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Ergebnisse
76
kDa pH 6
130
95
72
55
11
36
28
Abbildung 17: 2D-Gelelektrophorese des Oberflächenproteoms von Cmm382. Die
mittels Phenolextraktion und Methanolfällung isolierten Proteine wurden in einem pH-Bereich
zwischen 6 und 11 fokussiert und anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die
Proteine sammelten sich in einem pH Bereich zwischen etwa 8 und 11.
Die Auftrennung des Oberflächenproteoms von Cmm100 war vergleichbar (Daten nicht
gezeigt). In beiden Gelen waren keine voneinander unterscheidbaren Proteinpunkte zu
erkennen. Die Proteine sammelten sich vor allem in einem pH-Bereich zwischen 8 und 11
und zeigten horizontales shifting. Diese Phänomen tritt bei einer Auftrennung in einem engen
pH Bereich auf (Hoving et al., 2002). Um das horizontale shifting zu vermeiden, wurden
nacheinander einige Änderungen an dem Protokoll für die isoelektrische Fokussierung
vorgenommen (Tabelle 8).
Tabelle 8: Vorgenommene Änderungen zur verbesserten Proteinauftrennung bei der
2D-Gelelektrophorese. Verändert wurden die Lösung zur Rehydratisierung der Gelstreifen
vor der isoelektrischen Fokussierung sowie die Probenbeladung.
Änderung
Quelle
Rehydratisierungslösung + 0,6 % (w/v) DTT
(Rehm, 2006)
(Rehydratisierungslösung: Abschnitt 3.4.6, 6 M Harnstoff,
2 M Thioharnstoff, 4 % (w/v) CHAPS, 0,5 % (w/v)
TM
Pharmalyte , 0,4 % (w/v) DTT, Bromphenolblau)
Rehydratisierungslösung neu: 7 M Harnstoff, 2 M
Thioharnstoff, 4 % (w/v) CHAPs, 2,5 % (w/v) DTT, 10 % (v/v)
Isopropanol, 5 % (v/v) Glycerin, Bromphenolblau
Cup loading: Die Proteinlösung wird nach
der Rehydratisierung während der
isoelektrischen Fokussierung direkt über
einen sample cup zugegeben.
Probenbeladung
(Hoving et al.,
2002)
Amersham
Bioscience, 2-D
electrophoresis,
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