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TaqMan Probe-Based Chemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Development of TaqMan Probe-Based Chemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
How TaqMan Sequence Detection Chemistry Works . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Two Types of TaqMan Probes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Selecting the Appropriate Chemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5
Minimizing DNA Contaminants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6
Using UNG to Minimize Reamplification Carryover Products . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6
General PCR Practices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
Chapter 3
Gene Expression and Other Quantitative Assays
Section 3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
In This Section . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
About Quantitative Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
What Is a Quantification Assay? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Instruments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Terms Used in Quantification Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
How Real-Time PCR Quantification Assays Work . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Selecting a Quantification Assay Chemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-6
Chemistries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-6
Primers Used for cDNA Synthesis in Two-Step RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-6
Purchasing a Preformulated or Custom-Designed Quantification Assay . . . . . . . . . . .
Assays-on-Demand Gene Expression Product . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Product Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Purpose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Product Properties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Available Products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
About Target Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Assays-by-Design Service . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Designing Your Own Quantification Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-9
Important Design Steps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-9
Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-9
Primer and Probe Design Using Primer Express Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
Selecting an Amplicon Site for Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
About the Primer and Probe Design Guidelines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
Summary of Primer and MGB Probe Design Guidelines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
Selecting the Appropriate Reagent Configuration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
Recommended Reagent Configurations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
About Universal Master Mix Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-14
About the Reagent Components . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-14
Using the Universal Thermal Cycling Parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15
Recommended Thermal Cycling Parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15
Optimizing Primer Concentrations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17
Default Primer Concentrations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17
Primer Optimization Matrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17
5′ Nuclease Quantification Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17
SYBR Green I Dye Quantification Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
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DRAFT
November 13, 2003 12:42 pm, Chem 4348358ATOC.fm
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