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Material und Methoden
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3.4.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Für die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine wurden SDS-Polyacrylamid-Gele
verwendet (nach Laemmli, 1970; Schägger & von Jagow, 1987).
10%iges Trenngel mit Glycerin (Schägger & von Jagow, 1987)
Sammelgel:
3,3 ml
Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (37,5 : 1)
0,8 ml
4,5 ml
Gelpuffer
2,6 ml
1,1 ml
50%iges (v/v) Glycerin
4,2 ml
H2Obidest
4,2 ml
135 µl
10%iges (w/v) APS
160 µl
15 µl
TEMED
12,5%iges Trenngel (Laemmli, 1970)
---
15 µl
Sammelgel:
4,15 ml
Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (37,5 : 1)
0,835 ml
2,6 ml
Trenngelpuffer
---
Sammelgelpuffer
1,25 ml
3,21 ml
H2Obidest
2,87 ml
30 µl
10%iges (w/v) APS
30 µl
15 µl
TEMED
15 µl
---
Die Proteinproben wurden mit 5 x Probenauftragspuffer versetzt, bevor sie zur Denaturierung
für 5 min bei 95°C (10%ige Gele) inkubiert wurden. Folgte eine Analyse mittels MALDI-ToF
MS wurden lösliche Proteine für 15 min bei 60°C und 900 rpm (TS 100 Thermoshaker,
peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) inkubiert und Oberflächenproteine für 30 min bei
Raumtemperatur und 1.000 rpm (TS 100 Thermoshaker, peqlab Biotechnologie GmbH,
Erlangen). Anschließend erfolgte eine Gelelektrophorese. Diese wurde in einem BlueVertical
101 Gerät (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg) bei einer anfänglichen Spannung von
50 V durchgeführt. Die Spannung wurde auf 120 V erhöht, sobald die Proteine das Trenngel
erreicht hatten. Als Laufpuffer für 10%ige-Gele dienten Kathoden- und Anodenpuffer, für
12%ige-Gele wurde 1 x SDS-Laufpuffer verwendet. Zur Größenbestimmung wurde ein
Proteinmarker (peqGOLD Protein-Marker II oder V, peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen)
mit auf das Gel aufgetragen. Anschließend wurden die Gele mit Coomassie Brilliant Blue
gefärbt (vgl. Abschnitt 3.4.7).
Gelpuffer:
3 M Tris, 1 M HCl, 0,3 % (w/v) SDS; Sterilisation durch Autoklavieren