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Inhaltsverzeichnis
3.4.2 Analyse der Nitratkonzentration .........................................................................................44
3.4.3 Analyse der Zucker- und Aminosäurenkonzentration ........................................................44
3.4.4 Proteinisolierung aus C. michiganensis subsp. michiganensis .........................................45
3.4.4.1 Isolierung der Oberflächenproteine ......................................................................45
3.4.4.2 Isolierung extrazellulärer und zytoplasmatischer Proteine ...................................46
3.4.4.3 Isolierung spezifischer Proteine mittels magnetic beads .....................................46
3.4.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) .......................................................48
3.4.6 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) .............................................................49
3.4.7 Färbung mit Coomassie Brilliant Blue ................................................................................50
3.4.8 Zymographie ......................................................................................................................51
3.4.9 Vorbereitung der Proteine zur Analyse mittels MALDI-ToF MS ........................................52
3.4.10 Protein-Hybridisierung (Western Blot) ...............................................................................52
3.5 Techniken zur Manipulation von Bakterien ..................................................................................54
3.5.1 Herstellung kompetenter E. coli DH5αMCR ......................................................................54
3.5.2 Transformation kompetenter E. coli DH5αMCR ................................................................54
3.5.3 Herstellung kompetenter C. michiganensis subsp. michiganensis....................................54
3.5.4 Transformation kompetenter C. michiganensis subsp. michiganensis .............................55
3.5.5 Insertionsmutagenese in C. michiganensis subsp. michiganensis ...................................55
3.5.6 Fluoreszenzmessung .........................................................................................................55
4 Ergebnisse .........................................................................................................................................57
4.1 Wachstumsverhalten von C. michiganensis subsp. michiganensis .............................................57
4.2 Infektion von Tabakpflanzen ........................................................................................................58
4.2.1 Phänotypische Analyse der Nicotiana-Infektion ................................................................58
4.2.2 Molekulare Analyse der Nicotiana-Infektion ......................................................................60
4.3 Infektion von Tomatenpflanzen ....................................................................................................64
4.3.1 Analyse von Krankheitssymptomen ...................................................................................65
4.3.2 Analyse der Samenbesiedelung in infizierten Tomatenpflanzen .......................................66
4.3.3 Analyse der Samenbesiedelung nach einer in vitro-Infektion............................................68
4.4 Analyse von Virulenzfaktoren .......................................................................................................70
4.4.1 Xylemsaft-imitierendes in vitro-Medium (XMM) .................................................................71
4.4.2 Proteomanalysen ...............................................................................................................74
4.4.2.1 Analyse der Oberflächenproteine .........................................................................74
4.4.2.2 Analyse extrazellulärer und zytoplasmatischer Proteine ......................................78
4.4.3 Transkriptomanalysen ........................................................................................................85
4.4.3.1 Vergleich: synthetisches Medium (XMM) und Minimalmedium (M9) ...................86
4.4.3.2 Vergleich: synthetisches Medium (XMM) und Vollmedium (TBY) ........................90
4.4.3.3 Vergleich: synthetisches Medium (XMM) mit und ohne Acetosyringon ...............92
4.5 Charakterisierung und Analyse von Transkriptionsregulatoren ...................................................94
4.5.1 Charakterisierung von Regulatoren für pat-1 und celA .....................................................94
4.5.2 Insertionsmutagenese von drei putativen Regulatoren .....................................................96
4.5.3 Analyse der Mutation von CMM_2408 und CMM_2766 ..................................................101
4.6 Promotorstudien .........................................................................................................................103
4.6.1 Analyse der Promotorregion von glnA1 ...........................................................................104
4.6.2 Promotoranalyse des 5’-Transkriptoms mittels RNA-Sequenzierung .............................106
5 Diskussion .......................................................................................................................................112
5.1 Interaktion von Nicht-Wirts- und Wirts-Pflanze mit C. michiganensis subsp. michiganensis ....112
5.1.1 Interaktion mit der Nicht-Wirts-Pflanze Nicotiana ............................................................112
5.1.2 Interaktion mit der Wirts-Pflanze S. lycopersicum ...........................................................114
5.2 Das synthetische Xylemsaft-imitierende Medium XMM .............................................................116
5.3 Das extrazelluläre Proteom von Cmm382 in M9- und XMM-Medium ........................................118
5.4 Das Transkriptom von Cmm382 in unterschiedlichen Medien ..................................................121
5.5 Proteom- und Transkriptomdaten - Ein Vergleich ......................................................................123
5.6 Putative Transkriptionsregulatoren von pat-1 und celA .............................................................124
5.7 Homologe Sequenzen innerhalb des Genoms von Cmm382 ....................................................125
5.8 Analyse der 5’-Transkripte mittels RNA-Sequenzierung............................................................126
6 Literaturverzeichnis ........................................................................................................................129