分 類 ：
A61K
45/00
(2006.01)
A61K
31/7088
A61K
31/711
A61K
48/00
A61P
35/00
C12N
15/113
C12Q
1/68
G01N
33/15
(2006.01)
(2006.01)
G01N
33/50
(2006.01)
(2006.01)
G01N
33/574
(2006.01)
(2006.01)
(2010.01)
(2006.01)
(2006.01)
(21)
国際 出願 番 号 ：
(22)
国 際 出願 日：
(25)
国際 出願 の 言 語 ：
日本 語
(26)
国際公 開の言語 ：
日本 語
(30)
優 先権 丁一 タ：
特 願 2012-015982
(71)
PCT/JP2013/05
2013
年
i
月
28
W O 2013/111897 A 1
PCT
1733
(74)
代 理 人 ：庄 司
隆，外 （
〒
SHOJI,
Takashi
et al.);
532001 1 大 阪 府 大 阪 市 淀 川 区 西 中 島 五 丁 目 6 番
御 幸 ビル 3 0 7 号 Osaka (JP).
1 3 号
(81)
指定国 （
表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 国 内 保
護 が 可 肯 ) : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA,
日 （28.01 .2013)
BB,
2012
年
1
月
27
曰 （27.01 .2012)
BG,
JP
FI, GB,
出 願 人 ：国 立 大 学 法 人 大 阪 大 学 (OSAKA
UNIVER
〒 5650871 大 阪 府 吹 田 巿 山 田 丘
番
SITY)
[JP/JP];
1 号 Osaka (JP).
BN,
LS, LT,
MY,
GE,
発 明 者 ：石 井
優 (ISHII,
〒 5650871 大 阪
Masaru);
府 吹 田巿 山 田丘 1 番 1 号
国立大学法 人大 阪大
学 内 Osaka JP ) . 賀 川
義 規 (KAGAWA,
Yoshinori);
PT,
SM,
GT,
KN,
MA,
KP,
MD,
NG,
BY,
DM,
GM,
KM,
LY,
NA,
BW,
DK,
GH,
KG,
LU,
MZ,
BR,
CZ, DE,
GD,
IS, JP, KE,
PL,
(72)
BH,
CO, CR, CU,
NI,
ME,
RO,
RS, RU,
ST, SV,
SY,
TH,
TJ, TM,
VN,
ZA,
ZM,
VC,
HN,
RW,
HR,
HU,
LA,
MK,
OM,
TR,
CL,
ID,
CN,
IL,
LC,
MN,
PA,
SC, SD,
TN,
CH,
EC, EE, EG, ES,
KZ,
MG,
NZ,
CA,
DZ,
KR,
NO,
QA,
US, UZ,
BZ,
DO,
IN,
LK,
LR,
MW,
PE,
MX,
PG,
PH,
SE, SG, SK,
TT,
TZ,
UA,
SL,
UG,
ZW.
[続 葉 有 ]
(54)
Title:
NOVEL
ANTITUMOR
AGENT
AND
METHOD
(54)
発 明 の 名 称 ：新 規 抗 腫 瘍 剤 及 び そ の ス ク リ
(57)
FOR
The present
mechanism.
substance
capable
The Rho
o f the
B y targeting
controlled.
present
cc
タ、
-
ゆ
l
acid
i s capable
mechanism.
i n that a substance
i s selected
ability
the invasion
cycle,
and/or
and/or
an RhoGAP-encoding
method
i s preferred
the invasion
for
screening
o f inhibiting
the cell
method
and/or
a novel
metastasis
role
in
b y cancer
o f cancer
cells
cycle-dependent
antitumor
a
protein
ability
can b e
RhoGAP,
an oligonucleotide
containing
stability
selecting
a cell cycle-dependent
activating
an important
gene,
a novel
ingredient,
plays
o f the high
for
with
invasive
A n oligonucleotide
because
a screening
GTPase
metastasis
against
etc. can b e cited.
provides
capable
o n the cell
agent
a s the active
Rho
o f inhibiting
o f suppressing
This
cycle-dependent
depends
antitumor
comprises,
capable
a s BNA
also
a novel
agent
o f metastatic
the RhoGAP,
such
invention
novel
a synthet
thereoi.
an antitumor
o f cancer
agent
Rho
cells
e
agent
by a
i s characterized
GTPase
activating
thereby.
要 約 ：本 発 明 は 、 新 規 メ カ ニ ズ ム に よ リ作 用 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 を
提 供 す る 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 （R o GT：RhoGAP ) を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効 成 分 と して 含
Pase activating
protein
有 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 に よ る 。 RhoGAP は 細 胞 周 期 依 存 性 で あ リ、 が ん
細 胞 が 浸 潤 能 及 び/" 又 は 転 移 能 を 獲 得 す る 過 程 で 重 要 な 役 割 を 果 た
す 。 RhoGAP を 標 的 と す る こ と で 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び/" 又 は 転 移 を
制 御 し う る 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 が 、 RhoGAP
を コ ー ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド又 は
RNA 干 渉 を 誘 導 す る オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドな ど が 挙 げ られ る 。 オ リ ゴ ヌ
ク レオ チ ドに は 、 BNA な ど の 人 工 核 酸 を 含 む も の が 安 定 性 に 優 れ て お
リ、 好 ま しい 。 本 発 明 は 、 さ ら に は 、 新 規 メ カ ニ ズ ム に よ る 、 が ん 細
胞 の 浸 潤 及 び/" 又 は 転 移 を 抑 制 し う る 抗 腫 瘍 剤 を 選 別 す る ス ク リ
ン グ 方 法 を 提 供 す る 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質
を 阻 害 し うる 物 質 を選 別 す る こ と を特 徴 とす る新 規 抗 腫 瘍 剤 の ス ク
リ一 ニ ン グ 方 法 に よ る 。
(57)
屮
which
interference,
which
protein
a cell
oligonucleotide
RNA
i c nucleic
八P ,
provides
antitumor
acquisition
A s the substance
an antisense
inducing
invention
novel
o f inhibiting
(RhoGAP).
cells.
浸 潤 ア ツセ ィ
The
the
course
SAME
ング方法
Abstract:
action
SCREENING
(84)
指定 国 （
表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 広 域 保
護 が 可 肯^: ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW,
MZ, NA, RW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), ユ ー ラ
シ ァ （AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM), ョ一 ロ ッ
/ く (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI,
FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, ΓΓ , LT, LU, LV, MC, MK,
MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR),
OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML,
MR, NE, SN, TD, TG).
添付 公 開書 類 ：
一
一
国際調 査報 告 （
条 約 第 2 1 条 (3))
明 細 書 の 別 個 の 部 分 と して 表 した 配 列 リス ト
(規 則 5.2(a))
明
細
書
発 明 の 名 称 ：新 規 抗 腫 瘍 剤 及 び そ の ス ク リー ニ ン グ方 法
技術分野
本 発 明 は、 細 胞 周 期 依 存 性 タ ンパ ク質 を標 的 と し、 新 規 な メ カ ニ ズ ム に よ
[0001 ]
り作 用 す る新 規 抗 腫 瘍 剤 に 関 す る。 さ らに は、 新 規 な メ カ ニ ズ ム に よ る が ん
細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は転 移 を抑 制 しう る抗 腫 瘍 剤 を選 別 す る ス ク リ一 ニ ン グ
方 法 に 関 す る。
[0002]
本 出願 は、 参 照 に よ り こ こ に援 用 さ れ る と こ ろの 日本 出願 特 願 2 0 1 2 _
0
5 9 8 2 号 優 先 権 を請 求 す る。
背景技術
[0003]
細 胞 は増 殖 す る 時 に細 胞 周 期 と呼 ば れ る 一 定 の プ ロセ ス を経 る。 す な わ ち
、 細 胞 は G 1 期 (gapl ) → S期 (DNA synthes
i s ) → G2 期 (gap2)
→ M期 ( i tos i
s ) → G 1 期 と い う順 序 で 規 則 正 し く細 胞 周 期 を繰 り返 して 増 殖 して ゆ く。 細 胞
周 期 の 進 行 に と って ひ とつ の 重 要 な 時 期 が G 1 期 とS期 の 境 目 に存 在 す る。 そ の
時 期 は 哺 乳 動 物 培 養 細 胞 で は R点 （rest r i c t i o n po i nt)
と呼 ば れ る。 一 旦 、 R
点 を通 過 す る と、 細 胞 周 期 は 進 行 す る よ う に方 向 づ け られ て 速 や か に S期 に進
入 し、 続 け て G2 期 、 M期 へ と進 ん で い って G 1 期 へ 戻 って くる。 細 胞 が 増 殖 しな
い環 境 に あ る と き は、 S期 に進 ま ず に そ の ま ま G 1 期 に と ど ま る か 、 あ る い は 細
胞 周 期 か らは ず れ て 静 止 期 （rest i ng state;
G0 期 ）
と呼 ば れ る特 別 な 状 態 に
入 り休 止 状 態 とな る。 細 胞 の 置 か れ た 環 境 に よ って は、 分 化 、 老 化 、 ア ポ 卜
— シ ス、 減 数 分 裂 な どへ 進 む べ き シ グ ナ ル を 受 け取 る こ と も あ る が 、 そ れ ら
の 状 態 へ の 分 岐 点 も現 在 の と こ ろ は この G1期 の R点 前 に存 在 す る と考 え られ て
い る。
[0004]
が ん 細 胞 は 細 胞 周 期 制 御 が 異 常 とな り、 周 りの 細 胞 か ら来 る分 裂 停 止 の シ
グ ナ ル を無 視 して 増 殖 を続 け て ゆ く細 胞 で あ る。 が ん 細 胞 は 際 限 な く増 殖 し
、 浸潤
転 移 に よ りや が て 全 身 の 臓 器 の機 能 不 全 を も た ら し患 者 を死 に至 ら
しめ る。 これ ま で 悪 性 腫 瘍 治 療 薬 と して は、 旧 来 よ り使 用 さ れ て い る抗 悪 性
腫 瘍 剤 や 、 が ん 細 胞 特 異 的 な 増 殖 シ グ ナ ル を抑 制 す る 分 子 標 的 薬 剤 な ど、 い
ず れ も増 殖 性 の 高 い が ん 細 胞 を 障 害 す る も の で あ っ た 。 ま た 最 近 で は 、 悪 性
腫 瘍 組 織 周 囲 の 血 管 新 生 を抑 制 し、 代 謝 の 激 しい 悪 性 腫 瘍 組 織 へ の 補 給 路 を
断 つ 治 療 も あ る。 具 体 的 に は 、 乳 が ん に 発 現 す る HER2 を タ ー ゲ ッ トに した 卜
ラ ス ツ マ プ、 EGFR ( 上 皮 細 胞 増 殖 因 子 受 容 体 ） の キ ナ ー ゼ 活 性 を 阻 害 す る ゲ
フ イチ 二 プ、 CML ( 慢 性 骨 髄 性 白血 病 ） の 染 色 体 転 座 に よ る、 Bcr-Ab Lキ メ ラ
遺 伝 子 の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 活 性 を 阻 害 す る メ シ ル 酸 ィ マ チ ニ プ、 B細 胞 リ ンパ
腫 の 特 異 的 CD20 抗 原 を 認 識 す る ツ キ シ マ プ、 AML ( 急 性 骨 髄 性 白血 病 細 胞 ） に
発 現 す る、 細 胞 表 面 抗 原 CD33 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 含 む リツ キ シ マ
プ、 EGFR の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 酵 素 を 阻 害 す る エ ル ロ チ ニ プ、 VEGF ( 血 管 内 皮
成 長 因 子 ） に 対 す る、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 か らな る バ べ シ ズ マ プ等 が 挙 げ ら
れ る。 細 胞 周 期 進 行 に 要 す る タ ンパ ク 質 を 阻 害 して ア ポ 卜一 シ ス を 誘 導 す る
ボル テ ゾ ミプ （
Bortezom i b) も 用 い られ て い る。 ま た 、 ワ ク チ ン治 療 な ど、
宿 主 の 抗 腫 瘍 免 疫 を 高 め る 治 療 も 進 め られ て い る。
[0005]
一 方 で、 悪 性 腫 瘍 で 致 死 的状 況 とな る際 に最 も重 要 な 過 程 は、 浸 潤
転移
で あ る。 特 に、 が ん 化 した 細 胞 が 局 所 に 発 生 して も、 細 胞 の 増 殖 に は 生 体 内
で は 様 々 な 構 造 的 制 限 が あ る の で 、 十 分 な 浸 潤 能 を有 して い な け れ ば 、 が ん
細 胞 は 局 所 に と ど ま り、 増 殖
進 展 が で き な い 。 が ん 細 胞 は 原 発 巣 か ら離 脱
し、 タ ンパ ク 質 分 解 酵 素 を産 生 し周 囲 の 間 質 や 基 底 膜 を破 壊 して 脈 管 内 に侵
入 す る。 次 に脈 管 内 を移 動 して 標 的 臓 器 の 血 管 内 皮 細 胞 へ 接 着 し、 血 管 内 か
ら組 織 中 へ 同 様 の 機 序 で 浸 潤 して い く. そ して そ の 場 で 増 殖 す る こ と に よ り
転 移 巣 を形 成 す る と考 え られ て い る。 近 年 、 原 発 巣 か らの 離 脱 と標 的 組 織 へ
の 接 着 、 浸 潤 の 過 程 に は 細 胞 接 着 分 子 と特 殊 な タ ン パ ク 質 分 解 酵 素 が 大 き な
役 割 を 果 た して い る と考 え られ て い る。
[0006]
しか しな が ら、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 す る 薬 剤 は 十 分 と は
い え ず 、 さ らな る 開 発 が 望 ま れ て い る。
先行 技術 文献
特 許 文献
[0007]
特 許 文 南犬1 ：NK4
ogy
and
94 :
3 2 1-327.
(HGF-an
t h e r apeu t i cs.
t agon
i s t/ang
i ogenes
Mat sumo t o K ,
is
Nakamu
i nh i b i t o r )
r a T.
(2003)
i n cance
Cance
r
r
b io L
S c i ence
発 明 の概 要
発 明 が解 決 しょ う とす る課 題
本 発 明 は 、 細 胞 周 期 依 存 性 タ ン パ ク 質 を 標 的 と し、 新 規 メ カ ニ ズ ム に よ り
[0008]
作 用 す る新 規 抗 腫 瘍 剤 を提 供 す る こ と を課 題 とす る。 さ らに は、 新 規 メ カ 二
ズ 厶 に よ る、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は転 移 を抑 制 しう る抗 腫 瘍 剤 を選 別 す
る ス ク リ一 ニ ン グ 方 法 を 提 供 す る こ と を 課 題 と す る 。
課 題 を解 決 す るた め の手 段
本 発 明 者 ら は 上 記 課 題 を 解 決 す る た め に 鋭 意 研 究 を 重 ね た 結 果 、 あ る RhoGT
[0009]
P分 解
活 性 タ ン パ ク 質 ( h o GTPase
rRhoGAPj
a c t i vat
i ng
prot e i n
：RhoGAP,
以下単 に
と い う 場 合 も あ る 。 ） が 、 細 胞 周 期 に 依 存 した 調 節 を 受 け て お り
、 これ が ん 細 胞 が 浸 潤 能
（細 胞 可 動 性 ） を 獲 得 す る 過 程 で 重 要 な 役 割 を 果 た
す こ と を 初 め て 見 出 した 。 当 該 RhoGAP を 標 的 と す る こ と で 、 が ん 細 胞 の 可 動
性 及 び / 又 は 転 移 を 制 御 し う る こ と を 確 認 し、 本 発 明 を 完 成 した 。
す な わ ち 、 本 発 明 は 以 下 よ りな る。
[00 1 0 ]
. 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 （RhoGAP) を 阻 害 し う る 物 質
を 有 効 成 分 と して 含 有 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 。
2
. 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP 1 1A を 阻 害 し う る 物
質 で あ る、 前 項 1 に記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 。
3 .
ARHGAP 1 1A を 阻 害
し う る 物 質 が 、 ARHGAP 1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 に 対 す る
ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ド又 は RNA 干 渉 を 誘 導 す る 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ド
で あ り、 或 い は ARHGAP 1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 転 写 産 物 若 し く は 翻 訳 産 物 に
結 合 し得 る 低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら選 択 さ れ る い ず れ か で あ る 前 項 2
に記 載 の新 規 抗 腫 瘍 剤 。
4 .
ARHGAP 1 1A を 阻 害
し う る 物 質 が 、 当 該 ARHGAP 1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 に 対
す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ っ て 、 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを 構 成
す る塩 基 が 1 4 塩 基 〜 2 0 0 塩 基 で あ り、 当 該 塩 基 配 列 中 に 人 工 核 酸 を 少 な
く と も 1 以 上 含 む こ と を特 徴 とす る前 項 3 に記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 。
5 .
ア ンチ セ ン ス オ リゴ ヌ ク レオ チ ドが 、 以 下 の 1 ) ~ 1 3 ) の い ず れ か に
示 す 塩 基 配 列 を含 む 才 リゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る、 前 項 4 に記 載 の 新 規 抗 腫 瘍
剤 ：
) ARHGAP-625-BNA-1
6 ：5(L)T(L)5(L)aaatttgaa5(L)T(L)5(L)c
(配 列番 号 1
；
0 )
2 ) ARHGAP-969-BNA-1
6 ：T(L)5(L)5(L)gaaaaagcc5(L)T(L)T(L)c
(配 列番 号
3 )
3 ) ARHGAP-1 344-BNA-1 6 ：T(L)5(L)T(L)
6 )
；
4 ) ARHGAP-1447-BNA-1
)
(配 列番 号
tttcatgtc5(L)T(L)T(L)c
6 ：T(L)5(L)5(L)aggataaaaT(L)5(L)T(L)g
(配 列番 号
；
5 ) ARHGAP-1 748-BNA-1 6 ：5(L)T(L)T(L)gatggactt5(L)5(L)T(L)
t
(配 列番
t
(配 列番 号
号 1 9 )
6 ) ARHGAP-1 931 -BNA-1 6 ：T(L)T(L)T(L)gcctgcaatT(L)5(L)T(L)
2 1 )
;
7 ) ARHGAP-2032-BNA-1
6 ：5(L)5(L)T(L)agattgaatT(L)T(L)5(L)a
(配 列番
号 2 2 )
8 ) ARHGAPv1 -3484-BNA-1
号3 0 )
6 ：T(L)T(L)5(L)gagggtaacT(L)5(L)5(L)a
；
9 ) ARHGAPv2-221 5-BNA-1 6 ：5(L)T(L)5(L)
号3 4 )
(配 列番
6 ：T(L)5(L)T(L)agaacagtaA(L)A(L)T(L)
t
(配 列
6 ：T(L)T(L)5(L)aaacatgaa5(L)T(L)T(L)
t
(配 列
；
1 ) ARHGAPv2-2306-BNA-1
番号 3 6 )
taacagtagT(L)A(L)T(L)g
；
0 ) ARHGAPv2-2285-BNA-1
番号 3 5 )
(配 列番
；
) ARHGAPv2-2355-BNA-1
6 ：T(L)5(L)5(L)caattgttgA(L)T(L)A(L)g
(配 列
番号 3 7 )
；
3 ) ARHGAPv2-2404-BNA-1 6 ：T(L)T(L)T(L)
taacataagA(L)A(L)T(L)g
(配 列
番号 3 8 ) 。
[ こ こ に お い て 、 N(l_) は 人 工 核 酸 BNA 、 5(l_) は L-mC ( メ チ ル 化 人 工 核 酸 BNA) 、
T(l_) は 人 工 核 酸 チ ミ ジ ン、 A(l_) は 人 工 核 酸 ア デ ニ ン を表 す 。 ]
6 . ARHGAP1 1A を 阻 害 しう る物 質 が 、 RNA 干 渉 を 誘 導 す る オ リゴ ヌ ク レオ チ ド
で あ っ て 、 以 下 の 1 4 ) 又 は 1 5 ) に 示 す 塩 基 配 列 を 含 む オ リゴ ヌ ク レオ チ
ドで あ る、 前 項 3 に 記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 ：
4 ) ARHGAP1 1A
# 1 (TRCN0000047281 ) ：CCGGCGGTATCAGTTCACATCGATACTCGAG
TATCGATGTGAACTGATACCGTTTTTG ( 配 列 番 号 1 )
5 ) ARHGAP1 1A
#2 (TRCN0000047282)
；
：CCGGCCTTCTATTACACCTCAAGAACTCGAG
TTCTTGAGGTGTAATAGAAGGTTTTTG ( 配 列 番 号 2 ) 。
7 . 抗 腫 瘍 剤 が 、 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 作 用 及 び / 又 は 浸 潤 阻 害 作 用 を有 す る
こ と を特 徴 と す る、 前 項 1 ~ 6 の い ず れ か 1 項 に 記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 。
8 . 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 を 選 別 す る こ と を特 徴 と す る
新 規 抗 腫 瘍 剤 の ス ク リー ニ ン グ方 法 。
9 . 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP が 、 ARHGAP1 1A で あ る、 前 項 8 に 記 載 の ス ク リ一
ニ ン グ方 法 。
0 . 少 な く と も 以 下 の A ) ~ D ) の 工 程 を 含 む こ と を特 徴 と す る前 項 9 に
記 載 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 ：
A ) 候 補 物 質 を が ん 細 胞 株 と共 に 培 養 し、 該 細 胞 に お け る ARHGAP1 1A を コ ー ド
す る遺 伝 子 の 発 現 量 を測 定 す る工 程 ；
B ) 対 照 の 系 で 同 手 法 に よ り測 定 さ れ た ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 発 現
量 を測 定 す る工 程 ；
C ) 前 記 A ) 及 び B ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た ARHGAP1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子
の 発 現 量 と、 比 較 す る 工 程 ；
D)
A ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 量 が 、 B ) の 工 程 に よ り測 定
され た 遺 伝 子 の 発 現 量 に比 べ て低 い場 合 の候 補 物 質 を選 別 す る工 程 。
1 .
生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 定 量 す る こ と を 特 徴 と す る 悪
性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。
.
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP が 、 ARHGAP1 1A で あ る 、 前 項
1
1 に 記 載 の 悪 性
腫 瘍 の 検 査 方 法 。
3 .
悪 性 腫 瘍 が 、 大 腸 が ん や す い 臓 が ん 、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん 、 頭 頸
部 が ん 、 黒 色 腫
（メ ラ ノ 一 マ ） 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん 、 滕 臓 が ん 、 肝
細 胞 が ん 、 腎 細 胞 が ん 、 皮 膚 が ん か ら選 択 さ れ る 一 種 又 は 複 数 種 で あ る 、 前
項
1
4 .
1 又 は 1 2 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。
悪 性 腫 瘍 の 検 査 が 、 が ん の 進 行 度 及 び /
査 で あ る 、 前 項
5 .
1 3 の い ず れ か 1 項 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。
又 は 浸 潤 阻 害 剤 。
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る
物 質 で あ る 、 前 項
1 7 .
1 ~
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 か ら な る 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻
害 剤 及 び /
6 .
1
又 は 予 後 を 予 測 す る た め の 検
1 5 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び /
又 は 浸 潤 阻 害 剤
ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP1 1A を コ ー ド す る 遺 伝 子 に 対 す
る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド 又 は RNA 干 渉 を 誘 導 す る 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ
ド で あ り 、 或 い は ARHGAP1 1A を コ 一 ド す る 遺 伝 子 の 転 写 産 物 若 し く は 翻 訳 産 物
に 結 合 し得 る 低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら 選 択 さ れ る い ず れ か で あ る 前 項
1 6 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び /
8 .
又 は 浸 潤 阻 害 剤 。
ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 当 該 ARHGAP1 1A を コ ー ド す る 遺 伝 子 に
対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドで あ っ て 、 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を 構
成 す る 塩 基 が 1 4 塩 基 〜 2 0
0 塩 基 で あ り、 当 該 塩 基 配 列 中 に 人 工 核 酸 を 少
な く と も 1 以 上 含 む こ と を 特 徴 と す る 前 項
剤 及 び /
9 .
1 7 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害
又 は 浸 潤 阻 害 剤 。
ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドが 、 以 下 の 1 )
に 示 す 塩 基 配 列 を 含 む 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドで あ る 、 前 項
瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び /
又 は 浸 潤 阻 害 剤
：
~
1 3 )
の い ず れ か
1 8 に 記 載 の 悪 性 腫
) ARHGAP-625-BNA-1
6 ：5(L)T(L)5(L)aaatttgaa5(L)T(L)5(L)c
(配 列番 号 1
；
0 )
2 ) ARHGAP-969-BNA-1
6 ：T(L)5(L)5(L)gaaaaagcc5(L)T(L)T(L)c
(配 列番 号
3 )
3 ) ARHGAP-1 344-BNA-1 6 ：T(L)5(L)T(L)
6 )
；
4 ) ARHGAP-1447-BNA-1
)
(配 列番 号
tttcatgtc5(L)T(L)T(L)c
6 ：T(L)5(L)5(L)aggataaaaT(L)5(L)T(L)g
(配 列番 号
；
5 ) ARHGAP-1 748-BNA-1 6 ：5(L)T(L)T(L)gatggactt5(L)5(L)T(L)
t
(配 列番
t
(配 列番 号
号 1 9 )
6 ) ARHGAP-1 931 -BNA-1 6 ：T(L)T(L)T(L)gcctgcaatT(L)5(L)T(L)
2 1 )
;
7 ) ARHGAP-2032-BNA-1
6 ：5(L)5(L)T(L)agattgaatT(L)T(L)5(L)a
(配 列番
号 2 2 )
8 ) ARHGAPv1 -3484-BNA-1
号3 0 )
6 ：T(L)T(L)5(L)gagggtaacT(L)5(L)5(L)a
；
9 ) ARHGAPv2-221 5-BNA-1 6 ：5(L)T(L)5(L)
号3 4 )
6 ：T(L)5(L)T(L)agaacagtaA(L)A(L)T(L)
t
(配 列
6 ：T(L)T(L)5(L)aaacatgaa5(L)T(L)T(L)
t
(配 列
；
) ARHGAPv2-2355-BNA-1
番号 3 7 )
(配 列番
；
1 ) ARHGAPv2-2306-BNA-1
番号 3 6 )
taacagtagT(L)A(L)T(L)g
；
0 ) ARHGAPv2-2285-BNA-1
番号 3 5 )
(配 列番
6 ：T(L)5(L)5(L)caattgttgA(L)T(L)A(L)g
(配 列
6 ：T(L)T(L)T(L)
(配 列
；
3 ) ARHGAPv2-2404-BNA-1
taacataagA(L)A(L)T(L)g
番号 3 8 ) 。
[ こ こ に お い て 、 N(l_) は 人 工 核 酸 BNA 、 5(l_) は L-mC ( メ チ ル 化 人 工 核 酸 BNA) 、
T(l_) は 人 工 核 酸 チ ミ ジ ン、 A(l_) は 人 工 核 酸 ア デ ニ ン を表 す 。 ]
2 0 . ARHGAP1 1A を 阻 害 しう る物 質 が 、 RNA 干 渉 を 誘 導 す る オ リゴ ヌ ク レオ チ
ドで あ っ て 、 以 下 の 1 4 ) 又 は 1 5 ) に 示 す 塩 基 配 列 を 含 む オ リゴ ヌ ク レオ
チ ドで あ る、 前 項 1 7 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び / 又 は 浸 潤 阻 害 剤
4 ) ARHGAP1 1A
# 1 (TRCN0000047281 ) ：CCGGCGGTATCAGTTCACATCGATACTCGAG
TATCGATGTGAACTGATACCGTTTTTG ( 配 列 番 号 1 )
5 ) ARHGAP1 1A
#2 (TRCN0000047282)
；
：CCGGCCTTCTATTACACCTCAAGAACTCGAG
TTCTTGAGGTGTAATAGAAGGTTTTTG ( 配 列 番 号 2 ) 。
2 1 . 前 項 1 ~ 7 の い ず れ か に記 載 の新 規 抗 腫 瘍 剤 を用 い る悪 性 腫 瘍 の 治 療
及び/ 又 は予 防方法。
発 明 の効 果
[001 1]
本 発 明 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 を有 効 成 分 と して 含 有
す る新 規 抗 腫 瘍 剤 に よ り、 ARHGAP1 1A を 発 現 しう る が ん 、 例 え ば 大 腸 が ん 、 す
い 臓 が ん 、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん 、 頭 頸 部 が ん 、 黒 色 腫 （メ ラ ノ 一 マ ） 、
卵 巣 が ん、 肺 が ん、 脳 が ん、 滕 臓 が ん、 肝 細 胞 が ん、 腎細 胞 が ん、 皮 膚 が ん
等 に 由来 す る が ん 細 胞 等 に つ い て、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は転 移 が抑 制 さ
れ る。 従 来 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 しう る 抗 腫 瘍 剤 で 有 効 な
薬 剤 は ほ と ん ど存 在 しな か っ た 。 が ん の 悪 性 化 に影 響 を 及 ぼ す 、 が ん 細 胞 の
浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 しう る 薬 剤 の 提 供 に よ り、 効 果 的 な が ん 治 療 が で
き る。
さ ら に、 生 体 検 体 中 の ARHGAP1 1A の 発 現 を例 え ば mRNA に よ り検 査 した 結 果 、
がんの進行度 （
病 期 ス テ ー ジ分 類 ） や 、 無 再 発 生 存 期 間 との 関係 で有 意 な 違
い が 認 め られ た 。 こ の こ と か ら、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 定
量 す る こ と で 、 悪 性 腫 瘍 を検 査 す る こ と が で き る。
図面 の簡 単 な説 明
[001 2]
[ 図 1] が ん 組 織 に お け る転 移 / 浸 潤 が ん 細 胞 の 組 織 免 疫 に よ る 組 織 を 示 す 写 真
図 で あ る。 （
参考例 1 )
[ 図 2] ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 に 細 胞 周 期 を リア ル タ ィ 厶 で 可 視 化 す る Fucc i を 遺 伝
子 導 入 し、 蛍 光 顕 微 鏡 と FACS で 確 認 した 写 真 図 で あ る。 （
参考例 2 )
[ 図 3]N0D/SCID マ ウ ス に移 植 した ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 に つ い て 、 細 胞 の 細 胞 周 期
に よ っ て 細 胞 の 移 動 速 度 が 違 う こ と を確 認 した 写 真 図 で あ る。 S/G2/M 期 の 細
胞 の ほ うが、 G 1期 の 細 胞 に比 べ て、 細 胞 の 可 動 性 が 大 きい。 （
参考例 2 )
[ 図 4]S/G2/M 期 の 細 胞 (mAG) と G 1 期 の 細 胞 (mK02) に つ い て 、 mRNA レベ ル 及
び タ ンパ ク 質 で の ARHGAP 11Aの 発 現 を確 認 した 写 真 図 で あ る。 （
参考例 2 )
[ 図 5] 細 胞 周 期 依 存 性 転 写 因 子 の 存 在 とARHGAP1 1A の 発 現 と の 関 係 を 示 す 図 で
あ る。 （
参考例 3 )
[ 図 6] 各 種 細 胞 に お け る ARHGAP 11Aの 発 現 を確 認 した 図 で あ る。 （
参考例 4 )
[ 図 7]ARHGAP1 1A を shRNA で 阻 害 した ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 の 変 異 株 に つ い て 、 細 胞
増 殖 度 及 び 可 動 性 を確 認 した 図 で あ る。 （
実施例 1 )
[ 図 8] 免 疫 不 全 マ ウ ス （
N0D/SCID)
に 野 生 株 の ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 を移 植 した の
ち に、 ARHGA1 1A に 対 す る shRNA を 局 所 投 与 した と き の 腫 瘍 の 大 き さ を確 認 した
結 果 を 示 す 図 で あ る。 （
実施例 2 )
[ 図 9] 大 腸 が ん の ス テ ー ジ と、 mRNA レベ ル で の ARHGAP 11Aの 発 現 を確 認 した 図
で あ る。 （
実施例 3 )
[ 図 10] 大 腸 が ん 摘 出 手 術 を施 行 した 患 者 に つ い て 、 ARHGAP 11Aの 発 現 が 平 均 よ
り低 い 患 者 群 （n=38)
と高 い 患 者 群 （n=26)
で の 、 無 再 発 生 存 期 間 を確 認 し
た 結 果 を 示 す 図 で あ る。 （
実施例 4 )
[ 図 11] 人 工 核 酸 を 含 む 35種 類 の ア ン チ セ ン ス 才 リゴ ヌ ク レオ チ ド （ア ン チ セ
ン ス BNA)
に よ る 、 HCT1 16 ( ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 株 ） で の ARHGAP1 1A発 現 抑 制 効
果 を確 認 した 結 果 を 示 す 図 で あ る。 （
実施例 5 )
[ 図 12] 人 工 核 酸 を 含 む 5種 類 の ア ン チ セ ン ス 才 リゴ ヌ ク レオ チ ド （ア ン チ セ ン
ス BNA) に よ る、 各 種 が ん 細 胞 で の ARHGAP1 1A 発 現 抑 制 効 果 を、 ウ ェ ス タ ン プ
ロ ッテ イ ン グ に よ り確 認 した 結 果 を 示 す 写 真 図 で あ る。 （
実施例 6 )
[ 図 13]
( A ) ア ン チ セ ン ス BNA (#1 748)
を導 入 した HCT1 16 に お け る、 ARHGAP1
1A の 発 現 抑 制 効 果 を確 認 した 写 真 図 で あ る。
セ ン ス BNA (#1 748)
（B ) ま た 、 HCT1 16へ の ア ン チ
の 取 り込 み を FITC ( f luoresce
i n i soth i ocyanate)
標識
ア ン チ セ ン ス BNA (#1 748)
を 用 い て 確 認 した 写 真 図 で あ る 。
[ 図 14] 免 疫 不 全 マ ウ ス （N0D/SCID)
748)
748)
に つ い て 、 FITC 標 識 ア ン チ セ ン ス BNA (#1
投 与 に よ る i n v i voで の 抗 腫 瘍 効 果 を示 す 図 で あ る。
[ 図 15 ] 免 疫 不 全 マ ウ ス
（実 施 例 7 )
（実 施 例 8 )
に つ い て 、 FITC 標 識 ア ン チ セ ン ス BNA (#1
（N0D/SCID)
投 与 後 1 4 日 目 で の 各 臓 器 へ の FITC 標 識 の 取 り込 み を 確 認 した 結 果 を 示
す 写 真 図 で あ る。
（実 施 例 8 )
[ 図 16 ] ア ン チ セ ン ス BNA (#1 748)
の 腫 瘍 転 移 抑 制 効 果 を確 認 す る た め の 、 各
薬 剤 の 投 与 ス ケ ジ ュ ー ル を示 す 図 で あ る。
（実 施 例 9 )
[ 図 17 ] ヒ 卜線 維 肉 腫 細 胞 を 静 脈 注 射 した ヌ ー ドマ ウ ス に つ い て 、 ア ン チ セ ン
ス BNA (#1 748)
を 投 与 した と き の 肺 転 移 腫 瘍 の 大 き さ を イ メ ー ジ ン グ に て 確
認 した 結 果 を 示 す 写 真 図 で あ る 。
（実 施 例 9 )
[ 図 18 ] ヒ 卜線 維 肉 腫 細 胞 を 静 脈 注 射 した ヌ ー ドマ ウ ス に つ い て 、 ア ン チ セ ン
ス BNA (#1 748)
あ る。
を 投 与 した と き の 肺 重 量 及 び 体 重 を 測 定 した 結 果 を 示 す 図 で
（実 施 例 9 )
発 明 を実 施 す る た め の 形 態
[001 3 ]
本 発 明 は 、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効 成 分 と して 含
有 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 に 関 す る 。 本 発 明 に お い て 、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP と
して は 、 ARHGAP1 1A (Rho
[0014]
GTPase
act
i vat
i ng prote
i n 1 1A)
が 挙 げ られ る 。
後 述 の実 施 例 、 実 験 例 で具 体 的 な事 件 結 果 を詳 述 す るが、 本欄 で は本 発 明
を な す に 至 っ た 経 緯 を 、 簡 単 に 説 明 す る 。 本 発 明 者 ら は 、 独 自 に 確 立 した が
ん 組 織 の 生 体 イ メ ー ジ ン グ 実 験 系 を 用 い て 、 が ん 細 胞 が 正 常 組 織 に 浸 潤 して
い く様 子 を リ ア ル タ イ ム で 解 析 し、 S/G2/M 期 の 細 胞 で は G 1 期 の 細 胞 に 比 べ て
可 動 性 が 高 い こ と を 見 い だ した 。 が ん 細 胞 の う ち 、 S/G2/M と G 1 の 細 胞 を 分 取
して マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 を 行 う こ と に よ り、 細 胞 周 期 に 依 存 す る 遺 伝 子 を 抽
出 し、 そ の 中 で 可 動 性 に 関 連 す る ARHGAP1 1A が S/G2/M 期 の 細 胞 に 高 発 現 して い
る こ と を 初 め て 見 出 した 。 shRNA
( 低 分 子 ヘ ア ピ ン RNA)
を 用 い て ARHGAP1 1A を
阻 害 した が ん 細 胞 は 、 野 生 株 の が ん 細 胞 よ り も 可 動 性 が 低 く、 腫 瘍 の 進 展 速
度 が 低 下 して い る こ と が 確 認 さ れ た 。 さ ら に 、 免 疫 不 全 マ ウ ス （N0D/SCID)
に 野 生 株 の が ん 細 胞 を 移 植 した の ち に 、 ARHGA1 1A に 対 す る s i RNA
NA )
(低 分 子 干 渉
を i n v i v o で 局 所 投 与 す る と、 腫 瘍 の 拡 大 を 有 意 に 抑 制 す る こ と が で き
た。
[00
が ん細胞 が、 培養 器 内で増 殖 す る際 には空 間 的制 限 が な いが、 生体 内で増
15 ]
殖 す る た め に は 、 細 胞 分 裂 と 同 時 に 周 囲 の 正 常 組 織 に 浸 潤 して い く こ と が 必
要 で あ る。 本 発 明 者 らは 、 大 腸 が ん 細 胞 の 細 胞 周 期 を 可 視 化 す る 蛍 光 タ ンパ
ク 質 を 取 り込 ま せ 、 多 光 子 励 起 顕 微 鏡 を 用 い て 生 体 内 イ メ ー ジ ン グ を 行 っ た
。 その結 果、 が ん細胞 の浸潤
遊 走 能 が 、 細 胞 周 期 に 依 存 す る S/G2/M
胞 可 動 性 が 亢 進 す る こ と を 初 め て 見 出 した
期 で細
（図 2 、 3 ) 。 G 1 期 と S/G2/M
期の
細 胞 で 発 現 す る 分 子 を マ イ ク ロ ア レ イ 法 で 解 析 した 結 果 、 細 胞 可 動 性 を 低 下
さ せ る RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質
の一種 であ る
「ARHGAP 1 1A 」 が S /
期 の 細 胞 で G 1 期 の 細 胞 に 比 べ 1 0 培 以 上 高 発 現 して い る こ と を 確 認 した 。
G2/M
[00
（RhoGAP)
本 発 明 に お い て ARHGAP 1 1A と は 、 代 表 的 な も の と して 、 GenBank
16 ]
No.
N M 0 14783.
3
(バ リア ン 卜2 )
( バ リ ア ン 卜 1 ) 又 は GenBank
Access
ion
No.
Access
NM
ion
1 99357.
1
で 特 定 さ れ る 塩 基 配 列 か ら な る mRNA よ り 合 成 さ れ る ヒ 卜由
来 タ ン パ ク 質 が 挙 げ ら れ る 。 ま た 、 ARHGAP 1 1A を 別 の 視 点 か ら 定 義 す る と 、 Ge
nBank
Access
ion
No. NM_0 14783.
3又
は NMJ 99357.
1で 特
定 され る塩 基 配 列 か ら
翻 訳 さ れ る ア ミ ノ酸 配 列 、 又 は 前 記 ア ミ ノ酸 配 列 に お い て 、 一 つ 以 上 の ア ミ
ノ 酸 の 欠 失 、 付 加 、 置 換 又 は 揷 入 を 有 し、 か つ 、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分
解 活 性 を 有 す る ア ミ ノ酸 配 列 か らな る タ ンパ ク 質 が 含 ま れ る 。 さ ら に 、 ヒ 卜
以 外 の 哺 乳 動 物 由 来 の ARHGAP 1 1A も 本 発 明 の ARHGAP 1 1A に 含 め る こ と が で き る
[00
17 ]
本 発 明 に お い て ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 と は 、 GenBank
3又
は NMJ 99357.
1で 特
Access
ion
No.
NM— 0 14783.
定 さ れ る 塩 基 配 列 か ら な る mRNA を コ 一 ドす る DNA の 他 、
こ れ ら 配 列 と 類 似 の 配 列 を 保 持 す る DNA も 含 め る こ と が で き る 。 こ こ で
の 配 列 」 と は 、 GenBank
Access
ion
No.
NM— 0 14783.
3又
は NMJ 99357.
「類 似
1で 特
定
さ れ る 塩 基 配 列 か ら 一 つ 以 上 の ヌ ク レ オ チ ドの 欠 失 、 付 加 、 置 換 又 は 揷 入 を
有 し、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 を 合 成 し う る 塩 基 配
列 か らな る DNA と す る こ と が で き る。 さ ら に、 上 記 で 特 定 さ れ る塩 基 配 列 か ら
な る DNA 、 若 し くは 当 該 特 定 さ れ る塩 基 配 列 か ら一 つ 以 上 の ヌ ク レオ チ ドの 欠
失 、 付 加 、 置 換 又 は 揷 入 を有 し、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 活 性 を有 す る タ ン
パ ク 質 を 合 成 しう る塩 基 配 列 か らな る DNA 、 又 は そ の 一 部 配 列 と ス 卜リ ン ジ ェ
ン 卜な 条 件 で ハ イ プ リダ イ ズ し得 る 配 列 を有 す る DNA も、 本 発 明 の ARHGAP1 1A
遺 伝 子 に 包 含 さ れ る。 ス トリ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 と は 、 一 般 に、 ハ イ プ リダ イ
ズ の 際 又 は 洗 浄 の 際 に使 用 さ れ る緩 衝 液 の 塩 濃 度 や 温 度 に よ り規 定 さ れ る。
塩 濃 度 と して は 、 通 常 は 「1 X SSC 、 0. \ % SDSJ 、 よ り厳 しい 条 件 と して は 「
0
. 5 X SSC, 0. % SDSJ 、 さ ら に厳 しい 条 件 と して 「
0. 1 X SSC 、 0. % SDSJ と す
る こ と が で き る。 温 度 と して は 通 常 37 °C 、 厳 しい 条 件 と して は42 °C 、 よ り厳
しい 条 件 と して 55 °C 、 さ ら に厳 しい 条 件 と して は 65 °C と す る こ と が で き る。
[001 8]
本 明 細 書 に お い て 、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 （
Rho GTP
ase act i at i ng prote i n) 、 即 ち 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質
と は 、 当 該 RhoGAP の 機 能 を 阻 害 及 び / 又 は 発 現 を 阻 害 す る物 質 を い う。 RhoGA
Pの 機 能 を 阻 害 す る と は 、 RhoGAP の タ ンパ ク 質 と して の 機 能 を 阻 害 す る こ と を
い い 、 RhoGAP の 発 現 を 阻 害 す る と は 、 RhoGAP の 生 合 成 を 阻 害 す る こ と と 同 義
で あ る。 RhoGAP の 生 合 成 を 阻 害 しう る物 質 と して は 、 RhoGAP 遺 伝 子 、 又 は 転
写 産 物 若 し くは翻 訳 産 物 に結 合 し得 る物 質 が 挙 げ られ る。 RhoGAP 遺 伝 子 の 転
写 産 物 と は 、 具 体 的 に は RhoGAP mRNA 及 び 前 駆 RNA な ど が 挙 げ られ る。 RhoGAP
の 生 合 成 を 阻 害 しう る物 質 で あ れ ば 抗 腫 瘍 効 果 が 期 待 で き る。 よ り具 体 的 に
は 、 当 該 RhoGAP を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リゴ ヌ ク レオ チ
ドゃ RNAi
(RNA i nterference,
RNA 、 s i RNA 、
RNA 干 渉 ）
を 誘 導 す る オ リゴ ヌ ク レオ チ ド （
sh
i croRNA) 、 転 写 産 物 若 し くは翻 訳 産 物 に結 合 し得 る低 分 子 化
合 物 、 天 然 高 分 子 か ら選 択 さ れ る い ず れ か が 挙 げ られ る。
[001 9]
RhoGAP が ARHGAP1 1A の 場 合 に は 、 ARHGAP1 1A を 阻 害 しう る物 質 と は 、 当 該 ARH
GAP1 1A の 機
能 を 阻 害 及 び / 又 は 発 現 を 阻 害 す る物 質 を い う。 ARHGAP1 1A の 機 能
を 阻 害 す る と は 、 ARHGAP1 1A の タ ンパ ク 質 と して の 機 能 を 阻 害 す る こ と を い い
、 ARHGAP1 1A の 発 現 を 阻 害 す る と は 、 ARHGAP1 1A の 生 合 成 を 阻 害 す る こ と と 同
義 で あ る 。 ARHGAP 1 1A の 生 合 成 を 阻 害 し う る 物 質 と して は 、 ARHGAP 1 1A 遺 伝 子
、 又 は 転 写 産 物 若 し くは 翻 訳 産 物 に 結 合 し得 る 物 質 が 挙 げ られ る 。 よ り具 体
的 に は 、 当 該 RhoGAP を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ
才 チ ドや RNA i (RNA
(shRNA 、 s i RNA 、
i n t e r f e r ence,
i c r oRNA)
RNA 干 渉
） を 誘 導 す る オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド
、 転 写 産 物 若 し くは 翻 訳 産 物 に 結 合 し得 る 低 分
子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら選 択 さ れ る い ず れ か が 挙 げ られ る 。 尚 、 本 明 細 書
における 「
核酸 」、
核 酸 (DNA)
B
i dged
「ヌ ク レオ チ ド」 、 「ヌ ク レオ シ ド」 は 、 デ 才 キ シ リボ
、 リボ 核 酸 ( 瞧 ) の 他 に 、 PNA (Pept
Nuc Le i c A c i d )
i d e Nuc Le i c A c i d )
や BNA (
、 及 び こ れ らの 類 縁 体 な ど の 人 工 的 に 合 成 さ れ た 核
酸 （
以 下 、 「人 工 核 酸 」 と い う ） も 含 ま れ る 。 BNA は 、 例 え ば 株 式 会 社 ジ ー ン
デ ザ イ ンが 作 製 す る核 酸
（B
r i dged
Nuc Le i c A c i d
：架 橋 化 核 酸 ） を 使 用 す る
こ とが で き る。
ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドは 、 例 え ば 上 記 ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 転 写 産 物
[0020]
の 配 列 に 基 づ き、 該 転 写 産 物 と対 合 し得 る よ う に 配 列 を デ ザ イ ン す る こ と が
で き る 。 ア ン チ セ ン ス ヌ ク レオ チ ドは DNA 又 は RNA の い ず れ か ら構 成 さ れ て も
よ く、 天 然 に は 存 在 しな い 人 工 核 酸 を 含 む オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る の が 好
適 で あ る 。 人 工 核 酸 を 含 む こ と で 、 よ り安 定 性 の 高 い オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを
得 る こ と が で き る 。 ま た 、 オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドの 塩 基 配 列 の 長 さ は 、 特 に 制
限 さ れ な い が 、 少 な く と も 対 象 と す る 遺 伝 子 の 特 異 性 を 保 持 し得 る 長 さ を 有
して い れ ば よ く、 長 さ の 上 限 は mRNA と 同 等 の 長 さ と して も よ い 。 一 般 に は 、 1
4塩
[002
1]
基 〜 200 塩 基 、 好 ま し くは 1 5 塩 基 か ら5 0 塩 基 と す る こ と が で き る 。
RNA i
(RNA
i n t e r f e r ence,
RNA 、 shRNA 、 m i c r oRNA
RNA 干 渉
) を 誘 導 す る dsRNA
( 二 重 鎖 RNA)
に はs i
な ど の 形 態 が 知 られ て お り、 本 発 明 は こ れ ら全 て を 包
含 し得 る 。 dsRNA は 、 上 記 ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 の 転 写 産 物 の 一 部 領 域 と相 補 し得
る ア ン チ セ ン ス 鎖 と、 こ の ア ン チ セ ン ス 鎖 と対 合 し得 る 配 列 か らな る セ ン ス
鎖 と か ら構 成 さ れ る 。 す な わ ち 、 dsRNA の 二 重 鎖 領 域 は 、 ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 上
の 標 的 と す る領 域 の DNA 配 列 を リボ 核 酸 に 変 更 した 配 列 に 相 当 す る 。 な お 、 A R
HGAP 1 1A の 発 現
を 阻 害 し得 る 限 り、 ア ン チ セ ン ス 鎖 の 配 列 中 に標 的 と す る ARHG
A P 1 1A 遺 伝 子
と相 補 しな い配 列 を有 して い て も よ く、 また、 セ ン ス 鎖 配 列 中 に
ア ンチ セ ンス鎖 と対 合 しな い配 列 を有 して い て も よ い。 上 記 dsRNA の 二 重 鎖 領
域 の 長 さ は、 一 例 を示 せ ば、 16~49
塩 基 対 、 好 適 に は 16~30
塩 基 対 、 さ らに
好 適 に は 19 ~ 2 1 塩 基 対 とす る こ とが で き る。 長 い dsRNA は、 細 胞 毒 性 を有 す る
こ とか ら、 この毒 性 を与 え な い範 囲 で、 長 さ の 上 限 を決 定 す る こ とが で き る
。 また、 dsRNA の 長 さ の 下 限 は、 特 異 性 を保 持 し得 る範 囲 で調 整 す る こ とが で
き る。
[0022]
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP 1 1A の 発 現 を効 果 的 に 阻 害 し得 るA R
HGAP 1 1A 遺 伝 子 上 の標
的領 域 又 は具 体 的 な shRNA 、 s i RNA や m i c r oRNA な どの 配 列
は、 例 え ば、 DHARMACON 社 ( h t t p : //des
p : //www.
amb i on. com/t
会ネ
土 ( h t t p : //www.
ech L i b/m i sc/s
i gn. dha rmacon.
com)
i RNA f i nde r . h t m L)
t aka r a-b i o . co. j p / r n a i / i n t r o . h tm)
、 Amb i o n 社 ( h t t
、 タ カ ラ ンヾィ 才 株 式
な ど、 白体 公 知 の デ
ザ イ ンツ ー ル を利 用 して デ ザ イ ンす る こ と も で き る。 また、 合 成 器 な ど に よ
り人 工 的 に合 成 した 合 成 オ リゴdsRNA と して調 製 して も よ い。 又 は、 dsRNA を
コー ドした DNA を担 持 した 発 現 べ ク タ 一 か ら細 胞 内 で s i
NA を発 現
させ る構 成
と して も よ い。 細 胞 内 で dsRNA を発 現 させ る際 の ベ ク タ 一 は、 導 入 した い細 胞
な ど に よ り任 意 に選 択 す る こ とが で き る。 例 え ば、 哺 乳 動 物 細 胞 で は、 レ 卜
ロ ウ ィル スべ ク タ 一、 アデ ノ ウ イル スベ ク タ 一、 アデ ノ関 連 ウ ィル スベ ク タ
― 、 ワ ク シ ニ ア ウ ィル スベ ク タ 一、 レンチ ウ ィル スベ ク タ 一、 ヘ ル ぺ ス ウ イ
ル スべ ク タ 一、 アル フ ァ ウ ィル スベ ク タ 一、 EB ウ ィル スベ ク タ 一、 パ ピ 口一
マ ウ ィル スベ ク タ 一、
フ 才 一
ミ一 ウ ィル スベ ク タ 一 な どの ウ ィル スベ ク タ 一
な どが 挙 げ られ る。 これ ら発 現 べ ク タ 一 に は dsRNA を転 写 させ る た め の プ ロモ
— タ を備 え、 そ の 下 流 に dsRNA を コー ドした DNA を連 結 す る す る こ とが で き る
。 また、 プ ロモ ー タや dsRNA の構 築 方 法 な どは、 自体 公 知 の 方 法 を適 用 す る こ
とが で き る。
[0023]
本 発 明 の新 規 抗 腫 瘍 剤 に有 効 成 分 と して 含 有 され る " 細 胞 周 期 依 存 性 の Rho
GAP を 阻 害
しう る物 質 " が、 当該 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP 1 1A
を コー ドす る遺 伝 子 に対 す る ア ンチ セ ンス オ リゴ ヌ ク レオ チ ド、 shRNA 、 s i
N
A 、 m i c r oRNA な
どの 核 酸 物 質 の 場 合 は、 当 該 核 酸 物 質 を作 用 さ せ た い 細 胞 内 に
導 入 す る こ とが 好 ま しい。 核 酸 物 質 の 導 入 手 法 と して は、 リポ フ エ ク シ ヨ ン
法 、 リン酸 カル シ ウ ム 法 、 エ レク トロボ 一 レシ ヨ ン、 ジ ー ン ガ ンな ど、 自体
公 知 の 方 法 、 或 い は 開 発 さ れ て い る遺 伝 子 導 入 技 術 を適 用 す る こ とが で き、
市 販 の 遺 伝 子 導 入 試 薬 又 は キ ッ トを利 用 す る こ とが で き る。 ま た 、 感 染 力 を
保 持 した ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 を 用 い た dsRNA 発 現 べ ク タ 一 な どの 場 合 に は、 ウ イ
ル ス の 感 染 力 に よ り細 胞 にベ ク タ 一 を取 込 ませ る こ とが で き る。
[0024]
本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 に有 効 成 分 と して 含 有 さ れ る " 細 胞 周 期 依 存 性 の Rho
GAP を 阻 害
しう る物 質 " の うち 、 天 然 高 分 子 の 例 と して 抗 体 が 挙 げ られ る。 抗
体 は、 ポ リク ロ一 ナ ル 抗 体 で あ って も 良 い し、 モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 で あ って
も よ い。 抗 体 は、 自体 公 知 の 方 法 に よ り作 製 し、 得 る こ とが で き る。
[0025]
上 述 した 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 に よ り、 が ん 細 胞 の 可 動 性
浸 潤 能 が著 し
く低 下 し、 浸 潤 及 び / 又 は転 移 を抑 制 す る こ とが で き る。 従 って 本 発 明 は、
" 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " か らな る悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害
剤 及 び / 又 は浸 潤 阻害 剤 に も及ぶ 。
[0026]
本 発 明 の " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " を有 効 成 分 とす る
新 規 抗 腫 瘍 剤 が標 的 とす る が ん 細 胞 は、 特 に 限 定 さ れ な い が 、 当 該 細 胞 周 期
依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP 1 1A の 発 現 に よ り、 が ん 細 胞 の 転 移 や 浸 潤 が 誘
導 さ れ る可 能 性 の あ る が ん 細 胞 を挙 げ る こ とが で き る。 具 体 的 に は、 大 腸 が
ん や す い臓 が ん の 他 、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん 、 頭 頸 部 が ん 、 黒 色 腫 （メ ラ
ノー マ ） 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん 、 滕 臓 が ん 、 肝 細 胞 が ん 、 腎 細 胞 が ん
、 皮 膚 が ん 等 に 由 来 す る が ん 細 胞 を挙 げ る こ とが で き、 特 に 好 適 に は 大 腸 が
ん や す い臓 が ん が 挙 げ られ る。
[0027]
さ らに、 本 発 明 の " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " を有 効 成
分 とす る新 規 抗 腫 瘍 剤 は、 が ん が 組 織 に浸 潤 し固 有 筋 層 、 漿 膜 、 漿 膜 外 に達
す る T 2 、 3 、 4 ステ ー ジ
（U
ICC
の ΤΝΜ 分 類 に よ る ） の が ん に対 して よ り有 効
に作 用 しう る こ とが考 え られ る。 本 発 明 に お い て 治 療 標 的 で あ る ARHGAP 1 1Α な
どの RhoGAP が 、 T 2 、 3 、 4 ス テ ー ジ の が ん に お い て 上 昇 す る こ とが 明 らか
と な っ た か らで あ る。
[0028]
本 発 明 の " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " を有 効 成 分 と す る
新 規 抗 腫 瘍 剤 に は 、 本 成 分 に 必 要 に 応 じて 、 他 の 成 分 を 混 合 処 方 して も よ い
。 ま た 、 本 新 規 抗 腫 瘍 剤 も 公 知 の 製 剤 学 的 製 造 法 を 利 用 して 製 剤 化 す る こ と
が で き る。 有 効 成 分 に 応 じて 核 酸 製 剤 と して 、 ま た 低 分 子 化 合 物 製 剤 と して
製 剤 化 す る こ と が で き る。 製 剤 化 す る 場 合 は 、 例 え ば 、 薬 剤 と して 一 般 的 に
用 い られ る 媒 体 又 は 担 体 、 具 体 的 に は 、 滅 菌 水 や 生 理 食 塩 水 、 植 物 油 、 乳 化
剤 、 懸 濁 剤 、 界 面 活 性 剤 、 安 定 剤 な ど と適 宜 組 み 合 わ せ て 製 剤 化 す る こ と が
で き る。 従 っ て 本 発 明 は 、 本 発 明 の " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る
物 質 " を有 効 成 分 と す る新 規 抗 腫 瘍 剤 を 用 い る 悪 性 腫 瘍 の 治 療 及 び / 又 は 予
防方 法 に も及ぶ 。
[0029]
本 発 明 は 、 " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " を 選 別 す る こ と
を特 徴 と す る新 規 抗 腫 瘍 剤 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 に も 及 ぶ 。 本 明 細 書 に お け
る 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP の 代 表 例 と して は 、 上 述 した ご と くARHGAP1 1A が 挙
げ られ る。 具 体 的 に は 少 な く と も 以 下 の A ) ~ D ) の 工 程 を 含 む こ と を特 徴
と す る ス ク リー ニ ン グ方 法 に 及 ぶ 。 A ) の 工 程 及 び B ) の 工 程 は 、 い ず れ の
工 程 を 先 に 行 っ て も よ い し、 同 時 に 行 っ て も よ い 。 こ こ で 、 ス ク リー ニ ン グ
に よ っ て 選 別 さ れ る候 補 物 質 と して は 、 核 酸 物 質 、 低 分 子 化 合 物 又 は 天 然 高
分 子 を 上 げ る こ と が で き る。 具 体 的 に は 、 当 該 ARHGAP1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子
に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リゴ ヌ ク レオ チ ド、 shRNA 、 s i RNA 、
i croRNA,
転写
産 物 若 し くは翻 訳 産 物 に結 合 し得 る低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 等 が 挙 げ られ
る。 天 然 高 分 子 の 例 と して 、 抗 体 が 挙 げ られ る。 抗 体 は 、 ポ リク ロ 一 ナ ル 抗
体 で あ っ て も 良 い し、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 で あ っ て も よ い 。 抗 体 は 、 自体 公
知 の 方 法 に よ り作 製 し、 得 る こ と が で き る。
[0030]
A ) 候 補 物 質 を が ん 細 胞 株 と共 に 培 養 し、 該 細 胞 に お け る 細 胞 周 期 依 存 性 の
特 定 の RhoGAP ( 例 え ば 、 ARHGAP1 1A) を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 を 測 定 す る
工程 ；
B ) 対 照 の 系 で 同 手 法 に よ り測 定 さ れ た 特 定 の RhoGAP を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の
発 現 量 を測 定 す る工 程 ；
C ) 前 記 A ) 及 び B ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 特 定 の RhoGAP を コ ー ドす る 遺
伝 子 の 発 現 量 と、 比 較 す る 工 程 ；
D)
A ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 量 が 、 B ) の 工 程 に よ り測 定
され た 遺 伝 子 の 発 現 量 に比 べ て低 い場 合 の候 補 物 質 を選 別 す る工 程 。
[0031 ]
上 記 ス ク リー ニ ン グ方 法 の 工 程 B ) で は 、 候 補 物 質 を 含 ま な い 系 で が ん 細
胞 を 培 養 し、 工 程 A )
と 同 手 法 に よ り測 定 さ れ た 特 定 の RhoGAP を コ ー ドす る
遺 伝 子 の 発 現 量 を 測 定 す る 工 程 を い う。 上 記 工 程 A ) 及 び 工 程 B ) で 使 用 し
う る が ん 細 胞 は 、 特 定 の RhoGAP ( 例 え ば 、 ARHGAP1 1A) を 発 現 しう る 細 胞 で あ
れ ば よ く、 特 に 限 定 さ れ な い が 、 例 え ば 大 腸 が ん や す い 臓 が ん 、 前 立 腺 が ん
細 胞 、 乳 が ん 、 頭 頸 部 が ん 、 黒 色 腫 （メ ラ ノ ー マ ） 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳
が ん、 滕 臓 が ん、 肝 細 胞 が ん、 腎 細 胞 が ん、 皮 膚 が ん 等 に 由来 す る細 胞 株 が
挙 げ られ 、 好 ま し くは 大 腸 が ん 又 は す い 臓 が ん が 挙 げ られ る。 特 に具 体 的 に
は 、 大 腸 が ん 細 胞 株 で あ る HCT1 16 を 用 い る の が 最 も 好 適 で あ る。
[0032]
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 の
確 認 は 、 リア ル タ イ ム RT-PCR 法 、 ノ ー ザ ン プ ロ ッテ ィ ン グ、 ウ ェ ス タ ン プ ロ
ッテ ィ ン グ、 免 疫 染 色 等 の 自体 公 知 の 手 法 や 今 後 開 発 さ れ る新 た な 手 法 に よ
る こ と が で き る。
[0033]
本 発 明 は 、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP1 1A を コ ー ド
す る 遺 伝 子 の 発 現 量 を 定 量 す る こ と を特 徴 と す る 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 に も 及
ぶ 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP と して は 、 ARHGAP1 1A が 挙 げ られ る。 遺 伝 子 の 発
現 量 は 、 マ イ ク ロ ア レイ 法 、 リア ル タ イ ム 叮 -PCR 法 、 ノ ー ザ ン プ ロ ッテ ィ ン
グ、 ウ ェ ス タ ン プ ロ ッテ ィ ン グ、 免 疫 染 色 等 の 自体 公 知 の 手 法 や 今 後 開 発 さ
れ る新 た な 手 法 に よ る こ と が で き る。
[0034]
本 発 明 に お い て 生 体 検 体 と は 、 上 記 タ ンパ ク 質 を検 出 可 能 性 な 生 体 検 体 で
あ れ ば よ く、 特 に制 限 さ れ な い 。 例 え ば 組 織 、 血 漿 、 血 清 等 の 血 液 、 脊 髄 液
、 リ ンパ 液 、 尿 、 涙 、 乳 等 が 広 く例 示 さ れ 、 好 適 な 生 体 検 体 と して は 、 組 織
が 挙 げ られ る。 組 織 は 、 例 え ば 摘 出 病 変 組 織 、 バ イ オ プ シ ー 、 ま た は CTC ( C i
r c u La t i ng t umo r c e L L)
等 に よ り取 得 す る こ とが で きる。 後 述 の実 施 例 で も
示 す よ うに、 例 え ば大腸 が ん摘 出手 術 を施 行 した 患者 につ い て、 ARHGAP 1 1A の
発 現 が平 均 よ り低 い患者 群 と高 い患者 群 で の、 無 再 発 生存 期 間 を確 認 した と
こ ろ、 ARHGAP 1 1A の発 現 が低 い患者 群 の ほ うが、 有 意 に無 再 発 生存 率 が低 い こ
とが確 認 され た （図 1 0 ) 。 この よ うに、 ARHGAP 1 1A が発 現 す る と考 え られ る
悪 性 腫 瘍 、 例 え ば大腸 が ん や す い臓 が ん、 前 立 腺 が ん細 胞 、 乳 が ん、 頭 頸 部
が ん、 黒 色 腫 （メ ラ ノ一 マ ）、 卵 巣 が ん、 肺 が ん、 脳 が ん、 滕 臓 が ん、 肝 細
胞 が ん、 腎細 胞 が ん、 皮 膚 が ん か ら選 択 され る一種 又 は複 数 種 につ い て、 本
発 明 の検 査 方 法 に よ り、 が ん の進 行 度 予 測 や 予後 予 測 を行 う こ とが で きる。
実施 例
[0035]
以 下 に、 本 発 明 を完成 させ るた め に行 な った実 験 結 果 を参 考 例 と して示 し
、 実 施 例 に お い て本 発 明 を さ らに具 体 的 に説 明 す るが、 本 発 明 は これ らに限
定 され る もの で は な く、 本 発 明 の技 術 的思 想 を逸 脱 しな い範 囲 内 で種 々の応
用 が可 能 で あ る。
[0036]
(参 考 例 1 ) 細 胞 周 期 の確 認
まず は じめ に、 外 科 的 に切 除 され た 大腸 が ん組 織 Gem i n i n ( 細 胞 周 期 ：S/G2
/ Mステ ー ジ） に分 類
され る細 胞 を抗 Gem i n i n (S/G2/M)
ポ リク ロ一 ナル 抗 体 を
用 い て組 織 免 疫 染 色 法 に よ り染 色 した と こ ろ、 非 が ん部 位 （A ) 、 が ん細 胞
浸 潤 先 端 部 位 （B ) 及 び が ん 中心 部 位 （C ) につ い て確 認 した。 そ の結 果 、
( B )
の部 位 で Gem i n i n が最 も強 く染 色 され、 S/G2/M 期 の細 胞 が ん細 胞 浸 潤 先
端 部 位 に多 く存 在 す る こ とが確 認 され た （
図 1) 。
[0037]
(参 考 例 2 ) 運 動 型 細 胞 の解 析
が ん組 織 の 生 体 イ メー ジ ン グ実 験 系 を用 い て、 HCT 1 16 ( ヒ 卜大腸 が ん細 胞
株 ） が 正 常 組 織 に浸 潤 して い く様 子 を リアル タ イ ム で解 析 した。 S/G2/M とG1
の細 胞 を分 取 して マ イ ク ロア レイ解 析 を行 う こ とに よ り、 細 胞 周 期 に依 存 す
る遺 伝 子 を抽 出 し、 そ の 中 で可 動 性 に関連 す るARHGAP 1 1A が S/G2/M 期 の細 胞 に
高 発 現 して い る こ とを初 め て 見 出 した。
[0038]
N0D/SC I D マ ウス の盲 腸 又 は皮 下 に、 蛍 光
プ ロ一 プ
（F
ucc i
：F l u o r escen t Ub
i q u i t i nat
HCT 1 1 6
G2/M
i on-based
C e L L Cyc Le
I n d i cat
or)
で 表 現 さ れ た HCT 1 1 6 を 移 植 し、
の 細 胞 周 期 進 行 を 可 視 化 した 。 F ucc i は G 1 期 の 核 を 赤 色
（mK02)
に 、 S/
期 の 核 を 緑 色 （mAG) に 光 ら せ た 。 G 1 期 の 可 視 化 に は 、 Cd t 1 タ ン パ ク 質 の 一
部 を 、 S/G2/M
期 の 可 視 化 に は 、 Gem i n i n タ ン パ ク 質 の 一 部 を 用 い た 。 F ucc i を
表 現 す る 細 胞 は 、 FACSA r i a I I (BD バ イ オ サ イ エ ン ス 社 ）に よ り、 S/G2/M
期 の細
胞 を 表 現 す る mAG と G 1 期 の 細 胞 を 表 現 す る mK02 に 分 離 さ れ た 。 F ucc i を 恒 常 的
に発 現 させ る こ とで 安 定 に細 胞 周 期 を可 視 化 す る こ とが で き る。 そ の結 果 、 H
CT 1 1 6
で は S/G2/M
期 の 細 胞 が 多 く移 動 す る こ と が 確 認 さ れ た
ラ ッ キ ン グ 速 度 を 確 認 した 結 果 、 S/G2/M
（図 2 )
。細胞 卜
期 の 細 胞 の ほ う が G 1期 の 細 胞 に 比 べ
て 平 均 移 動 距 離 が 大 き く、 可 動 性 の あ る 細 胞 で あ る こ と が 確 認 さ れ た
（図 3
)
次 に 、 cDNA に よ る マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い て 、 S/G2/M
[0039]
期 の 細 胞 及 び G 1期 の 細
胞 に 発 現 して い る mRNA を 解 析 した 。 マ イ ク ロ ア レ イ 分 析 で は 、 2 倍 以 上 上 昇 し
統 計 学 的 に 有 意 な 1 656 遺 伝 子 が 抽 出 さ れ た
で あ る ARHGAP 1 1A が S/G2/M
(参 考 例 3 )
。 そ の 結 果 、 特 に RhoGAP
期 の 細 胞 に 強 く発 現 して い る こ と が 、 遺 伝 子 レベ ル
及 び タ ン パ ク 質 レベ ル で 確 認 さ れ た
[0040]
（表 1 )
（表 1 、 図 4 )
。
細 胞 周 期 依 存 性 転 写 因 子 E2F に よ る ARHGAP 1 1A の 発 現 制 御 に つ い
て
E2F
フ ァ ミ リ一 は 、 細 胞 周 期 依 存 性 の 転 写 調 節 因 子 で あ る こ と が 知 られ て い
る 。 ARHGAP 1 1A (ch r 1 5 : 3290769
63-3290767
1)
1)
の 転 写 開 始 部 位 か ら- 20-28b
(ch
r 15 :
329076
の 部 位 に E2Fs が 結 合 す る 配 列 が あ る こ と に 気 づ き 、 ARHGAP 1 1A の
発 現 は 、 細 胞 周 期 依 存 性 の 転 写 因 子 で あ る E2F に よ っ て 制 御 さ れ て い る こ と を
、 ル シ フ ェ ラ 一 ゼ レポ 一 タ 一 ア ツ セ ィ
(Ch I P )
（図 5 A )
及 び ク ロ マ チ ン免 疫 沈 降 法
に よ り確 認 した 。 ARHGAP 1 1A の 発 現 を 阻 害 す る と 、 が ん 細 胞 の 遊 走 -
浸 潤 能 が 低 下 す る こ と が 確 認 さ れ 、 治 療 標 的 と して 有 望 で あ る こ と が 示 さ れ
た
[0041
]
（図 5 B )
。
[ 表 1]
Rho
(参 考 例 4 )
GAPs
対 象 とな る疾 患 に つ い て
本 参 考 例 で は 、 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 が 標 的 と す る が ん 細 胞 を 確 認 した 。
即 ち ARHGAP 1 1 A が 発 現 す る こ と で 、 転 移 や 浸 潤 が 誘 導 さ れ る 可 能 性 の あ る が ん
細 胞 が 、 本 発 明 の ARHGAP 1 1 A を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効 成 分 と す る 新 規 抗 腫 瘍 剤
が 標 的 と す る が ん 細 胞 で あ る と 考 え ら れ た 。 ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞
ヒ 卜肝 臓 が ん 細 胞
La s t s
：HLF )
HGAP 1 1 A
、 リ ンパ 管 線 維 芽 細 胞
(HepG2)
、 ヒ 卜滕 臓 腺 が ん 細 胞
（PSN 1 、 M i aPaca2
(Human
Lymphat
、 Pane
の 発 現 を 定 量 的 リ ア ル タ ィ 厶 PCR の 方 法 で 確 認 し た 。
部 コ ン ト ロ ー ル と し、
（HCT 1 1 6 )
l )
i c
、
F i b rob
に つ い て 、 AR
ァ クチ ンを内
ァ ク チ ン の 発 現 量 を 1 と した と き の 相 対 値 を 示 した
。 そ の 結 果 、 ARHGAP 1 1 A の 発 現 を 認 め た ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 や ヒ 卜滕 臓 腺 が ん 細
胞 に由来 す るが ん細胞
た
（図 6 )
（HCT 1 1 6 、 PSN 1 )
に お い て ARHGAP 1 1 A の 発 現 が 認 め ら れ
。 よ っ て 、 こ れ ら の が ん 細 胞 に 対 して 、 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 が
有 効 に 作 用 し う る と考 え られ る 。
ま た 、 GeneNo
t e
の GeneCa
rds
I D : GC 1 5P032907
を 参 照 した と こ ろ 、 マ イ ク ロ ア
レ イ に よ る ARHGAP 1 1 A 発 現 が 、 大 腸 が ん 、 す い 臓 が ん 、 前 立 腺 が ん 、 乳 が ん 、
頭頸 部 が ん、 黒 色腫
（メ ラ ノ 一 マ ） 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん 、 滕 臓 が ん
、 肝 細胞 が ん、 腎細胞 が ん、 皮膚 が ん等 に由来 す る各 が ん細胞 にお いて認 め
ら れ て お り、 こ れ ら の が ん 細 胞 に 対 して 、 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 が 有 効 に 作
用 し う る と 考 え ら れ る 。 な お 、 GeneNo
t e
の GeneCa
rds
I D : GC 1 5P032907
で は、 各
が ん 細 胞 に お い て 発 現 が 認 め ら れ た こ と が 掲 載 さ れ て い る の み で あ り 、 ARHGA
P 1 1Aの 発 現
に よ る が ん 細 胞 に 及 ぼ す 影 響 や 、 ARHGAP1 1A を 阻 害 す る 場 合 の 効 果
に つ い て は 一 切 言 及 され て い な い。
[0043]
( 実 施 例 1 ) ARHGAP1 1A 阻 害 作 用 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 の 確 認
本 実 施 例 で は 、 細 胞 周 期 依 存 性 RhoGAP の う ち ARHGAP1 1A の 機 能 を確 認 し、 本
発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 の 効 果 を確 認 した 。 以 下 の 配 列 番 号 1 又 は 2 に 示 す 塩 基
配 列 か らな る 2 種 類 の shRNA(SH) を 含 む レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 を 作 製 し、 HC
T 1 16
( ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 株 ） に 各 々 を導 入 し、 ARHGAP1 1A 発 現 阻 害 株 （
SH#1 、
SH#2) を構 築 した 。 コ ン トロ ー ル と して 、 以 下 の 配 列 番 号 3 に 示 す 塩 基 配 列
か らな る 才 リゴ ヌ ク レオ チ ドを 含 む レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 を 作 製 し、 同 手
法 に よ りHCT1 16 に導 入 した 。 そ れ ぞ れ の ARHGAP1 1A 発 現 阻 害 株 （
SH#1 、 SH#2)
に つ い て 、 細 胞 増 殖 能 及 び 細 胞 浸 潤 を確 認 した 。
[0044]
細 胞 増 殖 に つ い て は 、 標 識 DNA の 前 駆 物 質 （
5- プ ロ モ -2' - デ 才 キ シ ゥ リジ ン
：
BrdU)
を 細 胞 に 添 加 し、 細 胞 周 期 （
複 製 ） の S期 に お け る、 ゲ ノ ム DNA へ の そ
れ らの 取 込 み を、 定 量 化 した も の に つ い て 分 析 を 行 うB rdU 増 殖 分 析 法 に よ り
分 析 した 。 が ん 細 胞 浸 潤 ア ツセ ィ は 、 BD B i oCoat  マ トリゲ ル イ ンべ 一 ジ ョ
ン チ ャ ンバ 一 を 用 い 、 取 扱 説 明 書 の 方 法 に従 い 行 っ た 。 そ の 結 果 、 細 胞 増 殖
能 に つ い て は コ ン トロ ー ル と の 違 い は 認 め られ な か っ た （図 7 A ) 。 細 胞 浸
潤 能 は 、 コ ン トロ ー ル に 比 べ て ARHGAP1 1A 発 現 阻 害 株 （
SH#1 、 SH#2) の ほ う に
低 い 値 が 認 め られ た （図 7 B ) 。 よ っ て 、 ARHGAP1 1A 発 現 阻 害 株 で 浸 潤 が 抑 制
さ れ る こ と が 観 察 さ れ た （図 7 A ， B ) 。 以 上 の こ と か ら、 ARHGAP1 1A を 阻 害
す る 杭 が ん 治 療 は 、 ヒ 卜の 大 腸 が ん の 浸 潤 を抑 制 す る 画 期 的 な 治 療 法 で あ と
考 え られ 、 今 後 の 創 薬 開 発 が 強 く期 待 さ れ る。
[0045]
ARHGAP1 1A に 対 す る shRNA 及 び コ ン トロ ー ル の DNA 配 列 は 以 下 の と お りで あ る
shRNA target
1 ) ARHGAP1 1A
：Sequence St rand
(5 - 3 )
# 1 (TRCN0000047281 ) ：CCGGCGGTATCAGTTCACATCGATACTCGAGTA
TCGATGTGAACTGATACCGTTTTTG ( 配 列 番 号 1 )
2 ) ARHGAP1 1A
#2 (TRCN0000047282)
：CCGGCCTTCTATTACACCTCAAGAACTCGAGTT
(配 列 番 号 2 )
CTTGAGGTGTAATAGAAGGTTTTTG
コ ン ト口 一 ル
3 )
： CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCT
(配 列 番 号 3 )
TCATCTTGTTGTTTTT
[0046]
（SHC002)
( 実 施 例 2 ) ARHGAP 1 1A 阻 害 作 用 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 の 確 認
本 実 施 例 で は 、 i n v i v o で の ARHGAP 1 1A 阻 害 作 用 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 を 確 認 し
た。
免疫 不全 マ ウス
（N0D/SC ID)
に 、 レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 を 導 入 して い な
い 野 生 株 の HCT 1 1 6 を 1 X l 0 6 c e L L局 注 し、 移 植 した 。
そ の 後 、 実 施 例 1 で 作 製 した 配 列 番 号 1 又 は 2 に 示 す 塩 基 配 列 か ら な る shR
NA (SH)
を含 む レンチ ウィル スベ ク タ一
入 キ ッ トで あ る A t e LoGene
群 と して 、
RNA
（a)
(R)
(Koken)
（SH# 1 、
又 は SH#2)
を 用 い て 局 注 した
をin
（s i RNA
i
s i RNA 導
o
投与群 ）。 対照
実 施 例 1 で 作 製 した 配 列 番 号 3 か ら な る 塩 基 配 列 か ら な る s h
を含 む レンチ ウイ スル ベ ク タ一
（コ ン トロ ー ル shRNA 群 ） 又 は
組 換 え して い な い レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 1 を A t e LoGene ( R) (Koken)
上 記 の 如 く導 入 した
（遺 伝 子 導 入 試 薬 コ ン ト ロ ー ル 群 ） さ ら に 、
ウ ィ ル ス を 局 注 して い な い 系
（b)
遺伝子
を用 いて
（c)
レンチ
（コ ン トロ ー ル 群 ） に つ い て も 対 照 と した 。 移
植 4 週 間 経 過 後 の 腫 瘍 細 胞 の 拡 大 を 、 腫 瘍 サ イ ズ の 大 き さ で 確 認 した 。 ARHGA
P 1 1A
に 対 す る shRNA を 腫 瘍 に 投 与 す る と 、 腫 瘍 の 拡 大 を 有 意 に 抑 制 す る こ と が
で きた
[0047]
（図 8 ) 。
( 実 施 例 3 ) ARHGAP 1 1A の 発 現 と 大 腸 が ん 患 病 期 分 類 と の 関 係
大 腸 が ん 摘 出 手 術 を 施 行 した 患 者 に つ い て 、 手 術 標 本 よ り が ん 組 織 部 位 を
レ一 ザ 一 マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン法
( Lase r
m i c r o d i ssec
t i on)
に て 分 取 し、
こ れ よ り mRNA を 分 離 して ARHGAP 1 1A の 発 現 を マ イ ク ロ ア レ イ 法 に て 確 認 した 。
大 腸 が ん 及 び 正 常 大 腸 粘 膜 の 手 術 切 除 標 本 に つ い て 比 較 す る と、 が ん 部 位 で A
RHGAP 1 1A の
発 現 が 上 昇 して お り、 さ ら に 大 腸 が ん の 病 期 分 類 に よ り ス テ ー ジ
が 進 行 す る に つ れ て 、 ARHGAP 1 1A の 発 現 が 上 昇 して い る こ と が 確 認 さ れ た 。 例
え ば 、 が ん が 組 織 に 浸 潤 し固 有 筋 層 に 達 す る T 1
比 較 して T 2 ， T 3 ,
T 4
( U ICC
の TNM 分 類 に よ る ） と
期 で 発 現 が 上 昇 す る こ と が 明 らか と な っ た
（図 9
)
(実 施 例 4 )
[0048]
が ん摘 出手 術 予後 予 測 検 査
大 腸 が ん 摘 出 手 術 を 施 行 した 患 者 に つ い て 、 が ん 摘 出 手 術
（根 治 的 手 術 ）
が 可 能 で あ っ た 症 例 に 対 して 、 高 発 現 群 と 低 発 現 群 に 分 類 し、 無 再 発 生 存 期
間 を 解 析 した 。 手 術 標 本 よ り が ん 組 織 部 位 を レ 一 ザ 一 マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ
ン法
（Lase r
1 1A の
発 現 を マ イ ク ロ ア レ イ 法 に て 確 認 した 。 そ の 結 果 、 ARHGAP 1 1A の 発 現 が
i c r o d i ssec
平 均 よ り低 い 患 者 群
に て 分 取 し、 こ れ よ り mRNA を 分 離 して ARHGAP
t i on)
（n=38)
と高 い 患 者 群
（n=26) で の 、 無 再 発 生 存 期 間 を 確
認 した と こ ろ 、 ARHGAP 1 1A が 低 い 患 者 群 の ほ う が 有 意 に 生 存 率 が 高 く、 高 発 現
群 で 予後 が悪 い事 が確 認 され た
（図 1 0 ) 。 こ れ に よ り、 ARHGAP 1 1A の 発 現 量
を 確 認 す る こ と で 、 が ん の 予 後 予 測 が 可 能 と考 え られ る 。 な お 実 施 例 3 及 び
4
の 内容 は、 国 立 大 学 法 人 九 州 大 学 の倫 理 委 員 会 の 了承 を得 、 同 大 学 の 生 体
防御 研 究 所 で な され た 試 験 結 果 に基 づ くも の で あ る。
( 実 施 例 5 ) ARHGAP 1 1A に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド （BNA)
[0049]
本 実 施 例 で は 、 人 工 核 酸 で あ る BNA を 含 む 3 5 種 類 の ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ
ク レ オ チ ド（ （以 下 、
「ア ン チ セ ン ス BNA 」 と い う 。 ） に つ い て 、 HCT 1 1 6
( ヒ
卜大 腸 が ん 細 胞 株 ） で の ARHGAP 1 1A に 対 す る 発 現 抑 制 効 果 を 確 認 した 。
ま ず は じめ に 、 以 下 配 列 番 号 4 ~
[0050]
ア ン チ セ ン ス BNA 及 び 配 列 番 号 3 9
3
8
に 示 す 塩 基 配 列 か らな る 3 5 種 類 の
に 示 す 塩 基 配 列 か らな る オ リゴ ヌ ク
4
レ オ チ ドを 作 製 した 。 ARHGAP 1 1A に は 、 GenBank
(バ リア ン 卜 1 )
又 は GenBank
Access
ion
No.
Access
NM
ion
1 99357.
No.
1
NM— 0 14783.
3
(バ リア ン 卜2 )
で 特 定 さ れ る 塩 基 配 列 か ら な る mRNA よ り 合 成 さ れ る ヒ 卜由 来 タ ン パ ク 質 が 挙
げ られ る 。 配 列 番 号 4 ~
2
3
で 特 定 さ れ る 各 ア ン チ セ ン ス BNA は 、 バ リ ア ン 卜
及 び バ リ ア ン 卜 2 の 共 通 配 列 部 分 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ
ド鎖 で あ り、 配 列 番 号 2 4 ~
3
3
で 特 定 さ れ る 各 ア ン チ セ ン ス BNA は 、 バ リ ア
ン 卜 1 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド鎖 で あ り、 配 列 番 号 3 4 ~
3
8
で 特 定 さ れ る 各 ア ン チ セ ン ス BNA は 、 バ リ ア ン 卜 2 に 対 す る ア ン チ セ ン ス
オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド鎖 で あ る 。
以 下 に 示 す 各 配 列 に お い て 、 N(l_) は 人 工 核 酸 BNA 、 5 は 5-mC ( メ チ ル シ トシ
ン） 、 5(1_) は L-mC ( メ チ ル 化 人 工 核 酸 BNA) 、 T(l_) は 人 工 核 酸 チ ミ ジ ン、 Τ ( Α)
は 人 工 核 酸 ア デ ニ ン を 示 す 。 こ こ で 使 用 す る ΒΝΑ は 、 株 式 会 社 ジ ー ンデ ザ イ ン
に よ り作 製 さ れ た も の で あ る。
ARHGAP--47- ΒΝΑ - 116 ：T(L)5(L)5(L)gcccccagcT(L)5(L)5(L)
(配 列番 号 4 )
t
ARHGAP-- 1 26- - ΒΝΑ -- 1 6 ：5(L)T(L)5(L)ccccatcag5(L)5(L)T(L)g
(配 列番 号 5 )
ARHGAP--203- - ΒΝΑ -- 1 6 ：5(L)T(L)5(L)aggcaactcT(L)T(L)5(L)c
(配 列番 号 6 )
ARHGAP--382- - ΒΝΑ -- 1 6 ：T(L)5(L)T(L)attgccagaT(L)T(L)5(L)
ARHGAP--406- - ΒΝΑ -- 1 6 ：5(L)T(L)T(L)
t
(配 列番 号 8 )
tctgattctT(L)T(L)5(L)g
ARHGAP--591 -- ΒΝΑ -- 1 6 ：5(L)5(L)5(L)gtctggcacT(L)T(L)5(L)
ARHGAP--625- - ΒΝΑ -- 1 6 ：5(L)T(L)5(L)aaatttgaa5(L)T(L)5(L)c
(配 列番 号 7 )
t
(配 列番 号 9 )
(配 列番 号 1 0
)
ARHGAP-720-BNA-1
6 ：T(L)5(L)T(L)gatcccacaT(L)T(L)5(L)c
(配 列番 号 1
6 ：T(L)T(L)T(L)
(配 列番 号
)
ARHGAP-843-BNA-1
taccccctaT(L)T(L)T(L)c
)
ARHGAP-969-BNA-1
6 ：T(L)5(L)5(L)gaaaaagcc5(L)T(L)T(L)c
(配 列番 号
3
)
6 ：T(L)T(L)5(L)
tttagtgctT(L)T(L)T(L)a
(配 列番 号
ARHGAP-1 162-BNA-1 6 ：T(L)T(L)T(L)
tcctctgtg5(L)5(L)T(L)a
(配 列番 号
ARHGAP-1 006-BNA-1
4 )
5 )
ARHGAP-1 344-BNA-1
6 ：T(L)5(L)T(L)
tttcatgtc5(L)T(L)T(L)
(配 列番 号
)
ARHGAP-1447-BNA-1
6 ：T(L)5(L)5(L)aggataaaaT(L)5(L)T(L)g
(配 列番 号
6 ：T(L)T(L)5(L)accaggagtT(L)T(L)5(L)a
(配 列番 号
7 )
ARHGAP-1 538-BNA-1
8 )
6
ε
ζ
( )
( )
歴)
( )
ΐ
( )
( )
( )
：9
-
N -0
-
d
Hy
( L
)
( )
( )
( )
( )
( )
(
)
：9
-
N -66
-
ε
Hy
(o ε
( )
)
( )
( )
( )
( )
：9 卜
( )
VN3-t78½-
ド
dv H V
( 6 Z
( )
( )
歴)
( )
( )
6
( )
( )
：9
-
N -8 .
-
d
Hy
( 8 Z
)
( )
( )
( )
( )
1
( )
：9 卜
( )
Ν3-^6
-
ド
dV H V
L Z
¾
)
1 (1)
上（
) S ( I) 上e
6
e
( l ) 上（
) 丄（
)丄
:
9 L-VNa-8083 -
dV Hy V
( 9 Z
)
( ) 丄（ ) 丄（，）S e
)
(
) ( ) (
(
)
)
666
( |) 丄（，）s (
( )
)
( )
(
)
|) s
：9 卜 誦
( )
( )
：9
)
( )
：9 卜
(
-8ZHAdV
L-VNa-
-
VN3-Z9
V
，
d
Hy
dV H
な -
V
(ε
)
6 ( |) 丄（，）s (
(
)
( )
|) 丄e oee o
e o ( ) 丄（，）丄（，）上
( )
(
)
(
)
( )
：
9 卜 VNa - 9ん
：9
- N -
- dV H V
-d
Hy
( L
)
(
)1(
) 5( ) 1
β οοβ ( η)
( η)
( η)
：9
-VNa-
6 L-dV0HyV
( 0
)
Z
(1)
丄（，）S (
l ) S e 6 e 6e 6
( |) s ( l) 丄（
)S
：9 卜 誦
- 6 サ8 ト
ぁ
隱
( 6
L
粜
Z.
歴)
( )
/ l 0 d f /X d
( )
( )
( )
S3
( )
( )
：9 卜 删
—8 サん 卜
dV H V
Ζ68
/
Ο
ARHGAPv1 -51 94-BNA-1
6 ：T(L)5(L)T(L)aacaaccaaT(L)5(L)T(L)
(配 列 番 号 3
3 )
ARHGAPv2-221
5-BNA-1
6 ：5(L)T(L)5(L)
(配 列 番 号
taacagtagT(L)A(L)T(L)g
3 4 )
ARHGAPv2-2285-BNA-1
6 ：T(L)5(L)T(L)agaacagtaA(L)A(L)T(L)
t
(配 列 番 号
6 ：T(L)T(L)5(L)aaacatgaa5(L)T(L)T(L)
t
(配 列 番 号
3 5 )
ARHGAPv2-2306-BNA-1
3 6 )
ARHGAPv2-2355-BNA-1
6 ：T(L)5(L)5(L)caattgttgA(L)T(L)A(L)g
(配 列 番 号
6 ：T(L)T(L)T(L)
(配 列 番 号
3 7 )
ARHGAPv2-2404-BNA-1
taacataagA(L)A(L)T(L)g
3 8 )
[0051 ]
ARHGAP-1 931 -BNA-1 6-cont1
：T(L) tT(L)gccT(L)gcaaT(L)
t
(配 列
：T(L) tgT(L)ccT(L)gcT(L)aat5(L)T(L)
t
(配 列
：T(L)5(L)T(L)caatgcctgT(L)T(L)T(L)
t
(配 列
t5(L)T(L)
番号 3 9 )
ARHGAP-1 931 -BNA-1 6-cont2
番号 4 0 )
ARHGAP-1 931 -BNA-1 6-cont3
番号 4
[0052]
)
上 記 各 配 列 か ら な る ア ン チ セ ン ス BNA を リポ フ エ ク タ ミ ン 試 薬 を 用 い て 各 々
HCT1 16 に 導 入 し、 ARHGAP1 1A の mRNA 発 現 抑 制 し う る ア ン チ セ ン ス BNA を qPCR 法
に て 確 認 した 。 GAPDH を 内 部 コ ン ト ロ ー ル と し、 GAPDH の 発 現 量 を 1 と した と
き の 相 対 値 を 示 した 。 そ の 結 果 、 配 列 番 号 1 0 、 1 3 、 1 6 、 1 7 、
9 、
2 1 、 2 2 、 3 0 、 3 4 、 3 5 ~ 3 8 に 示 す ア ン チ セ ン ス BNA が 、 効 果 的 に A R
HGAP1 1A の 発 現 を 抑 制 して い る こ と が 確 認 さ れ た
[0053]
（図 1 1 ) 。
( 実 施 例 6 ) 人 工 核 酸 を 含 む ア ン チ セ ン ス BNA に よ る ARHGAP1 1A の 発 現 抑 制 効
果 の確 認
本 実 施 例 で は 、 実 施 例 5 で ARHGAP1 1A の 発 現 抑 制 効 果 を 認 め た ア ン チ セ ン ス
BNA に つ い て 各 種 が ん 細 胞 で の ARHGAP1 1A 発 現 抑 制 効 果 を 確 認 した 。
ア ン チ セ ン ス BNA は 、 ARHGAP-625-BNA969-BNA1 6 )
16
(#969
16
( # 1447
16
( # 1344
：配 列 番 号
(#2032
：配 列 番 号 2 2 )
16
又
)
を 用 い た 。 コ ン ト ロ ー ル は 酉己
を用 い た。 また、 ア ンチ セ ンスB
t2
コ ン トロ ー ル と して の オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを 加 え な い も の を 野 生 型
と した 。 が ん 細 胞 は 、 DLD 1 ( ヒ 卜結 腸 腺 が ん 細 胞 株 ） 、 HT29
が ん 細 胞 株 ） 、 Pane l
4
16
：配 列 番 号 1 7 ) 、 ARHGAP- 1748-BNA-
列 番 号 4 0 に 示 す ARHGAP- 1 9 3 1-BNA- 1 6-con
)
：配 列 番 号 1 0 ) 、 ARHGAP-
：配 列 番 号 1 9 ) 、 ARHGAP- 1 9 3 1-BNA- 1 6 ( # 1 9 3 1 ：配 列 番 号 2
は ARHGAP-2032-BNA-
NA ゃ
(#625
：配 列 番 号 1 3 ) 、 ARHGAP- 1344-BNA-
、 ARHGAP- 1447-BNA-
( # 1748
16
（wt
( ヒ 卜結 腸 腺
( ヒ 卜滕 臓 腺 が ん 細 胞 株 ） 、 PSN 1 ( ヒ 卜滕 臓 腺 が ん ） の
種 類 の 各 種 が ん 細 胞 に つ い て 確 認 した 。
各 々 の ア ン チ セ ン ス BNA を 実 施 例 5 に 記 載 の 方 法 と 同 手 法 に よ り、 リポ フ エ
ク タ ミ ン試 薬 を 用 い て 各 が ん 細 胞 に 導 入 し、 ARHGAP 1 1A の 発 現 抑 制 効 果 を ゥ ェ
ス タ ン プ ロ ッテ イ ン グ に よ り確 認 した 。
そ の 結 果 、 各 細 胞 に お い て ア ン チ セ ン ス BNA に よ る ARHGAP 1 1A の 発 現 抑 制 が
認 め られ 、 特 に ARHGAP- 1748-BNA-
16
( # 1748
:
配列番号 1 9 )
に よ り強 い 発 現
抑 制 が 認 め られ た （図 1 2 ) 。
[0054]
(実施 例 7 )
ア ン チ セ ン ス BNA の 細 胞 内 へ の 取 り込 み 量 の 確 認 （i n v i t r o )
本 実 施 例 で は 、 F ITC 標 識 ア ン チ セ ン ス BNA (ARHGAP- 1748-BNA-
1 6 ：# 1748)
に つ い て 、 リポ フ エ ク タ ミ ン試 薬 を 用 い て HCT 1 1 6 内 へ の 取 り込 み 量 を 確 認 し
た 。 コ ン トロ ー ル と して は 、 実 施 例 1 で 作 製 した 配 列 番 号 4 0 か らな る 塩 基
配 列 か らな る 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを 使 用 した 。
そ の 結 果 、 ARHGAP- 1748-BNA-
16
を 導 入 した 細 胞 で は 、 ARHGAP 1 1A の 発 現 が 抑
制 さ れ る こ と が 確 認 さ れ た （図 1 3
( A )
)
。 ま た 、 ARHGAP- 1748-BNA-
細 胞 内 取 込 量 は コ ン トロ ー ル と 同 等 で あ っ た （図 1 3
[0055]
(実施 例 8 )
( B )
)
ア ン チ セ ン ス BNA の 腫 瘍 細 胞 増 殖 抑 制 効 果 の 確 認
本 実 施 例 で は 、 ア ン チ セ ン ス BNA (ARHGAP- 1748-BNAv i voでの抗腫瘍効
16
。
（i n
：# 1748)
果 を 確 認 した 。 免 疫 不 全 マ ウ ス （N0D/SC ID)
16 の
i vo)
による in
に実 施 例 2 と
同 手 法 に よ り、 野 生 株 の HCT 1 1 6 を 移 植 した の ち に 、 F ITC 標 識 ARHGAP- 1748- ΒΝΑ
- 16 を実 施 例 2
と同手 法 に よ りA t e LoGene
した。 ARHGAP- 1748-BNA-
(R)
(Koken)
を用 い て、 腫 瘍 周 囲 に局 注
16 の投 与 に よ り、 腫 瘍 の拡 大 を有 意 に抑 制 す る こ と
が確 認 され た （
図 1 4 ) 。 さ らに、 ARHGAP- 1748-BNA、 マ ウス の各 臓 器 （
脳 ：b r a i n
臓 ：k i dney,
胃 ：i n t e s t i ne)
16 の投 与 後 1 4
日 目に
肝 臓 ：いv e r 、 脾 臓 ：s p Leen 、 肺 ：Lung 、 腎
及 び腫 瘍 部 位 へ の F ITC 標 識 ARHGAP- 1748-BNA-
の取 り込 み を確 認 した。 そ の結 果 、 ARHGAP- 1748-BNA-
16
16 は腫 瘍 部 の み に到 達
し、 そ の他 の臓 器 に は到 達 して い な い こ とが確 認 され た （
図1 5 ) 。
[0056]
( 実 施 例 9 ) ア ン チ セ ン ス BNA の腫 瘍 転 移 抑 制 効 果 の確 認 （i n v i vo)
本 実 施 例 で は、 ア ンチ セ ンス BNA (ARHGAP- 1748-BNAv i v o で の悪 性 腫 瘍 細 胞 の転 移 抑 制 効 果 を確 認
16 ：# 1748)
した。 ル シ フ ェ ラ一 ゼ を コ一 ド
す る遺 伝 子 を含 む レンチ ウィル ス を作 製 し、 HT 1080
( ヒ 卜線 維 肉腫 細 胞 ） に
感 染 させ ル シ フ ェ ラ 一 ゼ遺 伝 子 を導 入 し、 ル シ フ ェ ラ 一 ゼ導 入 細 胞
Luc)
を作 製 した。 ヌー ドマ ウス に HT 1080/Luc
080/Luc
A 1 0mg/kg
による i n
（HT 1080/
を 5 X l 0 6 c e L L静 脈 注 射 した。 HT 1
注 射 後 14 日間経 過 後 に、 ァ ドリアマ イ シ ン 8mg/kg 又 は ア ンチ セ ン ス B N
を静 脈 注 射 した。 さ らに 7 日経 過 後 、 ル シ フ ェ リンを 150mg/kg 投 与
し、 HT 1080
/LUC
の肺 転 移 を発 光 ィ メ一 ジ ン グで確 認 した （
図 1 6 ) 。 そ の結
果 、 ア ドリアマ イ シ ン 投 与 群 （n=3) よ り ア ン チ セ ン ス BNA 投 与 群 （n=3) の 方
が腫 瘍 は小 さか った （
図 1 7 ) 。 また、 肺 の重 量 を測 定 した結 果 、 各 マ ウス
につ い て、 肺 の重 量 は ア ンチ セ ンス BNA 投 与 群 の ほ うが ァ ドリアマ イ シ ン投 与
群 に比 べ て軽 量 で あ った。 一 方 、 体 重 につ い て は両 群 に差 を認 め な か った （
図 1 8 ) 。 この こ とか ら、 ア ンチ セ ンス BNA 投 与 群 の ほ うが ア ドリアマ イ シ ン
投 与 群 に比 べ て腫 瘍 細 胞 の転 移 が抑 制 され て い る こ とが示 唆 され た。
産 業 上 の利 用可能 性
[0057]
以 上 詳 述 した よ うに、 本 発 明 の細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を阻害 しうる物 質
を有 効 成 分 と して含 有 す る新 規 抗 腫 瘍 剤 に よ り、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を
発 現 しうるが ん、 具 体 的 に はARHGAP 1 1A を発 現 しうるが ん、 例 え ば大腸 が ん、
す い臓 が ん、 前 立 腺 が ん細 胞 、 乳 が ん、 頭 頸 部 が ん、 黒 色 腫 （メ ラ ノ一 マ ）
、 卵 巣 が ん、 肺 が ん、 脳 が ん、 滕 臓 が ん、 肝 細 胞 が ん、 腎細 胞 が ん、 皮 膚 が
ん 等 に 由来 す る が ん 細 胞 等 に つ い て、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は転 移 が抑 制
さ れ る。 従 来 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 しう る 抗 腫 瘍 剤 で 有 効
な 薬 剤 は ほ と ん ど存 在 しな か っ た 。 が ん の 悪 性 化 に影 響 を 及 ぼ す 、 が ん 細 胞
の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 しう る 薬 剤 の 提 供 に よ り、 効 果 的 な が ん 治 療 が
で き、 有 用 で あ る。
さ ら に、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP1 1A の 発 現 を
、 例 え ば mRNA に よ り検 査 した 結 果 、 が ん の 進 行 度 （
病 期 ステ ー ジ分 類 ） や、
無 再 発 生 存 期 間 と の 関 係 で 有 意 な 違 い が 認 め られ た 。 こ の こ と か ら、 生 体 検
体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 定 量 す る こ と で 、 悪 性 腫 瘍 を検 査 す る こ と
が で き る。 さ ら に、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP の 発 現 、 例 え ば ARH
GAP1 1A の mRNA 量
に よれ ば、 悪 性 腫 瘍 の 進 行 度 （
病 期 ステ ー ジ分 類 ） や、 無 再
発 生 存 期 間 と の 関 係 で 有 意 な 違 い が 認 め られ る。 これ に よ り、 生 体 検 体 中 の
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP1 1A の 発 現 を 測 定 す る こ と で 、 が ん の
進 行 度 及 び / 又 は 予 後 の 予 測 が 可 能 と考 え られ 、 有 用 で あ る。
請 求 の範 囲
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効
成 分 と して 含 有 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 。
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し う る 物 質 が 、 A R
HGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 で あ る 、 請 求 項 1 に 記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 。
ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に 対 す
る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ド又 は RNA 干 渉 を 誘 導 す る 才 リ ゴ ヌ
ク レオ チ ドで あ り、 或 い は ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 転 写 産 物
若 し く は 翻 訳 産 物 に 結 合 し得 る 低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら選 択 さ
れ る い ず れ か で あ る請 求項 2 に記 載 の新 規 抗 腫 瘍 剤 。
ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 当 該 ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に
対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ っ て 、 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ
ドを 構 成 す る 塩 基 が 1 4 塩 基 〜 2 0 0 塩 基 で あ り、 当 該 塩 基 配 列 中 に
人 工 核 酸 を 少 な く と も 1 以 上 含 む こ と を特 徴 とす る請 求 項 3 に記 載 の
新規抗腫瘍剤。
ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドが 、 以 下 の 1 )
~
1 3 )
のいずれか
に 示 す 塩 基 配 列 を 含 む 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る 、 請 求 項 4 に 記 載 の
新規抗腫瘍剤 ：
)
ARHGAP-625-BNA-1
列番号 1 0 )
2 )
6 ：5(L)T(L)5(L)aaatttgaa5(L)T(L)5(L)c
(配
；
ARHGAP-969-BNA-1
6 ：T(L)5(L)5(L)gaaaaagcc5(L)T(L)T(L)c
(
配列番号 1 3 )
3 )
ARHGAP-1 344-BNA-1
列番号 1 6 )
4 )
5 )
6 ：T(L)5(L)5(L)aggataaaaT(L)5(L)T(L)g
(配
;
ARHGAP-1 748-BNA-1
配列番号 1 9 )
(配
tttcatgtc5(L)T(L)T(L)c
；
ARHGAP-1447-BNA-1
列番号 1 7 )
6 ：T(L)5(L)T(L)
6 ：5(L)T(L)T(L)gatggactt5(L)5(L)T(L)
t
(
6 ) ARHGAP-1 931 -BNA-1 6 ：T(L)T(L)T(L)gcctgcaatT(L)5(L)T(L)
列番号 2
)
t
(配
；
6 ：5(L)5(L)T(L)agattgaatT(L)T(L)5(L)a
7 ) ARHGAP-2032-BNA-1
(
配列番号 2 2 )
8 ) ARHGAPv1 -3484-BNA-1
配列番号 3 0 )
(
6 ：5(L)T(L)5(L)
(
；
9 ) ARHGAPv2-221
配列番号 3 4 )
6 ：T(L)T(L)5(L)gagggtaacT(L)5(L)5(L)a
5-BNA-1
taacagtagT(L)A(L)T(L)g
；
0 ) ARHGAPv2-2285-BNA-1
(配 列 番 号 3 5 )
6 ：T(L)T(L)5(L)aaacatgaa5(L)T(L)T(L)
t
；
) ARHGAPv2-2355-BNA-1
(配 列 番 号 3 7 )
t
；
) ARHGAPv2-2306-BNA-1
(配 列 番 号 3 6 )
6 ：T(L)5(L)T(L)agaacagtaA(L)A(L)T(L)
6 ：T(L)5(L)5(L)caattgttgA(L)T(L)A(L)g
；
3 ) ARHGAPv2-2404-BNA-1
6 ：T(L)T(L)T(L)
taacataagA(L)A(L)T(L)g
(配 列 番 号 3 8 ) 。
[ こ こ に お い て 、 N(
BNA)
[ 請 求 項 6]
、τ
は 人 工 核 酸 BNA 、 5 (l_) は L-mC
) は 人 工 核 酸 チ ミ ジ ン、 A (
(メチル化 人工核酸
は 人 工 核 酸 ア デ ニ ン を表 す 。 ]
ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 RNA 干 渉 を 誘 導 す る 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ
ドで あ っ て 、 以 下 の 1 4 ) 又 は 1 5 )
に示 す 塩 基 配 列 を含 む オ リゴ ヌ
ク レオ チ ドで あ る 、 請 求 項 3 に 記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 ：
4 ) ARHGAP1 1A
# 1 (TRCN0000047281
ACTCGAGTATCGATGTGAACTGATACCGTTTTTG
5 ) ARHGAP1 1A
# 2 (TRCN0000047282)
ACTCGAGTTCTTGAGGTGTAATAGAAGGTTTTTG
[ 請 求項 7]
) ：CCGGCGGTATCAGTTCACATCGAT
(配 列 番 号 1 )
；
：CCGGCCTTCTATTACACCTCAAGA
(配 列 番 号 2 ) 。
抗 腫 瘍 剤 が 、 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 作 用 及 び / 又 は 浸 潤 阻 害 作 用 を有 す
る こ と を特 徴 とす る、 請 求 項 1 ~ 6 の い ず れ か 1 項 に記 載 の 新 規 抗 腫
瘍剤。
[ 請 求 項 8]
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 を 阻 害 しう る物 質 を 選 別
す る こ と を特 徴 と す る新 規 抗 腫 瘍 剤 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 。
[ 請 求 項 9]
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 が 、 ARHGAP1 1A で あ る、
請 求 項 8 に 記 載 の ス ク リー ニ ン グ方 法 。
[ 請 求 項 10]
少 な く と も 以 下 の A ) ~ D ) の 工 程 を 含 む こ と を特 徴 と す る 請 求 項 9
に 記 載 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 ：
A ) 候 補 物 質 を が ん 細 胞 株 と共 に 培 養 し、 該 細 胞 に お け る ARHGAP1 1A
を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 を 測 定 す る 工 程 ；
B ) 対 照 の 系 で 同 手 法 に よ り測 定 さ れ た ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝
子 の 発 現 量 を測 定 す る工 程 ；
C ) 前 記 A ) 及 び B ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た ARHGAP1 1A を コ ー ドす
る 遺 伝 子 の 発 現 量 と、 比 較 す る 工 程 ；
D)
A ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 量 が 、 B ) の 工 程 に よ
り測 定 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 量 に 比 べ て 低 い 場 合 の 候 補 物 質 を 選 別 す る
工程。
[ 請 求 項 11]
生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 を 定 量 す る
こ と を特 徴 と す る 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。
[ 請 求 項 12]
細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 が 、 ARHGAP1 1A で あ る、
請 求 項 1 1 に記 載 の 悪 性 腫 瘍 の検 査 方 法 。
[ 請 求 項 13]
悪 性 腫 瘍 が、 大 腸 が ん や す い臓 が ん、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん、 頭 頸
部 が ん 、 黒 色 腫 （メ ラ ノ 一 マ ） 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん 、 滕 臓 が
ん 、 肝 細 胞 が ん 、 腎 細 胞 が ん 、 皮 膚 が ん か ら選 択 さ れ る 一 種 又 は 複 数
種 で あ る、 請 求 項 1 1 又 は 1 2 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。
[ 請 求 項 14]
悪 性 腫 瘍 の検 査 が、 が ん の進 行 度 及 び / 又 は予後 を予 測 す るた め の検
査 で あ る、 請 求 項 1 1 ~ 1 3 の い ず れ か 1 項 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査
方法。
INTERNATIONAL
A.
CLASSIFICATION
Ά 6 1 Κ 4 5/0
G01N33/1
Ά 61 Κ3 1 / 7 0 8 8 (2 0 0
0 (2 0 0 6 . 0 1 ) i ,
Ά 6 1 P35/0
5 (2 0 0 6 . 0 1 )
f
G01N33/5
According to International Patent Classification
B.
International application No.
REPORT
OF SUBJECT MATTER
0 (2 0 0 6 . 0 1 ) i ,
(2 0 0 6 . 0 1 ) i ,
SEARCH
1 ) i ,
C 1 2N1
0 (2 0 0
.
A 61K31
1 )
G01N33/5
f
Ά 61 Κ
/ 71 1 (2 0 0 6 . 0 1 ) i ,
. 01) i ,
/ 11 3 (2 0 1
C 1 2Q1 /68
{2 0 0
.
8/0
0
1 ) i ,
(2 0 0 6 . 0 1 ) i
7
(IPC) or t o both national classification and IPC
FIELDS SEARCHED
Minimum
documentation searched (classification
system followed by classification symbols)
A 6 1 K 4 5 / 0 0 , A 6 1K3 1 / 7 0 8 8 , A 6 1 K 3 1 / 7 1 1 , A 6 1 K 4 8 / 0 0 ,
C 1 2 Q1 / 6 8 , G0 1N3 3 / 1 5 , G0 1N3 3 / 5 0 , G0 1N3 3 / 5 7 4
Documentation
1922-1 996
1 971-2013
Koho
Electronic data base consulted during the international
Jitsuyo
Toroku
Shinan
Jitsuyo
DOCUMENTS
CONSIDERED
Category*
1996-2013
1994-2013
/ JME DPlu
s / J ST 7
8 0 ( JDreaml
Relevant t o claim No.
9 0 RhoGT P n i yoru
Sui
Gan Saibo
no
suru
Kento
,
3 , page s 9 t o 1 0 ,
, page
10, l ef t
1, 7/ 2- 4,
8- 10 / 5 , 6
B e s son , A . , e t a l . , Regulati
o n o f the
cyto s k e leton
： a n oncogeni
c funct
ion
f o r CDK
i nhibitor
s ? , Nature
Reviews
Cancer
, 2004 , Vo l .
4 , N o . 2 , p p . 9 4 8 - 9 5 5 , page
9 5 0 , l e f t c o lumn , 1 s t
t o 2 n d paragraphs
, Boxl
Further documents are listed in the continuation
*
Special categories of cited documents:
document defining the general state of the art which i s not considered
to b e of particular relevance
"E
earlier application
filing date
or patent but published on or after the international
document which may throw doubts on priority claim(s) or which i s
cited t o establish the publication
date of another citation or other
special reason (as specified)
document referring t o an oral disclosure, use, exhibnion
t o the international
February
,
2 0 13
(2
Japane
se
Facsimile No.
Form PCT/ISA/210
Patent
search
. 02 . 13 )
Name and mailing address of the ISA/
"
later document published after the international filing date or priority
date and not in conflict with the application but cited to understand
the principle or theory underlying tiie invention
"X"
document of particular relevance; the claimed invention cannot b e
considered novel or cannot b e considered t o involve an inventive
step when the document i s taken alone
"Y"
document of particular relevance; the claimed invention cannot b e
considered t o involve an inventive step when the document i s
combined with one or more other such documents, such combination
being obvious to a person skilled i n the art
"&"
document member of the same patent family
or other means
filing date but later than
Date of the actual completion of the international
Date of mailing of the international
0 5 March
Authorized
officer
Of f i c e
Telephone No.
(second sheet) (July 2009)
.- 4 , 7- 10 / 5 , 6
See patent family annex.
of Box C .
"A
"P"
l )
T O B E RELEVANT
T o shi yuki
KUSAMA e t a l . , " P I
RhoGT Pa s e S ogai
o 〇yo shita
Ten ' i Shi n u n Yokus e i n i Kan
S e i j i nbyo , 2 0 0 7 , v o l . 4 7 , n o .
summary , page
9 , l e f t column
column
, 2 n d paragraph
Y/A
25
Koho
Koho
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
X/Y / A
"O"
Toroku
Shinan
search (name of data base and, where practicable, search terms used)
MEDLINE / CAplu s / EMBASE / B IOS I S ( STN ) , JST Plus
REGI S TRY ( STN ) , GenBank/
E B L / DDB J / GeneS e q
L
C 1 2N1 5 / 1 1 3 ,
searched other than minimum documentation t o the extent that such documents are included in the fields searched
Jitsuyo
Shinan
Koho
Kokai
Jitsuyo
Shinan
C.
A 6 1 P3 5 / 0 0 ,
,
2013
search report
(05 . 03 . 13 )
INTERNATIONAL
SEARCH REPORT
International application No.
PCT / JP2 0 1 3 / 0 5 1 7 3 3
C (Continuation).
DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Category*
Relevant to claim No.
Y/ A
Homo sapi e n s Rho GT Pa s e activati
n g prote
i n 1 1A
(ARHGAP l lA) , tran s cript
vari ant
1 , mR
,
DATABASE NCBI Nucleot
ide
[ onl i n e ] acce s s ion
No . 丽
0 1 4 7 8 3 , 2 0 1 1 . 1 1 . 2 7 URL http
:/ /
w . ncbi .
nlm . nih . gov/ nucco r e / 1 9 7 3 3 3 7 1 6 ? s a t = 1 5 &s a t key=
63 2 2 65 9>
1- 4 , 7- 10/ 5 , 6
Y/ A
Homo sapi e n s Rho GT Pa s e activati
n g prote
i n 1 1A
(ARHGAP l lA) , tran s cript
vari ant
2 , mR
,
DATABASE NCBI Nucleot
ide
[ onl i n e ] acce s s ion
No . 丽
1 9 9 3 5 7 , 2 0 1 1 . 1 1 . 1 9 URL http
:/ /
w . ncbi .
nlm . nih . gov/ nucco r e / 4 0 7 8 8 0 1 7 ? s at=1 5 &satkey=
62 42 735>
1- 4 , 7- 10/ 5 , 6
X/A
WO
2008/ 111464 Al
(E i s a i R & D Management
Ltd . ) ,
1 8 Septembe
r 2008 (18 . 09 . 2008) ,
paragraph
s [ 0 00 8 ] t o [ 0 023 ]
page
64
& US 2 0 1 0 / 0 0 2 1 9 1 8 A l
& EP 2 13 62 0 9 A l
paragraph
s [ 0 00 8 ] t o [ 0 023 ]
page
64
Form PCT/ISA/2 10 (continuation of second sheet) (July 2009)
Co . ,
8- 1 0/ 1- 7
INTERNATIONAL
Box No. I I
Observations
This international
where
SEARCH
certain
claims were found
Claims Nos.:
ext
unsearchable
(Continuation
r a
application
of item 2 of first
search report has not been established in respect o f certain claims under Article
No.
sheet)
17(2)(a) for the following
reasons:
1 1- 14
because they relate t o subject matter not required
(Se e
International
REPORT
sheet
t o b e searched b y this Authority,
namely:
)
Claims Nos.:
because they relate t o parts of the international application that do not comply with the prescribed
extent that n o meaningful international
search can b e carried out, specifically:
requirements
t o such an
Claims Nos.:
because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences o f Rule 6.4(a).
Box No. Ill
Observations
This International
. □
where
Searching Authority
A s all required
additional
unity
of invention
found multiple
i s lacking
inventions
search fees were timely
(Continuation
of item 3 of first
i n this international
paid by the applicant,
application,
this international
sheet)
as follows:
search report covers all searchable
claims.
2. □
A s all searchable claims could b e searched without effort justifying
additional
fees, this Authority
did not invite payment of
additional fees.
3. □
A s only some o f the required additional
search fees were timely paid b y the applicant,
only those claims for which fees were paid, specifically
4. □
N o required
restricted
Remark
additional
search fees were timely paid b y the applicant.
t o the invention
on Protest
first mentioned
The additional
this international
search report covers
claims Nos.:
Consequently,
this international
search report i
in the claims; it i s covered b y claims Nos.:
search fees were accompanied
b y the applicant's
protest and, where applicable,
b y the applicant's
protest but the applicable
the
payment o f a protest fee.
The additional
search fees were accompanied
fee was not paid within
N o protest accompanied
Form PCT/ISA/210
(continuation
the time limit specified
in the invitation.
the payment of additional
o f first sheet ( 2 》（
July 2009)
search fees.
protest
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
Conti nuat ion
of Box No . ェエー1 of conti nuat ion
International application No.
of f i r st sheet (2 )
The i nventi on s i n claims 11 t o 14 i nclude invent ion s , wherei n " a medi cal
docto r " diagno ses a di s ea se on the basi s of obtained informati on , without
stati ng about the inevitable
udgment of the pre sence or ab sence of the
di s ea se using a spe ci f c examinat ion step or udgment criteria
or a step
for f or ecast ing the extent of the progre s s and progno si s of the di seas e The r ef or e , the se invent ions pe rtain t o di agno st i c methods t o be pract i ced
on the human body and , there fore , rel ate t o a subj ect matter whi ch thi s
I nternati onal Searchi ng Autho r i t y i s not requi red t o search .
Form PCT/ISA/210 (extra sheet) (July 2009)
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International application No.
Claims 1 t o 3 r elate t o " a nove l ant itumo r agent " whi ch compri se s ,
a s the active
ingredient
, a compound de fined by a des i red property
"a
sub stance capable o f inhibi t i ng a protei n wi t h RhoGT Pa se act ivity"
.
Although the se c l aims include any compounds havi ng the above prope rty ,
onl y an ant i sen se ol i gonucl eoti de t o a gene encodi ng ARHGAP l l A and an
shR
are exclu sive l y di sclo sed unde r the provi s ion o f Art i cle 5 o f the
PC . The r e f or e , i t appears that
the se claims are not supported
b y the
des cripti
on under the provi si on of Art i cle 6 o f the PC .
Even though the common techni cal knowl edge at the poi nt o f the
appl i cati on i s taken i nto cons der at on , i t cannot be recogni zed that
the scope o f compounds havi ng the above prope rty as " a sub stance capable
o f i nhibit ing a prote i n with RhoGT Pa se act ivity"
could b e speci fied .
Thu s , c l aims 1 t o 3 al so fai l t o sati s f y the requi rement of clearne s s
a s de f ned i n Art i cle 6 o f the PC .
Such being the cas e , the search wa s conducted
exclus ivel y on the
rel at ionship between " a protei n with RhoGTPas e act ivity"
or " ARHGAP l lA"
and " an ant itumor
agent " and the ant itumor
agent s whi ch compri se , as
the active
ingredient
, the compounds that are part i cul arly
stated
in
the des cripti
on and spe c i f ed i n claims
5 and 6 -
Form PCT/ISA/210 (extra sheet) (July 2009)
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
P C T /
J P 2 0 1 3 /
0 5 1 7 3 3
発 明 の 属 す る分 野 の 分 類 （
国 際 特 許 分 類 （I P C ) )
Int.Cl.
A61K45/00 (2006. 01) i , A61K31/7088 (2006. 01) i ，A61K31/71 1 (2006. 01) i ，A61K48/00 (2006. 01) i
A61P35/00 (2006. 01) i , C12N15/1 13 (2010. 01) i , C12Q1/68 (2006. 01) i , G01N33/15 (2006. 01) i ,
G01N33/50 (2006. 01) i ，G01N33/574 (2006. 01) i
B . — 調 査 を行 っ た分 野
調 査 を行 っ た 最 小 限資 料 （
国 際特 許 分 類 （I P C ) )
Int.Cl.
A61K45/00,
G01N33/574
A61K31/7088,
A61K31/71
1, A61K48/00,
A61P35/00,
C12N15/1 13, C12Q1/68,
G01N33/15,
G01N33/50
最 小 限 資 料 以 外 の 資 料 で調 査 を行 っ た 分 野 に含 ま れ る もの
日本 国 実 用 新 案 公 報
日本 国公 開 実 用 新 案 公 報
日本 国 実 用 新 案 登 録 公 報
1 9 2 2 — 1 9 9 6 年
1 9 7 1 — 2 0 1 3 年
日本 国 登 録 実 用 新 案 公 報
1 9 9 4
1 9 9 6 — 2 0 1 3 年
2 0 1 3 年
国 際調 査 で使 用 した電 子 デ ー タベ ー ス （
デ ー タベ ー ス の 名 称 、調 査 に使 用 した用 語 ）
MEDLINE/CAplus/EMBASE/BIOSIS
GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq
C .
(STN) ,
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580
(JDreaml l ) , REGISTRY (STN)
関連 す る と認 め られ る文 献
引用 文 献 の
カ テ ゴ リー *
引用 文 献 名
関連 す る
請 求 項 の番 号
及 び 一 部 の 箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の表 示
X/
草 間 俊 行 他 ， P190 RhoGTP に よ る RhoGTPase 阻 害 を応 用 した 瞵 が ん
1, 7/
Y/
細 胞 の転 移 浸 潤 抑 制 に 関す る検 討 ， 成 人 病 ， 2007 ， Vol. 47,
2—4 ，
8
A
pp. 9-10
No. 3 ,
要 旨、 第 9 頁 左 欄 、 第 10 頁 左 欄 第 2 段 落
Besson,
function
A. ，e t al. ，Regulation
for
CDK innibitors?,
o f the cytoskeleton
Nature
Reviews
1-4 ，7-10/
: a n oncogenic
Cancer,
5 ，6
2004,
Vol. 4 ， No. 2 ， pp. 948-955
第 950 頁 左 欄 第 1-2 段 落 、 Boxl
C 欄 の続 き に も 文 献 が列 挙 され て い るc
*
引用 文 献
ΓΑ 」特 に 関連 の あ る文 献 で は な く、一 般 的 技 術 水 準 を示 す
もの
ΓΕ 」国 際 出願 日前 の 出願 ま た は特 許 で あ るが 、国 際 出願 日
以 後 に公 表 され た も の
「L 」優 先 権 主 張 に疑 義 を提 起 す る文 献 又 は他 の 文 献 の発 行
日若 し く は 他 の 特 別 な 理 由 を確 立 す る た め に 引 用 す
る文 献 （
理 由 を付 す ）
Γθ 」 口頭 に よ る開 示 、使 用 、 展 示 等 に言 及 す る文 献
ΓΡ 」国 際 出願 日前 で 、か つ 優 先 権 の 主 張 の 基 礎 とな る 出願
2 5 .
0 2 .
出願 と矛 盾 す る もの で は な く、発 明 の原 理 又 は理 論
の 理 解 の た め に 引用 す る もの
「
X 」 特 に 関連 の あ る文 献 で あ っ て 、 当該 文 献 の み で発 明
の 新 規 性 又 は進 歩 性 が ない と考 え られ る も の
ΓΥ 」 特 に 関連 の あ る文 献 で あ っ て 、 当該 文 献 と他 の 1 以
上 の文 献 との 、 当業 者 に とっ て 自明 で あ る組 合 せ に
よ っ て進 歩 性 が な い と考 え
Γ& 」 同一 パ テ ン トフ ァ ミ リー 文 献
2 0 1 3
国 際調 査機 関 の名 称 及 び あ て 先
日本 国特 許 庁 （I S A
J Ρ )
郵便番 号 1 0 0 — 8 9 1 5
東 京 都 千 代 田 区 霞 が 関三 丁 目 4 番 3 号
l S A
の 日の 後 に公 表 され た 文 献
「
Τ 」 国 際 出願 日又 は優 先 日後 に公 表 され た文 献 で あ っ て
国 際調 査 報 告 の発 送 日
国 際調 査 を完 了 した 日
様式 P C T
パ テ ン トフ ァ ミ リー に 関す る別 紙 を参 照 。
2 1 0
0 5 .
0 3 .
4 C
特許 庁審 査官 （
権 限 の あ る職 員 ）
(第 2 ペ ー ジ） （2 0 0 9 年 7 月 ）
佐 々木
0 3 -
2 0 1 3
3 9 6 2
大輔
3 5 8 1 -
1 1 0
内線
3 4 5 2
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
C
(続 き)
P C
J P 2 0 1 3/
0 5 1 7 3 3
関 連 す る と認 め られ る文 献
引用 文 献 の
カ テ ゴ リー *
引用 文 献 名
Homo sapiens
transcript
URL<http
Rho GTPase
variant
accession
関連 す る
請 求 項 の番 号
及 び 一 部 の 箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の 表 示
activating
1 ， raRNA,
No. NM_014783,
：
//www, r c b .
protein
11A
(ARHGAPllA)
DATABASE NCBI Nucleotide
,
[online]
1-4
，7-10/
5 ，6
2011. 11. 2 7
m, n i h .
ov /
cco e/
9 7 3 3 3 716? s a t
5& s a
kev-6322659>
Homo sapiens
transcript
variant
accession
URL<http
Rho GTPase
activating
2 ， raRNA,
No. 丽 —199357
：
//www, ricbi .
，
protein
11A
(ARHGAPllA)
DATABASE NCBI Nucleotide
,
[online]
1-4
，7-10/
5 ，6
2011. 11. 19
m, n i h . gov/ nuccore/
407880
7?sa
5 & .satk
ey=6242735>
WO
2008/111464
ン ト株
Al
(エ ー ザ ィ · ア ー ノレ ·
式 会 社 ）2008. 09. 18 ， 段 落 【0008 】
US 2010/0021918
A l & EP 2136209
ド · デ ィー ' マ ネ ジ メ
段 落 【0023 】、第 6 4 頁 &
Al
段 落 【0008 】 一 段 落 【0023 】、 第 6 4 頁
様式 P C T
I SA
2 1 0
(第 2 ペ ー ジ の 続 き ） （2 0 0 9 年 7 月 ）
8-10/
1-7
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
第 Π欄
P C T /
J P 2 0 1 3/
0 5 1 7 3 3
請 求 の範 囲 の 一 部 の調 査 が で き ない とき の意 見 （
第 1 ペ ー ジ の 2 の続 き）
法 第 8条 第 3項 （P C T 17 条
（2)
(a) ) の 規 定 に よ り、 こ の 国 際 調 査 報 告 は 次 の 理 由 に よ り請 求 の 範 囲 の 一 部 に つ い て 作
成 しな か っ た。
1.
が 請求項
1 1
1 4
は 、 この 国 際調 査 機 関 が調 査 をす る こ とを要 しな い 対 象 に係 る もの で あ る。
つ ま り、
請求項 1 1
1 4 に係 る発 明 は 、 特 定 の 検 査 工 程 や 判 定 基 準 等 に よ り必 然 的 に 該 疾 患 の 有 無 を 判 定 す る
記 載 や 病 気 の進 行 度 · 予 後 を 予 測 す る 工 程 等 の 記 載 が な く、 「医 師 」が 得 られ た 情 報 か ら病 気 を 判 断 す る発
明 を含 ん で い る か ら、 ヒ トの 診 断 方 法 に 関 す る も の で あ っ て 、 こ の 国 際 調 査 機 関 が 国 際 調 査 を行 うこ と を
要 しな レ、
対 象 に係 る も の で あ る。
2 .
請求項
は 、有 意 義 な 国 際調 査 をす る こ とが で き る程 度 ま で所 定 の要 件 を満 た して い
ない 国 際 出願 の 部 分 に係 る もの で あ る。 つ ま り、
3 .
請求項
は 、従 属 請 求 の範 囲 で あ っ て P C T 規 則 6. 4 (a) の 第 2 文 及 び 第 3文 の 規 定 に
従 っ て記 載 され て い ない 。
第
欄
発 明 の 単 一 性 が欠 如 して い る とき の 意 見 （
第 1 ペ ー ジ の 3 の続 き）
次 に述 べ る よ うに こ の 国 際 出願 に二 以 上 の発 明 が あ る と こ の 国 際調 査 機 関 は認 め た。
1.
出願 人 が 必 要 な追 加 調 査 手 数 料 をす ベ て 期 間 内 に納 付 した の で 、 こ の 国 際調 査 報 告 は 、 す べ て の調 査 可 能 な請 求
項 につ い て作 成 した。
2 .
追 加 調 査 手 数 料 を要 求 す るま で も な く、 す べ て の調 査 可 能 な請 求 項 につ い て調 査 す る こ とが で き た の で 、追 加 調
查 手 数 料 の納 付 を求 め な か っ た。
3 .
出願 人 が必 要 な追加 調 査 手 数 料 を一 部 の み しか 期 間 内 に納 付 しな か っ た の で 、 この 国 際調 査 報 告 は 、 手 数 料 の納
付 の あ っ た次 の 請 求 項 の み につ い て 作 成 した。
4 .
出願 人 が 必 要 な追 加 調 査 手 数 料 を期 間 内 に納 付 しな か っ た の で 、 こ の 国 際調 査 報 告 は 、 請 求 の範 囲 の 最 初 に記 載
され て い る発 明 に係 る次 の 請 求 項 につ い て 作 成 した。
追 加 調 査 手 数 料 の 異 議 の 申立 て に 関す る注 意
□
追加 調 査 手 数 料 及 び 、該 当す る場 合 に は 、 異 議 申立 手 数 料 の納 付 と共 に 、 出願 人 か ら異 議 申立 て が あ っ た。
追加 調 査 手 数 料 の納 付 と共 に 出願 人 か ら異 議 申立 て が あ つ た が 、異 議 申立 手 数 料 が 納 付 命 令 書 に示 した期 間
内 に支 払 わ れ な か っ た。
追加 調 査 手 数 料 の納 付 は あ っ た が 、 異 議 申立 て は な か っ た。
様式 P C T
I SA
2 1 0
(第 1 ペ ー ジ の続 葉 （2 ) )
( 2 0 0 9 年 7 月）
国 際 出願 番 号
国 際調 査 報 告
請求項 1
P C T /
J P 2 0 1 3/
0 5 1 7 3 3
3 は 、 「RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し うる物 質 」 とい う所 望 の 性 質 に よ
り定 義 され た 化 合 物 を 有 効 成 分 とす る 「
新 規 抗 腫 瘍 剤 」 に 関 す る も の で あ る。 そ して 、該 請 求
項 は 、そ の よ うな 性 質 を 有 す る あ ら ゆ る化 合 物 を 包 含 す る も の で あ る が 、PCT 第 5 条 の 意 味
に お い て 開 示 され て い る の は 、 ARHGAP11A
を コ ー ドす る遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リ
ゴ ヌ ク レオ チ ド又 は shRNA
の み で あ り、 PCT
第 6 条 の 意 味 で の 明 細 書 の 開 示 に よ る裏 付 け
を 欠 く も の と認 め られ る。
ま た 、 「RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し うる物 質 」 は 、 出 願 時 の 技 術 常 識 を 勘 案 して
も そ の よ うな 性 質 を 有 す る化 合 物 の 範 囲 を 特 定 で き な い か ら、請 求 項 1
に お け る 明 確 性 の 要 件 も欠 い て い る。
3 は 、PCT 第 6 条
よ っ て 、 調 査 は 「RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 」 又 は 「ARHGAP11A 」 と 「
抗腫瘍剤 」 と
の 関 係 に つ い て 、及 び 、明 細 書 に 具 体 的 に 記 載 され 、請 求 項 5 、 6 に 特 定 され て い る化 合 物 を
有 効 成 分 とす る抗 腫 瘍 剤 に つ い て 行 っ た 。
式P C T
I SA
2 1 0
(特 別 ペー ジ）
（2 0 0 9 年 7 月 ）