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〇 V A (12) 特 許 協 力 条 約 に 基 づ い て 公 開 され た 国 際 出 願 c c (10) 国 際 公 開 番 号 (43) 国 際 公 開 曰 2013 年 8 月 1 日 (01.08.2013) (51) W 画P O 〒 5650871 大 阪 府 吹 田 巿 山 田 丘 1 番 1 号 国立 大 学 法 人 大 阪 大 学 内 Osaka (JP). 森 正 樹 (MORI, 〒 5650871 大 阪 府 吹 田 巿 山 田 丘 1 番 1 号 Masaki); 国立大学法 人大 大 学 内 O sa a (JP). 石 井 秀始 〒 5650871 大 阪 府 吹 田 巿 山 田 丘 1 (ISHII, Hideshi); 番 1 号 国 立 大 学 法 人 大 阪 大 学 内 Osaka (JP). 国際特 許分 類 : A61K 45/00 (2006.01) A61K 31/7088 A61K 31/711 A61K 48/00 A61P 35/00 C12N 15/113 C12Q 1/68 G01N 33/15 (2006.01) (2006.01) G01N 33/50 (2006.01) (2006.01) G01N 33/574 (2006.01) (2006.01) (2010.01) (2006.01) (2006.01) (21) 国際 出願 番 号 : (22) 国 際 出願 日: (25) 国際 出願 の 言 語 : 日本 語 (26) 国際公 開の言語 : 日本 語 (30) 優 先権 丁一 タ: 特 願 2012-015982 (71) PCT/JP2013/05 2013 年 i 月 28 W O 2013/111897 A 1 PCT 1733 (74) 代 理 人 :庄 司 隆,外 ( 〒 SHOJI, Takashi et al.); 532001 1 大 阪 府 大 阪 市 淀 川 区 西 中 島 五 丁 目 6 番 御 幸 ビル 3 0 7 号 Osaka (JP). 1 3 号 (81) 指定国 ( 表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 国 内 保 護 が 可 肯 ) : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, 日 (28.01 .2013) BB, 2012 年 1 月 27 曰 (27.01 .2012) BG, JP FI, GB, 出 願 人 :国 立 大 学 法 人 大 阪 大 学 (OSAKA UNIVER 〒 5650871 大 阪 府 吹 田 巿 山 田 丘 番 SITY) [JP/JP]; 1 号 Osaka (JP). BN, LS, LT, MY, GE, 発 明 者 :石 井 優 (ISHII, 〒 5650871 大 阪 Masaru); 府 吹 田巿 山 田丘 1 番 1 号 国立大学法 人大 阪大 学 内 Osaka JP ) . 賀 川 義 規 (KAGAWA, Yoshinori); PT, SM, GT, KN, MA, KP, MD, NG, BY, DM, GM, KM, LY, NA, BW, DK, GH, KG, LU, MZ, BR, CZ, DE, GD, IS, JP, KE, PL, (72) BH, CO, CR, CU, NI, ME, RO, RS, RU, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, VN, ZA, ZM, VC, HN, RW, HR, HU, LA, MK, OM, TR, CL, ID, CN, IL, LC, MN, PA, SC, SD, TN, CH, EC, EE, EG, ES, KZ, MG, NZ, CA, DZ, KR, NO, QA, US, UZ, BZ, DO, IN, LK, LR, MW, PE, MX, PG, PH, SE, SG, SK, TT, TZ, UA, SL, UG, ZW. [続 葉 有 ] (54) Title: NOVEL ANTITUMOR AGENT AND METHOD (54) 発 明 の 名 称 :新 規 抗 腫 瘍 剤 及 び そ の ス ク リ (57) FOR The present mechanism. substance capable The Rho o f the B y targeting controlled. present cc タ、 - ゆ l acid i s capable mechanism. i n that a substance i s selected ability the invasion cycle, and/or and/or an RhoGAP-encoding method i s preferred the invasion for screening o f inhibiting the cell method and/or a novel metastasis role in b y cancer o f cancer cells cycle-dependent antitumor a protein ability can b e RhoGAP, an oligonucleotide containing stability selecting a cell cycle-dependent activating an important gene, a novel ingredient, plays o f the high for with invasive A n oligonucleotide because a screening GTPase metastasis against etc. can b e cited. provides capable o n the cell agent a s the active Rho o f inhibiting o f suppressing This cycle-dependent depends antitumor comprises, capable a s BNA also a novel agent o f metastatic the RhoGAP, such invention novel a synthet thereoi. an antitumor o f cancer agent Rho cells e agent by a i s characterized GTPase activating thereby. 要 約 :本 発 明 は 、 新 規 メ カ ニ ズ ム に よ リ作 用 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 を 提 供 す る 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 (R o GT:RhoGAP ) を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効 成 分 と して 含 Pase activating protein 有 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 に よ る 。 RhoGAP は 細 胞 周 期 依 存 性 で あ リ、 が ん 細 胞 が 浸 潤 能 及 び/" 又 は 転 移 能 を 獲 得 す る 過 程 で 重 要 な 役 割 を 果 た す 。 RhoGAP を 標 的 と す る こ と で 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び/" 又 は 転 移 を 制 御 し う る 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 が 、 RhoGAP を コ ー ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド又 は RNA 干 渉 を 誘 導 す る オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドな ど が 挙 げ られ る 。 オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドに は 、 BNA な ど の 人 工 核 酸 を 含 む も の が 安 定 性 に 優 れ て お リ、 好 ま しい 。 本 発 明 は 、 さ ら に は 、 新 規 メ カ ニ ズ ム に よ る 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び/" 又 は 転 移 を 抑 制 し う る 抗 腫 瘍 剤 を 選 別 す る ス ク リ ン グ 方 法 を 提 供 す る 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し うる 物 質 を選 別 す る こ と を特 徴 とす る新 規 抗 腫 瘍 剤 の ス ク リ一 ニ ン グ 方 法 に よ る 。 (57) 屮 which interference, which protein a cell oligonucleotide RNA i c nucleic 八P , provides antitumor acquisition A s the substance an antisense inducing invention novel o f inhibiting (RhoGAP). cells. 浸 潤 ア ツセ ィ The the course SAME ング方法 Abstract: action SCREENING (84) 指定 国 ( 表 示 の な い 限 り、 全 て の 種 類 の 広 域 保 護 が 可 肯^: ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), ユ ー ラ シ ァ (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM), ョ一 ロ ッ / く (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, ΓΓ , LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). 添付 公 開書 類 : 一 一 国際調 査報 告 ( 条 約 第 2 1 条 (3)) 明 細 書 の 別 個 の 部 分 と して 表 した 配 列 リス ト (規 則 5.2(a)) 明 細 書 発 明 の 名 称 :新 規 抗 腫 瘍 剤 及 び そ の ス ク リー ニ ン グ方 法 技術分野 本 発 明 は、 細 胞 周 期 依 存 性 タ ンパ ク質 を標 的 と し、 新 規 な メ カ ニ ズ ム に よ [0001 ] り作 用 す る新 規 抗 腫 瘍 剤 に 関 す る。 さ らに は、 新 規 な メ カ ニ ズ ム に よ る が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は転 移 を抑 制 しう る抗 腫 瘍 剤 を選 別 す る ス ク リ一 ニ ン グ 方 法 に 関 す る。 [0002] 本 出願 は、 参 照 に よ り こ こ に援 用 さ れ る と こ ろの 日本 出願 特 願 2 0 1 2 _ 0 5 9 8 2 号 優 先 権 を請 求 す る。 背景技術 [0003] 細 胞 は増 殖 す る 時 に細 胞 周 期 と呼 ば れ る 一 定 の プ ロセ ス を経 る。 す な わ ち 、 細 胞 は G 1 期 (gapl ) → S期 (DNA synthes i s ) → G2 期 (gap2) → M期 ( i tos i s ) → G 1 期 と い う順 序 で 規 則 正 し く細 胞 周 期 を繰 り返 して 増 殖 して ゆ く。 細 胞 周 期 の 進 行 に と って ひ とつ の 重 要 な 時 期 が G 1 期 とS期 の 境 目 に存 在 す る。 そ の 時 期 は 哺 乳 動 物 培 養 細 胞 で は R点 (rest r i c t i o n po i nt) と呼 ば れ る。 一 旦 、 R 点 を通 過 す る と、 細 胞 周 期 は 進 行 す る よ う に方 向 づ け られ て 速 や か に S期 に進 入 し、 続 け て G2 期 、 M期 へ と進 ん で い って G 1 期 へ 戻 って くる。 細 胞 が 増 殖 しな い環 境 に あ る と き は、 S期 に進 ま ず に そ の ま ま G 1 期 に と ど ま る か 、 あ る い は 細 胞 周 期 か らは ず れ て 静 止 期 (rest i ng state; G0 期 ) と呼 ば れ る特 別 な 状 態 に 入 り休 止 状 態 とな る。 細 胞 の 置 か れ た 環 境 に よ って は、 分 化 、 老 化 、 ア ポ 卜 — シ ス、 減 数 分 裂 な どへ 進 む べ き シ グ ナ ル を 受 け取 る こ と も あ る が 、 そ れ ら の 状 態 へ の 分 岐 点 も現 在 の と こ ろ は この G1期 の R点 前 に存 在 す る と考 え られ て い る。 [0004] が ん 細 胞 は 細 胞 周 期 制 御 が 異 常 とな り、 周 りの 細 胞 か ら来 る分 裂 停 止 の シ グ ナ ル を無 視 して 増 殖 を続 け て ゆ く細 胞 で あ る。 が ん 細 胞 は 際 限 な く増 殖 し 、 浸潤 転 移 に よ りや が て 全 身 の 臓 器 の機 能 不 全 を も た ら し患 者 を死 に至 ら しめ る。 これ ま で 悪 性 腫 瘍 治 療 薬 と して は、 旧 来 よ り使 用 さ れ て い る抗 悪 性 腫 瘍 剤 や 、 が ん 細 胞 特 異 的 な 増 殖 シ グ ナ ル を抑 制 す る 分 子 標 的 薬 剤 な ど、 い ず れ も増 殖 性 の 高 い が ん 細 胞 を 障 害 す る も の で あ っ た 。 ま た 最 近 で は 、 悪 性 腫 瘍 組 織 周 囲 の 血 管 新 生 を抑 制 し、 代 謝 の 激 しい 悪 性 腫 瘍 組 織 へ の 補 給 路 を 断 つ 治 療 も あ る。 具 体 的 に は 、 乳 が ん に 発 現 す る HER2 を タ ー ゲ ッ トに した 卜 ラ ス ツ マ プ、 EGFR ( 上 皮 細 胞 増 殖 因 子 受 容 体 ) の キ ナ ー ゼ 活 性 を 阻 害 す る ゲ フ イチ 二 プ、 CML ( 慢 性 骨 髄 性 白血 病 ) の 染 色 体 転 座 に よ る、 Bcr-Ab Lキ メ ラ 遺 伝 子 の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 活 性 を 阻 害 す る メ シ ル 酸 ィ マ チ ニ プ、 B細 胞 リ ンパ 腫 の 特 異 的 CD20 抗 原 を 認 識 す る ツ キ シ マ プ、 AML ( 急 性 骨 髄 性 白血 病 細 胞 ) に 発 現 す る、 細 胞 表 面 抗 原 CD33 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 含 む リツ キ シ マ プ、 EGFR の チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 酵 素 を 阻 害 す る エ ル ロ チ ニ プ、 VEGF ( 血 管 内 皮 成 長 因 子 ) に 対 す る、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 か らな る バ べ シ ズ マ プ等 が 挙 げ ら れ る。 細 胞 周 期 進 行 に 要 す る タ ンパ ク 質 を 阻 害 して ア ポ 卜一 シ ス を 誘 導 す る ボル テ ゾ ミプ ( Bortezom i b) も 用 い られ て い る。 ま た 、 ワ ク チ ン治 療 な ど、 宿 主 の 抗 腫 瘍 免 疫 を 高 め る 治 療 も 進 め られ て い る。 [0005] 一 方 で、 悪 性 腫 瘍 で 致 死 的状 況 とな る際 に最 も重 要 な 過 程 は、 浸 潤 転移 で あ る。 特 に、 が ん 化 した 細 胞 が 局 所 に 発 生 して も、 細 胞 の 増 殖 に は 生 体 内 で は 様 々 な 構 造 的 制 限 が あ る の で 、 十 分 な 浸 潤 能 を有 して い な け れ ば 、 が ん 細 胞 は 局 所 に と ど ま り、 増 殖 進 展 が で き な い 。 が ん 細 胞 は 原 発 巣 か ら離 脱 し、 タ ンパ ク 質 分 解 酵 素 を産 生 し周 囲 の 間 質 や 基 底 膜 を破 壊 して 脈 管 内 に侵 入 す る。 次 に脈 管 内 を移 動 して 標 的 臓 器 の 血 管 内 皮 細 胞 へ 接 着 し、 血 管 内 か ら組 織 中 へ 同 様 の 機 序 で 浸 潤 して い く. そ して そ の 場 で 増 殖 す る こ と に よ り 転 移 巣 を形 成 す る と考 え られ て い る。 近 年 、 原 発 巣 か らの 離 脱 と標 的 組 織 へ の 接 着 、 浸 潤 の 過 程 に は 細 胞 接 着 分 子 と特 殊 な タ ン パ ク 質 分 解 酵 素 が 大 き な 役 割 を 果 た して い る と考 え られ て い る。 [0006] しか しな が ら、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 す る 薬 剤 は 十 分 と は い え ず 、 さ らな る 開 発 が 望 ま れ て い る。 先行 技術 文献 特 許 文献 [0007] 特 許 文 南犬1 :NK4 ogy and 94 : 3 2 1-327. (HGF-an t h e r apeu t i cs. t agon i s t/ang i ogenes Mat sumo t o K , is Nakamu i nh i b i t o r ) r a T. (2003) i n cance Cance r r b io L S c i ence 発 明 の概 要 発 明 が解 決 しょ う とす る課 題 本 発 明 は 、 細 胞 周 期 依 存 性 タ ン パ ク 質 を 標 的 と し、 新 規 メ カ ニ ズ ム に よ り [0008] 作 用 す る新 規 抗 腫 瘍 剤 を提 供 す る こ と を課 題 とす る。 さ らに は、 新 規 メ カ 二 ズ 厶 に よ る、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は転 移 を抑 制 しう る抗 腫 瘍 剤 を選 別 す る ス ク リ一 ニ ン グ 方 法 を 提 供 す る こ と を 課 題 と す る 。 課 題 を解 決 す るた め の手 段 本 発 明 者 ら は 上 記 課 題 を 解 決 す る た め に 鋭 意 研 究 を 重 ね た 結 果 、 あ る RhoGT [0009] P分 解 活 性 タ ン パ ク 質 ( h o GTPase rRhoGAPj a c t i vat i ng prot e i n :RhoGAP, 以下単 に と い う 場 合 も あ る 。 ) が 、 細 胞 周 期 に 依 存 した 調 節 を 受 け て お り 、 これ が ん 細 胞 が 浸 潤 能 (細 胞 可 動 性 ) を 獲 得 す る 過 程 で 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と を 初 め て 見 出 した 。 当 該 RhoGAP を 標 的 と す る こ と で 、 が ん 細 胞 の 可 動 性 及 び / 又 は 転 移 を 制 御 し う る こ と を 確 認 し、 本 発 明 を 完 成 した 。 す な わ ち 、 本 発 明 は 以 下 よ りな る。 [00 1 0 ] . 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 (RhoGAP) を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効 成 分 と して 含 有 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 。 2 . 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP 1 1A を 阻 害 し う る 物 質 で あ る、 前 項 1 に記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 。 3 . ARHGAP 1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP 1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ド又 は RNA 干 渉 を 誘 導 す る 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ド で あ り、 或 い は ARHGAP 1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 転 写 産 物 若 し く は 翻 訳 産 物 に 結 合 し得 る 低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら選 択 さ れ る い ず れ か で あ る 前 項 2 に記 載 の新 規 抗 腫 瘍 剤 。 4 . ARHGAP 1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 当 該 ARHGAP 1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ っ て 、 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを 構 成 す る塩 基 が 1 4 塩 基 〜 2 0 0 塩 基 で あ り、 当 該 塩 基 配 列 中 に 人 工 核 酸 を 少 な く と も 1 以 上 含 む こ と を特 徴 とす る前 項 3 に記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 。 5 . ア ンチ セ ン ス オ リゴ ヌ ク レオ チ ドが 、 以 下 の 1 ) ~ 1 3 ) の い ず れ か に 示 す 塩 基 配 列 を含 む 才 リゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る、 前 項 4 に記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 : ) ARHGAP-625-BNA-1 6 :5(L)T(L)5(L)aaatttgaa5(L)T(L)5(L)c (配 列番 号 1 ; 0 ) 2 ) ARHGAP-969-BNA-1 6 :T(L)5(L)5(L)gaaaaagcc5(L)T(L)T(L)c (配 列番 号 3 ) 3 ) ARHGAP-1 344-BNA-1 6 :T(L)5(L)T(L) 6 ) ; 4 ) ARHGAP-1447-BNA-1 ) (配 列番 号 tttcatgtc5(L)T(L)T(L)c 6 :T(L)5(L)5(L)aggataaaaT(L)5(L)T(L)g (配 列番 号 ; 5 ) ARHGAP-1 748-BNA-1 6 :5(L)T(L)T(L)gatggactt5(L)5(L)T(L) t (配 列番 t (配 列番 号 号 1 9 ) 6 ) ARHGAP-1 931 -BNA-1 6 :T(L)T(L)T(L)gcctgcaatT(L)5(L)T(L) 2 1 ) ; 7 ) ARHGAP-2032-BNA-1 6 :5(L)5(L)T(L)agattgaatT(L)T(L)5(L)a (配 列番 号 2 2 ) 8 ) ARHGAPv1 -3484-BNA-1 号3 0 ) 6 :T(L)T(L)5(L)gagggtaacT(L)5(L)5(L)a ; 9 ) ARHGAPv2-221 5-BNA-1 6 :5(L)T(L)5(L) 号3 4 ) (配 列番 6 :T(L)5(L)T(L)agaacagtaA(L)A(L)T(L) t (配 列 6 :T(L)T(L)5(L)aaacatgaa5(L)T(L)T(L) t (配 列 ; 1 ) ARHGAPv2-2306-BNA-1 番号 3 6 ) taacagtagT(L)A(L)T(L)g ; 0 ) ARHGAPv2-2285-BNA-1 番号 3 5 ) (配 列番 ; ) ARHGAPv2-2355-BNA-1 6 :T(L)5(L)5(L)caattgttgA(L)T(L)A(L)g (配 列 番号 3 7 ) ; 3 ) ARHGAPv2-2404-BNA-1 6 :T(L)T(L)T(L) taacataagA(L)A(L)T(L)g (配 列 番号 3 8 ) 。 [ こ こ に お い て 、 N(l_) は 人 工 核 酸 BNA 、 5(l_) は L-mC ( メ チ ル 化 人 工 核 酸 BNA) 、 T(l_) は 人 工 核 酸 チ ミ ジ ン、 A(l_) は 人 工 核 酸 ア デ ニ ン を表 す 。 ] 6 . ARHGAP1 1A を 阻 害 しう る物 質 が 、 RNA 干 渉 を 誘 導 す る オ リゴ ヌ ク レオ チ ド で あ っ て 、 以 下 の 1 4 ) 又 は 1 5 ) に 示 す 塩 基 配 列 を 含 む オ リゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る、 前 項 3 に 記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 : 4 ) ARHGAP1 1A # 1 (TRCN0000047281 ) :CCGGCGGTATCAGTTCACATCGATACTCGAG TATCGATGTGAACTGATACCGTTTTTG ( 配 列 番 号 1 ) 5 ) ARHGAP1 1A #2 (TRCN0000047282) ; :CCGGCCTTCTATTACACCTCAAGAACTCGAG TTCTTGAGGTGTAATAGAAGGTTTTTG ( 配 列 番 号 2 ) 。 7 . 抗 腫 瘍 剤 が 、 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 作 用 及 び / 又 は 浸 潤 阻 害 作 用 を有 す る こ と を特 徴 と す る、 前 項 1 ~ 6 の い ず れ か 1 項 に 記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 。 8 . 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 を 選 別 す る こ と を特 徴 と す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 の ス ク リー ニ ン グ方 法 。 9 . 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP が 、 ARHGAP1 1A で あ る、 前 項 8 に 記 載 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 。 0 . 少 な く と も 以 下 の A ) ~ D ) の 工 程 を 含 む こ と を特 徴 と す る前 項 9 に 記 載 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 : A ) 候 補 物 質 を が ん 細 胞 株 と共 に 培 養 し、 該 細 胞 に お け る ARHGAP1 1A を コ ー ド す る遺 伝 子 の 発 現 量 を測 定 す る工 程 ; B ) 対 照 の 系 で 同 手 法 に よ り測 定 さ れ た ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 を測 定 す る工 程 ; C ) 前 記 A ) 及 び B ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た ARHGAP1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 と、 比 較 す る 工 程 ; D) A ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 量 が 、 B ) の 工 程 に よ り測 定 され た 遺 伝 子 の 発 現 量 に比 べ て低 い場 合 の候 補 物 質 を選 別 す る工 程 。 1 . 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 定 量 す る こ と を 特 徴 と す る 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。 . 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP が 、 ARHGAP1 1A で あ る 、 前 項 1 1 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。 3 . 悪 性 腫 瘍 が 、 大 腸 が ん や す い 臓 が ん 、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん 、 頭 頸 部 が ん 、 黒 色 腫 (メ ラ ノ 一 マ ) 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん 、 滕 臓 が ん 、 肝 細 胞 が ん 、 腎 細 胞 が ん 、 皮 膚 が ん か ら選 択 さ れ る 一 種 又 は 複 数 種 で あ る 、 前 項 1 4 . 1 又 は 1 2 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。 悪 性 腫 瘍 の 検 査 が 、 が ん の 進 行 度 及 び / 査 で あ る 、 前 項 5 . 1 3 の い ず れ か 1 項 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。 又 は 浸 潤 阻 害 剤 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 で あ る 、 前 項 1 7 . 1 ~ 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 か ら な る 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び / 6 . 1 又 は 予 後 を 予 測 す る た め の 検 1 5 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び / 又 は 浸 潤 阻 害 剤 ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP1 1A を コ ー ド す る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド 又 は RNA 干 渉 を 誘 導 す る 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド で あ り 、 或 い は ARHGAP1 1A を コ 一 ド す る 遺 伝 子 の 転 写 産 物 若 し く は 翻 訳 産 物 に 結 合 し得 る 低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら 選 択 さ れ る い ず れ か で あ る 前 項 1 6 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び / 8 . 又 は 浸 潤 阻 害 剤 。 ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 当 該 ARHGAP1 1A を コ ー ド す る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドで あ っ て 、 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を 構 成 す る 塩 基 が 1 4 塩 基 〜 2 0 0 塩 基 で あ り、 当 該 塩 基 配 列 中 に 人 工 核 酸 を 少 な く と も 1 以 上 含 む こ と を 特 徴 と す る 前 項 剤 及 び / 9 . 1 7 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 又 は 浸 潤 阻 害 剤 。 ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドが 、 以 下 の 1 ) に 示 す 塩 基 配 列 を 含 む 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドで あ る 、 前 項 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び / 又 は 浸 潤 阻 害 剤 : ~ 1 3 ) の い ず れ か 1 8 に 記 載 の 悪 性 腫 ) ARHGAP-625-BNA-1 6 :5(L)T(L)5(L)aaatttgaa5(L)T(L)5(L)c (配 列番 号 1 ; 0 ) 2 ) ARHGAP-969-BNA-1 6 :T(L)5(L)5(L)gaaaaagcc5(L)T(L)T(L)c (配 列番 号 3 ) 3 ) ARHGAP-1 344-BNA-1 6 :T(L)5(L)T(L) 6 ) ; 4 ) ARHGAP-1447-BNA-1 ) (配 列番 号 tttcatgtc5(L)T(L)T(L)c 6 :T(L)5(L)5(L)aggataaaaT(L)5(L)T(L)g (配 列番 号 ; 5 ) ARHGAP-1 748-BNA-1 6 :5(L)T(L)T(L)gatggactt5(L)5(L)T(L) t (配 列番 t (配 列番 号 号 1 9 ) 6 ) ARHGAP-1 931 -BNA-1 6 :T(L)T(L)T(L)gcctgcaatT(L)5(L)T(L) 2 1 ) ; 7 ) ARHGAP-2032-BNA-1 6 :5(L)5(L)T(L)agattgaatT(L)T(L)5(L)a (配 列番 号 2 2 ) 8 ) ARHGAPv1 -3484-BNA-1 号3 0 ) 6 :T(L)T(L)5(L)gagggtaacT(L)5(L)5(L)a ; 9 ) ARHGAPv2-221 5-BNA-1 6 :5(L)T(L)5(L) 号3 4 ) 6 :T(L)5(L)T(L)agaacagtaA(L)A(L)T(L) t (配 列 6 :T(L)T(L)5(L)aaacatgaa5(L)T(L)T(L) t (配 列 ; ) ARHGAPv2-2355-BNA-1 番号 3 7 ) (配 列番 ; 1 ) ARHGAPv2-2306-BNA-1 番号 3 6 ) taacagtagT(L)A(L)T(L)g ; 0 ) ARHGAPv2-2285-BNA-1 番号 3 5 ) (配 列番 6 :T(L)5(L)5(L)caattgttgA(L)T(L)A(L)g (配 列 6 :T(L)T(L)T(L) (配 列 ; 3 ) ARHGAPv2-2404-BNA-1 taacataagA(L)A(L)T(L)g 番号 3 8 ) 。 [ こ こ に お い て 、 N(l_) は 人 工 核 酸 BNA 、 5(l_) は L-mC ( メ チ ル 化 人 工 核 酸 BNA) 、 T(l_) は 人 工 核 酸 チ ミ ジ ン、 A(l_) は 人 工 核 酸 ア デ ニ ン を表 す 。 ] 2 0 . ARHGAP1 1A を 阻 害 しう る物 質 が 、 RNA 干 渉 を 誘 導 す る オ リゴ ヌ ク レオ チ ドで あ っ て 、 以 下 の 1 4 ) 又 は 1 5 ) に 示 す 塩 基 配 列 を 含 む オ リゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る、 前 項 1 7 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び / 又 は 浸 潤 阻 害 剤 4 ) ARHGAP1 1A # 1 (TRCN0000047281 ) :CCGGCGGTATCAGTTCACATCGATACTCGAG TATCGATGTGAACTGATACCGTTTTTG ( 配 列 番 号 1 ) 5 ) ARHGAP1 1A #2 (TRCN0000047282) ; :CCGGCCTTCTATTACACCTCAAGAACTCGAG TTCTTGAGGTGTAATAGAAGGTTTTTG ( 配 列 番 号 2 ) 。 2 1 . 前 項 1 ~ 7 の い ず れ か に記 載 の新 規 抗 腫 瘍 剤 を用 い る悪 性 腫 瘍 の 治 療 及び/ 又 は予 防方法。 発 明 の効 果 [001 1] 本 発 明 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 を有 効 成 分 と して 含 有 す る新 規 抗 腫 瘍 剤 に よ り、 ARHGAP1 1A を 発 現 しう る が ん 、 例 え ば 大 腸 が ん 、 す い 臓 が ん 、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん 、 頭 頸 部 が ん 、 黒 色 腫 (メ ラ ノ 一 マ ) 、 卵 巣 が ん、 肺 が ん、 脳 が ん、 滕 臓 が ん、 肝 細 胞 が ん、 腎細 胞 が ん、 皮 膚 が ん 等 に 由来 す る が ん 細 胞 等 に つ い て、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は転 移 が抑 制 さ れ る。 従 来 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 しう る 抗 腫 瘍 剤 で 有 効 な 薬 剤 は ほ と ん ど存 在 しな か っ た 。 が ん の 悪 性 化 に影 響 を 及 ぼ す 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 しう る 薬 剤 の 提 供 に よ り、 効 果 的 な が ん 治 療 が で き る。 さ ら に、 生 体 検 体 中 の ARHGAP1 1A の 発 現 を例 え ば mRNA に よ り検 査 した 結 果 、 がんの進行度 ( 病 期 ス テ ー ジ分 類 ) や 、 無 再 発 生 存 期 間 との 関係 で有 意 な 違 い が 認 め られ た 。 こ の こ と か ら、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 定 量 す る こ と で 、 悪 性 腫 瘍 を検 査 す る こ と が で き る。 図面 の簡 単 な説 明 [001 2] [ 図 1] が ん 組 織 に お け る転 移 / 浸 潤 が ん 細 胞 の 組 織 免 疫 に よ る 組 織 を 示 す 写 真 図 で あ る。 ( 参考例 1 ) [ 図 2] ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 に 細 胞 周 期 を リア ル タ ィ 厶 で 可 視 化 す る Fucc i を 遺 伝 子 導 入 し、 蛍 光 顕 微 鏡 と FACS で 確 認 した 写 真 図 で あ る。 ( 参考例 2 ) [ 図 3]N0D/SCID マ ウ ス に移 植 した ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 に つ い て 、 細 胞 の 細 胞 周 期 に よ っ て 細 胞 の 移 動 速 度 が 違 う こ と を確 認 した 写 真 図 で あ る。 S/G2/M 期 の 細 胞 の ほ うが、 G 1期 の 細 胞 に比 べ て、 細 胞 の 可 動 性 が 大 きい。 ( 参考例 2 ) [ 図 4]S/G2/M 期 の 細 胞 (mAG) と G 1 期 の 細 胞 (mK02) に つ い て 、 mRNA レベ ル 及 び タ ンパ ク 質 で の ARHGAP 11Aの 発 現 を確 認 した 写 真 図 で あ る。 ( 参考例 2 ) [ 図 5] 細 胞 周 期 依 存 性 転 写 因 子 の 存 在 とARHGAP1 1A の 発 現 と の 関 係 を 示 す 図 で あ る。 ( 参考例 3 ) [ 図 6] 各 種 細 胞 に お け る ARHGAP 11Aの 発 現 を確 認 した 図 で あ る。 ( 参考例 4 ) [ 図 7]ARHGAP1 1A を shRNA で 阻 害 した ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 の 変 異 株 に つ い て 、 細 胞 増 殖 度 及 び 可 動 性 を確 認 した 図 で あ る。 ( 実施例 1 ) [ 図 8] 免 疫 不 全 マ ウ ス ( N0D/SCID) に 野 生 株 の ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 を移 植 した の ち に、 ARHGA1 1A に 対 す る shRNA を 局 所 投 与 した と き の 腫 瘍 の 大 き さ を確 認 した 結 果 を 示 す 図 で あ る。 ( 実施例 2 ) [ 図 9] 大 腸 が ん の ス テ ー ジ と、 mRNA レベ ル で の ARHGAP 11Aの 発 現 を確 認 した 図 で あ る。 ( 実施例 3 ) [ 図 10] 大 腸 が ん 摘 出 手 術 を施 行 した 患 者 に つ い て 、 ARHGAP 11Aの 発 現 が 平 均 よ り低 い 患 者 群 (n=38) と高 い 患 者 群 (n=26) で の 、 無 再 発 生 存 期 間 を確 認 し た 結 果 を 示 す 図 で あ る。 ( 実施例 4 ) [ 図 11] 人 工 核 酸 を 含 む 35種 類 の ア ン チ セ ン ス 才 リゴ ヌ ク レオ チ ド (ア ン チ セ ン ス BNA) に よ る 、 HCT1 16 ( ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 株 ) で の ARHGAP1 1A発 現 抑 制 効 果 を確 認 した 結 果 を 示 す 図 で あ る。 ( 実施例 5 ) [ 図 12] 人 工 核 酸 を 含 む 5種 類 の ア ン チ セ ン ス 才 リゴ ヌ ク レオ チ ド (ア ン チ セ ン ス BNA) に よ る、 各 種 が ん 細 胞 で の ARHGAP1 1A 発 現 抑 制 効 果 を、 ウ ェ ス タ ン プ ロ ッテ イ ン グ に よ り確 認 した 結 果 を 示 す 写 真 図 で あ る。 ( 実施例 6 ) [ 図 13] ( A ) ア ン チ セ ン ス BNA (#1 748) を導 入 した HCT1 16 に お け る、 ARHGAP1 1A の 発 現 抑 制 効 果 を確 認 した 写 真 図 で あ る。 セ ン ス BNA (#1 748) (B ) ま た 、 HCT1 16へ の ア ン チ の 取 り込 み を FITC ( f luoresce i n i soth i ocyanate) 標識 ア ン チ セ ン ス BNA (#1 748) を 用 い て 確 認 した 写 真 図 で あ る 。 [ 図 14] 免 疫 不 全 マ ウ ス (N0D/SCID) 748) 748) に つ い て 、 FITC 標 識 ア ン チ セ ン ス BNA (#1 投 与 に よ る i n v i voで の 抗 腫 瘍 効 果 を示 す 図 で あ る。 [ 図 15 ] 免 疫 不 全 マ ウ ス (実 施 例 7 ) (実 施 例 8 ) に つ い て 、 FITC 標 識 ア ン チ セ ン ス BNA (#1 (N0D/SCID) 投 与 後 1 4 日 目 で の 各 臓 器 へ の FITC 標 識 の 取 り込 み を 確 認 した 結 果 を 示 す 写 真 図 で あ る。 (実 施 例 8 ) [ 図 16 ] ア ン チ セ ン ス BNA (#1 748) の 腫 瘍 転 移 抑 制 効 果 を確 認 す る た め の 、 各 薬 剤 の 投 与 ス ケ ジ ュ ー ル を示 す 図 で あ る。 (実 施 例 9 ) [ 図 17 ] ヒ 卜線 維 肉 腫 細 胞 を 静 脈 注 射 した ヌ ー ドマ ウ ス に つ い て 、 ア ン チ セ ン ス BNA (#1 748) を 投 与 した と き の 肺 転 移 腫 瘍 の 大 き さ を イ メ ー ジ ン グ に て 確 認 した 結 果 を 示 す 写 真 図 で あ る 。 (実 施 例 9 ) [ 図 18 ] ヒ 卜線 維 肉 腫 細 胞 を 静 脈 注 射 した ヌ ー ドマ ウ ス に つ い て 、 ア ン チ セ ン ス BNA (#1 748) あ る。 を 投 与 した と き の 肺 重 量 及 び 体 重 を 測 定 した 結 果 を 示 す 図 で (実 施 例 9 ) 発 明 を実 施 す る た め の 形 態 [001 3 ] 本 発 明 は 、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効 成 分 と して 含 有 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 に 関 す る 。 本 発 明 に お い て 、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP と して は 、 ARHGAP1 1A (Rho [0014] GTPase act i vat i ng prote i n 1 1A) が 挙 げ られ る 。 後 述 の実 施 例 、 実 験 例 で具 体 的 な事 件 結 果 を詳 述 す るが、 本欄 で は本 発 明 を な す に 至 っ た 経 緯 を 、 簡 単 に 説 明 す る 。 本 発 明 者 ら は 、 独 自 に 確 立 した が ん 組 織 の 生 体 イ メ ー ジ ン グ 実 験 系 を 用 い て 、 が ん 細 胞 が 正 常 組 織 に 浸 潤 して い く様 子 を リ ア ル タ イ ム で 解 析 し、 S/G2/M 期 の 細 胞 で は G 1 期 の 細 胞 に 比 べ て 可 動 性 が 高 い こ と を 見 い だ した 。 が ん 細 胞 の う ち 、 S/G2/M と G 1 の 細 胞 を 分 取 して マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 を 行 う こ と に よ り、 細 胞 周 期 に 依 存 す る 遺 伝 子 を 抽 出 し、 そ の 中 で 可 動 性 に 関 連 す る ARHGAP1 1A が S/G2/M 期 の 細 胞 に 高 発 現 して い る こ と を 初 め て 見 出 した 。 shRNA ( 低 分 子 ヘ ア ピ ン RNA) を 用 い て ARHGAP1 1A を 阻 害 した が ん 細 胞 は 、 野 生 株 の が ん 細 胞 よ り も 可 動 性 が 低 く、 腫 瘍 の 進 展 速 度 が 低 下 して い る こ と が 確 認 さ れ た 。 さ ら に 、 免 疫 不 全 マ ウ ス (N0D/SCID) に 野 生 株 の が ん 細 胞 を 移 植 した の ち に 、 ARHGA1 1A に 対 す る s i RNA NA ) (低 分 子 干 渉 を i n v i v o で 局 所 投 与 す る と、 腫 瘍 の 拡 大 を 有 意 に 抑 制 す る こ と が で き た。 [00 が ん細胞 が、 培養 器 内で増 殖 す る際 には空 間 的制 限 が な いが、 生体 内で増 15 ] 殖 す る た め に は 、 細 胞 分 裂 と 同 時 に 周 囲 の 正 常 組 織 に 浸 潤 して い く こ と が 必 要 で あ る。 本 発 明 者 らは 、 大 腸 が ん 細 胞 の 細 胞 周 期 を 可 視 化 す る 蛍 光 タ ンパ ク 質 を 取 り込 ま せ 、 多 光 子 励 起 顕 微 鏡 を 用 い て 生 体 内 イ メ ー ジ ン グ を 行 っ た 。 その結 果、 が ん細胞 の浸潤 遊 走 能 が 、 細 胞 周 期 に 依 存 す る S/G2/M 胞 可 動 性 が 亢 進 す る こ と を 初 め て 見 出 した 期 で細 (図 2 、 3 ) 。 G 1 期 と S/G2/M 期の 細 胞 で 発 現 す る 分 子 を マ イ ク ロ ア レ イ 法 で 解 析 した 結 果 、 細 胞 可 動 性 を 低 下 さ せ る RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 の一種 であ る 「ARHGAP 1 1A 」 が S / 期 の 細 胞 で G 1 期 の 細 胞 に 比 べ 1 0 培 以 上 高 発 現 して い る こ と を 確 認 した 。 G2/M [00 (RhoGAP) 本 発 明 に お い て ARHGAP 1 1A と は 、 代 表 的 な も の と して 、 GenBank 16 ] No. N M 0 14783. 3 (バ リア ン 卜2 ) ( バ リ ア ン 卜 1 ) 又 は GenBank Access ion No. Access NM ion 1 99357. 1 で 特 定 さ れ る 塩 基 配 列 か ら な る mRNA よ り 合 成 さ れ る ヒ 卜由 来 タ ン パ ク 質 が 挙 げ ら れ る 。 ま た 、 ARHGAP 1 1A を 別 の 視 点 か ら 定 義 す る と 、 Ge nBank Access ion No. NM_0 14783. 3又 は NMJ 99357. 1で 特 定 され る塩 基 配 列 か ら 翻 訳 さ れ る ア ミ ノ酸 配 列 、 又 は 前 記 ア ミ ノ酸 配 列 に お い て 、 一 つ 以 上 の ア ミ ノ 酸 の 欠 失 、 付 加 、 置 換 又 は 揷 入 を 有 し、 か つ 、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 を 有 す る ア ミ ノ酸 配 列 か らな る タ ンパ ク 質 が 含 ま れ る 。 さ ら に 、 ヒ 卜 以 外 の 哺 乳 動 物 由 来 の ARHGAP 1 1A も 本 発 明 の ARHGAP 1 1A に 含 め る こ と が で き る [00 17 ] 本 発 明 に お い て ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 と は 、 GenBank 3又 は NMJ 99357. 1で 特 Access ion No. NM— 0 14783. 定 さ れ る 塩 基 配 列 か ら な る mRNA を コ 一 ドす る DNA の 他 、 こ れ ら 配 列 と 類 似 の 配 列 を 保 持 す る DNA も 含 め る こ と が で き る 。 こ こ で の 配 列 」 と は 、 GenBank Access ion No. NM— 0 14783. 3又 は NMJ 99357. 「類 似 1で 特 定 さ れ る 塩 基 配 列 か ら 一 つ 以 上 の ヌ ク レ オ チ ドの 欠 失 、 付 加 、 置 換 又 は 揷 入 を 有 し、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質 を 合 成 し う る 塩 基 配 列 か らな る DNA と す る こ と が で き る。 さ ら に、 上 記 で 特 定 さ れ る塩 基 配 列 か ら な る DNA 、 若 し くは 当 該 特 定 さ れ る塩 基 配 列 か ら一 つ 以 上 の ヌ ク レオ チ ドの 欠 失 、 付 加 、 置 換 又 は 揷 入 を有 し、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質 を 合 成 しう る塩 基 配 列 か らな る DNA 、 又 は そ の 一 部 配 列 と ス 卜リ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 で ハ イ プ リダ イ ズ し得 る 配 列 を有 す る DNA も、 本 発 明 の ARHGAP1 1A 遺 伝 子 に 包 含 さ れ る。 ス トリ ン ジ ェ ン 卜な 条 件 と は 、 一 般 に、 ハ イ プ リダ イ ズ の 際 又 は 洗 浄 の 際 に使 用 さ れ る緩 衝 液 の 塩 濃 度 や 温 度 に よ り規 定 さ れ る。 塩 濃 度 と して は 、 通 常 は 「1 X SSC 、 0. \ % SDSJ 、 よ り厳 しい 条 件 と して は 「 0 . 5 X SSC, 0. % SDSJ 、 さ ら に厳 しい 条 件 と して 「 0. 1 X SSC 、 0. % SDSJ と す る こ と が で き る。 温 度 と して は 通 常 37 °C 、 厳 しい 条 件 と して は42 °C 、 よ り厳 しい 条 件 と して 55 °C 、 さ ら に厳 しい 条 件 と して は 65 °C と す る こ と が で き る。 [001 8] 本 明 細 書 に お い て 、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 ( Rho GTP ase act i at i ng prote i n) 、 即 ち 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 と は 、 当 該 RhoGAP の 機 能 を 阻 害 及 び / 又 は 発 現 を 阻 害 す る物 質 を い う。 RhoGA Pの 機 能 を 阻 害 す る と は 、 RhoGAP の タ ンパ ク 質 と して の 機 能 を 阻 害 す る こ と を い い 、 RhoGAP の 発 現 を 阻 害 す る と は 、 RhoGAP の 生 合 成 を 阻 害 す る こ と と 同 義 で あ る。 RhoGAP の 生 合 成 を 阻 害 しう る物 質 と して は 、 RhoGAP 遺 伝 子 、 又 は 転 写 産 物 若 し くは翻 訳 産 物 に結 合 し得 る物 質 が 挙 げ られ る。 RhoGAP 遺 伝 子 の 転 写 産 物 と は 、 具 体 的 に は RhoGAP mRNA 及 び 前 駆 RNA な ど が 挙 げ られ る。 RhoGAP の 生 合 成 を 阻 害 しう る物 質 で あ れ ば 抗 腫 瘍 効 果 が 期 待 で き る。 よ り具 体 的 に は 、 当 該 RhoGAP を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リゴ ヌ ク レオ チ ドゃ RNAi (RNA i nterference, RNA 、 s i RNA 、 RNA 干 渉 ) を 誘 導 す る オ リゴ ヌ ク レオ チ ド ( sh i croRNA) 、 転 写 産 物 若 し くは翻 訳 産 物 に結 合 し得 る低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら選 択 さ れ る い ず れ か が 挙 げ られ る。 [001 9] RhoGAP が ARHGAP1 1A の 場 合 に は 、 ARHGAP1 1A を 阻 害 しう る物 質 と は 、 当 該 ARH GAP1 1A の 機 能 を 阻 害 及 び / 又 は 発 現 を 阻 害 す る物 質 を い う。 ARHGAP1 1A の 機 能 を 阻 害 す る と は 、 ARHGAP1 1A の タ ンパ ク 質 と して の 機 能 を 阻 害 す る こ と を い い 、 ARHGAP1 1A の 発 現 を 阻 害 す る と は 、 ARHGAP1 1A の 生 合 成 を 阻 害 す る こ と と 同 義 で あ る 。 ARHGAP 1 1A の 生 合 成 を 阻 害 し う る 物 質 と して は 、 ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 、 又 は 転 写 産 物 若 し くは 翻 訳 産 物 に 結 合 し得 る 物 質 が 挙 げ られ る 。 よ り具 体 的 に は 、 当 該 RhoGAP を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ 才 チ ドや RNA i (RNA (shRNA 、 s i RNA 、 i n t e r f e r ence, i c r oRNA) RNA 干 渉 ) を 誘 導 す る オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド 、 転 写 産 物 若 し くは 翻 訳 産 物 に 結 合 し得 る 低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら選 択 さ れ る い ず れ か が 挙 げ られ る 。 尚 、 本 明 細 書 における 「 核酸 」、 核 酸 (DNA) B i dged 「ヌ ク レオ チ ド」 、 「ヌ ク レオ シ ド」 は 、 デ 才 キ シ リボ 、 リボ 核 酸 ( 瞧 ) の 他 に 、 PNA (Pept Nuc Le i c A c i d ) i d e Nuc Le i c A c i d ) や BNA ( 、 及 び こ れ らの 類 縁 体 な ど の 人 工 的 に 合 成 さ れ た 核 酸 ( 以 下 、 「人 工 核 酸 」 と い う ) も 含 ま れ る 。 BNA は 、 例 え ば 株 式 会 社 ジ ー ン デ ザ イ ンが 作 製 す る核 酸 (B r i dged Nuc Le i c A c i d :架 橋 化 核 酸 ) を 使 用 す る こ とが で き る。 ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドは 、 例 え ば 上 記 ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 転 写 産 物 [0020] の 配 列 に 基 づ き、 該 転 写 産 物 と対 合 し得 る よ う に 配 列 を デ ザ イ ン す る こ と が で き る 。 ア ン チ セ ン ス ヌ ク レオ チ ドは DNA 又 は RNA の い ず れ か ら構 成 さ れ て も よ く、 天 然 に は 存 在 しな い 人 工 核 酸 を 含 む オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る の が 好 適 で あ る 。 人 工 核 酸 を 含 む こ と で 、 よ り安 定 性 の 高 い オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを 得 る こ と が で き る 。 ま た 、 オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドの 塩 基 配 列 の 長 さ は 、 特 に 制 限 さ れ な い が 、 少 な く と も 対 象 と す る 遺 伝 子 の 特 異 性 を 保 持 し得 る 長 さ を 有 して い れ ば よ く、 長 さ の 上 限 は mRNA と 同 等 の 長 さ と して も よ い 。 一 般 に は 、 1 4塩 [002 1] 基 〜 200 塩 基 、 好 ま し くは 1 5 塩 基 か ら5 0 塩 基 と す る こ と が で き る 。 RNA i (RNA i n t e r f e r ence, RNA 、 shRNA 、 m i c r oRNA RNA 干 渉 ) を 誘 導 す る dsRNA ( 二 重 鎖 RNA) に はs i な ど の 形 態 が 知 られ て お り、 本 発 明 は こ れ ら全 て を 包 含 し得 る 。 dsRNA は 、 上 記 ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 の 転 写 産 物 の 一 部 領 域 と相 補 し得 る ア ン チ セ ン ス 鎖 と、 こ の ア ン チ セ ン ス 鎖 と対 合 し得 る 配 列 か らな る セ ン ス 鎖 と か ら構 成 さ れ る 。 す な わ ち 、 dsRNA の 二 重 鎖 領 域 は 、 ARHGAP 1 1A 遺 伝 子 上 の 標 的 と す る領 域 の DNA 配 列 を リボ 核 酸 に 変 更 した 配 列 に 相 当 す る 。 な お 、 A R HGAP 1 1A の 発 現 を 阻 害 し得 る 限 り、 ア ン チ セ ン ス 鎖 の 配 列 中 に標 的 と す る ARHG A P 1 1A 遺 伝 子 と相 補 しな い配 列 を有 して い て も よ く、 また、 セ ン ス 鎖 配 列 中 に ア ンチ セ ンス鎖 と対 合 しな い配 列 を有 して い て も よ い。 上 記 dsRNA の 二 重 鎖 領 域 の 長 さ は、 一 例 を示 せ ば、 16~49 塩 基 対 、 好 適 に は 16~30 塩 基 対 、 さ らに 好 適 に は 19 ~ 2 1 塩 基 対 とす る こ とが で き る。 長 い dsRNA は、 細 胞 毒 性 を有 す る こ とか ら、 この毒 性 を与 え な い範 囲 で、 長 さ の 上 限 を決 定 す る こ とが で き る 。 また、 dsRNA の 長 さ の 下 限 は、 特 異 性 を保 持 し得 る範 囲 で調 整 す る こ とが で き る。 [0022] 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP 1 1A の 発 現 を効 果 的 に 阻 害 し得 るA R HGAP 1 1A 遺 伝 子 上 の標 的領 域 又 は具 体 的 な shRNA 、 s i RNA や m i c r oRNA な どの 配 列 は、 例 え ば、 DHARMACON 社 ( h t t p : //des p : //www. amb i on. com/t 会ネ 土 ( h t t p : //www. ech L i b/m i sc/s i gn. dha rmacon. com) i RNA f i nde r . h t m L) t aka r a-b i o . co. j p / r n a i / i n t r o . h tm) 、 Amb i o n 社 ( h t t 、 タ カ ラ ンヾィ 才 株 式 な ど、 白体 公 知 の デ ザ イ ンツ ー ル を利 用 して デ ザ イ ンす る こ と も で き る。 また、 合 成 器 な ど に よ り人 工 的 に合 成 した 合 成 オ リゴdsRNA と して調 製 して も よ い。 又 は、 dsRNA を コー ドした DNA を担 持 した 発 現 べ ク タ 一 か ら細 胞 内 で s i NA を発 現 させ る構 成 と して も よ い。 細 胞 内 で dsRNA を発 現 させ る際 の ベ ク タ 一 は、 導 入 した い細 胞 な ど に よ り任 意 に選 択 す る こ とが で き る。 例 え ば、 哺 乳 動 物 細 胞 で は、 レ 卜 ロ ウ ィル スべ ク タ 一、 アデ ノ ウ イル スベ ク タ 一、 アデ ノ関 連 ウ ィル スベ ク タ ― 、 ワ ク シ ニ ア ウ ィル スベ ク タ 一、 レンチ ウ ィル スベ ク タ 一、 ヘ ル ぺ ス ウ イ ル スべ ク タ 一、 アル フ ァ ウ ィル スベ ク タ 一、 EB ウ ィル スベ ク タ 一、 パ ピ 口一 マ ウ ィル スベ ク タ 一、 フ 才 一 ミ一 ウ ィル スベ ク タ 一 な どの ウ ィル スベ ク タ 一 な どが 挙 げ られ る。 これ ら発 現 べ ク タ 一 に は dsRNA を転 写 させ る た め の プ ロモ — タ を備 え、 そ の 下 流 に dsRNA を コー ドした DNA を連 結 す る す る こ とが で き る 。 また、 プ ロモ ー タや dsRNA の構 築 方 法 な どは、 自体 公 知 の 方 法 を適 用 す る こ とが で き る。 [0023] 本 発 明 の新 規 抗 腫 瘍 剤 に有 効 成 分 と して 含 有 され る " 細 胞 周 期 依 存 性 の Rho GAP を 阻 害 しう る物 質 " が、 当該 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP 1 1A を コー ドす る遺 伝 子 に対 す る ア ンチ セ ンス オ リゴ ヌ ク レオ チ ド、 shRNA 、 s i N A 、 m i c r oRNA な どの 核 酸 物 質 の 場 合 は、 当 該 核 酸 物 質 を作 用 さ せ た い 細 胞 内 に 導 入 す る こ とが 好 ま しい。 核 酸 物 質 の 導 入 手 法 と して は、 リポ フ エ ク シ ヨ ン 法 、 リン酸 カル シ ウ ム 法 、 エ レク トロボ 一 レシ ヨ ン、 ジ ー ン ガ ンな ど、 自体 公 知 の 方 法 、 或 い は 開 発 さ れ て い る遺 伝 子 導 入 技 術 を適 用 す る こ とが で き、 市 販 の 遺 伝 子 導 入 試 薬 又 は キ ッ トを利 用 す る こ とが で き る。 ま た 、 感 染 力 を 保 持 した ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 を 用 い た dsRNA 発 現 べ ク タ 一 な どの 場 合 に は、 ウ イ ル ス の 感 染 力 に よ り細 胞 にベ ク タ 一 を取 込 ませ る こ とが で き る。 [0024] 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 に有 効 成 分 と して 含 有 さ れ る " 細 胞 周 期 依 存 性 の Rho GAP を 阻 害 しう る物 質 " の うち 、 天 然 高 分 子 の 例 と して 抗 体 が 挙 げ られ る。 抗 体 は、 ポ リク ロ一 ナ ル 抗 体 で あ って も 良 い し、 モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 で あ って も よ い。 抗 体 は、 自体 公 知 の 方 法 に よ り作 製 し、 得 る こ とが で き る。 [0025] 上 述 した 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 に よ り、 が ん 細 胞 の 可 動 性 浸 潤 能 が著 し く低 下 し、 浸 潤 及 び / 又 は転 移 を抑 制 す る こ とが で き る。 従 って 本 発 明 は、 " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " か らな る悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 剤 及 び / 又 は浸 潤 阻害 剤 に も及ぶ 。 [0026] 本 発 明 の " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " を有 効 成 分 とす る 新 規 抗 腫 瘍 剤 が標 的 とす る が ん 細 胞 は、 特 に 限 定 さ れ な い が 、 当 該 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP 1 1A の 発 現 に よ り、 が ん 細 胞 の 転 移 や 浸 潤 が 誘 導 さ れ る可 能 性 の あ る が ん 細 胞 を挙 げ る こ とが で き る。 具 体 的 に は、 大 腸 が ん や す い臓 が ん の 他 、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん 、 頭 頸 部 が ん 、 黒 色 腫 (メ ラ ノー マ ) 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん 、 滕 臓 が ん 、 肝 細 胞 が ん 、 腎 細 胞 が ん 、 皮 膚 が ん 等 に 由 来 す る が ん 細 胞 を挙 げ る こ とが で き、 特 に 好 適 に は 大 腸 が ん や す い臓 が ん が 挙 げ られ る。 [0027] さ らに、 本 発 明 の " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " を有 効 成 分 とす る新 規 抗 腫 瘍 剤 は、 が ん が 組 織 に浸 潤 し固 有 筋 層 、 漿 膜 、 漿 膜 外 に達 す る T 2 、 3 、 4 ステ ー ジ (U ICC の ΤΝΜ 分 類 に よ る ) の が ん に対 して よ り有 効 に作 用 しう る こ とが考 え られ る。 本 発 明 に お い て 治 療 標 的 で あ る ARHGAP 1 1Α な どの RhoGAP が 、 T 2 、 3 、 4 ス テ ー ジ の が ん に お い て 上 昇 す る こ とが 明 らか と な っ た か らで あ る。 [0028] 本 発 明 の " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " を有 効 成 分 と す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 に は 、 本 成 分 に 必 要 に 応 じて 、 他 の 成 分 を 混 合 処 方 して も よ い 。 ま た 、 本 新 規 抗 腫 瘍 剤 も 公 知 の 製 剤 学 的 製 造 法 を 利 用 して 製 剤 化 す る こ と が で き る。 有 効 成 分 に 応 じて 核 酸 製 剤 と して 、 ま た 低 分 子 化 合 物 製 剤 と して 製 剤 化 す る こ と が で き る。 製 剤 化 す る 場 合 は 、 例 え ば 、 薬 剤 と して 一 般 的 に 用 い られ る 媒 体 又 は 担 体 、 具 体 的 に は 、 滅 菌 水 や 生 理 食 塩 水 、 植 物 油 、 乳 化 剤 、 懸 濁 剤 、 界 面 活 性 剤 、 安 定 剤 な ど と適 宜 組 み 合 わ せ て 製 剤 化 す る こ と が で き る。 従 っ て 本 発 明 は 、 本 発 明 の " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る 物 質 " を有 効 成 分 と す る新 規 抗 腫 瘍 剤 を 用 い る 悪 性 腫 瘍 の 治 療 及 び / 又 は 予 防方 法 に も及ぶ 。 [0029] 本 発 明 は 、 " 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 阻 害 しう る物 質 " を 選 別 す る こ と を特 徴 と す る新 規 抗 腫 瘍 剤 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 に も 及 ぶ 。 本 明 細 書 に お け る 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP の 代 表 例 と して は 、 上 述 した ご と くARHGAP1 1A が 挙 げ られ る。 具 体 的 に は 少 な く と も 以 下 の A ) ~ D ) の 工 程 を 含 む こ と を特 徴 と す る ス ク リー ニ ン グ方 法 に 及 ぶ 。 A ) の 工 程 及 び B ) の 工 程 は 、 い ず れ の 工 程 を 先 に 行 っ て も よ い し、 同 時 に 行 っ て も よ い 。 こ こ で 、 ス ク リー ニ ン グ に よ っ て 選 別 さ れ る候 補 物 質 と して は 、 核 酸 物 質 、 低 分 子 化 合 物 又 は 天 然 高 分 子 を 上 げ る こ と が で き る。 具 体 的 に は 、 当 該 ARHGAP1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リゴ ヌ ク レオ チ ド、 shRNA 、 s i RNA 、 i croRNA, 転写 産 物 若 し くは翻 訳 産 物 に結 合 し得 る低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 等 が 挙 げ られ る。 天 然 高 分 子 の 例 と して 、 抗 体 が 挙 げ られ る。 抗 体 は 、 ポ リク ロ 一 ナ ル 抗 体 で あ っ て も 良 い し、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 で あ っ て も よ い 。 抗 体 は 、 自体 公 知 の 方 法 に よ り作 製 し、 得 る こ と が で き る。 [0030] A ) 候 補 物 質 を が ん 細 胞 株 と共 に 培 養 し、 該 細 胞 に お け る 細 胞 周 期 依 存 性 の 特 定 の RhoGAP ( 例 え ば 、 ARHGAP1 1A) を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 を 測 定 す る 工程 ; B ) 対 照 の 系 で 同 手 法 に よ り測 定 さ れ た 特 定 の RhoGAP を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 を測 定 す る工 程 ; C ) 前 記 A ) 及 び B ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 特 定 の RhoGAP を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 と、 比 較 す る 工 程 ; D) A ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 量 が 、 B ) の 工 程 に よ り測 定 され た 遺 伝 子 の 発 現 量 に比 べ て低 い場 合 の候 補 物 質 を選 別 す る工 程 。 [0031 ] 上 記 ス ク リー ニ ン グ方 法 の 工 程 B ) で は 、 候 補 物 質 を 含 ま な い 系 で が ん 細 胞 を 培 養 し、 工 程 A ) と 同 手 法 に よ り測 定 さ れ た 特 定 の RhoGAP を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 を 測 定 す る 工 程 を い う。 上 記 工 程 A ) 及 び 工 程 B ) で 使 用 し う る が ん 細 胞 は 、 特 定 の RhoGAP ( 例 え ば 、 ARHGAP1 1A) を 発 現 しう る 細 胞 で あ れ ば よ く、 特 に 限 定 さ れ な い が 、 例 え ば 大 腸 が ん や す い 臓 が ん 、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん 、 頭 頸 部 が ん 、 黒 色 腫 (メ ラ ノ ー マ ) 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん、 滕 臓 が ん、 肝 細 胞 が ん、 腎 細 胞 が ん、 皮 膚 が ん 等 に 由来 す る細 胞 株 が 挙 げ られ 、 好 ま し くは 大 腸 が ん 又 は す い 臓 が ん が 挙 げ られ る。 特 に具 体 的 に は 、 大 腸 が ん 細 胞 株 で あ る HCT1 16 を 用 い る の が 最 も 好 適 で あ る。 [0032] 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 の 確 認 は 、 リア ル タ イ ム RT-PCR 法 、 ノ ー ザ ン プ ロ ッテ ィ ン グ、 ウ ェ ス タ ン プ ロ ッテ ィ ン グ、 免 疫 染 色 等 の 自体 公 知 の 手 法 や 今 後 開 発 さ れ る新 た な 手 法 に よ る こ と が で き る。 [0033] 本 発 明 は 、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP1 1A を コ ー ド す る 遺 伝 子 の 発 現 量 を 定 量 す る こ と を特 徴 と す る 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 に も 及 ぶ 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP と して は 、 ARHGAP1 1A が 挙 げ られ る。 遺 伝 子 の 発 現 量 は 、 マ イ ク ロ ア レイ 法 、 リア ル タ イ ム 叮 -PCR 法 、 ノ ー ザ ン プ ロ ッテ ィ ン グ、 ウ ェ ス タ ン プ ロ ッテ ィ ン グ、 免 疫 染 色 等 の 自体 公 知 の 手 法 や 今 後 開 発 さ れ る新 た な 手 法 に よ る こ と が で き る。 [0034] 本 発 明 に お い て 生 体 検 体 と は 、 上 記 タ ンパ ク 質 を検 出 可 能 性 な 生 体 検 体 で あ れ ば よ く、 特 に制 限 さ れ な い 。 例 え ば 組 織 、 血 漿 、 血 清 等 の 血 液 、 脊 髄 液 、 リ ンパ 液 、 尿 、 涙 、 乳 等 が 広 く例 示 さ れ 、 好 適 な 生 体 検 体 と して は 、 組 織 が 挙 げ られ る。 組 織 は 、 例 え ば 摘 出 病 変 組 織 、 バ イ オ プ シ ー 、 ま た は CTC ( C i r c u La t i ng t umo r c e L L) 等 に よ り取 得 す る こ とが で きる。 後 述 の実 施 例 で も 示 す よ うに、 例 え ば大腸 が ん摘 出手 術 を施 行 した 患者 につ い て、 ARHGAP 1 1A の 発 現 が平 均 よ り低 い患者 群 と高 い患者 群 で の、 無 再 発 生存 期 間 を確 認 した と こ ろ、 ARHGAP 1 1A の発 現 が低 い患者 群 の ほ うが、 有 意 に無 再 発 生存 率 が低 い こ とが確 認 され た (図 1 0 ) 。 この よ うに、 ARHGAP 1 1A が発 現 す る と考 え られ る 悪 性 腫 瘍 、 例 え ば大腸 が ん や す い臓 が ん、 前 立 腺 が ん細 胞 、 乳 が ん、 頭 頸 部 が ん、 黒 色 腫 (メ ラ ノ一 マ )、 卵 巣 が ん、 肺 が ん、 脳 が ん、 滕 臓 が ん、 肝 細 胞 が ん、 腎細 胞 が ん、 皮 膚 が ん か ら選 択 され る一種 又 は複 数 種 につ い て、 本 発 明 の検 査 方 法 に よ り、 が ん の進 行 度 予 測 や 予後 予 測 を行 う こ とが で きる。 実施 例 [0035] 以 下 に、 本 発 明 を完成 させ るた め に行 な った実 験 結 果 を参 考 例 と して示 し 、 実 施 例 に お い て本 発 明 を さ らに具 体 的 に説 明 す るが、 本 発 明 は これ らに限 定 され る もの で は な く、 本 発 明 の技 術 的思 想 を逸 脱 しな い範 囲 内 で種 々の応 用 が可 能 で あ る。 [0036] (参 考 例 1 ) 細 胞 周 期 の確 認 まず は じめ に、 外 科 的 に切 除 され た 大腸 が ん組 織 Gem i n i n ( 細 胞 周 期 :S/G2 / Mステ ー ジ) に分 類 され る細 胞 を抗 Gem i n i n (S/G2/M) ポ リク ロ一 ナル 抗 体 を 用 い て組 織 免 疫 染 色 法 に よ り染 色 した と こ ろ、 非 が ん部 位 (A ) 、 が ん細 胞 浸 潤 先 端 部 位 (B ) 及 び が ん 中心 部 位 (C ) につ い て確 認 した。 そ の結 果 、 ( B ) の部 位 で Gem i n i n が最 も強 く染 色 され、 S/G2/M 期 の細 胞 が ん細 胞 浸 潤 先 端 部 位 に多 く存 在 す る こ とが確 認 され た ( 図 1) 。 [0037] (参 考 例 2 ) 運 動 型 細 胞 の解 析 が ん組 織 の 生 体 イ メー ジ ン グ実 験 系 を用 い て、 HCT 1 16 ( ヒ 卜大腸 が ん細 胞 株 ) が 正 常 組 織 に浸 潤 して い く様 子 を リアル タ イ ム で解 析 した。 S/G2/M とG1 の細 胞 を分 取 して マ イ ク ロア レイ解 析 を行 う こ とに よ り、 細 胞 周 期 に依 存 す る遺 伝 子 を抽 出 し、 そ の 中 で可 動 性 に関連 す るARHGAP 1 1A が S/G2/M 期 の細 胞 に 高 発 現 して い る こ とを初 め て 見 出 した。 [0038] N0D/SC I D マ ウス の盲 腸 又 は皮 下 に、 蛍 光 プ ロ一 プ (F ucc i :F l u o r escen t Ub i q u i t i nat HCT 1 1 6 G2/M i on-based C e L L Cyc Le I n d i cat or) で 表 現 さ れ た HCT 1 1 6 を 移 植 し、 の 細 胞 周 期 進 行 を 可 視 化 した 。 F ucc i は G 1 期 の 核 を 赤 色 (mK02) に 、 S/ 期 の 核 を 緑 色 (mAG) に 光 ら せ た 。 G 1 期 の 可 視 化 に は 、 Cd t 1 タ ン パ ク 質 の 一 部 を 、 S/G2/M 期 の 可 視 化 に は 、 Gem i n i n タ ン パ ク 質 の 一 部 を 用 い た 。 F ucc i を 表 現 す る 細 胞 は 、 FACSA r i a I I (BD バ イ オ サ イ エ ン ス 社 )に よ り、 S/G2/M 期 の細 胞 を 表 現 す る mAG と G 1 期 の 細 胞 を 表 現 す る mK02 に 分 離 さ れ た 。 F ucc i を 恒 常 的 に発 現 させ る こ とで 安 定 に細 胞 周 期 を可 視 化 す る こ とが で き る。 そ の結 果 、 H CT 1 1 6 で は S/G2/M 期 の 細 胞 が 多 く移 動 す る こ と が 確 認 さ れ た ラ ッ キ ン グ 速 度 を 確 認 した 結 果 、 S/G2/M (図 2 ) 。細胞 卜 期 の 細 胞 の ほ う が G 1期 の 細 胞 に 比 べ て 平 均 移 動 距 離 が 大 き く、 可 動 性 の あ る 細 胞 で あ る こ と が 確 認 さ れ た (図 3 ) 次 に 、 cDNA に よ る マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い て 、 S/G2/M [0039] 期 の 細 胞 及 び G 1期 の 細 胞 に 発 現 して い る mRNA を 解 析 した 。 マ イ ク ロ ア レ イ 分 析 で は 、 2 倍 以 上 上 昇 し 統 計 学 的 に 有 意 な 1 656 遺 伝 子 が 抽 出 さ れ た で あ る ARHGAP 1 1A が S/G2/M (参 考 例 3 ) 。 そ の 結 果 、 特 に RhoGAP 期 の 細 胞 に 強 く発 現 して い る こ と が 、 遺 伝 子 レベ ル 及 び タ ン パ ク 質 レベ ル で 確 認 さ れ た [0040] (表 1 ) (表 1 、 図 4 ) 。 細 胞 周 期 依 存 性 転 写 因 子 E2F に よ る ARHGAP 1 1A の 発 現 制 御 に つ い て E2F フ ァ ミ リ一 は 、 細 胞 周 期 依 存 性 の 転 写 調 節 因 子 で あ る こ と が 知 られ て い る 。 ARHGAP 1 1A (ch r 1 5 : 3290769 63-3290767 1) 1) の 転 写 開 始 部 位 か ら- 20-28b (ch r 15 : 329076 の 部 位 に E2Fs が 結 合 す る 配 列 が あ る こ と に 気 づ き 、 ARHGAP 1 1A の 発 現 は 、 細 胞 周 期 依 存 性 の 転 写 因 子 で あ る E2F に よ っ て 制 御 さ れ て い る こ と を 、 ル シ フ ェ ラ 一 ゼ レポ 一 タ 一 ア ツ セ ィ (Ch I P ) (図 5 A ) 及 び ク ロ マ チ ン免 疫 沈 降 法 に よ り確 認 した 。 ARHGAP 1 1A の 発 現 を 阻 害 す る と 、 が ん 細 胞 の 遊 走 - 浸 潤 能 が 低 下 す る こ と が 確 認 さ れ 、 治 療 標 的 と して 有 望 で あ る こ と が 示 さ れ た [0041 ] (図 5 B ) 。 [ 表 1] Rho (参 考 例 4 ) GAPs 対 象 とな る疾 患 に つ い て 本 参 考 例 で は 、 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 が 標 的 と す る が ん 細 胞 を 確 認 した 。 即 ち ARHGAP 1 1 A が 発 現 す る こ と で 、 転 移 や 浸 潤 が 誘 導 さ れ る 可 能 性 の あ る が ん 細 胞 が 、 本 発 明 の ARHGAP 1 1 A を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効 成 分 と す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 が 標 的 と す る が ん 細 胞 で あ る と 考 え ら れ た 。 ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 ヒ 卜肝 臓 が ん 細 胞 La s t s :HLF ) HGAP 1 1 A 、 リ ンパ 管 線 維 芽 細 胞 (HepG2) 、 ヒ 卜滕 臓 腺 が ん 細 胞 (PSN 1 、 M i aPaca2 (Human Lymphat 、 Pane の 発 現 を 定 量 的 リ ア ル タ ィ 厶 PCR の 方 法 で 確 認 し た 。 部 コ ン ト ロ ー ル と し、 (HCT 1 1 6 ) l ) i c 、 F i b rob に つ い て 、 AR ァ クチ ンを内 ァ ク チ ン の 発 現 量 を 1 と した と き の 相 対 値 を 示 した 。 そ の 結 果 、 ARHGAP 1 1 A の 発 現 を 認 め た ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 や ヒ 卜滕 臓 腺 が ん 細 胞 に由来 す るが ん細胞 た (図 6 ) (HCT 1 1 6 、 PSN 1 ) に お い て ARHGAP 1 1 A の 発 現 が 認 め ら れ 。 よ っ て 、 こ れ ら の が ん 細 胞 に 対 して 、 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 が 有 効 に 作 用 し う る と考 え られ る 。 ま た 、 GeneNo t e の GeneCa rds I D : GC 1 5P032907 を 参 照 した と こ ろ 、 マ イ ク ロ ア レ イ に よ る ARHGAP 1 1 A 発 現 が 、 大 腸 が ん 、 す い 臓 が ん 、 前 立 腺 が ん 、 乳 が ん 、 頭頸 部 が ん、 黒 色腫 (メ ラ ノ 一 マ ) 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん 、 滕 臓 が ん 、 肝 細胞 が ん、 腎細胞 が ん、 皮膚 が ん等 に由来 す る各 が ん細胞 にお いて認 め ら れ て お り、 こ れ ら の が ん 細 胞 に 対 して 、 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 が 有 効 に 作 用 し う る と 考 え ら れ る 。 な お 、 GeneNo t e の GeneCa rds I D : GC 1 5P032907 で は、 各 が ん 細 胞 に お い て 発 現 が 認 め ら れ た こ と が 掲 載 さ れ て い る の み で あ り 、 ARHGA P 1 1Aの 発 現 に よ る が ん 細 胞 に 及 ぼ す 影 響 や 、 ARHGAP1 1A を 阻 害 す る 場 合 の 効 果 に つ い て は 一 切 言 及 され て い な い。 [0043] ( 実 施 例 1 ) ARHGAP1 1A 阻 害 作 用 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 の 確 認 本 実 施 例 で は 、 細 胞 周 期 依 存 性 RhoGAP の う ち ARHGAP1 1A の 機 能 を確 認 し、 本 発 明 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 の 効 果 を確 認 した 。 以 下 の 配 列 番 号 1 又 は 2 に 示 す 塩 基 配 列 か らな る 2 種 類 の shRNA(SH) を 含 む レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 を 作 製 し、 HC T 1 16 ( ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 株 ) に 各 々 を導 入 し、 ARHGAP1 1A 発 現 阻 害 株 ( SH#1 、 SH#2) を構 築 した 。 コ ン トロ ー ル と して 、 以 下 の 配 列 番 号 3 に 示 す 塩 基 配 列 か らな る 才 リゴ ヌ ク レオ チ ドを 含 む レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 を 作 製 し、 同 手 法 に よ りHCT1 16 に導 入 した 。 そ れ ぞ れ の ARHGAP1 1A 発 現 阻 害 株 ( SH#1 、 SH#2) に つ い て 、 細 胞 増 殖 能 及 び 細 胞 浸 潤 を確 認 した 。 [0044] 細 胞 増 殖 に つ い て は 、 標 識 DNA の 前 駆 物 質 ( 5- プ ロ モ -2' - デ 才 キ シ ゥ リジ ン : BrdU) を 細 胞 に 添 加 し、 細 胞 周 期 ( 複 製 ) の S期 に お け る、 ゲ ノ ム DNA へ の そ れ らの 取 込 み を、 定 量 化 した も の に つ い て 分 析 を 行 うB rdU 増 殖 分 析 法 に よ り 分 析 した 。 が ん 細 胞 浸 潤 ア ツセ ィ は 、 BD B i oCoat マ トリゲ ル イ ンべ 一 ジ ョ ン チ ャ ンバ 一 を 用 い 、 取 扱 説 明 書 の 方 法 に従 い 行 っ た 。 そ の 結 果 、 細 胞 増 殖 能 に つ い て は コ ン トロ ー ル と の 違 い は 認 め られ な か っ た (図 7 A ) 。 細 胞 浸 潤 能 は 、 コ ン トロ ー ル に 比 べ て ARHGAP1 1A 発 現 阻 害 株 ( SH#1 、 SH#2) の ほ う に 低 い 値 が 認 め られ た (図 7 B ) 。 よ っ て 、 ARHGAP1 1A 発 現 阻 害 株 で 浸 潤 が 抑 制 さ れ る こ と が 観 察 さ れ た (図 7 A , B ) 。 以 上 の こ と か ら、 ARHGAP1 1A を 阻 害 す る 杭 が ん 治 療 は 、 ヒ 卜の 大 腸 が ん の 浸 潤 を抑 制 す る 画 期 的 な 治 療 法 で あ と 考 え られ 、 今 後 の 創 薬 開 発 が 強 く期 待 さ れ る。 [0045] ARHGAP1 1A に 対 す る shRNA 及 び コ ン トロ ー ル の DNA 配 列 は 以 下 の と お りで あ る shRNA target 1 ) ARHGAP1 1A :Sequence St rand (5 - 3 ) # 1 (TRCN0000047281 ) :CCGGCGGTATCAGTTCACATCGATACTCGAGTA TCGATGTGAACTGATACCGTTTTTG ( 配 列 番 号 1 ) 2 ) ARHGAP1 1A #2 (TRCN0000047282) :CCGGCCTTCTATTACACCTCAAGAACTCGAGTT (配 列 番 号 2 ) CTTGAGGTGTAATAGAAGGTTTTTG コ ン ト口 一 ル 3 ) : CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCT (配 列 番 号 3 ) TCATCTTGTTGTTTTT [0046] (SHC002) ( 実 施 例 2 ) ARHGAP 1 1A 阻 害 作 用 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 の 確 認 本 実 施 例 で は 、 i n v i v o で の ARHGAP 1 1A 阻 害 作 用 に よ る 抗 腫 瘍 効 果 を 確 認 し た。 免疫 不全 マ ウス (N0D/SC ID) に 、 レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 を 導 入 して い な い 野 生 株 の HCT 1 1 6 を 1 X l 0 6 c e L L局 注 し、 移 植 した 。 そ の 後 、 実 施 例 1 で 作 製 した 配 列 番 号 1 又 は 2 に 示 す 塩 基 配 列 か ら な る shR NA (SH) を含 む レンチ ウィル スベ ク タ一 入 キ ッ トで あ る A t e LoGene 群 と して 、 RNA (a) (R) (Koken) (SH# 1 、 又 は SH#2) を 用 い て 局 注 した をin (s i RNA i s i RNA 導 o 投与群 )。 対照 実 施 例 1 で 作 製 した 配 列 番 号 3 か ら な る 塩 基 配 列 か ら な る s h を含 む レンチ ウイ スル ベ ク タ一 (コ ン トロ ー ル shRNA 群 ) 又 は 組 換 え して い な い レ ン チ ウ ィ ル ス ベ ク タ 一 1 を A t e LoGene ( R) (Koken) 上 記 の 如 く導 入 した (遺 伝 子 導 入 試 薬 コ ン ト ロ ー ル 群 ) さ ら に 、 ウ ィ ル ス を 局 注 して い な い 系 (b) 遺伝子 を用 いて (c) レンチ (コ ン トロ ー ル 群 ) に つ い て も 対 照 と した 。 移 植 4 週 間 経 過 後 の 腫 瘍 細 胞 の 拡 大 を 、 腫 瘍 サ イ ズ の 大 き さ で 確 認 した 。 ARHGA P 1 1A に 対 す る shRNA を 腫 瘍 に 投 与 す る と 、 腫 瘍 の 拡 大 を 有 意 に 抑 制 す る こ と が で きた [0047] (図 8 ) 。 ( 実 施 例 3 ) ARHGAP 1 1A の 発 現 と 大 腸 が ん 患 病 期 分 類 と の 関 係 大 腸 が ん 摘 出 手 術 を 施 行 した 患 者 に つ い て 、 手 術 標 本 よ り が ん 組 織 部 位 を レ一 ザ 一 マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン法 ( Lase r m i c r o d i ssec t i on) に て 分 取 し、 こ れ よ り mRNA を 分 離 して ARHGAP 1 1A の 発 現 を マ イ ク ロ ア レ イ 法 に て 確 認 した 。 大 腸 が ん 及 び 正 常 大 腸 粘 膜 の 手 術 切 除 標 本 に つ い て 比 較 す る と、 が ん 部 位 で A RHGAP 1 1A の 発 現 が 上 昇 して お り、 さ ら に 大 腸 が ん の 病 期 分 類 に よ り ス テ ー ジ が 進 行 す る に つ れ て 、 ARHGAP 1 1A の 発 現 が 上 昇 して い る こ と が 確 認 さ れ た 。 例 え ば 、 が ん が 組 織 に 浸 潤 し固 有 筋 層 に 達 す る T 1 比 較 して T 2 , T 3 , T 4 ( U ICC の TNM 分 類 に よ る ) と 期 で 発 現 が 上 昇 す る こ と が 明 らか と な っ た (図 9 ) (実 施 例 4 ) [0048] が ん摘 出手 術 予後 予 測 検 査 大 腸 が ん 摘 出 手 術 を 施 行 した 患 者 に つ い て 、 が ん 摘 出 手 術 (根 治 的 手 術 ) が 可 能 で あ っ た 症 例 に 対 して 、 高 発 現 群 と 低 発 現 群 に 分 類 し、 無 再 発 生 存 期 間 を 解 析 した 。 手 術 標 本 よ り が ん 組 織 部 位 を レ 一 ザ 一 マ イ ク ロ ダ イ セ ク シ ョ ン法 (Lase r 1 1A の 発 現 を マ イ ク ロ ア レ イ 法 に て 確 認 した 。 そ の 結 果 、 ARHGAP 1 1A の 発 現 が i c r o d i ssec 平 均 よ り低 い 患 者 群 に て 分 取 し、 こ れ よ り mRNA を 分 離 して ARHGAP t i on) (n=38) と高 い 患 者 群 (n=26) で の 、 無 再 発 生 存 期 間 を 確 認 した と こ ろ 、 ARHGAP 1 1A が 低 い 患 者 群 の ほ う が 有 意 に 生 存 率 が 高 く、 高 発 現 群 で 予後 が悪 い事 が確 認 され た (図 1 0 ) 。 こ れ に よ り、 ARHGAP 1 1A の 発 現 量 を 確 認 す る こ と で 、 が ん の 予 後 予 測 が 可 能 と考 え られ る 。 な お 実 施 例 3 及 び 4 の 内容 は、 国 立 大 学 法 人 九 州 大 学 の倫 理 委 員 会 の 了承 を得 、 同 大 学 の 生 体 防御 研 究 所 で な され た 試 験 結 果 に基 づ くも の で あ る。 ( 実 施 例 5 ) ARHGAP 1 1A に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (BNA) [0049] 本 実 施 例 で は 、 人 工 核 酸 で あ る BNA を 含 む 3 5 種 類 の ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド( (以 下 、 「ア ン チ セ ン ス BNA 」 と い う 。 ) に つ い て 、 HCT 1 1 6 ( ヒ 卜大 腸 が ん 細 胞 株 ) で の ARHGAP 1 1A に 対 す る 発 現 抑 制 効 果 を 確 認 した 。 ま ず は じめ に 、 以 下 配 列 番 号 4 ~ [0050] ア ン チ セ ン ス BNA 及 び 配 列 番 号 3 9 3 8 に 示 す 塩 基 配 列 か らな る 3 5 種 類 の に 示 す 塩 基 配 列 か らな る オ リゴ ヌ ク 4 レ オ チ ドを 作 製 した 。 ARHGAP 1 1A に は 、 GenBank (バ リア ン 卜 1 ) 又 は GenBank Access ion No. Access NM ion 1 99357. No. 1 NM— 0 14783. 3 (バ リア ン 卜2 ) で 特 定 さ れ る 塩 基 配 列 か ら な る mRNA よ り 合 成 さ れ る ヒ 卜由 来 タ ン パ ク 質 が 挙 げ られ る 。 配 列 番 号 4 ~ 2 3 で 特 定 さ れ る 各 ア ン チ セ ン ス BNA は 、 バ リ ア ン 卜 及 び バ リ ア ン 卜 2 の 共 通 配 列 部 分 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ド鎖 で あ り、 配 列 番 号 2 4 ~ 3 3 で 特 定 さ れ る 各 ア ン チ セ ン ス BNA は 、 バ リ ア ン 卜 1 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド鎖 で あ り、 配 列 番 号 3 4 ~ 3 8 で 特 定 さ れ る 各 ア ン チ セ ン ス BNA は 、 バ リ ア ン 卜 2 に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド鎖 で あ る 。 以 下 に 示 す 各 配 列 に お い て 、 N(l_) は 人 工 核 酸 BNA 、 5 は 5-mC ( メ チ ル シ トシ ン) 、 5(1_) は L-mC ( メ チ ル 化 人 工 核 酸 BNA) 、 T(l_) は 人 工 核 酸 チ ミ ジ ン、 Τ ( Α) は 人 工 核 酸 ア デ ニ ン を 示 す 。 こ こ で 使 用 す る ΒΝΑ は 、 株 式 会 社 ジ ー ンデ ザ イ ン に よ り作 製 さ れ た も の で あ る。 ARHGAP--47- ΒΝΑ - 116 :T(L)5(L)5(L)gcccccagcT(L)5(L)5(L) (配 列番 号 4 ) t ARHGAP-- 1 26- - ΒΝΑ -- 1 6 :5(L)T(L)5(L)ccccatcag5(L)5(L)T(L)g (配 列番 号 5 ) ARHGAP--203- - ΒΝΑ -- 1 6 :5(L)T(L)5(L)aggcaactcT(L)T(L)5(L)c (配 列番 号 6 ) ARHGAP--382- - ΒΝΑ -- 1 6 :T(L)5(L)T(L)attgccagaT(L)T(L)5(L) ARHGAP--406- - ΒΝΑ -- 1 6 :5(L)T(L)T(L) t (配 列番 号 8 ) tctgattctT(L)T(L)5(L)g ARHGAP--591 -- ΒΝΑ -- 1 6 :5(L)5(L)5(L)gtctggcacT(L)T(L)5(L) ARHGAP--625- - ΒΝΑ -- 1 6 :5(L)T(L)5(L)aaatttgaa5(L)T(L)5(L)c (配 列番 号 7 ) t (配 列番 号 9 ) (配 列番 号 1 0 ) ARHGAP-720-BNA-1 6 :T(L)5(L)T(L)gatcccacaT(L)T(L)5(L)c (配 列番 号 1 6 :T(L)T(L)T(L) (配 列番 号 ) ARHGAP-843-BNA-1 taccccctaT(L)T(L)T(L)c ) ARHGAP-969-BNA-1 6 :T(L)5(L)5(L)gaaaaagcc5(L)T(L)T(L)c (配 列番 号 3 ) 6 :T(L)T(L)5(L) tttagtgctT(L)T(L)T(L)a (配 列番 号 ARHGAP-1 162-BNA-1 6 :T(L)T(L)T(L) tcctctgtg5(L)5(L)T(L)a (配 列番 号 ARHGAP-1 006-BNA-1 4 ) 5 ) ARHGAP-1 344-BNA-1 6 :T(L)5(L)T(L) tttcatgtc5(L)T(L)T(L) (配 列番 号 ) ARHGAP-1447-BNA-1 6 :T(L)5(L)5(L)aggataaaaT(L)5(L)T(L)g (配 列番 号 6 :T(L)T(L)5(L)accaggagtT(L)T(L)5(L)a (配 列番 号 7 ) ARHGAP-1 538-BNA-1 8 ) 6 ε ζ ( ) ( ) 歴) ( ) ΐ ( ) ( ) ( ) :9 - N -0 - d Hy ( L ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) :9 - N -66 - ε Hy (o ε ( ) ) ( ) ( ) ( ) ( ) :9 卜 ( ) VN3-t78½- ド dv H V ( 6 Z ( ) ( ) 歴) ( ) ( ) 6 ( ) ( ) :9 - N -8 . - d Hy ( 8 Z ) ( ) ( ) ( ) ( ) 1 ( ) :9 卜 ( ) Ν3-^6 - ド dV H V L Z ¾ ) 1 (1) 上( ) S ( I) 上e 6 e ( l ) 上( ) 丄( )丄 : 9 L-VNa-8083 - dV Hy V ( 9 Z ) ( ) 丄( ) 丄(,)S e ) ( ) ( ) ( ( ) ) 666 ( |) 丄(,)s ( ( ) ) ( ) ( ) |) s :9 卜 誦 ( ) ( ) :9 ) ( ) :9 卜 ( -8ZHAdV L-VNa- - VN3-Z9 V , d Hy dV H な - V (ε ) 6 ( |) 丄(,)s ( ( ) ( ) |) 丄e oee o e o ( ) 丄(,)丄(,)上 ( ) ( ) ( ) ( ) : 9 卜 VNa - 9ん :9 - N - - dV H V -d Hy ( L ) ( )1( ) 5( ) 1 β οοβ ( η) ( η) ( η) :9 -VNa- 6 L-dV0HyV ( 0 ) Z (1) 丄(,)S ( l ) S e 6 e 6e 6 ( |) s ( l) 丄( )S :9 卜 誦 - 6 サ8 ト ぁ 隱 ( 6 L 粜 Z. 歴) ( ) / l 0 d f /X d ( ) ( ) ( ) S3 ( ) ( ) :9 卜 删 —8 サん 卜 dV H V Ζ68 / Ο ARHGAPv1 -51 94-BNA-1 6 :T(L)5(L)T(L)aacaaccaaT(L)5(L)T(L) (配 列 番 号 3 3 ) ARHGAPv2-221 5-BNA-1 6 :5(L)T(L)5(L) (配 列 番 号 taacagtagT(L)A(L)T(L)g 3 4 ) ARHGAPv2-2285-BNA-1 6 :T(L)5(L)T(L)agaacagtaA(L)A(L)T(L) t (配 列 番 号 6 :T(L)T(L)5(L)aaacatgaa5(L)T(L)T(L) t (配 列 番 号 3 5 ) ARHGAPv2-2306-BNA-1 3 6 ) ARHGAPv2-2355-BNA-1 6 :T(L)5(L)5(L)caattgttgA(L)T(L)A(L)g (配 列 番 号 6 :T(L)T(L)T(L) (配 列 番 号 3 7 ) ARHGAPv2-2404-BNA-1 taacataagA(L)A(L)T(L)g 3 8 ) [0051 ] ARHGAP-1 931 -BNA-1 6-cont1 :T(L) tT(L)gccT(L)gcaaT(L) t (配 列 :T(L) tgT(L)ccT(L)gcT(L)aat5(L)T(L) t (配 列 :T(L)5(L)T(L)caatgcctgT(L)T(L)T(L) t (配 列 t5(L)T(L) 番号 3 9 ) ARHGAP-1 931 -BNA-1 6-cont2 番号 4 0 ) ARHGAP-1 931 -BNA-1 6-cont3 番号 4 [0052] ) 上 記 各 配 列 か ら な る ア ン チ セ ン ス BNA を リポ フ エ ク タ ミ ン 試 薬 を 用 い て 各 々 HCT1 16 に 導 入 し、 ARHGAP1 1A の mRNA 発 現 抑 制 し う る ア ン チ セ ン ス BNA を qPCR 法 に て 確 認 した 。 GAPDH を 内 部 コ ン ト ロ ー ル と し、 GAPDH の 発 現 量 を 1 と した と き の 相 対 値 を 示 した 。 そ の 結 果 、 配 列 番 号 1 0 、 1 3 、 1 6 、 1 7 、 9 、 2 1 、 2 2 、 3 0 、 3 4 、 3 5 ~ 3 8 に 示 す ア ン チ セ ン ス BNA が 、 効 果 的 に A R HGAP1 1A の 発 現 を 抑 制 して い る こ と が 確 認 さ れ た [0053] (図 1 1 ) 。 ( 実 施 例 6 ) 人 工 核 酸 を 含 む ア ン チ セ ン ス BNA に よ る ARHGAP1 1A の 発 現 抑 制 効 果 の確 認 本 実 施 例 で は 、 実 施 例 5 で ARHGAP1 1A の 発 現 抑 制 効 果 を 認 め た ア ン チ セ ン ス BNA に つ い て 各 種 が ん 細 胞 で の ARHGAP1 1A 発 現 抑 制 効 果 を 確 認 した 。 ア ン チ セ ン ス BNA は 、 ARHGAP-625-BNA969-BNA1 6 ) 16 (#969 16 ( # 1447 16 ( # 1344 :配 列 番 号 (#2032 :配 列 番 号 2 2 ) 16 又 ) を 用 い た 。 コ ン ト ロ ー ル は 酉己 を用 い た。 また、 ア ンチ セ ンスB t2 コ ン トロ ー ル と して の オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを 加 え な い も の を 野 生 型 と した 。 が ん 細 胞 は 、 DLD 1 ( ヒ 卜結 腸 腺 が ん 細 胞 株 ) 、 HT29 が ん 細 胞 株 ) 、 Pane l 4 16 :配 列 番 号 1 7 ) 、 ARHGAP- 1748-BNA- 列 番 号 4 0 に 示 す ARHGAP- 1 9 3 1-BNA- 1 6-con ) :配 列 番 号 1 0 ) 、 ARHGAP- :配 列 番 号 1 9 ) 、 ARHGAP- 1 9 3 1-BNA- 1 6 ( # 1 9 3 1 :配 列 番 号 2 は ARHGAP-2032-BNA- NA ゃ (#625 :配 列 番 号 1 3 ) 、 ARHGAP- 1344-BNA- 、 ARHGAP- 1447-BNA- ( # 1748 16 (wt ( ヒ 卜結 腸 腺 ( ヒ 卜滕 臓 腺 が ん 細 胞 株 ) 、 PSN 1 ( ヒ 卜滕 臓 腺 が ん ) の 種 類 の 各 種 が ん 細 胞 に つ い て 確 認 した 。 各 々 の ア ン チ セ ン ス BNA を 実 施 例 5 に 記 載 の 方 法 と 同 手 法 に よ り、 リポ フ エ ク タ ミ ン試 薬 を 用 い て 各 が ん 細 胞 に 導 入 し、 ARHGAP 1 1A の 発 現 抑 制 効 果 を ゥ ェ ス タ ン プ ロ ッテ イ ン グ に よ り確 認 した 。 そ の 結 果 、 各 細 胞 に お い て ア ン チ セ ン ス BNA に よ る ARHGAP 1 1A の 発 現 抑 制 が 認 め られ 、 特 に ARHGAP- 1748-BNA- 16 ( # 1748 : 配列番号 1 9 ) に よ り強 い 発 現 抑 制 が 認 め られ た (図 1 2 ) 。 [0054] (実施 例 7 ) ア ン チ セ ン ス BNA の 細 胞 内 へ の 取 り込 み 量 の 確 認 (i n v i t r o ) 本 実 施 例 で は 、 F ITC 標 識 ア ン チ セ ン ス BNA (ARHGAP- 1748-BNA- 1 6 :# 1748) に つ い て 、 リポ フ エ ク タ ミ ン試 薬 を 用 い て HCT 1 1 6 内 へ の 取 り込 み 量 を 確 認 し た 。 コ ン トロ ー ル と して は 、 実 施 例 1 で 作 製 した 配 列 番 号 4 0 か らな る 塩 基 配 列 か らな る 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを 使 用 した 。 そ の 結 果 、 ARHGAP- 1748-BNA- 16 を 導 入 した 細 胞 で は 、 ARHGAP 1 1A の 発 現 が 抑 制 さ れ る こ と が 確 認 さ れ た (図 1 3 ( A ) ) 。 ま た 、 ARHGAP- 1748-BNA- 細 胞 内 取 込 量 は コ ン トロ ー ル と 同 等 で あ っ た (図 1 3 [0055] (実施 例 8 ) ( B ) ) ア ン チ セ ン ス BNA の 腫 瘍 細 胞 増 殖 抑 制 効 果 の 確 認 本 実 施 例 で は 、 ア ン チ セ ン ス BNA (ARHGAP- 1748-BNAv i voでの抗腫瘍効 16 。 (i n :# 1748) 果 を 確 認 した 。 免 疫 不 全 マ ウ ス (N0D/SC ID) 16 の i vo) による in に実 施 例 2 と 同 手 法 に よ り、 野 生 株 の HCT 1 1 6 を 移 植 した の ち に 、 F ITC 標 識 ARHGAP- 1748- ΒΝΑ - 16 を実 施 例 2 と同手 法 に よ りA t e LoGene した。 ARHGAP- 1748-BNA- (R) (Koken) を用 い て、 腫 瘍 周 囲 に局 注 16 の投 与 に よ り、 腫 瘍 の拡 大 を有 意 に抑 制 す る こ と が確 認 され た ( 図 1 4 ) 。 さ らに、 ARHGAP- 1748-BNA、 マ ウス の各 臓 器 ( 脳 :b r a i n 臓 :k i dney, 胃 :i n t e s t i ne) 16 の投 与 後 1 4 日 目に 肝 臓 :いv e r 、 脾 臓 :s p Leen 、 肺 :Lung 、 腎 及 び腫 瘍 部 位 へ の F ITC 標 識 ARHGAP- 1748-BNA- の取 り込 み を確 認 した。 そ の結 果 、 ARHGAP- 1748-BNA- 16 16 は腫 瘍 部 の み に到 達 し、 そ の他 の臓 器 に は到 達 して い な い こ とが確 認 され た ( 図1 5 ) 。 [0056] ( 実 施 例 9 ) ア ン チ セ ン ス BNA の腫 瘍 転 移 抑 制 効 果 の確 認 (i n v i vo) 本 実 施 例 で は、 ア ンチ セ ンス BNA (ARHGAP- 1748-BNAv i v o で の悪 性 腫 瘍 細 胞 の転 移 抑 制 効 果 を確 認 16 :# 1748) した。 ル シ フ ェ ラ一 ゼ を コ一 ド す る遺 伝 子 を含 む レンチ ウィル ス を作 製 し、 HT 1080 ( ヒ 卜線 維 肉腫 細 胞 ) に 感 染 させ ル シ フ ェ ラ 一 ゼ遺 伝 子 を導 入 し、 ル シ フ ェ ラ 一 ゼ導 入 細 胞 Luc) を作 製 した。 ヌー ドマ ウス に HT 1080/Luc 080/Luc A 1 0mg/kg による i n (HT 1080/ を 5 X l 0 6 c e L L静 脈 注 射 した。 HT 1 注 射 後 14 日間経 過 後 に、 ァ ドリアマ イ シ ン 8mg/kg 又 は ア ンチ セ ン ス B N を静 脈 注 射 した。 さ らに 7 日経 過 後 、 ル シ フ ェ リンを 150mg/kg 投 与 し、 HT 1080 /LUC の肺 転 移 を発 光 ィ メ一 ジ ン グで確 認 した ( 図 1 6 ) 。 そ の結 果 、 ア ドリアマ イ シ ン 投 与 群 (n=3) よ り ア ン チ セ ン ス BNA 投 与 群 (n=3) の 方 が腫 瘍 は小 さか った ( 図 1 7 ) 。 また、 肺 の重 量 を測 定 した結 果 、 各 マ ウス につ い て、 肺 の重 量 は ア ンチ セ ンス BNA 投 与 群 の ほ うが ァ ドリアマ イ シ ン投 与 群 に比 べ て軽 量 で あ った。 一 方 、 体 重 につ い て は両 群 に差 を認 め な か った ( 図 1 8 ) 。 この こ とか ら、 ア ンチ セ ンス BNA 投 与 群 の ほ うが ア ドリアマ イ シ ン 投 与 群 に比 べ て腫 瘍 細 胞 の転 移 が抑 制 され て い る こ とが示 唆 され た。 産 業 上 の利 用可能 性 [0057] 以 上 詳 述 した よ うに、 本 発 明 の細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を阻害 しうる物 質 を有 効 成 分 と して含 有 す る新 規 抗 腫 瘍 剤 に よ り、 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 発 現 しうるが ん、 具 体 的 に はARHGAP 1 1A を発 現 しうるが ん、 例 え ば大腸 が ん、 す い臓 が ん、 前 立 腺 が ん細 胞 、 乳 が ん、 頭 頸 部 が ん、 黒 色 腫 (メ ラ ノ一 マ ) 、 卵 巣 が ん、 肺 が ん、 脳 が ん、 滕 臓 が ん、 肝 細 胞 が ん、 腎細 胞 が ん、 皮 膚 が ん 等 に 由来 す る が ん 細 胞 等 に つ い て、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は転 移 が抑 制 さ れ る。 従 来 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 しう る 抗 腫 瘍 剤 で 有 効 な 薬 剤 は ほ と ん ど存 在 しな か っ た 。 が ん の 悪 性 化 に影 響 を 及 ぼ す 、 が ん 細 胞 の 浸 潤 及 び / 又 は 転 移 を抑 制 しう る 薬 剤 の 提 供 に よ り、 効 果 的 な が ん 治 療 が で き、 有 用 で あ る。 さ ら に、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP1 1A の 発 現 を 、 例 え ば mRNA に よ り検 査 した 結 果 、 が ん の 進 行 度 ( 病 期 ステ ー ジ分 類 ) や、 無 再 発 生 存 期 間 と の 関 係 で 有 意 な 違 い が 認 め られ た 。 こ の こ と か ら、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP を 定 量 す る こ と で 、 悪 性 腫 瘍 を検 査 す る こ と が で き る。 さ ら に、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP の 発 現 、 例 え ば ARH GAP1 1A の mRNA 量 に よれ ば、 悪 性 腫 瘍 の 進 行 度 ( 病 期 ステ ー ジ分 類 ) や、 無 再 発 生 存 期 間 と の 関 係 で 有 意 な 違 い が 認 め られ る。 これ に よ り、 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGAP 、 例 え ば ARHGAP1 1A の 発 現 を 測 定 す る こ と で 、 が ん の 進 行 度 及 び / 又 は 予 後 の 予 測 が 可 能 と考 え られ 、 有 用 で あ る。 請 求 の範 囲 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し う る 物 質 を 有 効 成 分 と して 含 有 す る 新 規 抗 腫 瘍 剤 。 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し う る 物 質 が 、 A R HGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 で あ る 、 請 求 項 1 に 記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 。 ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ド又 は RNA 干 渉 を 誘 導 す る 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ り、 或 い は ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 転 写 産 物 若 し く は 翻 訳 産 物 に 結 合 し得 る 低 分 子 化 合 物 、 天 然 高 分 子 か ら選 択 さ れ る い ず れ か で あ る請 求項 2 に記 載 の新 規 抗 腫 瘍 剤 。 ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 当 該 ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ っ て 、 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドを 構 成 す る 塩 基 が 1 4 塩 基 〜 2 0 0 塩 基 で あ り、 当 該 塩 基 配 列 中 に 人 工 核 酸 を 少 な く と も 1 以 上 含 む こ と を特 徴 とす る請 求 項 3 に記 載 の 新規抗腫瘍剤。 ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドが 、 以 下 の 1 ) ~ 1 3 ) のいずれか に 示 す 塩 基 配 列 を 含 む 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る 、 請 求 項 4 に 記 載 の 新規抗腫瘍剤 : ) ARHGAP-625-BNA-1 列番号 1 0 ) 2 ) 6 :5(L)T(L)5(L)aaatttgaa5(L)T(L)5(L)c (配 ; ARHGAP-969-BNA-1 6 :T(L)5(L)5(L)gaaaaagcc5(L)T(L)T(L)c ( 配列番号 1 3 ) 3 ) ARHGAP-1 344-BNA-1 列番号 1 6 ) 4 ) 5 ) 6 :T(L)5(L)5(L)aggataaaaT(L)5(L)T(L)g (配 ; ARHGAP-1 748-BNA-1 配列番号 1 9 ) (配 tttcatgtc5(L)T(L)T(L)c ; ARHGAP-1447-BNA-1 列番号 1 7 ) 6 :T(L)5(L)T(L) 6 :5(L)T(L)T(L)gatggactt5(L)5(L)T(L) t ( 6 ) ARHGAP-1 931 -BNA-1 6 :T(L)T(L)T(L)gcctgcaatT(L)5(L)T(L) 列番号 2 ) t (配 ; 6 :5(L)5(L)T(L)agattgaatT(L)T(L)5(L)a 7 ) ARHGAP-2032-BNA-1 ( 配列番号 2 2 ) 8 ) ARHGAPv1 -3484-BNA-1 配列番号 3 0 ) ( 6 :5(L)T(L)5(L) ( ; 9 ) ARHGAPv2-221 配列番号 3 4 ) 6 :T(L)T(L)5(L)gagggtaacT(L)5(L)5(L)a 5-BNA-1 taacagtagT(L)A(L)T(L)g ; 0 ) ARHGAPv2-2285-BNA-1 (配 列 番 号 3 5 ) 6 :T(L)T(L)5(L)aaacatgaa5(L)T(L)T(L) t ; ) ARHGAPv2-2355-BNA-1 (配 列 番 号 3 7 ) t ; ) ARHGAPv2-2306-BNA-1 (配 列 番 号 3 6 ) 6 :T(L)5(L)T(L)agaacagtaA(L)A(L)T(L) 6 :T(L)5(L)5(L)caattgttgA(L)T(L)A(L)g ; 3 ) ARHGAPv2-2404-BNA-1 6 :T(L)T(L)T(L) taacataagA(L)A(L)T(L)g (配 列 番 号 3 8 ) 。 [ こ こ に お い て 、 N( BNA) [ 請 求 項 6] 、τ は 人 工 核 酸 BNA 、 5 (l_) は L-mC ) は 人 工 核 酸 チ ミ ジ ン、 A ( (メチル化 人工核酸 は 人 工 核 酸 ア デ ニ ン を表 す 。 ] ARHGAP1 1A を 阻 害 し う る 物 質 が 、 RNA 干 渉 を 誘 導 す る 才 リ ゴ ヌ ク レオ チ ドで あ っ て 、 以 下 の 1 4 ) 又 は 1 5 ) に示 す 塩 基 配 列 を含 む オ リゴ ヌ ク レオ チ ドで あ る 、 請 求 項 3 に 記 載 の 新 規 抗 腫 瘍 剤 : 4 ) ARHGAP1 1A # 1 (TRCN0000047281 ACTCGAGTATCGATGTGAACTGATACCGTTTTTG 5 ) ARHGAP1 1A # 2 (TRCN0000047282) ACTCGAGTTCTTGAGGTGTAATAGAAGGTTTTTG [ 請 求項 7] ) :CCGGCGGTATCAGTTCACATCGAT (配 列 番 号 1 ) ; :CCGGCCTTCTATTACACCTCAAGA (配 列 番 号 2 ) 。 抗 腫 瘍 剤 が 、 悪 性 腫 瘍 の 転 移 阻 害 作 用 及 び / 又 は 浸 潤 阻 害 作 用 を有 す る こ と を特 徴 とす る、 請 求 項 1 ~ 6 の い ず れ か 1 項 に記 載 の 新 規 抗 腫 瘍剤。 [ 請 求 項 8] 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 を 阻 害 しう る物 質 を 選 別 す る こ と を特 徴 と す る新 規 抗 腫 瘍 剤 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 。 [ 請 求 項 9] 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 が 、 ARHGAP1 1A で あ る、 請 求 項 8 に 記 載 の ス ク リー ニ ン グ方 法 。 [ 請 求 項 10] 少 な く と も 以 下 の A ) ~ D ) の 工 程 を 含 む こ と を特 徴 と す る 請 求 項 9 に 記 載 の ス ク リ一 ニ ン グ方 法 : A ) 候 補 物 質 を が ん 細 胞 株 と共 に 培 養 し、 該 細 胞 に お け る ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 を 測 定 す る 工 程 ; B ) 対 照 の 系 で 同 手 法 に よ り測 定 さ れ た ARHGAP1 1A を コ 一 ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 を測 定 す る工 程 ; C ) 前 記 A ) 及 び B ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た ARHGAP1 1A を コ ー ドす る 遺 伝 子 の 発 現 量 と、 比 較 す る 工 程 ; D) A ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 量 が 、 B ) の 工 程 に よ り測 定 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 量 に 比 べ て 低 い 場 合 の 候 補 物 質 を 選 別 す る 工程。 [ 請 求 項 11] 生 体 検 体 中 の 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 を 定 量 す る こ と を特 徴 と す る 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。 [ 請 求 項 12] 細 胞 周 期 依 存 性 の RhoGTP 分 解 活 性 タ ンパ ク 質 が 、 ARHGAP1 1A で あ る、 請 求 項 1 1 に記 載 の 悪 性 腫 瘍 の検 査 方 法 。 [ 請 求 項 13] 悪 性 腫 瘍 が、 大 腸 が ん や す い臓 が ん、 前 立 腺 が ん 細 胞 、 乳 が ん、 頭 頸 部 が ん 、 黒 色 腫 (メ ラ ノ 一 マ ) 、 卵 巣 が ん 、 肺 が ん 、 脳 が ん 、 滕 臓 が ん 、 肝 細 胞 が ん 、 腎 細 胞 が ん 、 皮 膚 が ん か ら選 択 さ れ る 一 種 又 は 複 数 種 で あ る、 請 求 項 1 1 又 は 1 2 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方 法 。 [ 請 求 項 14] 悪 性 腫 瘍 の検 査 が、 が ん の進 行 度 及 び / 又 は予後 を予 測 す るた め の検 査 で あ る、 請 求 項 1 1 ~ 1 3 の い ず れ か 1 項 に 記 載 の 悪 性 腫 瘍 の 検 査 方法。 INTERNATIONAL A. CLASSIFICATION Ά 6 1 Κ 4 5/0 G01N33/1 Ά 61 Κ3 1 / 7 0 8 8 (2 0 0 0 (2 0 0 6 . 0 1 ) i , Ά 6 1 P35/0 5 (2 0 0 6 . 0 1 ) f G01N33/5 According to International Patent Classification B. International application No. REPORT OF SUBJECT MATTER 0 (2 0 0 6 . 0 1 ) i , (2 0 0 6 . 0 1 ) i , SEARCH 1 ) i , C 1 2N1 0 (2 0 0 . A 61K31 1 ) G01N33/5 f Ά 61 Κ / 71 1 (2 0 0 6 . 0 1 ) i , . 01) i , / 11 3 (2 0 1 C 1 2Q1 /68 {2 0 0 . 8/0 0 1 ) i , (2 0 0 6 . 0 1 ) i 7 (IPC) or t o both national classification and IPC FIELDS SEARCHED Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols) A 6 1 K 4 5 / 0 0 , A 6 1K3 1 / 7 0 8 8 , A 6 1 K 3 1 / 7 1 1 , A 6 1 K 4 8 / 0 0 , C 1 2 Q1 / 6 8 , G0 1N3 3 / 1 5 , G0 1N3 3 / 5 0 , G0 1N3 3 / 5 7 4 Documentation 1922-1 996 1 971-2013 Koho Electronic data base consulted during the international Jitsuyo Toroku Shinan Jitsuyo DOCUMENTS CONSIDERED Category* 1996-2013 1994-2013 / JME DPlu s / J ST 7 8 0 ( JDreaml Relevant t o claim No. 9 0 RhoGT P n i yoru Sui Gan Saibo no suru Kento , 3 , page s 9 t o 1 0 , , page 10, l ef t 1, 7/ 2- 4, 8- 10 / 5 , 6 B e s son , A . , e t a l . , Regulati o n o f the cyto s k e leton : a n oncogeni c funct ion f o r CDK i nhibitor s ? , Nature Reviews Cancer , 2004 , Vo l . 4 , N o . 2 , p p . 9 4 8 - 9 5 5 , page 9 5 0 , l e f t c o lumn , 1 s t t o 2 n d paragraphs , Boxl Further documents are listed in the continuation * Special categories of cited documents: document defining the general state of the art which i s not considered to b e of particular relevance "E earlier application filing date or patent but published on or after the international document which may throw doubts on priority claim(s) or which i s cited t o establish the publication date of another citation or other special reason (as specified) document referring t o an oral disclosure, use, exhibnion t o the international February , 2 0 13 (2 Japane se Facsimile No. Form PCT/ISA/210 Patent search . 02 . 13 ) Name and mailing address of the ISA/ " later document published after the international filing date or priority date and not in conflict with the application but cited to understand the principle or theory underlying tiie invention "X" document of particular relevance; the claimed invention cannot b e considered novel or cannot b e considered t o involve an inventive step when the document i s taken alone "Y" document of particular relevance; the claimed invention cannot b e considered t o involve an inventive step when the document i s combined with one or more other such documents, such combination being obvious to a person skilled i n the art "&" document member of the same patent family or other means filing date but later than Date of the actual completion of the international Date of mailing of the international 0 5 March Authorized officer Of f i c e Telephone No. (second sheet) (July 2009) .- 4 , 7- 10 / 5 , 6 See patent family annex. of Box C . "A "P" l ) T O B E RELEVANT T o shi yuki KUSAMA e t a l . , " P I RhoGT Pa s e S ogai o 〇yo shita Ten ' i Shi n u n Yokus e i n i Kan S e i j i nbyo , 2 0 0 7 , v o l . 4 7 , n o . summary , page 9 , l e f t column column , 2 n d paragraph Y/A 25 Koho Koho Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages X/Y / A "O" Toroku Shinan search (name of data base and, where practicable, search terms used) MEDLINE / CAplu s / EMBASE / B IOS I S ( STN ) , JST Plus REGI S TRY ( STN ) , GenBank/ E B L / DDB J / GeneS e q L C 1 2N1 5 / 1 1 3 , searched other than minimum documentation t o the extent that such documents are included in the fields searched Jitsuyo Shinan Koho Kokai Jitsuyo Shinan C. A 6 1 P3 5 / 0 0 , , 2013 search report (05 . 03 . 13 ) INTERNATIONAL SEARCH REPORT International application No. PCT / JP2 0 1 3 / 0 5 1 7 3 3 C (Continuation). DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Category* Relevant to claim No. Y/ A Homo sapi e n s Rho GT Pa s e activati n g prote i n 1 1A (ARHGAP l lA) , tran s cript vari ant 1 , mR , DATABASE NCBI Nucleot ide [ onl i n e ] acce s s ion No . 丽 0 1 4 7 8 3 , 2 0 1 1 . 1 1 . 2 7 URL http :/ / w . ncbi . nlm . nih . gov/ nucco r e / 1 9 7 3 3 3 7 1 6 ? s a t = 1 5 &s a t key= 63 2 2 65 9> 1- 4 , 7- 10/ 5 , 6 Y/ A Homo sapi e n s Rho GT Pa s e activati n g prote i n 1 1A (ARHGAP l lA) , tran s cript vari ant 2 , mR , DATABASE NCBI Nucleot ide [ onl i n e ] acce s s ion No . 丽 1 9 9 3 5 7 , 2 0 1 1 . 1 1 . 1 9 URL http :/ / w . ncbi . nlm . nih . gov/ nucco r e / 4 0 7 8 8 0 1 7 ? s at=1 5 &satkey= 62 42 735> 1- 4 , 7- 10/ 5 , 6 X/A WO 2008/ 111464 Al (E i s a i R & D Management Ltd . ) , 1 8 Septembe r 2008 (18 . 09 . 2008) , paragraph s [ 0 00 8 ] t o [ 0 023 ] page 64 & US 2 0 1 0 / 0 0 2 1 9 1 8 A l & EP 2 13 62 0 9 A l paragraph s [ 0 00 8 ] t o [ 0 023 ] page 64 Form PCT/ISA/2 10 (continuation of second sheet) (July 2009) Co . , 8- 1 0/ 1- 7 INTERNATIONAL Box No. I I Observations This international where SEARCH certain claims were found Claims Nos.: ext unsearchable (Continuation r a application of item 2 of first search report has not been established in respect o f certain claims under Article No. sheet) 17(2)(a) for the following reasons: 1 1- 14 because they relate t o subject matter not required (Se e International REPORT sheet t o b e searched b y this Authority, namely: ) Claims Nos.: because they relate t o parts of the international application that do not comply with the prescribed extent that n o meaningful international search can b e carried out, specifically: requirements t o such an Claims Nos.: because they are dependent claims and are not drafted in accordance with the second and third sentences o f Rule 6.4(a). Box No. Ill Observations This International . □ where Searching Authority A s all required additional unity of invention found multiple i s lacking inventions search fees were timely (Continuation of item 3 of first i n this international paid by the applicant, application, this international sheet) as follows: search report covers all searchable claims. 2. □ A s all searchable claims could b e searched without effort justifying additional fees, this Authority did not invite payment of additional fees. 3. □ A s only some o f the required additional search fees were timely paid b y the applicant, only those claims for which fees were paid, specifically 4. □ N o required restricted Remark additional search fees were timely paid b y the applicant. t o the invention on Protest first mentioned The additional this international search report covers claims Nos.: Consequently, this international search report i in the claims; it i s covered b y claims Nos.: search fees were accompanied b y the applicant's protest and, where applicable, b y the applicant's protest but the applicable the payment o f a protest fee. The additional search fees were accompanied fee was not paid within N o protest accompanied Form PCT/ISA/210 (continuation the time limit specified in the invitation. the payment of additional o f first sheet ( 2 》( July 2009) search fees. protest INTERNATIONAL SEARCH REPORT Conti nuat ion of Box No . ェエー1 of conti nuat ion International application No. of f i r st sheet (2 ) The i nventi on s i n claims 11 t o 14 i nclude invent ion s , wherei n " a medi cal docto r " diagno ses a di s ea se on the basi s of obtained informati on , without stati ng about the inevitable udgment of the pre sence or ab sence of the di s ea se using a spe ci f c examinat ion step or udgment criteria or a step for f or ecast ing the extent of the progre s s and progno si s of the di seas e The r ef or e , the se invent ions pe rtain t o di agno st i c methods t o be pract i ced on the human body and , there fore , rel ate t o a subj ect matter whi ch thi s I nternati onal Searchi ng Autho r i t y i s not requi red t o search . Form PCT/ISA/210 (extra sheet) (July 2009) INTERNATIONAL SEARCH REPORT International application No. Claims 1 t o 3 r elate t o " a nove l ant itumo r agent " whi ch compri se s , a s the active ingredient , a compound de fined by a des i red property "a sub stance capable o f inhibi t i ng a protei n wi t h RhoGT Pa se act ivity" . Although the se c l aims include any compounds havi ng the above prope rty , onl y an ant i sen se ol i gonucl eoti de t o a gene encodi ng ARHGAP l l A and an shR are exclu sive l y di sclo sed unde r the provi s ion o f Art i cle 5 o f the PC . The r e f or e , i t appears that the se claims are not supported b y the des cripti on under the provi si on of Art i cle 6 o f the PC . Even though the common techni cal knowl edge at the poi nt o f the appl i cati on i s taken i nto cons der at on , i t cannot be recogni zed that the scope o f compounds havi ng the above prope rty as " a sub stance capable o f i nhibit ing a prote i n with RhoGT Pa se act ivity" could b e speci fied . Thu s , c l aims 1 t o 3 al so fai l t o sati s f y the requi rement of clearne s s a s de f ned i n Art i cle 6 o f the PC . Such being the cas e , the search wa s conducted exclus ivel y on the rel at ionship between " a protei n with RhoGTPas e act ivity" or " ARHGAP l lA" and " an ant itumor agent " and the ant itumor agent s whi ch compri se , as the active ingredient , the compounds that are part i cul arly stated in the des cripti on and spe c i f ed i n claims 5 and 6 - Form PCT/ISA/210 (extra sheet) (July 2009) 国 際 出願 番 号 国 際調 査 報 告 P C T / J P 2 0 1 3 / 0 5 1 7 3 3 発 明 の 属 す る分 野 の 分 類 ( 国 際 特 許 分 類 (I P C ) ) Int.Cl. A61K45/00 (2006. 01) i , A61K31/7088 (2006. 01) i ,A61K31/71 1 (2006. 01) i ,A61K48/00 (2006. 01) i A61P35/00 (2006. 01) i , C12N15/1 13 (2010. 01) i , C12Q1/68 (2006. 01) i , G01N33/15 (2006. 01) i , G01N33/50 (2006. 01) i ,G01N33/574 (2006. 01) i B . — 調 査 を行 っ た分 野 調 査 を行 っ た 最 小 限資 料 ( 国 際特 許 分 類 (I P C ) ) Int.Cl. A61K45/00, G01N33/574 A61K31/7088, A61K31/71 1, A61K48/00, A61P35/00, C12N15/1 13, C12Q1/68, G01N33/15, G01N33/50 最 小 限 資 料 以 外 の 資 料 で調 査 を行 っ た 分 野 に含 ま れ る もの 日本 国 実 用 新 案 公 報 日本 国公 開 実 用 新 案 公 報 日本 国 実 用 新 案 登 録 公 報 1 9 2 2 — 1 9 9 6 年 1 9 7 1 — 2 0 1 3 年 日本 国 登 録 実 用 新 案 公 報 1 9 9 4 1 9 9 6 — 2 0 1 3 年 2 0 1 3 年 国 際調 査 で使 用 した電 子 デ ー タベ ー ス ( デ ー タベ ー ス の 名 称 、調 査 に使 用 した用 語 ) MEDLINE/CAplus/EMBASE/BIOSIS GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq C . (STN) , JSTPlus/JMEDPlus/JST7580 (JDreaml l ) , REGISTRY (STN) 関連 す る と認 め られ る文 献 引用 文 献 の カ テ ゴ リー * 引用 文 献 名 関連 す る 請 求 項 の番 号 及 び 一 部 の 箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の表 示 X/ 草 間 俊 行 他 , P190 RhoGTP に よ る RhoGTPase 阻 害 を応 用 した 瞵 が ん 1, 7/ Y/ 細 胞 の転 移 浸 潤 抑 制 に 関す る検 討 , 成 人 病 , 2007 , Vol. 47, 2—4 , 8 A pp. 9-10 No. 3 , 要 旨、 第 9 頁 左 欄 、 第 10 頁 左 欄 第 2 段 落 Besson, function A. ,e t al. ,Regulation for CDK innibitors?, o f the cytoskeleton Nature Reviews 1-4 ,7-10/ : a n oncogenic Cancer, 5 ,6 2004, Vol. 4 , No. 2 , pp. 948-955 第 950 頁 左 欄 第 1-2 段 落 、 Boxl C 欄 の続 き に も 文 献 が列 挙 され て い るc * 引用 文 献 ΓΑ 」特 に 関連 の あ る文 献 で は な く、一 般 的 技 術 水 準 を示 す もの ΓΕ 」国 際 出願 日前 の 出願 ま た は特 許 で あ るが 、国 際 出願 日 以 後 に公 表 され た も の 「L 」優 先 権 主 張 に疑 義 を提 起 す る文 献 又 は他 の 文 献 の発 行 日若 し く は 他 の 特 別 な 理 由 を確 立 す る た め に 引 用 す る文 献 ( 理 由 を付 す ) Γθ 」 口頭 に よ る開 示 、使 用 、 展 示 等 に言 及 す る文 献 ΓΡ 」国 際 出願 日前 で 、か つ 優 先 権 の 主 張 の 基 礎 とな る 出願 2 5 . 0 2 . 出願 と矛 盾 す る もの で は な く、発 明 の原 理 又 は理 論 の 理 解 の た め に 引用 す る もの 「 X 」 特 に 関連 の あ る文 献 で あ っ て 、 当該 文 献 の み で発 明 の 新 規 性 又 は進 歩 性 が ない と考 え られ る も の ΓΥ 」 特 に 関連 の あ る文 献 で あ っ て 、 当該 文 献 と他 の 1 以 上 の文 献 との 、 当業 者 に とっ て 自明 で あ る組 合 せ に よ っ て進 歩 性 が な い と考 え Γ& 」 同一 パ テ ン トフ ァ ミ リー 文 献 2 0 1 3 国 際調 査機 関 の名 称 及 び あ て 先 日本 国特 許 庁 (I S A J Ρ ) 郵便番 号 1 0 0 — 8 9 1 5 東 京 都 千 代 田 区 霞 が 関三 丁 目 4 番 3 号 l S A の 日の 後 に公 表 され た 文 献 「 Τ 」 国 際 出願 日又 は優 先 日後 に公 表 され た文 献 で あ っ て 国 際調 査 報 告 の発 送 日 国 際調 査 を完 了 した 日 様式 P C T パ テ ン トフ ァ ミ リー に 関す る別 紙 を参 照 。 2 1 0 0 5 . 0 3 . 4 C 特許 庁審 査官 ( 権 限 の あ る職 員 ) (第 2 ペ ー ジ) (2 0 0 9 年 7 月 ) 佐 々木 0 3 - 2 0 1 3 3 9 6 2 大輔 3 5 8 1 - 1 1 0 内線 3 4 5 2 国 際 出願 番 号 国 際調 査 報 告 C (続 き) P C J P 2 0 1 3/ 0 5 1 7 3 3 関 連 す る と認 め られ る文 献 引用 文 献 の カ テ ゴ リー * 引用 文 献 名 Homo sapiens transcript URL<http Rho GTPase variant accession 関連 す る 請 求 項 の番 号 及 び 一 部 の 箇 所 が 関連 す る とき は 、 そ の 関連 す る箇 所 の 表 示 activating 1 , raRNA, No. NM_014783, : //www, r c b . protein 11A (ARHGAPllA) DATABASE NCBI Nucleotide , [online] 1-4 ,7-10/ 5 ,6 2011. 11. 2 7 m, n i h . ov / cco e/ 9 7 3 3 3 716? s a t 5& s a kev-6322659> Homo sapiens transcript variant accession URL<http Rho GTPase activating 2 , raRNA, No. 丽 —199357 : //www, ricbi . , protein 11A (ARHGAPllA) DATABASE NCBI Nucleotide , [online] 1-4 ,7-10/ 5 ,6 2011. 11. 19 m, n i h . gov/ nuccore/ 407880 7?sa 5 & .satk ey=6242735> WO 2008/111464 ン ト株 Al (エ ー ザ ィ · ア ー ノレ · 式 会 社 )2008. 09. 18 , 段 落 【0008 】 US 2010/0021918 A l & EP 2136209 ド · デ ィー ' マ ネ ジ メ 段 落 【0023 】、第 6 4 頁 & Al 段 落 【0008 】 一 段 落 【0023 】、 第 6 4 頁 様式 P C T I SA 2 1 0 (第 2 ペ ー ジ の 続 き ) (2 0 0 9 年 7 月 ) 8-10/ 1-7 国 際 出願 番 号 国 際調 査 報 告 第 Π欄 P C T / J P 2 0 1 3/ 0 5 1 7 3 3 請 求 の範 囲 の 一 部 の調 査 が で き ない とき の意 見 ( 第 1 ペ ー ジ の 2 の続 き) 法 第 8条 第 3項 (P C T 17 条 (2) (a) ) の 規 定 に よ り、 こ の 国 際 調 査 報 告 は 次 の 理 由 に よ り請 求 の 範 囲 の 一 部 に つ い て 作 成 しな か っ た。 1. が 請求項 1 1 1 4 は 、 この 国 際調 査 機 関 が調 査 をす る こ とを要 しな い 対 象 に係 る もの で あ る。 つ ま り、 請求項 1 1 1 4 に係 る発 明 は 、 特 定 の 検 査 工 程 や 判 定 基 準 等 に よ り必 然 的 に 該 疾 患 の 有 無 を 判 定 す る 記 載 や 病 気 の進 行 度 · 予 後 を 予 測 す る 工 程 等 の 記 載 が な く、 「医 師 」が 得 られ た 情 報 か ら病 気 を 判 断 す る発 明 を含 ん で い る か ら、 ヒ トの 診 断 方 法 に 関 す る も の で あ っ て 、 こ の 国 際 調 査 機 関 が 国 際 調 査 を行 うこ と を 要 しな レ、 対 象 に係 る も の で あ る。 2 . 請求項 は 、有 意 義 な 国 際調 査 をす る こ とが で き る程 度 ま で所 定 の要 件 を満 た して い ない 国 際 出願 の 部 分 に係 る もの で あ る。 つ ま り、 3 . 請求項 は 、従 属 請 求 の範 囲 で あ っ て P C T 規 則 6. 4 (a) の 第 2 文 及 び 第 3文 の 規 定 に 従 っ て記 載 され て い ない 。 第 欄 発 明 の 単 一 性 が欠 如 して い る とき の 意 見 ( 第 1 ペ ー ジ の 3 の続 き) 次 に述 べ る よ うに こ の 国 際 出願 に二 以 上 の発 明 が あ る と こ の 国 際調 査 機 関 は認 め た。 1. 出願 人 が 必 要 な追 加 調 査 手 数 料 をす ベ て 期 間 内 に納 付 した の で 、 こ の 国 際調 査 報 告 は 、 す べ て の調 査 可 能 な請 求 項 につ い て作 成 した。 2 . 追 加 調 査 手 数 料 を要 求 す るま で も な く、 す べ て の調 査 可 能 な請 求 項 につ い て調 査 す る こ とが で き た の で 、追 加 調 查 手 数 料 の納 付 を求 め な か っ た。 3 . 出願 人 が必 要 な追加 調 査 手 数 料 を一 部 の み しか 期 間 内 に納 付 しな か っ た の で 、 この 国 際調 査 報 告 は 、 手 数 料 の納 付 の あ っ た次 の 請 求 項 の み につ い て 作 成 した。 4 . 出願 人 が 必 要 な追 加 調 査 手 数 料 を期 間 内 に納 付 しな か っ た の で 、 こ の 国 際調 査 報 告 は 、 請 求 の範 囲 の 最 初 に記 載 され て い る発 明 に係 る次 の 請 求 項 につ い て 作 成 した。 追 加 調 査 手 数 料 の 異 議 の 申立 て に 関す る注 意 □ 追加 調 査 手 数 料 及 び 、該 当す る場 合 に は 、 異 議 申立 手 数 料 の納 付 と共 に 、 出願 人 か ら異 議 申立 て が あ っ た。 追加 調 査 手 数 料 の納 付 と共 に 出願 人 か ら異 議 申立 て が あ つ た が 、異 議 申立 手 数 料 が 納 付 命 令 書 に示 した期 間 内 に支 払 わ れ な か っ た。 追加 調 査 手 数 料 の納 付 は あ っ た が 、 異 議 申立 て は な か っ た。 様式 P C T I SA 2 1 0 (第 1 ペ ー ジ の続 葉 (2 ) ) ( 2 0 0 9 年 7 月) 国 際 出願 番 号 国 際調 査 報 告 請求項 1 P C T / J P 2 0 1 3/ 0 5 1 7 3 3 3 は 、 「RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し うる物 質 」 とい う所 望 の 性 質 に よ り定 義 され た 化 合 物 を 有 効 成 分 とす る 「 新 規 抗 腫 瘍 剤 」 に 関 す る も の で あ る。 そ して 、該 請 求 項 は 、そ の よ うな 性 質 を 有 す る あ ら ゆ る化 合 物 を 包 含 す る も の で あ る が 、PCT 第 5 条 の 意 味 に お い て 開 示 され て い る の は 、 ARHGAP11A を コ ー ドす る遺 伝 子 に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド又 は shRNA の み で あ り、 PCT 第 6 条 の 意 味 で の 明 細 書 の 開 示 に よ る裏 付 け を 欠 く も の と認 め られ る。 ま た 、 「RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 を 阻 害 し うる物 質 」 は 、 出 願 時 の 技 術 常 識 を 勘 案 して も そ の よ うな 性 質 を 有 す る化 合 物 の 範 囲 を 特 定 で き な い か ら、請 求 項 1 に お け る 明 確 性 の 要 件 も欠 い て い る。 3 は 、PCT 第 6 条 よ っ て 、 調 査 は 「RhoGTP 分 解 活 性 タ ン パ ク 質 」 又 は 「ARHGAP11A 」 と 「 抗腫瘍剤 」 と の 関 係 に つ い て 、及 び 、明 細 書 に 具 体 的 に 記 載 され 、請 求 項 5 、 6 に 特 定 され て い る化 合 物 を 有 効 成 分 とす る抗 腫 瘍 剤 に つ い て 行 っ た 。 式P C T I SA 2 1 0 (特 別 ペー ジ) (2 0 0 9 年 7 月 )